KR20210081366A - 간 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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마이클 윤석 최
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더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

간 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 본 발명의 측면은 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 HSC를 투여하는 것에 관한 것이다.

Description

간 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/747,903을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 간 질환의 치료에 관한 것이다.
간은 대사물을 여과하고, 단백질을 합성하며, 소화에 필요한 생화학물질을 생산할 수 있는 고도로 중요한 기관이다. 구체적으로, 간은 담즙을 생산하여 지방을 분해하고 지질을 유화시킨다. 만성 및 진행성 간 질환은 간에서 담관의 진행성 파괴를 유발할 수 있으며, 이는 담즙 축적, 중증 염증, 반흔형성 및 섬유증으로 이어질 수 있다. 반흔 조직이 건강한 간 조직을 대체하는 경우에, 간 기능은 점점 더 손상되게 된다. 일부 간 질환 (예를 들어 원발성 담즙성 담관염 (PBC))의 경우, 단지 1종의 약물인 우르소데옥시콜산 (UDCA)만이 생존을 개선시킬 수 있다. 불행하게도, UDCA-치료된 환자의 대략 40%가 요법에 대해 부적절한 반응을 나타낸다. 따라서, 간 질환, 예컨대 PBC 등의 치료를 위해 보다 효과적인 치료제가 필요하다.
본원에 기재된 본 발명은, 부분적으로, miRNA-15a, miRNA-412 및 항-WISP1 항체에 의한 WISP1의 억제가 간의 섬유화 진행에서 중추적 역할을 하는 세포 유형인 활성화된 간 성상 세포 (HSC)에서 정지상태를 유도하였다는 발견에 관한 것이다. miR-15a 및 WISP1 IgG는 활성화된 HSC에서 WISP1을 직접 표적화하여 단백질의 섬유화유발 기능을 억제할 수 있는 것으로 본원에 추가로 제시된다.
따라서, 본원에 기재된 한 측면은 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 간 질환은 알라질 증후군; 알콜-관련 간 질환; 알파-1 항트립신 결핍; 자가면역 간염; 양성 간 종양; 담도 폐쇄증; 간경변증; 크리글러-나자르 증후군; 갈락토스혈증; 길버트 증후군; 혈색소증; 간성 뇌병증; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 간신 증후군; 임신 중 간내 담즙정체 (ICP); 리소솜 산 리파제 결핍 (LAL-D); 간낭; 간암; 신생아 황달; 비-알콜성 지방간 질환; 비-알콜성 지방간염; 원발성 담즙성 담관염 (PBC); 원발성 경화성 담관염 (PSC); 진행성 가족성 간내 담즙정체 (PFIC); 라이 증후군; 제I형 글리코겐 축적 질환; 경피증; 및 윌슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1은 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4로 이루어진 군으로부터 선택된 스플라이스 변이체이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약은 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1은 표적 세포에서 억제된다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 표적 세포는 간 성상 세포, 섬유모세포 또는 근섬유모세포이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 간 성상 세포는 정지 세포이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 직접 주사, 피하 주사, 근육 주사, 경구, 경피 또는 비강 투여에 의해 투여된다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1을 억제하는 것은 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것이다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1의 활성은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 억제된다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1의 수준은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 감소된다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 간 질환을 치료 또는 예방하기 위해 제제화된다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 검출하는 단계; (b) (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계; (c) 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및 (d) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 방법은 (a) 전에, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 조직, 백혈구 연층, 혈청 또는 조직이다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, WISP1을 억제하는 작용제는 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA, lncRNA, mRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 마이크로RNA는 miRNA15a 또는 miRNA412이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 작용제는 직접 주사, 피하 주사, 근육 주사, 경구, 경피 또는 비강 투여에 의해 투여된다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 WISP1을 억제하는 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Acta2의 수준을 검출하는 단계; (b) (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계; (c) 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및 (d) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 간 성상 세포를 WISP1을 억제하는 작용제와 접촉시키는 단계 및 세포를 작용제의 발현이 가능하도록 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 조작된 간 성상 세포 또는 그의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 세포는 정지 세포이다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 접촉은 세포를 작용제 또는 작용제를 코딩하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 임의의 측면의 한 실시양태에서, 접촉은 형질도입, 뉴클레오펙션, 전기천공, 직접 주사 및/또는 형질감염을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포를 포함하는 세포주를 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포 또는 그의 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 세포, 본원에 기재된 임의의 생성된 세포, 또는 본원에 기재된 생성된 세포를 포함하는 임의의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 섬유증의 감소를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 세포, 본원에 기재된 임의의 생성된 세포, 또는 본원에 기재된 생성된 세포를 포함하는 임의의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 (a) 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Acta2 수준 (예를 들어, mRNA, miRNA, 단백질 수준 등)을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및 (b) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 (a) 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Acta2 수준을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및 (b) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 일부 용어 및 어구의 의미가 하기에 제공된다. 달리 언급되거나 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 하기 용어 및 어구는 하기 제공된 의미를 포함한다. 정의는 특정한 실시양태를 기재하는 것을 보조하기 위해 제공되고, 청구된 기술을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이는 기술의 범주가 단지 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 이 기술이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 관련 기술분야에서의 용어의 용법과 본원에 제공된 그의 정의 사이에 명백한 불일치가 존재하는 경우에, 명세서 내에 제공된 정의가 우선할 것이다.
면역학 및 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의는 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)]에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "호전"은 치유적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 간 질환, 예를 들어 간 섬유증과 연관된 상태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 호전, 억제, 둔화 또는 정지시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 간 질환의 적어도 1종의 유해 효과 또는 증상, 예를 들어 황달, 정맥류 출혈의 감소 또는 완화, 섬유증, 반흔형성 및 복수의 감소를 포함한다. 치료는 일반적으로 1종 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소되는 경우에 "효과적"이다. 대안적으로, 치료는 질환의 진행이 감소 또는 중단되는 경우에 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라, 치료의 부재 하에 예상되는 것과 비교하여 증상의 진행 또는 악화의 중지 또는 적어도 둔화 또는 역전을 포함한다. 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 검출가능하든 또는 검출불가능하든 1종 이상의 증상(들)의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 관해 (부분적이든 또는 전체적이든) 및/또는 감소된 사망률을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 질환의 "치료"는 또한 질환의 증상 또는 부작용으로부터의 완화를 제공하는 것을 포함한다 (완화적 치료 포함).
본원에 사용된 "예방하는" 또는 "예방"은 방법론의 작용 (예컨대, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 투여)으로 인해 질환 상태가 발생하지 않는 임의의 방법론을 지칭한다. 한 측면에서, 예방은 또한 질환이 비치료 대조군에서 발생하는 정도로 확립되지는 않음을 의미할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 질환의 예방은 비치료 대상체 (예를 들어 본원에 기재된 방법 또는 조성물로 치료되지 않은 대상체)에 비해 대상체에서 질환이 발생할 수 있는 가능성의 감소를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "투여하는" 및 "주사하는"은 세포, 예를 들어 간 성상 세포 또는 본원에 기재된 작용제를 대상체 내로, 도입되는 세포 또는 작용제를 목적하는 부위, 예컨대 간 또는 그의 영역에 적어도 부분적으로 국재화시키는 방법 또는 경로에 의해 배치하여, 목적하는 효과(들) (예를 들어, 감소된 WISP1 수준 또는 활성)가 생성되도록 하는 것과 관련하여 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 기재된 작용제 또는 세포는 임의의 적절한 경로에 의해 투여되어 대상체 내의 목적하는 위치로의 전달됨으로써 여기서 전달된 작용제, 세포 또는 세포의 성분의 적어도 한 부분이 생존가능하게 유지될 수 있다. 대상체에 대한 투여 후 세포의 생존 기간은 짧게는 수시간, 예를 들어 24시간에서 수일, 길게는 수년, 즉 장기간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "투여하는"은 1종 이상의 작용제 또는 세포를 포함하는 제약 조성물의 투여를 지칭한다. 투여는 이를 필요로 하는 대상체에 대한 직접 주사 (예를 들어, 표적 세포에 직접 투여), 피하 주사, 근육 주사, 경구 또는 비강 전달에 의해 수행될 수 있다. 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다.
용어 "환자", "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 예방적 치료를 포함한 치료가 제공되는 동물, 특히 인간을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 지칭한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예를 들어 마우스 또는 래트), 기니 피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소 및 비-포유동물, 예컨대 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 질환 모델로서의 실험 동물 또는 동물 대체물이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이, 래트, 기니 피그, 햄스터 등)을 포함한 가축 동물이다. 대상체는 이전에 간 질환에 대한 치료를 받았을 수 있거나 또는 간 질환에 대한 치료를 받지 않았다. 대상체는 이전에 간 질환을 갖는 것으로 진단되었을 수 있거나 또는 간 질환으로 진단되지 않았다.
용어 "감소시키다", "감소된", "감소" 또는 "억제하다"는 모두 특성, 수준 또는 다른 파라미터의 통계적으로 유의한 양만큼의 감소 또는 경감을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, "감소시키다", "감소" 또는 "감소시키다" 또는 "억제하다"는 전형적으로 참조 수준 (예를 들어, 소정의 치료 부재 하의 수준)과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소를 의미하고, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 초과만큼의 감소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "감소" 또는 "억제"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포괄하지 않는다. "완전한 억제"는 참조 수준과 비교하여 100% 억제이다. 감소는 바람직하게는 소정의 장애를 갖지 않는 개체에 대한 정상 범위 내로서 허용되는 수준까지의 감소일 수 있다. 예를 들어, WISP1을 억제하는 것은 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것이다.
용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 일반적으로 특성, 수준 또는 다른 파라미터의 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하는 것으로 본원에 사용되며; 어떠한 의심도 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 100%까지의 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배 또는 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 적어도 약 20배 증가, 적어도 약 50배 증가, 적어도 약 100배 증가, 적어도 약 1000배 증가 또는 그 초과를 의미한다.
본원에 사용된 "참조 수준"은 정상인, 달리 이환되지 않은 세포 집단 또는 조직 (예를 들어, 건강한 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플, 또는 이전 시점에 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플, 예를 들어 간 질환으로 진단되기 전 환자로부터 수득된 생물학적 샘플, 또는 본원에 개시된 작용제 또는 조성물과 접촉되지 않은 생물학적 샘플)을 지칭한다.
본원에 사용된 "적절한 대조군"은 비-대조군 세포와 비교하여 비처리된 것 외에는 동일한 세포 또는 집단 (예를 들어, 본원에 기재된 작용제 또는 조성물에 의해 접촉되지 않았거나 또는 동일한 방식으로 접촉되지 않은, 예를 들어 상이한 지속기간 동안 접촉된 생물학적 샘플)을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는"은 과도한 독성 없이 대상체 (예를 들어, 포유동물 또는 인간)에게 투여될 수 있는 화합물 및 조성물을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 활성 성분과 조합되는 경우에 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 재료 또는 물질을 포함할 수 있다. 예는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "제약상 허용되는 담체"는 조직 배양 배지를 제외한다. 제약 담체의 비제한적 예는 입자 또는 중합체-기반 비히클, 예컨대 나노입자, 마이크로입자, 리포솜, 중합체 마이크로구체 또는 중합체-약물 접합체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1" 또는 "WISP1" 또는 "CCN4"는 세포 부착, 이동, 증식, 분화 및 생존을 포함한 많은 다양한 세포 기능을 갖는 WISP1 유전자에 의해 코딩되는 기질세포 단백질이다. 간에서, WISP1은 간 성상 세포 (HSC)가 근섬유모세포로 활성화될 때 그에 의해 분비된다. 자가분비 시스템을 통해, WISP1은 또한 콜라겐의 활성화 및 분비를 가속시켜 섬유증을 촉진함으로써 HSC에 영향을 미친다. CCN4, WISP1c, WISP1i, WISP1tc, WISP1-OT1 및 WISP1-UT1로도 공지된 WISP1에 대한 서열은 다수의 종에 대해 공지되어 있으며, 예를 들어 인간 WISP1 (NCBI 진(Gene) ID: 8840) 폴리펩티드 (예를 들어, NCBI Ref 서열: NP_001191798.1) 및 mRNA (예를 들어, NCBI Ref 서열: NM_001204869.1)이다. WISP1은 인간 WISP1, 그의 자연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. WISP1은, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유동물 WISP1을 지칭한다. 서열식별번호: 5의 핵산 서열은 WISP1을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "WISP1 활성"은 WISP1의 세포 기능을 지칭하며, 예를 들어 WISP1은 HSC에서 콜라겐의 활성화 및 분비를 가속시켜 섬유증을 촉진하고, p53-매개 아폽토시스를 약화시키고, WISP1은 다른 세포 유형에서 TNF-유도된 세포 사멸을 억제할 수 있다. 예를 들어, WISP1 활성의 증가는 세포에 의한 콜라겐 침착의 증가를 지칭할 수 있다. WISP1 활성은 알파 평활근 액틴 발현 또는 IL-6과 같은 일부 염증유발 시토카인의 발현의 유도를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 그의 유사체의 단위를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 단일-가닥 핵산은 변성된 이중-가닥 DNA의 1개의 핵산 가닥일 수 있다. 대안적으로, 그것은 임의의 이중-가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일-가닥 핵산일 수 있다. 한 측면에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 또 다른 측면에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA는, 예를 들어 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 적합한 RNA는, 예를 들어 mRNA를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작용제"는 임의의 화합물 또는 물질, 예컨대 비제한적으로 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등을 의미한다. "작용제"는 합성 및 자연-발생 단백질성 및 비-단백질성 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 화학물질, 물질 또는 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 압타머, 핵산의 올리고머, 아미노산 또는 탄수화물, 예컨대 비제한적으로 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지단백질, 압타머 및 그의 변형 및 조합 등이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로시클릴 모이어티, 예컨대 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 포함한다. 화합물은 목적하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지될 수 있거나 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
작용제는 1종 이상의 화학적 부류로부터의 분자, 예를 들어 유기금속 분자를 포함할 수 있는 유기 분자, 무기 분자, 유전자 서열 등일 수 있다. 작용제는 또한 1종 이상의 단백질로부터의 융합 단백질, 키메라 단백질 (예를 들어 관련 또는 상이한 분자의 기능적으로 유의한 영역의 도메인 스위칭 또는 상동 재조합), 합성 단백질, 또는 치환, 결실, 삽입 및 다른 변이체를 포함한 다른 단백질 변이일 수 있다.
본원에 사용된 "항체"는 항체를 자연적으로 생산하는 임의의 종으로부터 유래되든 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되든; 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마, 효모 또는 박테리아로부터 단리되든, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자 또는 그의 항원-특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디술피드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디술피드-연결된 scFv, 디아바디를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 지칭한다.
또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. VH 영역 (예를 들어, 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 한 부분)은 본원의 다른 곳에 기재된 VH 절편과 동일하지 않음을 주목하여야 한다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역" ("FR")으로 칭해지는 보다 보존된 영역이 사이에 배치되어 있는, "상보성 결정 영역" ("CDR")으로 칭해지는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정확하게 정의되어 있다 (문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조; 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노 기와 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "항체 시약"은 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 또는 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고 소정의 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 시약은 항체 또는 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 항체 시약은 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 경쇄 (L) 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체 시약"은 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 쇄 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, CDR 및 도메인 항체 (dAb) 단편 (예를 들어, 문헌 [de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39] 참조; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)) 뿐만 아니라 완전 항체를 포괄한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD 또는 IgM (뿐만 아니라 그의 하위유형 및 조합)의 구조적 특색을 가질 수 있다. 항체는 마우스, 토끼, 돼지, 래트 및 영장류 (인간 및 비-인간 영장류) 및 영장류화 항체를 포함한 임의의 공급원으로부터의 것일 수 있다. 항체는 또한 미디바디, 나노바디, 인간화 항체, 키메라 항체 등을 포함한다. 항체 시약은 항체 단편일 수 있다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 그의 크기 또는 기능에 관계없이 변형된 아미노산 (예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함한 아미노산의 중합체를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 비교적 큰 폴리펩티드에 관하여 사용되는 반면 용어 "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드에 관하여 사용되지만, 관련 기술분야에서의 이들 용어의 용법은 중첩된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 유전자 산물 및 그의 단편을 언급하는 경우에 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 산물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 상기의 다른 등가물, 변이체, 단편 및 유사체를 포함한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 기재된 임의의 특정한 폴리펩티드의 변이체 (자연 발생 또는 다른 것), 대립유전자, 상동체, 보존적으로 변형된 변이체 및/또는 보존적 치환 변이체가 포괄되는 것으로 추가로 고려된다. 아미노산 서열에 관하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 코딩 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가, 이러한 변경이 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 유발하고 폴리펩티드의 목적하는 활성을 보유하는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시내용과 일치하는 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가적이고 이들을 제외하지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, "항원"은 항체 상의 결합 부위에 의해 결합되는 분자이다. 전형적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 항원은 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 다른 분자 또는 그의 부분일 수 있다. 용어 "항원 결정기"는 항원-결합 분자에 의해, 보다 특히 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식되는 항원 상의 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 상호작용, 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합의 강도를 지칭하고, 해리 상수 (KD)로서 정량적으로 표현될 수 있다. 결합력은 항원-결합 분자 (예컨대 본원에 기재된 항체 시약)와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 항원 결정기와 항원-결합 분자 상의 그의 항원 결합 부위 사이의 친화도 및 항원-결합 분자 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 둘 다와 관련된다. 전형적으로, 항원-결합 단백질 (예컨대 본원에 기재된 항체 시약)은 그의 동족 또는 특이적 항원에 10-5 내지 10-12 몰/리터 또는 그 미만, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 또는 그 미만, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD) (즉, 105 내지 1012 리터/몰 또는 그 초과, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 또는 그 초과, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA))로 결합할 것이다. 10-4 몰/리터 초과의 임의의 KD 값 (또는 104 M-1 미만의 임의의 KA 값)은 일반적으로 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 의미있는 것으로 간주되는 (예를 들어 특이적인) 생물학적 상호작용에 대한 KD는 전형적으로 10-10 M (0.1 nM) 내지 10-5 M (10000 nM)의 범위이다. 상호작용이 더 강할수록, 그의 KD는 더 낮다. 바람직하게는, 본원에 기재된 항체 시약 상의 결합 부위는 목적하는 항원에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합할 것이다. 항원 또는 항원 결정기에 대한 항체 시약의 특이적 결합은, 예를 들어 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA), 효소 면역검정 (EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 관련 기술분야에 그 자체로 공지된 그의 상이한 변형법; 뿐만 아니라 본원에 언급된 바와 같은 다른 기술을 포함한, 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이성"은 제1 물질이 비-표적인 제3 물질에 결합하는 것보다 더 큰 특이성 및 친화도로 제2 표적 물질에 결합하는, 2종의 분자, 화합물, 세포 및/또는 입자 사이의 화학적 상호작용을 지칭한다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 제1 물질의 제2 표적 물질에 대한 친화도가 제3 비표적 물질에 대한 친화도보다 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 또는 그 초과인 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 본원에 기재된 작용제 (예를 들어 항체 시약)가, 예를 들어 소정의 항원의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 같은 표적에, KD 10-5 M (10000 nM) 이하, 예를 들어 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하 또는 10-12 M 이하로 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 작용제가 항원을 포함하는 제1 펩티드에 10-5 M 이하의 KD로 결합하지만 또 다른 무작위로 선택된 펩티드에는 결합하지 않는 경우에, 작용제는 제1 펩티드에 특이적으로 결합한다고 한다. 특이적 결합은, 예를 들어 작용제의 친화도 및 결합력 및 작용제의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 적합한 방법, 예컨대 적합한 세포에서의 작용제의 적정 및/또는 펩티드 결합 검정을 사용하여 작용제가 표적에 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다.
용어 "발현"은 RNA 및 단백질을 생산하는데 및 적절한 경우, 단백질을 분비하는데 수반되는 세포 과정을 지칭하며, 이는 적용가능한 경우에, 예를 들어 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 경우에 시험관내 또는 생체내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열 (DNA)을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 앞 및 뒤의 영역, 예를 들어 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열, 뿐만 아니라 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 세포 또는 기관에 관하여 사용되는 경우에, 세포와 작용제, 표면, 호르몬 등과의 물리적 접촉을 허용하는 방식으로 세포에 작용제, 표면, 호르몬 등을 도입하는 것, 및 세포에서 작용제, 예컨대 miRNA, 폴리펩티드 또는 다른 발현 산물의 발현을 허용하는 요소, 예컨대 유전자 구축물 또는 벡터를 도입하는 것 둘 다를 포괄한다. 작용제를 발현하도록 유전자 변형된 세포는, 작용제를 발현하는 세포의 자손도 마찬가지로, 작용제와 "접촉"되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 지칭하고, 일반적으로 2 표준 편차 (2SD) 이상의 차이를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 제시되어 있는 정의된 요소에 추가로 다른 요소가 또한 존재할 수 있다는 것을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한보다는 포함을 나타낸다.
용어 "로 이루어진"은 실시양태의 기재에서 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 그의 각각의 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 이루어진"은 소정의 실시양태에 대해 요구되는 요소를 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 실시양태의 기본적인 신규 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소의 존재를 허용한다.
단수 용어는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어인 예를 들어로부터 유래되고, 비제한적 예를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적인 것 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
추가로, 측정가능한 값, 예컨대 본 발명의 조성물의 양, 용량, 시간, 온도 등을 지칭하는 경우에 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도된다. 작업 실시예 이외에 또는 달리 나타낸 경우에, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 관련하여 사용되는 경우에 ±1%를 의미할 수 있다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용은 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 따라서 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적의 것이며, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
확인된 모든 특허 및 다른 간행물은, 예를 들어 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 포함된다. 이들 간행물은 단지 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 이전 개시내용에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 날짜에 관한 모든 진술 또는 이들 문헌의 내용에 관한 표현은 출원인에게 이용가능한 정보에 기초하며, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 관한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
도 1은 연구 계획의 개략도를 보여준다: 목표 1은 miR-15a 및 miR-412의 메카니즘 및 기능을 조사하고, 목표 2는 그의 치료 잠재력을 시험하고, 목표 3은 miR-15a의 공지된 표적 WISP1의 기능을 규명한다. HSC는 간 성상 세포에 대한 용어이다.
도 2는 활성화된 간 성상 세포를 정지상태로 복귀시키는 후보를 확인하기 위해 전체 게놈 마이크로RNA 모방체 라이브러리를 스크리닝한 실험의 흐름의 개략도를 보여준다.
도 3은 miR-15a 또는 miR-412가 과다발현된 경우에, 나일 레드 염색-양성 지질 액적의 재형성에 의해 입증된 바와 같이, 활성화된 마우스 간 성상 세포 (HSC)가 정지상태로 복귀된 것을 보여준다 (상단 열). 도 3은 또한 miR-15a 또는 miR-412의 인간 오르토로그가 과다발현된 경우에, 지질 액적의 재형성에 의해 입증된 바와 같이, 활성화된 인간 HSC가 정지상태로 복귀된 것을 보여준다 (하단 열).
도 4a 및 4b는 활성화된 간 성상 세포 (HSC)로의 miR-15a 또는 miR-412 전달이 정지상태의 것으로 형태의 변화를 유발하였다는 것을 보여준다. 도 4a는 모든 사진이 동일한 배율로 촬영되었을 때 (모든 패널에 대해 동일한 축척 막대), HSC의 크기가 10-100배 감소된 것을 보여준다. 도 4b는 초기 활성화된 HSC에서의 miR-15a 또는 miR-412의 강제 발현이 qPCR로 측정시 알파 평활근 액틴 (Acta2) 및 알파-1 유형 I 콜라겐 (Col1a1)을 하향조절하였다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 5는 miR-15a 또는 miR-412-형질감염된 간 성상 세포 (HSC)가 기능적 표현형을 가진다는 것을 보여준다. miR-15a 또는 miR-412로 처리된 활성화된 HSC는 공동배양된 간세포에서 지방증을 유발하지 않았다. 음성 대조군 마이크로RNA로 처리된 활성화된 HSC는 공동배양된 간세포에서 지방증을 유도하였다. qHSC, 정지 간 성상 세포; Ac-HSC, 활성화된 간 성상 세포; miR-Neg, 마이크로RNA 음성 대조군.
도 6은 miR-15a 또는 miR-412를 받은 활성화된 인간 HSC와 공동배양된 HepG2 세포에서 염증유발 시토카인의 발현이 감소되었다는 것을 보여준다 (좌측 패널). miR-15a 또는 miR-412를 받은 활성화된 인간 HSC와 공동배양된 Huh7 세포는 일부 염증유발 시토카인의 발현이 감소되었다 (우측 패널). 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 7은, miR-15a에 대해서는 유의하지 않았지만, 내인성 miR-15a 및 miR-412가 정지 HSC와 비교하여 활성화된 1차 HSC에서 감소된 발현 수준을 가졌다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 8은 CCl4 챌린지 및 세포 요법 주사에 대한 스케줄의 개략도를 보여준다 (다이어그램). 상단 열: 간이 miRNA 발현을 구동하는 벡터 내로 구축된 GFP 신호를 생성하는 것에 의해 입증된 바와 같이, 비장 내로 주사된 miR-15a 또는 miR-412에 의해 재프로그램화된 정지-유사 HSC는 간 상에 이식되었다. 중간 열: 정지-유사 HSC를 받은 CCl4 챌린지된 마우스는 H&E 염색으로 입증된 바와 같이 감소된 간 아폽토시스 및 염증을 가졌다. 하단 열: 정지-유사 HSC를 받은 CCl4 챌린지된 마우스는 시리우스 레드로 염색된 바와 같이 감소된 간 섬유증을 가졌다. 섬유증의 상대 수준을 정량화하였다. CCl4, HSC 주사 부재 하의 CCl4 위관영양; HSC 대조군, CCl4 위관영양 및 빈 GFP-벡터를 갖는 HSC 주사; HSC miR-15a, CCl4 위관영양 및 miR-15a-GFP-벡터를 갖는 HSC 주사; HSC miR-412, CCl4 위관영양 및 miR-412-GFP-벡터를 갖는 HSC 주사.
도 9는 CCl4로 챌린지된 마우스에서 재프로그램화된 정지-유사 HSC에 의한 세포 요법이 qPCR에 의해 측정시 전체 간 내 알파-1 유형 I 콜라겐 (Col1a1)의 발현을 감소시켰다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 10은 인간 원발성 담즙성 담관염에서의 간 성상 세포가 알파 평활근 액틴 (Acta2)과 공동-국재화된 WISP1을 발현하였다는 것을 보여준다.
도 11은 2개의 예측 WISP1 표적 서열 중 어느 하나를 함유하는 리포터로 공동-형질감염된 miR-15a 모방체가 루시페라제 발현을 감소시킨 한편, 돌연변이된 서열을 함유하는 리포터는 영향이 없었다는 것을 보여주며, 이는 miR-15a가 WISP1 표적 서열 둘 다에 결합한다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다 (**P < 0.01; ***P < 0.001).
도 12는 저배율 및 고배율에서의 정지 HSC를 보여준다 (좌측 칼럼). 고배율 영상은 BODIPY 염색 (삽도)에 의해 녹색 형광을 발하는 여러 지질 액적을 명확하게 보여준다. 우측 칼럼: 저배율 및 고배율에서의 활성화된 HSC. 활성화된 세포는 훨씬 더 크고, 지질 액적이 결여되어 있으며, BODIPY (삽입도)로 염색되지 않는다. HSC, 간 성상 세포.
도 13은 표준 식이 (좌측 칼럼) 및 CDAHFD (우측 칼럼)가 공급된 마우스의 비교를 보여준다. CDAHFD가 공급된 마우스는 3주 내에 초기 NASH가 발생하였으며, 증가된 신체 크기, 육안상 및 현미경상 지방증 간, 및 시리우스 레드 염색에 의한 미량의 섬유증을 보여준다. CDAHFD, 콜린-결핍 L-아미노산 한정 고지방 식이.
도 14는 챌린지되지 않은 마우스로부터의 대조군 간 성상 세포 (HSC) 또는 CDAHFD 챌린지된 NASH 마우스로부터의 HSC와 건강한 간세포 (Hep)의 공동배양을 보여주는 실험의 개략도를 보여준다. 상단 열: 대조군 마우스로부터의 HSC와 공동배양된 간세포는 BODIPY로 염색된 지질 액적이 거의 없다는 것을 보여주었다. 하단 열: NASH 마우스로부터의 HSC와 공동배양된 간세포는 훨씬 더 많은 지질 액적을 보여주었다. CDAHFD, 콜린-결핍 L-아미노산 한정 고지방 식이.
도 15는 NASH 마우스로부터의 간 성상 세포 (HSC)와 공동배양된 간세포가 qPCR에 의해 측정시, 대조군 HSC와 공동배양된 경우보다 더 높은 수준의 여러 염증성 시토카인 및 화학유인물질을 발현하였다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 16은 NASH-간 성상 세포 (HSC)로부터의 조건화 배지가 정상 간세포에 적용되는 경우에 간세포 (Hep)에서의 지방 축적의 유도가 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 상단 열: 정지 HSC (qHSC) 배지를 건강한 간세포에 적용한 경우에, 지방증은 유도되지 않았다. 하단 열: NASH-HSC 배지는 초기 건강한 간세포에서 지방증을 유도하였다. 지질 액적은 BODIPY로 염색되었다.
도 17은 miR-15a 또는 miR-412를 활성화된 간 성상 세포 (AcHSC) 내로 전달하는 것이 자외선 하의 형광에 의해 입증되는 레티노이드 양성인 지질 액적의 재형성을 유도하였다는 것을 보여주며, 이는 정지 간 성상 세포 (qHSC)에서의 경우와 일치한다.
도 18은 다차원 척도법에 의해 분석된 RNA 서열분석 데이터가, miR-15a 또는 miR-412를 받은 정지-유사 HSC가 활성화된 세포보다 정지 HSC에 40-50% 더 가까운 전반적 전사 프로파일을 가졌음을 입증하였다는 것을 보여준다. HSC, 간 성상 세포.
도 19는 miR-15a 또는 miR-412-형질감염된 간 성상 세포 (HSC)가 기능적 표현형을 가진다는 것을 보여준다. 상단 열: miR-15a 또는 miR-412로 처리된 활성화된 HSC는 공동배양된 간세포에서 지방증을 유발하지 않았다. 음성 대조군 마이크로RNA로 처리된 활성화된 HSC는 공동배양된 간세포에서 지방증을 유도하였다. qHSC, 정지 간 성상 세포; Ac-HSC, 활성화된 간 성상 세포; miR-Neg, 마이크로RNA 음성 대조군. 하단 열: NASH의 CDAHFD 모델로부터 수거된 HSC는 공동배양된 간세포에서 지방증을 유도하였다. miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 이들 동일한 HSC는 인접한 간세포에서 지방증을 유도하는 능력을 잃었다.
도 20은 miR-15a 또는 miR-412를 받은 후 간 성상 세포에서의 mRNA 수준이 감소된 유전자 세트를, 예측 알고리즘에 기초한 잠재적인 직접적 표적 세트와 오버레이하여, 진정한 miRNA 표적을 포함할 가능성이 더 큰 표적 후보 세트를 생산한 것을 보여준다. 표적 후보 세트 내의 유전자를 Tgf-베타 또는 Pdgf 신호전달 경로의 일부인 것을 선택함으로써 추가로 필터링하였다.
도 21은 CRISPR 기술이 1차 간 성상 세포에 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 1차 세포에 대한 이러한 기술 사용의 실행가능성을 긴 비코딩 RNA Digit 결실 벡터를 전달함으로써 검증하였다. 동형접합 녹-인은 새로운 PCR 밴드, 즉 퓨로마이신 구축물을 갖는 하나의 대립유전자 및 네오마이신 구축물을 갖는 또 다른 대립유전자의 출현으로 확인된다. Ctl, 대조군 구축물; KI, 녹-인 구축물.
도 22는 >100개의 시토카인, 케모카인 및 세포외 매트릭스 단백질의 단백질 블롯이, CDAHFD가 공급된 마우스로부터의 HSC가 건강한 마우스로부터의 것과 비교하여 WISP1이 상향-분비된 NASH를 유도하였음을 나타냈다는 것을 보여준다. CM, 조건화 배지.
도 23은 활성화된 간 성상 세포 (AcHSC)가 정지 간 성상 세포 (qHSC)보다 거의 30배 더 높은 WISP1을 발현하였다는 것을 보여준다. 간세포 (Hep)도 또한 WISP1을 발현하였지만, 활성화된 간 성상 세포보다는 훨씬 더 적었다. Lv, 전체 간. 데이터는 평균 +/- SD로서 제시된다.
도 24는 WISP1을 과다발현하는 간 성상 세포로부터의 조건화 배지가 건강한 마우스로부터 수거된 간세포에서 지방증을 유도하였다는 것을 보여준다. CM, 조건화 배지.
도 25는 WISP1이 인간 질환에 관여한다는 것을 보여주는 개략도이다.
도 26은 WISP1이 분비 기질세포 단백질의 CCN 패밀리의 구성원이라는 것을 보여주는 개략도이다.
도 27은 간 성상 세포가 간 섬유증의 주요 유도인자라는 것을 보여주는 개략도이다.
도 28은 간 성상 세포 (HSC) 활성화를 보여주는 개략도이다.
도 29a 및 29b는 WISP1이 활성화된 HSC에서 고도로 상향조절되고 miR-15a의 직접적 표적이라는 것을 보여준다. (도 29a) WISP1은 NASH 마우스에서 활성화된 간 성상 세포에 의해 분비되었다. (도 29b) 예측 WISP1 표적 서열을 함유하는 것으로 보고된 공동-형질감염된 miR-15a 모방체는 루시페라제 발현을 감소시켰다.
도 30a-30c는 WISP1 및 Yap1이 서로 상호적으로 활성화시킨다는 것을 보여준다. (도 30a) WISP1 및 YAP mRNA는 qHSC에서 rc-WISP1 처리에 의해 증가되었다. (도 30b) YAP1 활성화는 qHSC에서 rc-WISP1 처리에 의해 유도되었다. (도 30c) WISP1 발현은 miRNA에 의해 재프로그램화된 HSC에서 YAP1 과다발현에 의해 증가되었다.
도 31a 및 31b는 간 및 폐 섬유증에서의 WISP 억제의 역할을 지지하는 기존 문헌을 보여준다. (도 31a) 항-WISP1 mAb는 CCl4-유도된 간 섬유증을 약화시켰다. (도 31b) 항-WISP1 mAb는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 약화시켰다.
도 32a 및 32b는 WISP1 중화 항체가 담관 섬유증을 약화시킨다는 것을 보여준다. (도 32a) WISP1에 대한 중화 항체를 사용한 생체내 처리는 담관 결찰 (BDL) 유도된 간 섬유증을 감소시켰다. (도 32b) 표시된 조건에서의 콜라겐 발현.
도 33a 및 33b는 WISP1이 일반 및 희귀 인간 섬유화 간 질환에서 분비된다는 것을 보여준다. (도 33a) WISP1은 NASH의 HSC에서 상향조절되었다. (도 33b) WISP1은 여러 희귀 섬유화 간 질환의 HSC에서 상향조절되었다.
도 34a 및 34b는 WISP1이 간 염증 및 섬유증에 대한 신규 분비 섬유화 유도인자라는 것을 보여준다. (도 34a) NAFLD 마우스로부터의 활성화된 HSC는 WISP1을 분비한다. (도 34b) WISP1 과다발현-HSC는 건강한 공동-배양된 1차 간세포에서 지방증을 유도한다 (BODIPY 염색).
도 35는 Rc WISP1 처리가 ki67에 의해 측정시 HSC 증식을 가속화시킨다는 것을 보여준다.
도 36은 인간 및 마우스 miR-15a 및 miR-412의 서열 정렬을 보여준다.
도 37a 및 37b는 HSC에 의해 발현된 WISP1이 자기-활성화 자가분비 및 지방증유발 주변분비 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 도 37a는 HSC 증식 및 활성화가 마우스에서 재조합 WISP1 처리에 의해 유도되었다는 것을 보여준다. 도 37b는 대조군 및 RcWisp1의 면역조직화학을 보여준다.
도 38a-38f는 Rc WISP1 및 Wisp IgG가 콜린 결핍, L-아미노산 한정, 고지방 식이 (CDAHFD) 모델-유도된 지방증으로부터 NASH-HSC를 치료하고 섬유증을 예방한다는 것을 보여준다. 1 μg/ml WISP1 항체를 조건화 배지와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, HSC에 적용하였다. 도 38a는 처리 및 샘플링의 타임라인을 보여준다. 도 38b는 대조군, Rc WISP1 처리된 세포 및 Ab WISP1 처리된 세포의 세포 수를 보여준다. 도 38c는 qHSC, 대조군, Rc WISP1 처리된 세포 및 Ab WISP1 처리된 세포의 Acta2 mRNA 발현을 보여준다. 도 38d는 qHSC, 대조군, Rc WISP1 처리된 세포 및 Ab WISP1 처리된 세포의 Col1a1 mRNA 발현을 보여준다. 도 38e는 대조군, Rc WISP1 처리된 세포 및 Ab WISP1 처리된 세포의 면역조직화학을 보여준다. 도 38f는 대조군, Rc WISP1 처리된 세포 및 Ab WISP1 처리된 세포의 BODIPY 염색된 면적 분율의 정량화를 보여준다.
도 39a 및 39b는 WISP1이 HSC 이동을 조정한다는 것을 입증한다. 도 39a는 Rc-WISP1 및 WISP1 IgG의 존재 및 부재 하의 HSC 이동의 영상을 보여준다. 도 39b는 대조군 HSC와 비교한, Rc-WISP1 및 WISP1 IgG로 처리된 HSC의 상대 손상 면적을 보여준다. WISP1 IgG로 처리된 HSC는 24시간 이내에 대조군 HSC와 유사한 상대 손상 면적을 나타냈으며, 이는 WISP1 IgG가 HSC 활성화 및 이동을 방지할 수 있다는 것을 확인시켜 준다.
간 질환 (예를 들어, 원발성 담즙성 담관염 (PBC))은 간내 담관의 진행성 파괴, 담즙정체, 문맥주위 염증, 및 결국 경변성 말기 간 질환으로 종결되는 담관 섬유증으로 이어질 수 있다. 간 질환, 예컨대 PBC는, 유전적 및 환경적 인자 둘 다가 간 질환을 야기할 가능성이 있지만, 불명확한 발병기전을 갖는 자가면역 장애로서 나타날 수 있다.
WISP1은 간의 간 성상 세포 (HSC)가 근섬유모세포로 활성화될 때 그에 의해 분비되는 단백질이다. 자가분비 시스템을 통해, WISP1은 또한 콜라겐의 활성화 및 분비를 가속시켜 섬유증을 촉진함으로써 HSC에 영향을 미친다. 간 질환 (예를 들어 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파1-항트립신 결핍, 비-인간 질환, 비-알콜성 지방간염 및 경피증)에서의 섬유모세포는 WISP1을 고도로 발현한다. 따라서, 이는 WISP1을 억제하는 것이 간의 질환을 치료하는 전략이라는 것을 나타낸다.
간 성상 세포는 동모양혈관주위 공간 (디쎄강으로도 공지됨)에서 발견되는 간의 지방-저장 혈관주위세포이다. 정지 HSC는 세포질 내의 지질 액적의 존재에 의해 구별된다. 간이 손상되면, 성상 세포가 활성화될 수 있다. 활성화된 HSC는 증식하고, 세포질 내에 감소된 지질 액적을 갖는다. 활성화된 HSC는 콜라겐을 분비하는 섬유화유발 근섬유모세포 및 반흔 형성을 촉진하는 매개체가 된다.
본원에 기재된 방법은 WISP1이 HSC에서 상향조절된다는 것을 보여준다. WISP1이 마이크로RNA인 miR-15a 및 miR-412에 의해 억제되는 경우에, 이러한 억제는 독립적으로, 간의 섬유화 진행에서 중추적 역할을 하는 세포 유형인 활성화된 간 성상 세포 (HSC)에서 정지상태를 유도한다. 추가로, miR-15a는 활성화된 HSC에서 WISP1을 직접 표적화하여 이 단백질의 섬유화유발 기능을 억제한다. 마이크로RNA 및 그의 표적을 사용하여 HSC 정지상태를 촉진함으로써, WISP1 억제제는 간 질환, 예컨대 PBC에서 진행성 간 섬유증을 제어하는데 유용한 요법이다.
간 질환의 치료 및/또는 예방
본원에 기재된 방법 및 조성물은 대상체에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용된다. 예시적인 간 질환은 알라질 증후군; 알콜-관련 간 질환; 알파-1 항트립신 결핍; 자가면역 간염; 양성 간 종양; 담도 폐쇄증; 간경변증; 크리글러-나자르 증후군; 갈락토스혈증; 길버트 증후군; 혈색소증; 간성 뇌병증; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 간신 증후군; 임신 중 간내 담즙정체 (ICP); 리소솜 산 리파제 결핍 (LAL-D); 간낭; 간암; 신생아 황달; 비-알콜성 지방간 질환; 비-알콜성 지방간염; 원발성 담즙성 담관염 (PBC); 원발성 경화성 담관염 (PSC); 진행성 가족성 간내 담즙정체 (PFIC); 라이 증후군; 제I형 글리코겐 축적 질환; 경피증; 및 윌슨병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 간 질환은 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 및 경피증이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 간부전, 예를 들어 간 합성 및 대사 기능의 부전을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 전격성 또는 중증 급성 간부전 (예를 들어, 이전에 건강한 개체에서 <8주에 걸쳐 발생하는 뇌병증을 동반한 간부전); 초급성 간부전 (예를 들어, 이전에 건강한 개체에서 <14일에 걸쳐 발생하는 뇌병증을 동반한 간부전); 급성 간부전 (예를 들어, 이전에 건강한 개체에서 <26주에 걸쳐 발생하는 뇌병증을 동반한 간부전); 만성 간부전 (예를 들어, 뇌병증을 동반하지 않는 간부전); 또는 급만성 간부전 (예를 들어, 뇌병증의 발생을 동반한 만성 간부전)을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 숙련된 진료의는 표준 방법, 예를 들어 차일드-퍼 점수 (이는 총 빌리루빈, 알부민, INR, 복수 및 간성 뇌병증의 복합점수임), MELD 점수 (이는 혈청 빌리루빈, 크레아티닌 및 INR을 사용함), 또는 PELD 점수 (이는 MELD와 유사하지만 소아과 환자에 대한 것임), 또는 METAVIR 점수 (이는 샘플에서 섬유증의 수준을 평가함)를 사용하여 간 질환 (예를 들어, 간부전)의 중증도를 평가할 수 있다. METAVIR
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 간 섬유증을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 간 섬유증은, 예를 들어 METAVIR 점수를 사용하여 숙련된 임상의에 의해 진단될 수 있다. METAVIR 점수는 섬유증 점수 및 활성 점수인 2가지 점수를 제공한다. 섬유증 점수는 간에서의 염증의 양 (염증의 강도/조직의 분해)을 기재하는데 사용되며, 예를 들어 F0: 섬유증 부재; F1: 격막이 없는 문맥 섬유증; F2: 소수의 격막이 있는 문맥 섬유증; F3: 간경변증이 없는 수많은 격막; F4: 간경변증이다. 활성 점수는 섬유증 정도가 얼마나 급속하게 진행되는지에 대한 예측이며, 예를 들어 A0: 활성 부재; A1: 경도 활성; A2: 중등도 활성; 및 A3: 중증 활성이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 치료된 대상체는 F1, F2, F3 또는 F4 및/또는 A1, A2, A3의 METAVIR 점수를 갖는다.
또 다른 측면에서, 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재된다.
한 측면에서, 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재된다.
다양한 실시양태에서, WISP1은 표적 세포에서 억제된다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 WISP1을 고도로 발현하고 질환 상태, 예를 들어 간 질환을 유발하는 간 세포이다. 예를 들어, 간 세포는 적절한 대조군, 예를 들어 건강한 비-이환 간 세포와 비교하여 증가된 수준의 WISP1을 발현한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포 내의 WISP1의 mRNA 또는 단백질 수준을 표준 기술을 사용하여, 각각 PCR-기반 검정 또는 웨스턴-블롯팅을 사용하여 평가할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 세포는 간 성상 세포 (HSC)이다. HSC는 간의 동모양혈관주위 공간에서 발견되는 혈관주위세포이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포가 HSC인지를, 예를 들어 염화금에 대한 선택적 염색 또는 세포질 내의 지질 액적의 가시화를 사용하여 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, HSC는 정지 세포이다. 정지 HSC는 비-증식 세포 내의 세포질 내의 지질 액적의 존재에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다. 활성 HSC는 세포의 증식, 세포질 내의 감소된 지질 액적, 및/또는 반흔 형성을 촉진하는 매개체 및 콜라겐의 분비를 평가함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 세포는 섬유모세포, 예를 들어 간 섬유모세포이다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 근섬유모세포이다. 근섬유모세포 세포는 섬유모세포 세포 및 평활근 세포 둘 다의 특징을 갖는다. 섬유모세포 및 근섬유모세포는, 예를 들어 각각 섬유모세포 또는 섬유모세포 및 평활근 세포 마커를, 예를 들어 현미경검사를 통해 선택함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다.
또 다른 측면에서, (a) 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 측정하는 단계; (b) (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계; (c) 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및 (d) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
또 다른 측면에서, (a) 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 측정하는 단계; (b) (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계; (c) 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및 (d) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준을 측정하기 위한 검정은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 mRNA 수준을 평가하기 위한 PCR-기반 검정, 또는 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 단백질 수준을 평가하기 위한 웨스턴-블롯팅을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 참조 수준과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 또는 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배 또는 그 초과만큼 증가된다. 한 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 mRNA 수준이다. 또 다른 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 단백질 수준이다.
본원에 사용된 "참조 수준"은 건강한 대상체, 예를 들어 간 질환을 갖지 않는 대상체의, 그 외 다른 것은 동일한 생물학적 샘플을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 (a) 전에 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 조직 샘플, 백혈구 연층 샘플 (예를 들어, 원심분리 후 높은 수준의 백혈구 및 혈소판을 함유하는 항응고된 혈액 샘플의 분획), 혈청 샘플 또는 간 생검 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 관련 기술분야에 공지된 통상적인 적절한 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플은 생검을 통해 수득될 수 있고, 혈액 샘플은 손가락 채혈 또는 정맥내 채혈로부터 수득될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 이전에 간 질환으로 진단되었거나 또는 이전에 간 질환으로 진단되지 않은 대상체로부터 취해진다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 간 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체, 예를 들어 간 질환에 대한 적어도 1가지 위험 인자, 예를 들어 정상 섭취와 비교하여 증가된 알콜 섭취를 갖는 대상체로부터 취해진다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 (a) 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Acta2 수준을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및 (b) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 (a) 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1, Yap, Col1a1 및/또는 Acta2 수준을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및 (b) 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제 시약을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이다.
WISP1, Yap (NCBI 진 ID 10413), Col1a1 (NCBI 진 ID 1277) 및/또는 Acta2 (NCBI 진 ID 59) 수준을 측정하기 위한 검정은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 mRNA 수준을 평가하기 위한 PCR-기반 검정, 또는 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 단백질 수준을 평가하기 위한 웨스턴-블롯팅을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 검정 (예를 들어, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 mRNA 수준을 평가하기 위한 PCR-기반 검정, 또는 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 단백질 수준을 평가하기 위한 웨스턴-블롯팅)은 WISP1을 억제하는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 시약)를 투여하는 숙련된 진료의에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 검정은 또 다른 개체에 의해 (즉, WISP1을 억제하는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항체 시약)를 투여하는 진료의에 의해서가 아님) 수행될 수 있다. 검정의 결과는 임의의 수단에 의해, 예를 들어 우편 쿠리어, 전화 송신 (예를 들어, 팩스), 전자 송신 (예를 들어, 전자 의료 기록, 전자 메일 (이메일)) 등을 통해 받을 수 있다. 한 실시양태에서, 치료는 검정의 결과를 받은지 임의의 시간 (예를 들어, 적어도 1초, 1분, 1시간, 1일, 1주, 1개월, 1년 또는 그 초과) 후에 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 참조 수준과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 또는 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배 또는 그 초과만큼 증가된다. 한 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 mRNA 수준이다. 또 다른 실시양태에서, WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 수준은 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2 단백질 수준이다.
또 다른 측면에서, 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 임의의 세포 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포를 포함하는 임의의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재된다.
본원에 제공된 또 다른 측면에서, 임의의 항체 또는 항체 시약, 작용제, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포, 조성물, 본원에 기재된 제약 조성물은 대상체에서 간의 섬유증을 치료 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 섬유증, 예를 들어 간 섬유증의 감소를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 임의의 세포 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포를 포함하는 임의의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 섬유증, 예를 들어 간 섬유증을 감소시키는 방법이 본원에 기재된다.
한 실시양태에서, 대상체는 이전에 간 질환을 갖는 것으로 진단되었다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 작용제의 투여 전에 간 질환으로 진단된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 관련 기술분야의 표준 기술을 사용하여 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 진단할 수 있다. 예를 들어, 간 기능 검사로 지칭되는 혈액 검사; 비-침습적 영상화, 예컨대 CT-스캔, 초음파 또는 MRI 스캔; 또는 조직 생검이 있다. 간 기능 검사는 간-특이적 효소, 예를 들어 알라닌 트랜스아미나제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST), 알칼리성 포스파타제 (ALP), 알부민 또는 빌리루빈의 수준을 평가하는 혈액 검사를 지칭한다. 심지어 약간 상승된 수준의 ALT, AST, ALP, 알부민 또는 빌리루빈도 간 질환을 나타낼 수 있다. 간 질환을 평가하기 위한 추가의 검사가 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 차일드-퍼 점수, METAVIR 점수, 및 PELD 및 MELD 점수).
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 표적 세포에서 WISP1 스플라이스 변이체를 억제한다. 예시적인 WISP1 스플라이스 변이체는 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, WISP1을 억제하는 것은 WISP1 활성을 억제하는 것이다. WISP1 활성은 임의의 현재 공지되어 있는, 또는 아직 발견되지 않은, WISP1 유전자 또는 유전자 산물의 기능의 활성일 수 있다. 예를 들어, WISP1은 HSC에서 콜라겐의 활성화 및 분비를 가속시켜 섬유증을 촉진하고, p53-매개 아폽토시스를 약화시키고, 다른 세포 유형에서 TNF-유도된 세포 사멸을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, WISP1 활성은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과만큼 억제된다.
본원에 사용된 "적절한 대조군"은 WISP1 활성의 수준이 본원에 기재된 작용제 또는 조성물에 의해 접촉되지 않은 것 이외에는 동일한 샘플의 수준이거나 또는 작용제 또는 조성물의 투여 전 대상체에서의 WISP1 활성의 수준인 것을 지칭한다. 추가로, 적절한 대조군은 건강한 대상체, 예를 들어 간 질환을 갖지 않는 개체에서의 WISP1 활성의 수준일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 HSC에서 콜라겐의 활성화 및 분비를 측정/평가/정량화함으로써 WISP1 활성의 기능적 판독치를 사용하여 WISP1의 활성을 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, WISP1을 억제하는 것은 세포 내의 WISP1 수준, 예를 들어 유전자 발현 수준 또는 유전자 산물 수준을 억제하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, WISP1 수준은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과만큼 억제된다. 본원에 사용된 "적절한 대조군"은 WISP1의 수준이 본원에 기재된 작용제 또는 조성물에 의해 접촉되지 않은 것 이외에는 동일한 샘플의 수준이거나 또는 작용제 또는 조성물의 투여 전 대상체에서의 WISP1의 수준일 것이다. 추가로, 적절한 대조군은 건강한 대상체, 예를 들어 간 질환을 갖지 않는 개체에서의 WISP1의 수준일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 HSC에서 콜라겐의 활성화 및 분비를 측정/평가함으로써 WISP1 활성의 기능적 판독치를 사용하여 WISP1의 활성을 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 WISP1의 단백질 및 mRNA 수준을, 예를 들어 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 사용하여 평가/측정할 수 있다.
작용제
한 측면에서, WISP1을 억제하는 작용제는 간 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 작용제는 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA이다.
본원에 기재된 작용제는, 예를 들어 투여시 세포 내의 WISP1의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 억제하는 경우에, WISP1을 억제하는데 효과적인 것으로 간주된다.
작용제는, 예를 들어 세포에서 WISP1의 전사 또는 번역을 억제할 수 있다. 작용제는 세포 내의 WISP1의 활성 (예를 들어, WISP1의 발현)을 억제하거나 또는 활성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 이에 따라 활성은 더 이상 발생하지 않거나, 적절하게 더 이상 발생하지 않거나 (예를 들어, 야생형 WISP1 활성과 비교하여), 또는 감소된 비율로 발생함).
한 실시양태에서, 작용제는 miRNA 412 및 miRNA 15a를 제외한다. 또 다른 실시양태에서, 작용제는 임의의 miRNA 412 또는 miRNA 15a 모방체를 제외한다.
작용제는 그것이 투여되는 형태로 직접 기능할 수 있다. 대안적으로, 작용제는 변형되거나 세포내 이용되어 WISP1을 억제하는 어떤 것을 생산할 수 있으며, 예컨대 핵산 서열의 세포 내로의 도입 및 그의 전사에 의해 세포 내에서 WISP1의 핵산 및/또는 단백질 억제제의 생산을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 합성 및 자연-발생 비-단백질성 물질을 비제한적으로 포함하는 임의의 화학물질, 물질 또는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로시클릴 모이어티, 예컨대 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 포함한다. 작용제는 목적하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지될 수 있거나 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 확인될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 작용제는 WISP1을 억제하는 소분자이다. 본원에 사용된 용어 "소분자"는 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 약 10,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 (예를 들어, 헤테로유기 및 유기금속 화합물 포함), 약 5,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 1,000 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 500 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 제약상 허용되는 형태를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 화학적 작용제를 지칭한다.
소분자를 스크리닝하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 목적하는 표적 (예를 들어, WISP1 폴리펩티드)을 고려하여, 예를 들어 WISP1 활성 또는 수준을 억제하는데 효율적인 소분자를 확인하는데 사용될 수 있다.
본원에 제공된 한 측면은 본원에 기재된 WISP1을 억제하는 임의의 작용제를 포함하는 조성물이다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다.
WISP1을 억제하는 폴리펩티드
한 실시양태에서, 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 표적 세포에서 WISP1을 억제하는 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재된다.
용어 "WISP1-결합 폴리펩티드"는 목적하는 관심 항원 (예를 들어, WISP1 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하고 링커 또는 이뮤노글로불린 불변 도메인에 연결된 본원에 기재된 항원 결합 도메인 중 1개 이상을 포함하는 Ig-유사 단백질인 폴리펩티드를 지칭한다. 결합 단백질은 일부 실시양태에서 이중 가변 도메인 (DVD-Ig) 결합 단백질일 수 있다. "링커 폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 1개 이상의 항원 결합 부분을 연결하는데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123)] 참조). 이뮤노글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 출원 2016/0200813의 서열식별번호: 197, 198, 199 및 200을 참조하며, 이 출원은 대표적인 예에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, WISP1을 억제하는 폴리펩티드는 이종이다. 본원에 사용된 "이종"은 숙주 세포, 예를 들어 이종 폴리펩티드를 발현하는 세포에 의해 통상적으로 생산되는 것이 아니라 숙주 세포와 상이한 유기체로부터 유래된 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 WISP1 억제제는, 예를 들어 박테리아 세포로부터 유래되고, 예를 들어 포유동물 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, WISP1을 억제하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-4 또는 6에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 상동이다. 본원에 사용된 용어 "상동성" 또는 "상동"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 표적 염색체 또는 폴리펩티드 상의 상응하는 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 클러스탈W2 또는 메그얼라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 WISP1-결합 단편 또는 폴리펩티드의 핵산 또는 아미노산 서열 (예를 들어, DNA, RNA 또는 아미노산 서열)은 서열이 WISP1의 상응하는 천연 또는 비편집 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 서열) 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 경우에 "상동"인 것으로 간주된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 기재된 임의의 특정한 폴리펩티드의 변이체 (자연 발생 또는 다른 것), 대립유전자, 상동체, 보존적으로 변형된 변이체 및/또는 보존적 치환 변이체가 포괄되는 것으로 추가로 고려된다. 아미노산 서열에 관하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 코딩 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가, 이러한 변경이 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 유발하고 폴리펩티드의 목적하는 활성을 보유하는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시내용과 일치하는 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가적이고 이들을 제외하지 않는다.
소정의 아미노산은 유사한 생리화학적 특징을 갖는 잔기에 의해 대체될 수 있으며, 예를 들어 하나의 지방족 잔기를 또 다른 것으로 치환하거나 (예컨대, 서로 Ile, Val, Leu 또는 Ala), 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 것으로 치환한다 (예컨대, Lys와 Arg 사이; Glu와 Asp 사이; 또는 Gln과 Asn 사이). 다른 이러한 보존적 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환은 널리 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 목적하는 활성, 예를 들어 리간드-매개 수용체 활성 및 천연 또는 참조 폴리펩티드의 특이성이 보유되어 있는지를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정 중 어느 하나에서 시험될 수 있다.
아미노산은 그의 측쇄의 특성의 유사성에 따라 군분류될 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]): (1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H). 대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 특정한 보존적 치환은, 예를 들어; Ala에서 Gly 또는 Ser로; Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Ala 또는 Pro로; His에서 Asn 또는 Gln으로; Ile에서 Leu 또는 Val로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp로; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu로를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 하나의 기능적 단편일 수 있다. 본원에 사용된 "기능적 단편"은 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 검정에 따라 야생형 참조 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%를 보유하는 펩티드의 단편 또는 절편이다. 기능적 단편은 본원에 개시된 서열의 보존적 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 분자의 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 보존적으로 변형된 변이체이다. 보존적 치환 변이체는, 예를 들어 천연 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 본원에서 지칭되는 "변이체"는 천연 또는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 상동이지만, 1개 또는 복수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 또는 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 변이체 폴리펩티드-코딩 DNA 서열은 천연 또는 참조 DNA 서열과 비교하였을 때 뉴클레오티드의 1개 이상의 부가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 비-변이체 폴리펩티드의 활성을 보유하는 변이체 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 서열을 포괄한다. 매우 다양한 PCR-기반 부위-특이적 돌연변이유발 접근법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에 의해 적용될 수 있다.
변이체 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 또는 참조 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일할 수 있다. 천연 서열과 돌연변이체 서열 사이의 상동성의 정도 (퍼센트 동일성)는, 예를 들어 월드 와이드 웹 상에서 이러한 목적을 위해 통상적으로 사용되는 자유롭게 이용가능한 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, 디폴트 설정을 갖는 BLASTp 또는 BLASTn)을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
천연 아미노산 서열의 변경은 관련 기술분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어 천연 서열의 단편에 대한 라이게이션을 허용하는 제한 부위가 플랭킹된 돌연변이체 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정한 유전자좌에 도입될 수 있다. 라이게이션 후에, 생성된 재구축된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유사체를 코딩한다. 대안적으로, 요구되는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정한 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공하기 위해 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적 돌연변이유발 절차가 사용될 수 있다. 이러한 변경을 만드는 기술은 널리 확립되어 있고, 예를 들어 문헌 [Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)]; 및 미국 특허 번호 4,518,584 및 4,737,462 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것을 포함한다. 폴리펩티드의 적절한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 폴리펩티드에 부가되어, 그의 안정성을 개선시키거나 올리고머화를 용이하게 할 수 있다.
WISP1을 억제하는 항체
임의의 실시양태의 한 측면에서, 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 표적 세포에서 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기재된다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 WISP1에 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 시약이다.
또 다른 실시양태에서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약은 WISP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 1-4 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 용어 "항체 시약"은 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 또는 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고 소정의 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 시약은 항체 또는 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 항체 시약은 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 경쇄 (L) 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체 시약"은 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 쇄 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, CDR 및 도메인 항체 (dAb) 단편 (예를 들어, 문헌 [de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39] 참조; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)) 뿐만 아니라 완전 항체를 포괄한다.
항체는 IgA, IgG, IgE, IgD 또는 IgM (뿐만 아니라 그의 하위유형 및 조합)의 구조적 특색을 가질 수 있다. 항체는 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 래트 및 영장류 (인간 및 비-인간 영장류) 및 영장류화 항체를 포함한 임의의 공급원으로부터의 것일 수 있다. 항체는 또한 미디바디, 나노바디, 인트라바디, 인간화 항체, 키메라 항체 등을 포함한다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간화, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항체 시약이다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 폴리클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 치료 용도를 위한 것이다.
본원에 기재된 항-WISP1 항체는 단일특이적 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 용어 "단일특이적 항체"는 특정한 표적, 예를 들어 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체를 지칭한다. 이 용어는 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"을 포함하며, 이는 본원에 사용된 바와 같이 항체가 생성되는 방법과 무관하게 단일 분자 조성의 항체 또는 그의 단편의 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 양 또는 염소)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 한 부분이 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 따라서, "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하도록 조작되거나 설계된 키메라 항체의 형태이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 또는 수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 본원에 사용된 "복합 인간 항체" 또는 "탈면역화 항체"는 가변 도메인으로부터의 T 세포 에피토프를 감소시키거나 제거하도록 설계된 특이적 유형의 조작된 또는 인간화 항체이다.
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "유입"가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 실질적으로 무손상이 아닌 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
특정 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 인트라바디이다. 인트라바디는 세포 내의 표적에 기능적으로 결합하는 세포내 항체이다 (일반적으로, 문헌 [Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986); 및 Rondon and Marasco, Annu Rev Microbiol, 51:257-83 (1997)]; 미국 특허 번호 6,004,940; 및 미국 특허 번호 5,581,829 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 인트라바디 생산 방법은, 예를 들어 WO 2002/086096에 기재된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 항체는 통상적으로 적어도 약 1 mM, 보다 통상적으로 적어도 약 300 μM, 전형적으로 적어도 약 10 μM, 보다 전형적으로 적어도 약 30 μM, 바람직하게는 적어도 약 10 μM 및 보다 바람직하게는 적어도 약 3 μM 또는 더 우수한 KD로 결합할 것이다.
한 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 중화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 비-중화 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 키메라이다. 본원에 사용된 용어 "키메라"는, 항체 또는 항체를 코딩하는 서열과 관련하여 사용된 경우, 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개 이상의 절편 또는 부분을 특징으로 하는 이뮤노글로린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 키메라 항체의 가변 영역은 비-인간 포유동물 항체, 예컨대 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래되고, 이뮤노글로빈 불변 영역은 인간 이뮤노글로빈 분자로부터 유래된다. 키메라 항체의 가변 절편은 전형적으로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것에 연결된다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포, 예컨대 불멸화 B-세포로부터 널리 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다 (WO 87/02671; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역 둘 다를 함유할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 때때로 CH4 영역을 포함할 수 있다. 치료 목적을 위해, CH2 도메인은 결실되거나 생략될 수 있다. "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 (문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)] 참조; 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 예를 들어 마우스 또는 다른 종, 적절한 항원 특이성의 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, WISP1-결합 도메인은 가변 경쇄 서열, 가변 중쇄 서열 또는 둘 다를 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인: CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL인 1개의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 보다 보존된 영역이 사이에 배치되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 이 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 쇄는 통상적으로 디술피드 결합을 통해 서로 연결된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR"), 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 특이적 항원 결합을 위해 존재하는 것이 필요한 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 약 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 약 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 정의된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 분명한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 코티아(Chothia) 및 동료들 (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))은 카바트 CDR 내의 특정 하위-부분이 아미노산 서열의 수준에서의 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 입체형태를 채택한다는 것을 발견하였다. 이들 하위-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로 지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌 [Padlan (FASEB). 9:133-139 (1995)) 및 MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))]에 기재되었다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이며, 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수도 있다. CDR은 또한, 일부 실시양태에서, IMGT에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서 기재될 수 있다. 본원에 사용된 조성물 및 방법은 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있으며, 그럼에도 불구하고 바람직한 실시양태는 IMGT 또는 아비시스(Abysis) 정의된 CDR을 사용한다. CDR의 경계는 이들 넘버링 규정 중 어느 하나에 관하여 명확하다.
이뮤노글로불린 불변 (C) 도메인은 중쇄 (CH) 또는 경쇄 (CL) 불변 도메인을 지칭한다. 뮤린 및 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 중쇄와 관련하여, 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄일 수 있다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 기재된 항체의 중쇄는 인간 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적 예는 관련 기술분야에 기재되었으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,693,780 및 상기 문헌 [Kabat E A et al., (1991)]을 참조한다.
따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 실시양태에서, 항-WISP1은 비-IgG 프레임워크로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "공여자" 및 "공여자 항체"는 1개 이상의 CDR을 제공하는 항체를 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, 공여자 항체는 프레임워크 영역이 수득되거나 유래된 항체와 상이한 종으로부터의 항체이다. 일부 실시양태에서, 공여자 항체는 수용자 항체와 상이한 이소형의 것이다. 인간화 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 1개 이상의 CDR을 제공하는 비-인간 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "수용자" 및 "수용자 항체"는 프레임워크 영역 중 1개 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하는 항체 또는 그를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "수용자"는 불변 영역(들)을 제공하는 항체 아미노산 또는 그를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "수용자"는 프레임워크 영역 및 불변 영역(들) 중 1개 이상을 제공하는 항체 아미노산 또는 그를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 용어 "수용자"는 프레임워크 영역 중 1개 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 또는 그를 코딩하는 인간 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 실시양태에 따르면, 수용자는 인간 항체의 1개 이상의 특정 위치에서 발생하지 않는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용자 프레임워크 영역 및/또는 수용자 불변 영역(들)은, 예를 들어 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능적 항체 (예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 항체, 개발 중인 항체 또는 상업적으로 입수가능한 항체)로부터 유래되거나 수득될 수 있다.
인간 중쇄 및 경쇄 수용자 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 및 경쇄 수용자 서열은 V-염기 (월드와이드 웹 상의 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 발견됨) 또는 IMGT™ 국제 이뮤노제네틱스 인포메이션 시스템(IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM)™ (월드와이드 웹 상의 imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/에서 발견됨)으로부터 열거된 서열로부터 선택된다. 본원에 개시된 기술의 또 다른 실시양태에서, 인간 중쇄 및 경쇄 수용자 서열은 미국 특허 공개 번호 2011/0280800 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 표 3 및 표 4에 기재된 서열로부터 선택된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 일부 실시양태에서 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 부분"을 포함할 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "WISP1-결합 단편"은 항원 (예를 들어, WISP1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다.
항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 이러한 항체 단편 실시양태는 또한 2종 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이적 포맷, 예컨대 이중 가변 도메인 (DVD-Ig) 포맷으로 포함될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 항원-결합 단편의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature, 341: 544-546; PCT 공개 번호 WO 90/05144); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다.
일부 실시양태에서, 항체 시약은 이중특이적 모노클로날 항체이다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가 이중특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123); Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, N.Y. (2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5] 참조). 추가로, 단일 쇄 항체는 또한 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"를 포함한다 (문헌 [Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062]; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 항체 이펙터 기능을 변경시키기 위한 Fc 부분 내의 아미노산 잔기의 대체는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (미국 특허 번호 5,648,260 및 5,624,821). 항체의 Fc 부분은 여러 중요한 이펙터 기능, 예를 들어 시토카인 유도, 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC), 식세포작용, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/클리어런스율을 매개한다. 일부 경우에, 이들 이펙터 기능은 치료 항체에 대해 바람직하지만, 다른 경우에는 치료 목적에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수 있다. 특정 인간 IgG 이소형, 특히 IgG1 및 IgG3은 각각 Fcγ 수용체 및 보체 C1q에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 항체의 순환 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 실시양태에서, 항체의 이펙터 기능이 변경되도록, 항체의 불변 영역, 예를 들어 항체의 Fc 영역에서 적어도 1개의 아미노산 잔기가 대체된다.
본원에 기재된 바와 같은 WISP1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 서열. 이러한 핵산 서열은 또한, 예를 들어 상동 포유동물 (예를 들어, 뮤린) 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 또는 프레임워크 영역에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 본원의 다른 곳에 또한 기재된 바와 같은 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 연결시킴으로써 변형될 수 있다.
이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인 대신 치환될 수 있거나, 또는 이들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인 대신 치환되어 하나의 관심 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 관심 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 WISP1-결합 단편은 그것이 유래된 중쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역 중 1, 2, 3 또는 4개에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역 중 1, 2, 3 또는 4개를 포함한다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열로부터 유래된 중쇄 가변 프레임워크 영역은 10개 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고는 상기 아미노산 서열로 이루어진다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열로부터 유래된 중쇄 가변 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기가 상응하는 비-인간, 영장류 또는 인간 중쇄 가변 프레임워크 영역 내의 유사한 위치에서 발견되는 아미노산 대신 치환된 상기 아미노산 서열로 이루어진다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 또는 영장류 항체의 VH로부터 유래된 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 VH 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 중쇄 CDR 서열과 함께 사용하기 위해 선택된 영장류 또는 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역은 비-인간 모 항체의 중쇄 프레임워크 영역과, 예를 들어 적어도 70% 동일성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 영장류 또는 인간 중쇄 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 본원에 기재된 임의의 항체의 중쇄 프레임워크 영역과 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성 (또는 그 초과)을 갖는 천연 영장류 또는 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역으로부터의 것이다. 구체적 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 중쇄 가변 서브패밀리 (예를 들어, 서브패밀리 1 내지 7 중 하나)로부터 유래된 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 VH 프레임워크 영역을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 측면의 일부 이러한 실시양태에서, 항체 또는 그의 WISP1-결합 단편은 그것이 유래된 경쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역 중 1, 2, 3 또는 4개에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역 중 1, 2, 3 또는 4개를 포함한다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열로부터 유래된 경쇄 가변 프레임워크 영역은 10개 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고는 상기 아미노산 서열로 이루어진다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열로부터 유래된 경쇄 가변 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기가 상응하는 비-인간, 영장류 또는 인간 경쇄 가변 프레임워크 영역 내의 유사한 위치에서 발견되는 아미노산 대신 치환된 상기 아미노산 서열로 이루어진다. 본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 또는 영장류 항체의 VL로부터 유래된 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 VL 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 경쇄 CDR 서열과 함께 사용하기 위해 선택된 영장류 또는 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역은 비-인간 모 항체의 경쇄 프레임워크 영역과, 예를 들어 적어도 70% 동일성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 영장류 또는 인간 경쇄 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 본원에 기재된 임의의 항체의 경쇄 프레임워크 영역과 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성 (또는 그 초과)을 갖는 천연 영장류 또는 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 경쇄 가변 카파 서브패밀리로부터 유래된 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 VL 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 경쇄 가변 람다 서브패밀리로부터 유래된 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 VL 프레임워크 영역을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 VH (예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 및/또는 VL (예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 영역에 따른 1개 이상의 CDR의 위치는, 관심 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로 유지되는 한, 예를 들어 그것이 유래된 원래 항체의 결합의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%로 유지되는 한), 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 위치만큼 달라질 수 있다, 즉 더 짧거나 더 길 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CDR을 정의하는 위치는, 관심 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로 유지되는 한, 예를 들어 그것이 유래된 원래 항체의 결합의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%로 유지되는 한), 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 CDR 위치에 비해 CDR의 N-말단 및/또는 C-말단 경계를 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산만큼 이동시킴으로써 달라질 수 있다, 즉 더 짧거나 더 길 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 VH (예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 및/또는 VL (예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3) 영역에 따른 1개 이상의 CDR의 길이는, 관심 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로 유지되는 한, 예를 들어 그것이 유래된 원래 항체의 결합의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%로 유지되는 한), 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산만큼 달라질 수 있다 (예를 들어, 더 짧거나 더 길 수 있음).
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가 본원에 기재된 임의의 항체 또는 그의 단편의 Fc 영역 (예를 들어, CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 힌지 영역, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예를 들어, 카바트에서의 EU 인덱스)에 따름) 내로 도입되어 항체의 1개 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시킨다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 5,677,425에 기재된 바와 같이, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가 Fc 영역 (CH1 도메인)의 힌지 영역 내로 도입되어 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록 (예를 들어, 증가 또는 감소되도록) 한다. CH1 도메인의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 변경되어, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)시킬 수 있다.
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 1, 2개 또는 그 초과의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환)가 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 Fc 영역 (예를 들어, CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 힌지 영역, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예를 들어, 카바트에서의 EU 인덱스)에 따름) 내로 도입되어 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체 (예를 들어, 활성화된 Fc 수용체)에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소 또는 증가시키는 항체 또는 그의 단편의 Fc 영역 내의 돌연변이 및 이러한 돌연변이를 Fc 수용체 또는 그의 단편 내로 도입하기 위한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체의 친화도를 변경시키기 위해 이루어질 수 있는 항체의 Fc 수용체 내의 돌연변이의 예는, 예를 들어 문헌 [Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186], 미국 특허 번호 6,737,056 및 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631 (이들은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
용어 "CDR-그라프트된 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 1개 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예컨대 인간 CDR 중 1개 이상 (예를 들어, CDR3)이 마우스 CDR 서열로 대체된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 본원에 기재된 CDR-그라프트된 항체는 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 1개 이상이 본원에 기재된 비-인간 항체의 CDR 서열로 대체된 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본원에 기재된 항-WISP1 항체는 치료 용도를 위한 개선된 결합 특이성 또는 약동학적 특성을 위해 조작될 수 있다. 결합 특이성은, 예를 들어 항원 (예를 들어, WISP1 또는 그의 폴리펩티드 단편)을 사용하는 경쟁 검정에 의해, 1종 이상의 비관련 또는 상이한 항원과의 경쟁과 비교하여 검정될 수 있다. 다양한 면역검정 포맷이 WISP1에 특이적으로 결합하는 작용제, 항체 또는 다른 리간드를 선택하는데 적절하다. 특이적 결합은, 예를 들어 본원에 기재된 작용제 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 항-WISP1 항체)의 친화도 및 결합력 및 작용제의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 작용제가 임의의 적합한 방법, 예컨대 적합한 결합 검정에서의 작용제의 적정을 사용하여 WISP1에 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "주요" 잔기는 항체, 특히 인간화 항체의 결합 특이성 및/또는 친화도에 다른 것보다 더 큰 영향을 미치는 가변 도메인 내의 특정 잔기를 지칭한다. 주요 잔기는 CDR에 인접한 잔기, 잠재적 글리코실화 부위 (N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있음), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 정규 잔기, 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 사이의 접촉 잔기, 버니어 구역 내의 잔기, 및 가변 중쇄 CDR의 코티아 정의와 제1 중쇄 프레임워크의 카바트 정의 사이에 중첩되는 영역 내의 잔기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 항-WISP1 항체는 조작된 항체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 유전자좌는 자연에서는 그 유전자좌에서 그 순서로 함께 연결되지 않는 2개 이상의 서열이 인간의 손에 의해 조작되어 조작된 유전자좌에서 서로 직접 연결되는 경우에 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 조작된 유전자좌는 비-천연 V 절편을 갖는 다양한 Ig 서열을 포함하며, 이들 모두는 자연에서 발견되지만 동일한 유전자좌에서 발견되지 않거나 또는 자연에서 유전자좌에서 그 순서로 발견되지 않는다. 통상의 관행에 따라 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오티드 (및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 동물)의 자손 및 카피는 실제 조작이 선행 물질에 대해 수행되었더라도 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
WISP1-결합 폴리펩티드, 항체, 항체 시약 또는 그의 항원-결합 부분은 항체 항원-결합 부분과 1개 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된, 보다 큰 면역부착 분자 또는 분자의 조성물의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용 (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibod. Hybridomas 6:93-101), 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. 항체 부분, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 전체 항체로부터 통상적인 기술, 예컨대 전체 항체의 각각 파파인 또는 펩신 소화를 사용하여 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 그의 항원-결합 부분 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 표적 결합 단백질, 예컨대 항체의 항원-결합 부분은 또한 이중 가변 도메인 (DVD-Ig)의 일부일 수 있다.
임의의 특정한 표적 항원 (예를 들어, WISP1)에 대해 치료적이고/거나 특이적인 항체 및 항체 시약은 공지된 항체 또는 항체 시약으로부터, 예를 들어 FDA-승인된 치료 항체 시약 및/또는 카탈로그에 열거된 상업적으로 입수가능한 항체 시약으로부터 그의 표적 특이성에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 항-WISP1 항체 또는 아직 발견되지 않은 임의의 항-WISP1 항체이다. 관련 기술분야에 공지된 예시적인 항-WISP1 항체는 압캠(Abcam)에 의해 판매되는 항-WISP1 항체 (예를 들어, ab60114; ab65943), 알앤디 시스템즈(RND Systems)에 의해 판매되는 항체 (예를 들어, mab1680), 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에 의해 판매되는 항체 (예를 들어, SAB2501114)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 하기 표 1 (항체 표)로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 서열식별번호: 12-120의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
표 1: 항체 표 (항-WISP1)
Figure pct00001
Figure pct00002
*서열은 아비시스로부터 입수하였으며, 월드-와이드 웹 상의 <abysis.org>에서 이용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체는 임의의 공지된 또는 아직 발견되지 않은 비-인간 항-WISP1 항체로부터 유래된 인간화 항-WISP1 항체이다.
한 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 WISP1을 코딩하는 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)에 상응하는 아미노산 서열에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합하거나; 또는 서열식별번호: 1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-WISP1 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 1의 전체 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 1의 서열의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합하며, 여기서 단편은 그의 표적, 예를 들어 WISP1에 결합하고 WISP1 수준 및/또는 활성의 억제를 유발하기에 충분하다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 다양한 인간 WISP1 이소형을 코딩하는 아미노산 서열 (서열식별번호: 2, 3 또는 4)에 상응하는 아미노산 서열에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항-WISP1 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 2, 3 또는 4의 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합하거나; 또는 서열식별번호: 2, 3 또는 4의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-WISP1 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 2, 3 또는 4의 전체 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 2, 3 또는 4의 서열의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합하며, 여기서 단편은 그의 표적, 예를 들어 WISP1에 결합하고 WISP1 수준 및/또는 활성의 억제를 유발하기에 충분하다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 마우스 WISP1을 코딩하는 아미노산 서열 (서열식별번호: 6)에 상응하는 아미노산 서열에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 6의 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합하거나; 또는 서열식별번호: 6의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-WISP1 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 6의 전체 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 6의 서열의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합하며, 여기서 단편은 그의 표적, 예를 들어 WISP1에 결합하고 WISP1 수준 및/또는 활성의 억제를 유발하기에 충분하다.
따라서, 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 12-120의 가변 중쇄 및 경쇄 서열에 의해 코딩되는 1개 이상의 CDR을 포함하는 1개 이상의 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체가 본원에 기재된다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약 CDR은 서열식별번호: 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
달리 말하면, 일부 실시양태에서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약은 서열식별번호: 1-4, 6 또는 서열식별번호: 12-120에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 상동이다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 WISP1-결합 단편 또는 항-WISP1 항체의 핵산 또는 아미노산 서열 (예를 들어, DNA, RNA 또는 아미노산 서열)은 서열이 WISP1에 특이적으로 결합하는 항체의 상응하는 천연 또는 비편집 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 서열) 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 경우에 "상동"으로 간주된다.
본원에 제공된 한 측면은 본원에 기재된 항-WISP1 항체 또는 항체 시약 중 임의의 것을 포함하는 조성물이다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다.
WISP1을 억제하는 핵산
한 실시양태에서, WISP1을 억제하는 작용제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 mRNA 서열, 예컨대 마이크로RNA의 것에 상보적인 합성된 핵산 서열을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 DNA 또는 RNA 표적에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 수준에서 발현을 중단시킴으로써 이러한 표적의 발현을 차단하도록 설계된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 조건 하에 유전자, 예를 들어 WISP1에 혼성화하도록 설계된 상보적 핵산 서열이다. 따라서, 표적에 충분히 상보적인, 즉 세포 환경과 관련하여 충분히 잘 및 충분한 특이성으로 혼성화하여 목적하는 효과를 제공하는 올리고뉴클레오티드가 선택된다. 예를 들어, WISP1을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 WISP1 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 5) 또는 마우스 WISP1 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 7)의 코딩 서열의 한 부분에 상보적인 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개 또는 그 초과의 염기를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, WISP1은 아연 핑거 뉴클레아제, TALENS, 메가뉴클레아제 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 게놈 편집 시스템을 사용하여 세포의 게놈으로부터 고갈된다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 세포의 게놈 내로 혼입시키는데 사용되는 게놈 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이 아니며; 이는 소량의 Cas 효소/단백질을 보유하는 세포에서 바람직하지 않은 세포 사멸을 방지할 수 있다. 또한, Cas 효소 또는 sgRNA는 각각 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 발현되고, 이에 의해 각각의 시간적 발현이 이러한 간섭을 방지하게 하는 것으로 본원에서 고려된다.
1개 이상의 sgRNA를 코딩하는 핵산 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 각각 생체내 투여될 필요가 있는 경우에, 아데노바이러스 연관 벡터 (AAV)의 사용이 구체적으로 고려된다. 핵산을 게놈 편집/단편화 시스템의 두 성분 (예를 들어, sgRNA, RNA-가이드 엔도뉴클레아제)에 동시에 전달하기 위한 다른 벡터는 렌티바이러스 벡터, 예컨대 엡스타인 바르, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 B형 간염 바이러스 (HBV)를 포함한다. RNA-가이드 게놈 편집 시스템의 각각의 성분 (예를 들어, sgRNA 및 엔도뉴클레아제)은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 또는 본원에 기재된 바와 같은 개별 벡터에 전달될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 RNA 억제에 의해 WISP1을 억제한다. 소정의 유전자의 발현의 억제제는 억제 핵산일 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 억제 RNA (iRNA)이다. RNAi는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
iRNA는 siRNA, shRNA, 내인성 마이크로RNA (miRNA) 또는 인공 miRNA일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 표적, 예를 들어 WISP1의 발현 및/또는 활성의 억제를 가져온다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 작용제는 WISP1을 억제하는 siRNA이다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 작용제는 WISP1을 억제하는 shRNA이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 공중 이용가능한 설계 도구를 사용하여, WISP1을 표적화하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 설계할 수 있을 것이다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 통상적으로 다마콘(Dharmacon) (콜로라도주 레이파예트) 또는 시그마 알드리치 (미주리주 세인트 루이스)와 같은 회사를 사용하여 제조된다.
임의의 측면의 일부 실시양태에서, iRNA는 dsRNA일 수 있다. dsRNA는 dsRNA가 사용될 조건 하에 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하기에 충분히 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥 (안티센스 가닥)은 표적 서열에 실질적으로 상보적이고 일반적으로는 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 표적의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥이 적합한 조건 하에 조합되는 경우에 혼성화하고 듀플렉스 구조를 형성한다.
iRNA의 RNA는 안정성 또는 다른 유익한 특징을 증진시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명에서 특색화된 핵산은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법, 예컨대 문헌 ["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 WISP1을 억제하는 miRNA이다. 마이크로RNA는 평균 길이가 22개 뉴클레오티드인 소형 비-코딩 RNA이다. 이들 분자는 통상적으로 3' 비번역 (3'UTR) 영역에서 mRNA 분자 내의 상보적 서열에 결합하여, 표적 mRNA 분해 또는 억제된 mRNA 번역을 촉진함으로써 작용한다. 마이크로RNA와 mRNA 사이의 상호작용은 불완전 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통해 mRNA에 대한 서열-특이적 결합을 지시하는 마이크로RNA의 6-8개-뉴클레오티드 영역인 "시드 서열"로 공지된 것에 의해 매개된다. 900종 초과의 마이크로RNA가 포유동물에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. 이들 중 다수는 그의 시드 서열에 기초하여 패밀리로 군분류되고, 이에 의해 유사한 마이크로RNA의 "클러스터"를 확인할 수 있다. miRNA는 세포에서, 예를 들어 네이키드 DNA로서 발현될 수 있다. miRNA는 세포에서, 예를 들어 네이키드 DNA로서 발현되는 핵산에 의해 코딩될 수 있거나 또는 벡터 내에 함유된 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
한 실시양태에서, WISP1을 하향조정하는 작용제는 miRNA-15a이다. miRNA-15a는 간을 포함한 다수의 기관에서 유전자 발현을 조절하는 비-코딩 RNA이다. miRNA-15a 서열은 다수의 종에 대해 공지되어 있으며, 예를 들어 인간 miRNA-15a, 예를 들어 miRBase 수탁 번호 MI0000069, 및 마우스 miRNA-15a, 예를 들어 miRBase 수탁 번호 MI0000564이다. 인간 miRNA-15a는 서열식별번호: 8의 서열을 포함한다. miRNA-15a는 인간 miRNA-15a, 그의 자연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. 예를 들어, miRNA-15a는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 마우스 miRNA-15a일 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제, 예를 들어 miRNA-15A는 서열식별번호: 8의 서열에 상응하는 서열을 갖거나; 또는 서열식별번호: 8의 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 8의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 작용제, 예를 들어 miRNA-15a는 서열식별번호: 10의 서열에 상응하는 서열을 갖거나; 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 10의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, WISP1을 하향조정하는 작용제는 miRNA-412이다. miRNA-412 서열은 다수의 종에 대해 공지되어 있으며, 예를 들어 인간 miRNA-412, 예를 들어 miRBase 수탁 번호 MI0001464, 및 마우스 miRNA-412, 예를 들어 miRBase 수탁 번호 MI0001164이다. 인간 miRNA-412는 서열식별번호: 9의 서열을 포함한다. miRNA-412는 인간 miRNA-15a, 그의 자연 발생 변이체, 분자 및 대립유전자를 지칭할 수 있다. 예를 들어, miRNA-15a는 서열식별번호: 11의 서열을 갖는 마우스 miRNA-412일 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제, 예를 들어 miRNA-412는 서열식별번호: 9의 서열에 상응하는 서열을 갖거나; 또는 서열식별번호: 9의 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 9의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 작용제, 예를 들어 miRNA-412는 서열식별번호: 11의 서열에 상응하는 서열을 갖거나; 또는 서열식별번호: 11의 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 11의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
작용제는, 예컨대 RNAi 분자 (예를 들어 siRNA 또는 miRNA)를 사용하여 표적 유전자 (예를 들어, WISP1)의 유전자 침묵을 유발할 수 있다. 이는 작용제의 부재 하에 세포에서 발견되는 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%만큼 표적에 대한 세포 내의 mRNA 수준의 감소를 수반한다. 한 바람직한 실시양태에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%만큼 감소된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 세포 내로 형질감염시키고 웨스턴-블롯팅 또는 PCR-기반 검정을 통해 세포 내에서 발견되는 유전자 (예를 들어, WISP1)의 수준을 검출함으로써, siRNA, shRNA 또는 miRNA가, 예를 들어 WISP1을 그의 하향조절을 위해 표적화하는데 효과적인지 여부를 용이하게 평가할 수 있을 것이다.
작용제는 벡터 내에 함유될 수 있고, 따라서 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 외인성 유전자를 표적 포유동물 세포 내로 전달하는데 유용한 많은 이러한 벡터가 이용가능하다. 벡터는 에피솜, 예를 들어 플라스미드, 바이러스-유래 벡터, 예컨대 시토메갈로바이러스, 아데노바이러스 등일 수 있거나, 또는 상동 재조합 또는 무작위 통합을 통해 표적 세포 게놈 내로 통합될 수 있다 (예를 들어, 레트로바이러스-유래 벡터, 예컨대 MMLV, HIV-1, ALV 등). 일부 실시양태에서, 레트로바이러스와 적절한 패키징 세포주의 조합이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 캡시드 단백질은 표적 세포를 감염시키는데 기능적일 것이다. 통상적으로, 세포 및 바이러스는 배양 배지에서 적어도 약 24시간 동안 인큐베이션될 것이다. 이어서, 세포를 일부 적용에서 짧은 간격, 예를 들어 24-73시간 동안 또는 적어도 2주 동안 배양 배지에서 성장하도록 하고, 분석 전 5주 이상 동안 성장하도록 할 수 있다. 통상적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 생산적 감염에 요구되는 바이러스 단백질을 생산할 수 없는 "결함성"이다. 벡터의 복제는 패키징 세포주에서의 성장을 요구한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 본원에 사용된 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 회합되는 경우에 복제가 가능하고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포괄한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된, 그 안에 함유된 핵산 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드 (예를 들어, WISP1 억제제)의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현되는 서열은 반드시는 아니지만 종종 세포에 대해 이종일 것이다. 발현 벡터는 추가의 요소를 포함할 수 있고, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 따라서 그것이 2종의 유기체에서, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포에서 및 클로닝과 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지되도록 할 수 있다. 용어 "발현"은 RNA 및 단백질을 생산하는데 및 적절한 경우, 단백질을 분비하는데 수반되는 세포 과정을 지칭하며, 이는 적용가능한 경우에, 예를 들어 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 경우에 시험관내 또는 생체내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열 (DNA)을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 앞 및 뒤의 영역, 예를 들어 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열, 뿐만 아니라 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
통합 벡터는 그의 전달된 RNA/DNA가 숙주 세포 염색체 내로 영구적으로 혼입되도록 한다. 비-통합 벡터는 에피솜으로 남아있으며, 이는 그 안에 함유된 핵산이 숙주 세포 염색체 내로 통합되지 않는다는 것을 의미한다. 통합 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 하이브리드 아데노바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다.
비-통합 벡터의 한 예는 비-통합 바이러스 벡터이다. 비-통합 바이러스 벡터는 그의 게놈을 숙주 DNA 내로 혼입시키지 않기 때문에 통합 레트로바이러스에 의해 제기되는 위험을 제거한다. 한 예는 자기-복제를 제한할 수 있고 포유동물 세포에서 기능하는 것으로 공지된 엡스타인 바르 oriP/핵 항원-1 ("EBNA1") 벡터이다. 엡스타인-바르 바이러스로부터의 2종의 요소인 oriP 및 EBNA1을 함유함에 따라, 바이러스 레플리콘 영역 oriP에 대한 EBNA1 단백질의 결합은 포유동물 세포에서 플라스미드의 비교적 장기간 에피솜 존재를 유지한다. oriP/EBNA1 벡터의 이러한 특정한 특색은 벡터가 무통합 iPSC를 생성하는데 이상적이도록 한다. 또 다른 비-통합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
또 다른 비-통합 바이러스 벡터는 RNA 센다이 바이러스 벡터이며, 이는 감염된 세포의 핵에 진입하지 않으면서 단백질을 생산할 수 있다. F-결핍 센다이 바이러스 벡터는 몇몇 계대 동안 감염된 세포의 세포질에 남아있지만, 여러 계대 (예를 들어, 10회 계대) 후에 신속하게 희석되고 완전히 상실된다.
비-통합 벡터의 또 다른 예는 미니서클 벡터이다. 미니서클 벡터는 플라스미드 백본이 방출되어 발현되어야 할 진핵 프로모터 및 cDNA(들)만을 남긴 원형화 벡터이다.
본원에 사용된 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 1종의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로 패키징되는 능력을 갖는 핵산 벡터 구축물을 지칭한다. 바이러스 벡터는 비-필수 바이러스 유전자 대신에 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내 또는 생체내에서 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
조작된 간 성상 세포 (HSC)
한 측면에서, 간 성상 세포를 본원에 기재된 WISP1을 억제하는 임의의 작용제와 접촉시키는 단계 및 세포를 작용제의 발현이 가능하도록 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 간 성상 세포 또는 그의 집단을 생성하는 방법이 본원에 기재된다.
한 실시양태에서, 세포는 정지 세포이다. 정지 세포를 확인하는 방법은 본원 상기에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 접촉은 세포를 작용제 또는 작용제를 코딩하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 접촉은 형질도입, 뉴클레오펙션, 전기천공, 직접 주사 (예를 들어, HSC 내로) 및/또는 형질감염을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 세포를 본원에 기재된 작용제와 접촉시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 miRNA이다. 한 실시양태에서, miRNA는 miRNA-15a 또는 miRNA412이다.
한 실시양태에서, 세포는 표준 배양 조건 하에 20% (중량/부피) 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% (중량/부피) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 배양된다.
한 실시양태에서, 세포는 작용제의 발현이 가능하도록 적어도 1시간 동안 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 작용제의 발현이 가능하도록 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144시간 또는 그 초과 동안 배양된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야의 표준 기술, 예를 들어 miRNA 발현을 검출하기 위한 PCR-기반 검정을 사용하여 작용제가 배양 후 세포 내에서 발현되는지 여부를 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 작용제를 일시적으로 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 작용제의 발현은 세포의 게놈 내로 통합되어, 예를 들어 세포의 자손이 작용제를 발현한다.
한 측면은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 HSC를 포함하는 세포주를 제공한다. WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 HSC는, 예를 들어 치료, 예를 들어 간 질환에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 제약상 허용되는 담체 중에 존재할 수 있다.
또 다른 측면은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 HSC의 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
조성물 및 제약 조성물
한 측면에서, 본원에 기재된 임의의 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 한 측면에서, 본원에 기재된 임의의 작용제를 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다.
또 다른 측면에서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 제약 조성물은 본원에 기재된 적어도 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 WISP1을 억제하는 siRNA 및 항-WISP1 항체 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 2종의 항-WISP1 항체-시약을 포함할 수 있다.
임의의 측면의 한 실시양태에서, 조성물은 간 질환의 치료 또는 예방을 위해 제제화된다. 본원에 기재된 방법의 임상 용도를 위해, 본원에 기재된 WISP1을 억제하는 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 시약 또는 그의 WISP1-결합 단편)의 투여는 비경구 투여, 예를 들어 정맥내; 점막, 예를 들어 비강내; 안구 또는 다른 투여 방식을 위한 제약 조성물 또는 제약 제제로의 제제화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 대상체에서 효과적인 치료를 유발하는 임의의 제약상 허용되는 담체 화합물, 물질 또는 조성물과 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 제약 제제는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 1종 이상의 제약상 허용되는 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
어구 "제약상 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하게 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 담체"는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 안정성, 용해도 또는 활성을 유지하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 매질, 캡슐화 물질, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 관점에서 "허용되는" 것이어야 한다. 용어 "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 기재된 WISP1의 작용제 또는 억제제의 치료 제제는 목적하는 순도를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예시적인 동결건조 항체 제제는 WO 97/04801 (명백하게 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
임의로, 그러나 바람직하게는, 본원에 기재된 조성물을 포함하는 제제는 제약상 허용되는 염, 전형적으로, 예를 들어 염화나트륨을, 바람직하게는 약 생리학적 농도로 함유한다. 임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존제 농도는 전형적으로 v/v로, 0.1 내지 2.0%의 범위이다. 적합한 보존제는 제약 기술분야에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤 및 프로필파라벤이 보존제의 예이다. 임의로, 본 발명의 제제는 0.005 내지 0.02% 농도의 제약상 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 시약 및 그의 WISP1-결합 단편)를 포함하는 조성물의 치료 제제는 또한 치료될 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 대안적으로, 조성물은, 예를 들어 세포독성제, 시토카인 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
본원에 기재된 작용제를 포함하는 조성물의 치료 제제의 활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 지질 비히클을 추가로 포함한다. 예시적인 지질 비히클은 리포솜, 미셀, 엑소솜, 지질 에멀젼 및 지질-약물 복합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 입자 또는 중합체-기재 비히클을 추가로 포함한다. 예시적인 입자 또는 중합체-기반 비히클은 나노입자, 마이크로입자, 중합체 마이크로구체 또는 중합체-약물 접합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 지속-방출 제제가 사용될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 초과 동안 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 장시간 동안 남아있는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에의 노출로 인해 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 가능한 변화를 유발할 수 있다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 발견되는 경우에, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 생체내 투여, 예컨대 비경구 투여에 사용될 치료 제제는 멸균될 수 있으며, 이는 멸균 여과 막을 통한 여과 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법에 의해 용이하게 달성된다.
투여
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 간 질환을 갖는 대상체는 현행 상태 진단 방법을 사용하여 의사에 의해 확인될 수 있다. 간 질환을 특징화하고 진단을 보조하는 이러한 간 질환의 증상 및/또는 합병증은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 피로, 체중 감소, 통증, 피부 및/또는 눈의 황변 및 암뇨를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 간 질환의 진단을 보조할 수 있는 검사는 혈액 검사, 비-침습적 영상화 및/또는 조직 생검을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 간 질환의 가족력은 또한 대상체가 상태를 가질 가능성이 있는지를 결정하거나 또는 간 질환의 진단을 내리는 것을 보조할 것이다.
본원에 기재된 (예를 들어, WISP1을 억제하는) 작용제 및 조성물은 간 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 간 질환의 적어도 1종의 증상을 완화시키기 위해 대상체에게 유효량의 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "간 질환의 적어도 1종의 증상을 완화시키는"은 간 질환과 연관된 임의의 상태 또는 증상 (예를 들어, 피로, 체중 감소, 통증, 피부 및/또는 눈의 황변 또는 암뇨)을 호전시키는 것이다. 동등한 비처리 대조군과 비교하여, 이러한 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정시 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과만큼이다. 대상체에게 본원에 기재된 작용제 및 조성물을 투여하기 위한 다양한 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 전신으로 또는 국부로 (예를 들어, 간에) 투여된다. 한 실시양태에서, 작용제는 정맥내로 투여된다. 한 실시양태에서, 작용제는 연속적으로, 간격을 두고 또는 산발적으로 투여된다. 작용제의 투여 경로는 전달될 작용제의 유형 (예를 들어, miRNA, 세포 또는 RNAi)에 대해 최적화될 것이고, 숙련된 진료의에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 작용제 및 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 대상체에서 효과적인 치료를 유발하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "투여하는" 및 "도입하는"은 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기재된 작용제 또는 제약 조성물 (예를 들어, 항체, 항체 시약 또는 그의 WISP1-결합 단편)을 대상체 내로, 이러한 작용제를 목적하는 부위, 예컨대 감염 또는 암의 부위에 적어도 부분적으로 국재화시키는 방법 또는 경로에 의해 배치하여, 목적하는 효과(들)가 생성되도록 하는 것을 지칭한다. 작용제 또는 제약 조성물은 작용제를 전신으로 또는 목적하는 표면 또는 표적으로 전달하는 임의의 투여 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있고, 주사, 주입, 점적주입 및 흡입 투여를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 작용제가 장에서 불활성화로부터 보호될 수 있는 경우, 경구 투여 형태가 또한 고려된다. "주사"는, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 뇌실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
작용제 (예를 들어, 항체, 항체 시약 및 그의 WISP1-결합 단편)는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여된다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 특정한 장애, 치료될 특정한 대상체, 개별 대상체의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여될 작용제의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우되고, 암을 호전, 치료 또는 안정화시키거나; 진행까지의 시간 (무진행 생존 기간)을 증가시키거나, 또는 간 질환의 발생 또는 재발을 치료 또는 예방하는데 필요한 최소량을 지칭한다. 작용제는, 일부 실시양태에서, 예를 들어 감염을 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 임의로 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 작용제 (예를 들어, 항체 및 그의 WISP1-결합 단편)의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원 상기에 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 상기 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
투여량
본원에 기재된 바와 같은 간 질환의 치료를 위해, 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 시약 또는 그의 WISP1-결합 단편)의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 간 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 작용제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료 적응증, 대상체의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 작용제는 적합하게는 대상체에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 조합 치료 요법에서, 본원에 기재된 작용제 및 1종 이상의 추가의 치료제는 치료 유효량 또는 상승작용적 양으로 투여된다.
본원에 사용된 "단위 투여 형태"는 적합한 1회 투여를 위한 투여량을 지칭한다. 예로서 단위 투여 형태는 전달 장치, 예를 들어 시린지 또는 정맥내 점적 백에 배치된 치료제의 양일 수 있다. 한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 단일 투여로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 1개 초과의 단위 투여 형태가 동시에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 작용제의 투여량은 의사에 의해 결정되고, 관찰된 치료 효과에 적합하도록 필요에 따라 조정될 수 있다. 치료 지속기간 및 빈도와 관련하여, 숙련된 임상의는 치료가 치료 이익을 제공하고 있는 때를 결정하기 위해 및 추가의 세포를 투여할지, 치료를 중단할지, 치료를 재개할지 또는 치료 요법에 대해 다른 변경을 행할지 결정하기 위해 대상체를 모니터링하는 것이 전형적이다. 투여량은 유해 부작용, 예컨대 시토카인 방출 증후군을 유발할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태 및 성별에 따라 달라질 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 또한 임의의 합병증의 경우에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
치료제에 대한 투여량 범위는 효력에 좌우되고, 목적하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 양을 포괄한다. 투여량은 허용되지 않는 유해 부작용을 유발할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태 및 성별에 따라 달라질 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 또한 임의의 합병증의 경우에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 0.001 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중의 범위이다. 일부 실시양태에서, 용량 범위는 5 μg/kg 체중 내지 100 μg/kg 체중이다. 대안적으로, 용량 범위는 1 μg/mL 내지 1000 μg/mL의 혈청 수준을 유지하도록 적정될 수 있다. 전신 투여를 위해, 대상체에게 치료량, 예컨대, 예를 들어 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과가 투여될 수 있다. 이들 용량은 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 상기 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어 간 질환이 치료될 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다.
조합 요법
한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제 또는 조성물은 단독요법으로서 사용된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 간 질환을 위한 다른 공지된 작용제 및 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "조합되어" 투여되는 것은, 대상체가 장애를 앓는 과정 동안 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체에게 전달되는 것, 예를 들어 대상체가 장애 (간 질환)로 진단된 후 및 장애가 치유 또는 제거되거나 또는 치료가 다른 이유로 중지되기 전에 2종 이상의 치료가 전달되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 제2 치료의 전달이 시작될 때 여전히 일어나고 있으며, 따라서 투여 면에서 중첩이 존재한다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 한 경우의 일부 실시양태에서, 치료는 조합 투여로 인해 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우 관찰된 것보다 더 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에서 동등한 효과가 관찰되거나, 또는 제2 치료가 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에서 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증상 또는 장애에 관련된 다른 파라미터의 감소가, 하나의 치료가 다른 치료의 부재 하에 전달될 때 관찰되는 것보다 더 크도록, 전달이 이루어진다. 2가지 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전적으로 상가적이거나, 상가적인 것보다 더 클 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 작용제 및 적어도 1종의 추가의 요법은 동시에, 동일한 또는 개별 조성물로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여를 위해, 본원에 기재된 작용제가 먼저 투여될 수 있고, 추가의 작용제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 또는 투여 순서가 역전될 수 있다. 작용제 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 장애가 활성인 기간 동안 또는 질환이 완화 또는 덜 활성인 기간 동안 투여될 수 있다. 작용제는 또 다른 치료 전에, 치료와 공동으로, 치료후 또는 장애의 완화 동안 투여될 수 있다.
간 질환을 치료하기 위해 현재 사용되는 치료제는 우르소데옥시콜산 (UDCA, 또한 우르소디올, INN, NAN, AAN 또는 USAN으로도 공지됨), 콜레스티라민, 스타노졸롤, 날트렉손, 리팜피신, 피오글리타존, 메트포르민, 로시글리타존, 로베글리타존, 레티놀 에스테르, 비타민 A, 간 투석 또는 간 이식, 또는 관련 기술분야에 공지된 간 질환을 위한 임의의 다른 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제 또는 조성물은 또 다른 요법과 함께 투여되지 않는다. 구체적으로, 본원에 기재된 작용제 또는 조성물은 우르소데옥시콜산 (UDCA, 또한 우르소디올, INN, NAN, AAN 또는 USAN으로도 공지됨), 콜레스티라민, 스타노졸롤, 날트렉손, 리팜피신, 피오글리타존, 메트포르민, 로시글리타존, 로베글리타존, 레티놀 에스테르, 비타민 A, 간 투석 또는 간 이식, 또는 관련 기술분야에 공지된 간 질환을 위한 임의의 다른 치료와 함께 투여되지 않는다.
조합되어 투여되는 경우에, 작용제 또는 조성물 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제) 또는 모두는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 더 높거나, 더 낮거나 또는 그와 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 작용제, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제) 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 더 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 간 질환의 치료)를 유발하는 작용제, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제) 또는 모두의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하는데 개별적으로 요구되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 더 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 더 낮음).
비경구 투여 형태
본원에 기재된 작용제의 비경구 투여 형태는 피하, 정맥내 (볼루스 주사 포함), 근육내 및 동맥내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여 형태의 투여가 전형적으로 오염물에 대한 환자의 자연 방어를 우회하기 때문에, 비경구 투여 형태는 바람직하게는 멸균되거나 또는 환자에게 투여하기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여 형태의 예는 즉석 주사 용액, 주사용 제약상 허용되는 비히클 중에 용해 또는 현탁될 즉석 건조 제품, 즉석 주사 현탁액, 제어-방출 비경구 투여 형태 및 에멀젼을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭한다. 본원에 사용된 어구 "전신 투여", "전신으로 투여되는", "말초 투여" 및 "말초로 투여되는"은 치료제가 대상체의 순환계에 진입하여 대사 및 다른 유사 과정에 적용되도록, 표적 부위, 조직 또는 기관, 예컨대 종양 부위 내로의 직접 투여 이외의 치료제의 투여를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 장애가 허용하는 경우에 국부로, 예를 들어 직접 주사에 의해 투여되고, 주사는 주기적으로 반복될 수 있다.
본 개시내용의 비경구 투여 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 비히클은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예는, 비제한적으로 멸균수; 주사용수 USP; 염수 용액; 글루코스 용액; 수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사 및 락테이트화 링거 주사; 수혼화성 비히클, 예컨대 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 비-수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 옥수수 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 참깨 오일, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트를 포함한다.
본원에 기재된 방법을 사용하는 요법의 지속기간은 의학적으로 지시되는 한 또는 목적하는 치료 효과 (예를 들어, 본원에 기재된 것)가 달성될 때까지 계속될 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 투여는 1개월, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 20년 동안 또는 대상체의 수명까지 수년의 기간 동안 계속된다.
제어 및 지연 방출 투여 형태
본원에 기재된 측면의 일부 실시양태에서, 작용제 또는 조성물은 제어- 또는 지연-방출 수단에 의해 대상체에게 투여된다. 이상적으로, 의학적 치료에서 최적으로 설계된 제어-방출 제제의 사용은 최소량의 시간 내에 상태를 치유 또는 제어하기 위해 최소의 약물 물질이 사용되는 것을 특징으로 한다. 제어-방출 제제의 이점은 1) 약물의 연장된 활성; 2) 감소된 투여 빈도; 3) 증가된 환자 순응도; 4) 보다 적은 총 약물의 사용; 5) 국부 또는 전신 부작용의 감소; 6) 약물 축적의 최소화; 7) 혈액 수준 변동의 감소; 8) 치료 효능의 개선; 9) 약물 활성의 강화 또는 손실의 감소; 및 10) 질환 또는 상태의 제어 속도의 개선을 포함한다 (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). 제어-방출 제제는 화학식 (I)의 화합물의 작용 개시, 작용 지속기간, 치료 범위 내의 혈장 수준 및 피크 혈액 수준을 제어하는데 사용될 수 있다. 특히, 제어- 또는 연장-방출 투여 형태 또는 제제는 약물의 과소-투여 (즉, 최소 치료 수준 미만으로) 뿐만 아니라 약물에 대한 독성 수준 초과 둘 다로부터 발생할 수 있는 잠재적 유해 효과 및 안전성 우려를 최소화하면서 작용제의 최대 유효성이 달성되는 것을 보장하는데 사용될 수 있다.
다양한 공지된 제어- 또는 연장-방출 투여 형태, 제제 및 장치는 본원에 기재된 임의의 작용제와 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 예는 미국 특허 번호: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; 및 6,365,185 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 투여 형태는, 예를 들어 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템 (예컨대 오로스(OROS)® (알자 코포레이션(Alza Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)), 다층 코팅, 마이크로입자, 리포솜 또는 마이크로구체 또는 그의 조합을 사용하여 1종 이상의 활성 성분의 느린 또는 제어-방출을 제공함으로써 다양한 비율의 목적하는 방출 프로파일을 제공하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 이온 교환 물질이 개시된 화합물의 고정화된 흡착된 염 형태를 제조하여 약물의 제어된 전달을 수행하는데 사용될 수 있다. 특정 음이온 교환체의 예는 듀오라이트(DUOLITE)® A568 및 듀오라이트® AP143 (롬앤하스(Rohm&Haas), 미국 펜실베니아주 스프링 하우스)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
효능
예를 들어 간 질환의 치료를 위한 본원에 기재된 작용제의 효능은 숙련된 진료의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 치료는 이 용어가 본원에 사용될 때, 간 질환의 징후 또는 증상 중 1종 이상이 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 증상이 개선 또는 심지어 호전되거나, 또는 목적하는 반응이, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 따른 치료 후 적어도 10%만큼 유도되는 경우에, "유효 치료"로 간주된다. 효능은, 예를 들어 마커, 지표, 증상 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 치료된 상태의 발생률 또는 적절한 임의의 다른 측정가능한 파라미터, 예를 들어 피로, 통증, 체중 감소 또는 암뇨를 측정함으로써 평가될 수 있다. 효능은 또한 입원 또는 의학적 개입에 대한 필요성 (즉, 증상의 진행)에 의해 평가되는 바와 같이 개체가 악화되는 실패에 의해 측정될 수도 있다. 이들 지표를 측정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고/거나 본원에 기재되어 있다.
효능은 본원에 기재된 상태의 동물 모델, 예를 들어 경우에 따라 간 질환의 마우스 모델 또는 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우에, 치료 효능은 마커, 예를 들어 황달, 피로, 오심, 구토, 소변 색상, 복통의 통계적으로 유의한 변화가 관찰되는 경우에 입증된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 간 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있는, 질환의 적어도 1종 이상의 증상을 완화시키는데 필요한 본원에 기재된 작용제 또는 조성물의 양을 지칭한다. 용어 "치료 유효량"은 따라서 전형적 대상체에게 투여되는 경우에 특정한 항-간 질환 효과를 제공하기에 충분한 작용제 또는 조성물의 양을 지칭한다. 다양한 문맥에서 본원에 사용된 유효량은 또한 질환의 증상의 발생을 지연시키거나, 질환의 증상의 과정을 변경시키거나 (예를 들어, 간 질환의 진행을 둔화시키거나), 또는 질환의 증상을 역전시키기에 (예를 들어, 간 질환의 증상을 교정하거나 중단시키기에) 충분한 작용제의 양을 포함할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것은 일반적으로 실행가능하지 않다. 그러나, 임의의 소정의 경우, 적절한 "유효량"은 단지 상용 실험을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제 또는 조성물은 연속적으로 (예를 들어, 일정 기간에 걸쳐 일정한 수준으로) 투여된다. 작용제의 연속 투여는, 예를 들어 표피 패치, 연속 방출 제제 또는 온-바디 주사기에 의해 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제 또는 조성물은 간격을 두고 (예를 들어, 주어진 기간에 걸쳐 다양한 수준으로) 투여된다.
유효량, 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 평가될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 또한, 용량은 세포 배양물 또는 적절한 동물 모델에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 반수-최대 억제를 달성하는 작용제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 혈장 내의 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정한 투여량의 효과는 적합한 생물검정, 예를 들어 특히 간 기능 측정 또는 혈액 검사에 의해 모니터링될 수 있다. 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 관찰된 치료 효과에 적합하도록 필요에 따라 조정될 수 있다.
본원에 제공된 본 발명은 하기 넘버링된 단락에 추가로 기재될 수 있다:
1. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
2. 단락 1에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 및 경피증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
3. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1이 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4로 이루어진 군으로부터 선택된 스플라이스 변이체인 방법.
4. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
5. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
6. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1이 표적 세포에서 억제되는 것인 방법.
7. 임의의 상기 단락에 있어서, 표적 세포가 포유동물 세포인 방법.
8. 임의의 상기 단락에 있어서, 표적 세포가 간 성상 세포, 섬유모세포 또는 근섬유모세포인 방법.
9. 임의의 상기 단락에 있어서, 간 성상 세포가 정지 세포인 방법.
10. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약이 직접 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 비강 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
11. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 것이 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것인 방법.
12. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1의 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 억제되는 것인 방법.
13. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1의 수준이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
14. WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
15. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
16. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 조성물.
17. 임의의 상기 단락에 있어서, 간 질환을 치료 또는 예방하기 위해 제제화되는 조성물.
18. a. 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 검출하는 단계;
b. (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계;
c. 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및
d. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
19. 임의의 상기 단락에 있어서, (a) 전에, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
20. 임의의 상기 단락에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 또는 경피증인 방법.
21. 임의의 상기 단락에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 조직, 백혈구 연층, 혈청 또는 조직인 방법.
22. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
23. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
24. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
25. 임의의 상기 단락에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 및 경피증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
26. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1이 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4로 이루어진 군으로부터 선택된 스플라이스 변이체인 방법.
27. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1이 표적 세포에서 억제되는 것인 방법.
28. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
29. 임의의 상기 단락에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
30. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
31. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
32. 임의의 상기 단락에 있어서, 작용제가 직접 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 비강 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
33. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 것이 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것인 방법.
34. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1의 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 억제되는 것인 방법.
35. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1의 수준이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
36. WISP1을 억제하는 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
37. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
38. 임의의 상기 단락에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 조성물.
39. a. 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 검출하는 단계;
b. (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계;
c. 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및
d. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
40. 임의의 상기 단락에 있어서, (a) 전에, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
41. 임의의 상기 단락에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 또는 경피증인 방법.
42. 임의의 상기 단락에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 조직, 백혈구 연층, 혈청 또는 조직인 방법.
43. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
44. 임의의 상기 단락에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
45. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
46. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
47. 간 성상 세포를 WISP1을 억제하는 작용제와 접촉시키는 단계 및 세포를 작용제의 발현이 가능하도록 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 조작된 간 성상 세포 또는 그의 집단을 생성하는 방법.
48. 임의의 상기 단락에 있어서, 세포가 정지 세포인 방법.
49. 임의의 상기 단락에 있어서, 접촉이 세포를 작용제 또는 작용제를 코딩하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
50. 임의의 상기 단락에 있어서, 접촉이 형질도입, 뉴클레오펙션, 전기천공, 직접 주사 및/또는 형질감염을 포함하는 것인 방법.
51. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
52. 임의의 상기 단락에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
53. 임의의 상기 단락에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
54. 임의의 상기 단락에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
55. 단락 46-53 중 어느 것의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포를 포함하는 세포주.
56. 임의의 상기 단락의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포 또는 그의 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
57. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 단락의 방법에 의해 생성된 세포, 임의의 상기 단락의 세포, 또는 임의의 상기 단락의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
58. 섬유증의 감소를 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 단락의 방법에 의해 생성된 세포, 임의의 상기 단락의 세포, 또는 임의의 상기 단락의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법.
59. a. 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및
b. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
60. a. 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및
b. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제 시약을 투여하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
실시예
실시예 1: 진행성 간 질환의 치료
간 질환 치료제에 대한 미충족 필요에 반응하여, 간의 섬유화 진행에서 중추적 역할을 하는 세포 유형인 활성화된 간 성상 세포 (HSC)에서 정지상태를 독립적으로 유도하는 마이크로RNA miR-15a 및 miR-412가 본원에 기재된다. 추가로, miR-15a는 활성화된 HSC에서 WISP1을 직접 표적화하여 그의 섬유화유발 기능을 억제한다. 마이크로RNA 및 그의 표적을 사용하여 HSC 정지상태를 촉진함으로써, 마이크로RNA는 PBC에서 진행성 간 섬유증을 제어하는 유용한 요법일 수 있다 (도 1). 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, miR-15a 및 miR-412는 HSC에서 정지상태를 유도하며, 이는 후속적으로 miR-15a의 공지된 표적 WISP1의 기능을 규명할 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 연구는 miR-15a 또는 miR-412에 의해 유도된 정지-유사 HSC가 CCl4 챌린지된 마우스에서 간 손상 및 섬유증의 개선을 유발하였다는 것을 보여준다. CCl4 모델에서의 miR-15a 또는 miR-412의 유익한 효과를 고려하여, 담즙정체성 섬유증 모델, 담관 결찰 (BDL) 및 3,5-디에톡시카르보닐-1,4-디히드로콜리딘 (DDC)을 사용하여 마우스 처리 연구를 확장시킬 수 있다. 다음 3종의 상이한 miRNA 전달 시스템을 시험할 수 있다: 1) miR-15a 또는 miR-412를 구성적으로 발현하는 정지-유사 HSC를 사용하는 세포 요법, 2) miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 렌티바이러스를 꼬리 정맥 내로 주사하는 것, 및 3) 지질 기반 담체에 패키징된 miR-15a 또는 miR-412의 화학적으로 변형된 모방체를 꼬리 정맥 내로 주사하는 것. 대조군 및 처리 마우스를 사용하여 결과를 분석할 수 있다.
본원에 기재된 연구는 miR-15a가 HSC에서 WISP1을 직접 표적화하여 그의 섬유화유발 기능을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. BDL 및 DDC 챌린지의 세팅에서 WISP1-널 마우스의 간 표현형을 정의할 수 있다. 챌린지 후의 간 손상 및 HSC 기능장애의 중증도를 평가하고, 이를 야생형 마우스의 중증도와 비교할 수 있다. 담즙정체성 섬유증의 마우스 모델을 WISP1 차단 항체로 처리한 다음, 이를 사용하여 결과를 분석할 수 있다.
원발성 담즙성 담관염 (PBC) - 이전에 원발성 담즙성 간경변증으로 명명됨 -은 간내 담관의 진행성 파괴, 담즙정체, 문맥주위 염증, 및 결국 경변성 말기 간 질환으로 종결되는 담관 섬유증으로 이어지는 잠행성 간 질환이다. 이는 유전적 및 환경적 인자 둘 다가 상호작용하여 질환을 나타낼 가능성이 있지만, 불명확한 발병기전을 갖는 자가면역 장애이다. 흥미롭게도, PBC는 여성 대 남성 질환 비가 9:1로 남성보다 여성에서 훨씬 더 많이 이환된다. 미국에서 연간 1백만명의 사람당 PBC의 연령-조정 발생률은 여성의 경우 45명이고 남성의 경우 7명인 반면, 1백만명의 사람당 유병률은 여성의 경우 654명이고 남성의 경우 121명이다 [1].
친수성 담즙 염 우르소데옥시콜산 (UDCA)은 여전히 PBC에 대한 생존 이익을 입증한 유일한 약물이다. 이는 개선된 조직학 및 생화학적 파라미터에 의해 입증된 바와 같이 질환 진행을 지연시키는 것으로 나타났다. 그의 작용의 정확한 메카니즘은 불명확하지만, 독성 담즙 염에 대해 담관세포를 보호하는 것으로 보인다. 불행하게도, UDCA 치료된 개체의 30%-40%는 준최적 반응의 세팅에서 여전히 질환 진행을 경험한다 [2]. 이러한 치료 격차를 충족시키기 위해, 많은 상이한 작용제가 임상 시험 하에 있지만, 두드러지게 시험된 약물 중 일부, 예컨대 오베티콜산은 여전히 유의한 부작용을 갖고 생존 이익에 대한 증거가 결여되어 있다 [3].
대부분의 만성 간 질환과 마찬가지로, PBC는 염증에서 섬유증으로 진행한다. 이러한 병리학적 캐스케이드 동안, 간 성상 세포 (HSC)는 간 섬유생성에서 중추적 역할을 하는 것으로 고려된다 [4-6]. HSC는 2가지 형태로 존재한다. 건강한 개체에서, 이들은 정지 세포이며, 다수의 레티노이드-풍부 지질 액적을 특징으로 한다. 그러나, 활성화되면, 이들은 그의 지질 액적을 상실하고, 콜라겐을 분비하는 섬유화유발 근섬유모세포 및 반흔 형성을 촉진하는 매개체가 된다 [7, 8]. 간 섬유증에 있어서 HSC의 중요성이 널리 확립되어 있지만, 이 세포 유형에 대해 알려지지 않은 것은 여전히 많다.
현재 HSC 활성화 상태를 결정하는데 있어서 마이크로RNA (miRNA)의 역할에 대한 이해는 HSC에 관한 지식에 있어서의 다수의 차이 중 하나이다. miRNA는 통상적으로 22개 뉴클레오티드 길이이며 모든 생물학적 및 병리학적 과정에 관여하는 짧은 비-코딩 유전자이다. 이들은 그의 mRNA 표적 내의 상보적 서열과 불완전하게 염기-쌍형성함으로써 특이적 코딩 유전자를 하향조절하여 분해 또는 번역 억제를 유도한다. 각각의 miRNA는 많은 상이한 코딩 유전자를 조절할 수 있는 반면, 각각의 표적 유전자는 유전자 조절 네트워크의 복잡한 층을 구성하는 많은 상이한 miRNA에 의해 조절될 수 있다 [9]. 본원에 기재된 실험은 miRNA가 세포 증식 및 재프로그램화에 필수적이라는 것을 보여주었다 [10-12]. 그럼에도 불구하고, HSC 활성화 또는 정지상태로의 복귀에 있어서 miRNA의 역할은 철저히 탐구되지 않았다.
그룹들이 HSC에서 전반적 miRNA 발현 패턴을 프로파일링하였지만, 그의 발현 상태의 기능적 유의성은 대체로 불명확하다 [13-15]. 이에 반응하여, 대규모 발현 프로파일링에 의존하는 대신, 활성화된 HSC를 정지상태로 복귀시키도록 강제하는 miRNA를 체계적으로 확인하는 기능적 스크린이 개발되었고, 이러한 노력을 통해, miR-15a 및 miR-412를 확인하였다. miR-15a 및 miR-412는 이전에 간 성상 세포와 관련하여 연구된 바 없다. 그러나, miR-15 패밀리는 심장에서 Tgf-베타 경로를 억제하여 잠재적으로 섬유증을 약화시키는 것으로 밝혀졌다 [16]. 이들 miRNA 또는 그의 하류 표적을 통해 HSC 정지상태를 촉진하는 것은 PBC에서의 섬유화 진행을 방지할 수 있다. 본 연구의 목적은 PBC 치료에서 miR-15a, miR-412 및 그의 직접적 표적의 치료 효과를 평가하는 것이다.
결과
본원에 기재된 비편향 기능적 스크린은 HSC가 플라스틱 표면 상에서 성장되는 경우에 활성화되려는 자연적 경향을 활용하였다. HSC가 활성화됨에 따라, 이들은 정지 HSC에 풍부하게 존재하는 지질 액적을 상실한다. 이러한 유용한 표현형 이분법을 이용하여, 세포질에서 재형성되는 지질 액적의 수준을 추적함으로써, 활성화된 HSC가 보다 정지-유사하게 되도록 강제하는 miRNA를 검색하였다. miRNA는 다수의 코딩 유전자를 동시에 표적화하여 전체 세포 프로그램, 예컨대 기관 발생, 발암 또는 세포 재프로그램화에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있기 때문에 [17], 심지어 단일 miRNA도 전환분화를 유도할 수 있는 것으로 고려되었다.
활성화된 HSC의 정지상태로의 복귀를 촉진하는 miRNA를 확인하기 위해, 활성화된 HSC가 전체 게놈 miRNA 라이브러리로부터 개별 miRNA 모방체를 받은 후, 레티노이드를 갖는 세포내 지질 액적의 재출현을 정지상태의 마커로서 스캐닝하였다 (도 2). 실제로, 웰 중 일부에서의 HSC는 3일 이내에 재형성된, BODIPY 염색 양성 지질 액적을 보여주었다. 이 초기 스크린은 15개 1차 히트를 생성하였다. miRNA인 miR-15a 및 miR-412를 인간 오르토로그의 존재 및 마우스 및 인간 HSC 둘 다에서 지질 액적을 재형성하는 능력에 기초하여 추가의 조사를 위해 선택하였다 (도 3). 새로 형성된 지질 액적은 자외선 하의 형광에 의해 입증되는 레티노이드 양성이었으며, 이는 정지 HSC에서의 것과 일치한다 (데이터는 제시되지 않음). 형질감염된 HSC의 전체 크기는 10-100배 감소하여, 보다 정지-유사하게 되었다 (도 4). 추가로, miR-15a 또는 miR-412의 강제 발현은 활성화의 가장 중요한 유전자 마커 중 2종인 알파 평활근 액틴 (Acta2) 및 알파-1 유형 I 콜라겐 (Col1a1)을 하향조절하였다 (도 4).
보다 포괄적인 발현 분석의 경우, 심층-RNA 서열분석은 miR-15a 또는 miR-412를 받은 정지-유사 HSC가 활성화된 세포보다 정지 HSC에 40-50% 더 가까운 전반적 전사 프로파일을 가졌다는 것을 입증하였다 (데이터는 제시되지 않음). 가장 중요하게는, miR-15a 또는 miR-412에 의해 정지-유사하게 된 HSC는 진정한 정지 HSC와 유사한 기능적 표현형을 가졌다. 생체외 실험은 2종의 세포 유형이 공동-배양된 경우에 정지-유사 HSC가 건강한 간세포에서 지방증을 유도하지 않았다는 것을 입증하였다. 대조적으로, 후보 miRNA로 처리되지 않은 활성화된 HSC는 공동배양된 경우에 간세포 지방증을 유도하였다 (도 5). 추가로, 이들 복귀된 HSC는 공동배양된 인간 간세포성 암종 세포주 HepG2 및 Huh7로부터의 염증유발 시토카인 발현을 감소시킬 수 있었다 (도 6). 마지막으로, 예상된 바와 같이, 내인성 miR-15a 및 miR-412는, 비록 miR-15a에 대해서는 유의하지 않았지만, 정지 HSC와 비교하여 활성화된 HSC에서 감소된 발현 수준을 가졌고 (도 7), miR-412는 활성화를 촉진하는 배양 조건에서 활성화된 HSC가 정지상태로 복귀하도록 강제하는 것으로 보인다. 이러한 및 다른 주요 생체외 관찰은, 특히 miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 HSC가 심지어 활성화 촉진 신호를 갖는 이환된 간에서도 정지-유사 상태를 유지할 수 있기 때문에, 전통적인 CCl4 마우스 모델 (경구 위관영양 100 ul의 40% CCl4 1주 2회)에서 이들 miRNA가 생체내 전달되어 간 병리상태의 수준을 약화시킬 수 있는지 여부를 시험하는 것을 가능하게 하였다. 세포 접촉 및 가용성 매개체를 통해, 정지-유사 HSC는 간 내의 다른 세포 유형이 염증 또는 섬유증을 촉진하는 그의 신호를 약화시키도록 유도할 수 있다.
살아있는 마우스에게 miRNA를 전달하는 상이한 방법들이 존재하지만, 주사되도록 선택된 HSC는 miR-15a 또는 miR-412를 구성적으로 발현함으로써 생체외에서 정지-유사하게 되었다. 재프로그램화된 HSC를 4-주 CCl4 챌린지의 제3주 동안 1회 주사하였다. 주사된 HSC가 간에 이식되었다는 것은, 간 세포 내에서 miRNA를 발현하는 피기백 벡터에 삽입된 GFP 신호의 방출을 가시화함으로써 확인하였다 [18] (도 8). 보다 중요하게는, 정지-유사 HSC로 처리된 마우스는 간에서의 감소된 풍선화, 아폽토시스, 염증 및 섬유증 (도 8) 및 보다 낮은 간 콜라겐 발현 (도 9)을 나타내는 조직학을 가졌다.
이들 2종의 miRNA 후보는 간 염증 및 섬유증을 촉진하는 HSC 유전자를 하향조절할 가능성이 있다. miR-15a 및 miR-412에 의해 억제되는 많은 유전자가 존재할 가능성이 있지만, WISP1이 miR-15a의 직접적 표적인 것으로 실험적으로 검증되었다. 활성화된 HSC는 정지 HSC 수준의 거의 30배의 WISP1을 발현하였고 (데이터는 제시되지 않음), 인간 PBC에서의 HSC는 정상 간에서보다 훨씬 더 고도로 WISP1을 발현하였다 (도 10). 마지막으로, miR-15a는 3'-UTR 내에 2개의 잠재적 miR-15a 결합 서열을 함유하는 WISP1을 표적화하는 것으로 예측된다. 따라서, 추정 표적 서열 또는 그의 돌연변이된 변이체를 구성적으로 활성인 루시페라제 리포터 유전자 뒤에 클로닝하였다. 이들 리포터 중 하나를 miR-15a 모방체와 함께 공동-형질감염시킨 경우에, 야생형 서열을 갖는 리포터는 감소된 루시페라제 발현을 갖는 반면 돌연변이된 서열을 갖는 리포터는 그렇지 않았으며, 이는 miR-15a가 두 WISP1 표적 서열에 결합한다는 것을 나타낸다 (도 11). WISP1은 HSC에서 miR-15a 작용 중 일부를 달성하기 위한 주요 표적 유전자이다.
담관염의 마우스 모델에서 miR-15a 및 miR-412의 시험.
miR-15a 또는 miR-412를 전달하는 것이 PBC에 대한 요법이다: 본원에 기재된 놀라운 결과를 고려하여, 생체내 실험을 확장시켜 PBC 치료에서의 miR-15a 및 miR-412의 잠재력을 추가로 평가하였다. 이들 miRNA가 오로지 HSC를 통해서만 또는 보다 광범위하게 다른 세포 유형을 통해서도 그의 기능을 발휘하는지 여부를 평가하기 위해, 세포 요법 대신 바이러스 벡터 또는 모방체를 사용하여 miRNA를 전신으로 전달할 수 있다. 모든 생체내 처리 실험에 대해, 간에서의 섬유화유발 유전자의 PCR, H&E 및 시리우스 레드 염색을 포함한 조직학, 간 히드록시프롤린 검정을 수행하고, 혈장 ALT 및 알칼리성 포스파타제를 측정함으로써 효능을 평가할 수 있다.
각각의 PBC 모델은 인간 PBC를 나타내는데 있어서 강점 및 약점을 갖는다. 본 연구의 목적을 위해, 섬유증 및 염증의 감소로 이어질 수 있는 WISP1의 억제 및 miRNA 후보를 시험하기 위해 담관 섬유증으로 비교적 빨리 일관되게 진행하는 모델이 필요하다. PBC의 유전자 모델의 대부분은 간 섬유증으로 이어지지 않거나 또는 매우 느리게 이어진다 [19]. 따라서, 담관 결찰 (BDL)에 의해 외과적으로 유도되는 섬유증 및 3,5-디에톡시카르보닐-1,4-디히드로콜리딘 (DDC)에 의해 화학적으로 유도되는 섬유증에 신뢰할 수 있게 도달하는 2가지 담관염 모델을 이용할 수 있다. 모든 실험은 BDL 모델의 경우 3주 후에 및 DDC 모델의 경우 4주 후에 종결할 수 있으며, 이는 이들이 유의한 수준의 담즙정체성 섬유증의 발생에 요구되는 시간이기 때문이다 [20-22].
중간엽 줄기 세포 및 대식세포를 사용하여, 다수의 그룹들이 간 섬유증에 대한 세포 요법을 이미 시도하였고, 일부 성공이 있었다 [23]. 그러나, 본원에 기재된 실험은 간 섬유증을 예방하기 위해 처음 의도적으로 조작된 HSC를 이용한다. 초기 생체내 치료 결과가 유력하지만, 담관염의 마우스 모델에서 이 세포 요법의 효과를 시험하는 것은 지금까지 단지 CCl4 모델만이 시험되어 왔다는 것을 고려하면 유용한 것이다. 모든 세포 요법 실험을 위해, miR-15a 또는 miR-412로 재프로그램화된 500,000개의 정지-유사 HSC를 비장 내로 주사할 수 있다. 모든 적절한 대조군, 예를 들어 비처리 및 재프로그램화되지 않은 HSC로의 처리가 있는 대조군을 또한 포함시킬 수 있다.
21일 동안 BDL로 챌린지된 마우스에서는 정상적으로 유의한 섬유증이 발생한다. 재프로그램화된 HSC는 BDL 챌린지의 21-일 과정 동안 제7일 및 제14일에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제21일에 희생시킨다. 28일 동안 DDC로 챌린지된 마우스에서는 정상적으로 유의한 섬유증이 발생한다. 재프로그램화된 HSC는 DDC 챌린지의 28일 과정 동안 제14일 및 제21일에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제28일에 희생시킨다.
초기 실험은 miR-15a 또는 miR-412로 재프로그램화된 HSC를 주사하는 것이 CCl4 유도된 간 섬유증에서 콜라겐 발현 및 간 손상의 전체 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 세포 요법을 통해 miRNA를 전달하는 것이 유망한 것으로 나타났지만, 다른 전달 방법이 탐구되어야 한다. 한 방법은 miRNA를 발현하는 렌티바이러스를 주사하는 것이다. 렌티바이러스는 BDL 챌린지의 21-일 과정 동안 제7일 및 제14일에 꼬리 정맥 내에서 miR-15a 또는 miR-412를 발현할 수 있다. 모든 마우스를 제21일에 희생시킨다. 렌티바이러스는 DDC 챌린지의 28일 과정 동안 제14일 및 제21일에 miR-15a 또는 miR-412를 발현할 수 있다. 모든 마우스를 제28일에 희생시킨다.
또 다른 전달 방법으로서, 지질 기반 담체 (B100 사이언티픽의 맥스서프레서(MaxSuppressor)™)에 패키징된 보다 안정한 화학적으로 변형된 miRNA 모방체 (엑시콘(Exiqon) 및 인비트로젠(Invitrogen)) 주사의 실행가능성을 시험할 수 있다 [24, 25]. 렌티바이러스를 피함으로써, 이 방법 또는 그의 변형법은 인간에서 사용될 잠재력을 갖는다. miR-15a 또는 miR-412를 함유하는 담체를 BDL 챌린지의 21일 과정 동안 제7일 및 제14일에 꼬리 정맥 내로 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제21일에 희생시킨다. miR-15a 또는 miR-412를 함유하는 담체를 DDC 챌린지의 28일 과정 동안 제14일 및 제21일에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제28일에 희생시킨다.
암컷 마우스에서 간 섬유증을 유도하기가 어렵기 때문에, 수컷 마우스는 본원에 기재된 생체내 치료 연구에 보다 유용하다. 검정력 계산은 각각의 군에 8마리의 마우스를 사용하여 0.01의 p 값 및 90% 검정력에서 측정시 20% 표준 편차로 알파-1 유형 I 콜라겐 수준의 50% 감소를 검출할 수 있다는 것을 보여준다. miRNA로 HSC를 처리하는데 가장 큰 과제 중 하나는 오프-타겟 효과를 최소화하기 위해 이 세포 유형을 특이적으로 표적화하는 전달 시스템을 개발하는 것이다. 전달 시스템은 개선된 특이성을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 최근에 개발된 2종의 유망한 HSC 전달 시스템은 p75 뉴로트로핀 수용체 펩티드 (p75NTRp)-태그부착된 아데노바이러스 및 AAV6 벡터이다 [26, 27].
담관염의 마우스 모델에서 WISP1의 기능 평가.
miR-15a 표적 Wisp1은 PBC에서 염증 및 섬유증을 촉진시킨다: WISP1은 Cyr61 (Ccn1), Ctgf (Ccn2), Nov (Ccn3), WISP1 (Ccn4), Wisp2 (Ccn5) 및 Wisp3 (Ccn6)을 포함하는 기질세포 단백질의 Ccn 패밀리의 구성원이다. Ctgf는 간에서 중요한 섬유화유발 인자로서 이미 확립되어 있다 [28].
흥미롭게도, WISP1은 인간 특발성 폐 섬유증에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌고, 블레오마이신 챌린지된 마우스를 중화 WISP1 항체로 처리하는 것은 폐 섬유증의 약화를 유발하였다 [29]. 더욱이, 소규모 동물 연구는 WISP1을 차단하는 것이 CCl4 유도된 간 섬유증을 호전시킨다는 것을 보여주었다 [30]. 그러나, 간에서의 WISP1의 역할은 특히 PBC와 관련하여서는 상세하게 연구되지 않았다.
WISP1이 miR-15a의 직접적 표적이지만, HSC 활성화 상태에 대한 그의 영향 및 PBC 발병기전에서의 그의 역할은 불명확하다. 골 형성에서 WISP1의 역할을 입증하기 위해 WISP1-널 마우스 계통을 생성하였지만, 간에서의 그의 기능은 연구되지 않았다 [31]. 이들 마우스는 가임성이고, 명백한 간 표현형을 갖지 않는다. 이들의 돌연변이체 대립유전자는 캘리포니아 대학교 데이비스의 MMRRC 시설 내 동결된 정자 및 배아에 보존되어 성공적인 돌연변이체 마우스 유래를 보장한다.
표현형은 간 병리상태의 전체 중증도에 의해 평가할 수 있다. WISP1-널 마우스를 BDL 및 DDC로 챌린지할 수 있다. 그 결과 WISP1-널 마우스에 의해 지속된 간 손상을 야생형 마우스의 것과 비교할 수 있다. 폐를 포함한 다른 기관에서의 Wisp1의 공지된 섬유화유발 역할을 고려하여, WISP1-널 마우스는 감소된 간 섬유증 및 아마도 심지어 감소된 염증을 가질 것으로 예상된다. 모든 생체내 실험에 대해, 간에서의 섬유화유발 유전자의 PCR, H&E 및 시리우스 레드 염색을 포함한 조직학, 간 히드록시프롤린 검정을 수행하고, 혈장 ALT 및 알칼리성 포스파타제를 측정함으로써 간 표현형을 평가할 수 있다. 마지막으로, 담관 섬유증의 이들 마우스 모델로부터 수거된 HSC의 기능적 표현형을 평가할 수 있다. 수컷 야생형 및 WISP1-널 마우스를 BDL로 챌린지할 수 있다. 이들을 제21일에 희생시킬 수 있다. 수컷 야생형 및 WISP1-널 마우스를 DDC로 챌린지할 수 있다. 이들을 제28일에 희생시킬 수 있다.
이어서, 21일 동안 BDL 및 28일 동안 DDC로 챌린지된 마우스로부터 HSC를 단리할 수 있다. 이들 HSC를 건강한 간세포와 함께 공동-배양하여 염증유발 매개체가 유도되는지 여부를 결정할 수 있다. 그 결과를 동일한 챌린지를 겪은 야생형 HSC의 결과와 비교할 수 있다.
WISP1를 중화 항체로 차단하는 것은 마우스 폐에서 블레오마이신-유도된 섬유증을 약화시켰다 [29]. 유사하게, Wisp1을 차단하는 것은 PBC에서 발생하는 염증 및 섬유증의 수준을 감소시킬 수 있다. 담관염의 마우스 모델을 WISP1 항체로 처리하고, 간 표현형을 평가할 수 있다.
21일 동안 BDL로 챌린지된 마우스에서는 정상적으로 유의한 섬유증이 발생한다. 처리군은 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 치료하는데 이전에 사용된 상업적으로 입수가능한 WISP1 항체 (알앤디 시스템즈)를 제7일 및 제14일에 받을 수 있다 [29]. 대조군은 IgG를 받을 수 있다. 모든 마우스를 제21일에 희생시킬 수 있다. 28일 동안 DDC로 챌린지된 마우스에서는 정상적으로 유의한 섬유증이 발생한다. WISP1 차단 항체를 DDC 챌린지의 28일 과정 동안 제14일 및 제21일에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제28일에 희생시킬 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, WISP1은 염증유발 및 섬유화유발 매개체이며, 이는 생체내에서 염증 및 섬유증의 수준을 감소시키는 항체로 중화될 수 있다. 따라서, WISP1 차단은 또한 담관 섬유증을 호전시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 활성화된 HSC의 조건화 배지를 분석함으로써, 분비된 주변분비 또는 자가분비 매개체를 확인할 수 있다. 활성화된 HSC 조건화 배지의 보다 상세한 분석을 질량 분광측정법을 통해 분석하여 약물 표적인 다른 매개체를 확인할 수 있다.
참고문헌 - 실시예 1:
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실시예 2: 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)에 대한 치료
비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 향후 5-10년에 선진국에서 말기 간 질환, 간 이식 및 간세포성 암종의 가장 흔한 원인이 될 수 있다. 현재, FDA 승인된 약물이 존재하지 않기 때문에 NAFLD로 이어질 수 있는 위험 인자를 감소시키는 것이 주요 관리 방식이다. 따라서, NAFLD에 대한 효과적인 요법을 개발하는 것이 가장 중요하다.
활성화된 간 성상 세포 (HSC)는 간의 섬유화 진행에서 중추적 역할을 하는 것으로 공지되어 있고, 본원에 제시된 데이터는 마이크로RNA인 miR-15a 및 miR-412가 독립적으로 활성화된 HSC를 정지상태로 복귀시킨다는 것을 입증한다. 추가로, miR-15a는 활성화된 HSC에서 WISP1을 직접 표적화하여 그의 지방증유발 및 염증유발 기능을 억제한다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, miR-15a 및 miR-412는 HSC에서 정지상태를 촉진하며, 이는 후속적으로 NAFLD에서 섬유화 진행을 억제할 수 있는 것으로 가정되었다.
B형 및 C형 간염에 대한 고도로 효과적인 항바이러스 요법의 출현으로, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)이 가장 심각한 간 장애가 되었다. NAFLD는 현재 선진국에서 가장 흔한 간 질환으로 간주되고 [1], 2025년까지 말기 간 질환, 간 이식 및 간세포성 암종의 주요 원인이 될 것으로 예상된다 [2, 3]. 이 질환은 미국과 같은 부유한 국가에서 특히 흔하며, 여기서 6천 4백만명의 사람이 비만, 당뇨병 및 고지혈증을 포함한 위험 인자의 높은 유병률로 인해 이환된 것으로 추정된다. 더욱이, NAFLD의 경제적 부담은 엄청나며, 연간 직접적 의료 비용은 약 $103십억으로 예상된다 [4]. 질환은 간 지방증으로서 시작하지만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 섬유증 및 궁극적으로 경변성 간부전 또는 간세포성 암종으로 진행할 수 있다. NAFLD는 현재 주로 위험 인자를 감소시킴으로써 관리된다. 그러나, 이들 조치는 종종 달성하기 어렵고, 심지어 이들을 제거하는 것도 개선을 보장하지 않는다 [5]. NAFLD가 간 관련 이환의 가장 흔한 원인이 되고 있고 현재 그를 관리할 약물이 존재하지 않는다는 것을 고려하여, 더 우수한 치료 옵션이 필요하다. NAFLD에 대한 새로운 요법을 개발하는 제1 단계는 본원에 기재된 바와 같다.
NAFLD는 지방증, 염증 및 섬유증을 통해 단계적 방식으로 진행한다. 이 병리학적 캐스케이드 동안, 간 성상 세포 (HSC)는 간 섬유생성에서 중추적 역할을 하는 것으로 고려된다 [6-8]. HSC는 2가지 형태로 존재한다. 건강한 개체에서, 이들은 정지 세포이며, 다수의 레티노이드-풍부 지질 액적을 특징으로 한다 (도 12). 그러나, 활성화되면, 이들은 그의 지질 액적을 상실하고, 콜라겐을 분비하는 섬유화유발 근섬유모세포 및 반흔 형성을 촉진하는 매개체가 된다 (도 12) [9, 10].
간 섬유증에 있어서 HSC의 중요성이 널리 확립되어 있지만, 이 세포 유형에 대해 알려지지 않은 것은 여전히 많다. 예를 들어, 활성화된 HSC를 정지상태로 복귀시킬 수 있는 유전자가 존재하는가? HSC가 또한 초기 NAFLD에 수반되어, 섬유증만이 아니라 지방증 및 염증을 촉진하는가? HSC가 지방간염 또는 섬유증에 기여하는 경우에, 이들 과정에 수반되는 중요한 매개체는 무엇인가? 이들 질문에 답하고 보다 나은 생물학적 통찰력을 얻는 것은 NAFLD를 관리하기 위한 신규 아이디어로 이어질 수 있다.
현재 지식에 있어서의 다수 차이 중, HSC 활성화 상태를 결정하는데 있어서 마이크로RNA (miRNA)의 역할에 대한 이해가 특히 부족하다. 그룹들이 HSC에서 전반적 miRNA 발현 패턴을 프로파일링하였지만, 그의 발현 상태의 기능적 유의성은 대체로 불명확하다 [11-13]. 이에 반응하여, 연구는 먼저 miRNA 기능을 결정하고, HSC의 활성화 상태에 영향을 미치는 주요 miRNA를 발견하는 것에 초점을 맞추었다. 대규모 발현 프로파일링에 의존하는 대신, 활성화된 HSC를 정지상태로 복귀시키도록 강제하는 miRNA를 체계적으로 확인하는 기능적 스크린 및 검정이 개발되었고, 이러한 노력을 통해, miR-15a 및 miR-412를 확인하였다. 이들 miRNA 또는 그의 하류 표적을 통해 HSC 정지상태를 촉진하는 것은 NAFLD에서의 섬유화 진행을 방지할 수 있다.
마지막으로, 섬유증을 유발하는 활성화된 HSC는 NAFLD에 고유한 것이 아니다. 대부분의 만성 간 질환은 간경변증에 도달하기 전 수년 동안 섬유증을 촉진하는 HSC를 수반한다. 따라서, 치료제가 HSC를 표적화함으로써 섬유화 진행 속도를 감소시킬 수 있다면, NAFLD 이외의 다른 간 질환에서 이러한 접근법을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 요법의 잠재적 영향은 막대하다. 심지어 약물 요법이 확립된 원발성 담즙성 간경변증 또는 자가면역 간염과 같은 질환에 대해서도, 섬유화 진행을 억제하는 추가의 작용제는 이들 만성 질병을 관리하는 능력을 유의하게 개선시킬 수 있다. 결론적으로, NAFLD의 중요성 및 그의 섬유화 진행에서 HSC가 하는 중추적 역할 둘 다를 고려하면, 본원에 기재된 연구의 유의성은 광범위하다.
여러 화합물이 NAFLD 치료에 대해 인간 시험 중에 있지만, 이들 중 어느 것도 1차 목표로서 HSC 활성화를 방지하거나 역전시키는 것에 의존하지 않는다 [5, 14, 15]. 이에 반응하여, 첫 번째 주요 혁신은 진행성 간 손상 및 섬유증을 예방하는 방식으로서 HSC의 활성화 상태를 제어하려는 시도로 시작하였다. 본원에 기재된 시험관내 스크린은 HSC가 플라스틱 표면 상에서 성장되는 경우에 활성화되려는 자연적 경향을 활용하였다. HSC가 활성화됨에 따라, 이들은 정지 HSC에 풍부하게 존재하는 지질 액적을 상실한다 (도 12). 이러한 유용한 표현형 이분법을 이용하여, 세포질에서 재형성되는 지질 액적의 수준을 추적함으로써, 활성화된 HSC가 보다 정지-유사하게 되도록 강제하는 miRNA를 검색하였다. miRNA는 다수의 코딩 유전자를 동시에 표적화하여 전체 세포 프로그램, 예컨대 기관 발생, 발암 또는 세포 재프로그램화에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있기 때문에 [16], 심지어 단일 miRNA도 이러한 전환분화를 유도할 수 있는 것으로 판단되었다. 실제로, 비편향 조사를 통해, 세포내 지질 액적의 재출현에 의해 입증된 바와 같이, HSC를 활성화된 상태로부터 정지상태로 복귀시키는 것으로 보이는 여러 miRNA 후보가 확인되었다 (도 3). 이들 miRNA의 하위세트는 또한 유전자 발현 패턴, 증식 속도 및 근처 간세포에 대한 영향을 포함한, HSC 정지상태로의 다른 표현형 변화를 유발하였다. HSC 활성화 상태를 제어하기 위해 miRNA를 이용하는데 있어서의 이러한 혁신은 간 섬유증을 예방하는 요법의 전적으로 새로운 카테고리를 개발하기 위한 토대로서의 역할을 한다.
두 번째 주요 혁신은 정지-유사 HSC를 사용하는 신규 세포 요법의 형태이다. miR-15a 또는 miR-412의 모방체로의 일시적 형질감염을 사용하여 초기 스크린 및 추적 시험관내 검정을 수행하였지만, HSC에서 게놈 내로 통합되어 miRNA를 구성적으로 발현할 수 있는 피기백 트랜스포손 벡터를 사용한 경우에 [17], 이들은 형태, 발현 및 기능의 극적인 변화를 동반하는 정지-유사 상태로 영구적으로 전환분화하는 것으로 보인다. 놀랍게도, 이들 재프로그램화된 HSC를 0014로 챌린지된 마우스 내로 주사한 경우에, 이들은 간에 생착하였고, 간 손상 및 섬유증의 수준을 개선시켰다. 다른 그룹들이 중간엽 줄기 세포 또는 대식세포를 사용하여 간 경변증에서 세포 요법을 시도하였으나 [18], 조작된 HSC를 간 섬유증 또는 NASH에 대한 요법으로서 사용한 것은 이것이 처음이다.
마지막 주요 혁신은 사실상 기술적이다. HSC가 이미 NASH에서 간 섬유증의 주요 유도인자인 것으로 공지되어 있다면, 그의 작용을 방해하는 것이 가능하다. 그러나, 이러한 노력에는 근본적인 난제가 존재한다. HSC 기능 및 작용 메카니즘의 연구를 방해하는 가장 큰 장애물 중 하나는, 단순한 검정으로 기능적 표현형 및 작용 메카니즘 평가를 가능하게 하는, HSC와 다른 세포 유형과의 상호작용에 대한 우수한 시험관내 모델이 부족하다는 것이다. 이러한 요구를 충족시키기 위해, 1차 마우스 HSC 및 간세포를 사용하는 공동배양 시스템을 개발하여 이들 2종의 세포 유형의 간 미세환경을 매우 근접하게 재생성하였다. 더욱이, 이 기술을 NASH의 마우스 모델과 조합함으로써, 근처 간세포에 대한 NASH-HSC의 효과를 신뢰성 있게 측정할 수 있다. 흥미롭게도, 콜린 결핍, L-아미노산 한정, 고지방 식이 (CDAHFD) 모델로부터의 NASH-HSC (도 13)는 건강한 마우스로부터 수거된 공동배양된 간세포에서 지방증을 유도하고 염증유발 시토카인의 발현을 자극하였다 (도 14, 15) [19]. 이러한 신호전달은, 공동배양물 중 2종의 세포 유형이 트랜스웰에 의해 분리되어 있을 수 있기 때문에, 세포-세포 접촉을 요구하지 않으며, 이는 HSC에 의한 가용성 인자(들)의 분비를 암시한다. 실제로, 심지어 배양된 NASH-HSC로부터의 조건화 배지가 공동배양 없이 정상 간세포에 적용되는 경우에도, 간세포에서의 지방 축적의 유도가 재현될 수 있다 (도 16). 따라서, 이 시스템은 간세포에서 지방증 및 염증유발 시토카인을 유도하는 HSC-분비 매개체의 확인을 가능하게 한다. 단순하지만 강건한 생체외 시스템을 사용하여 NAFLD에서 HSC와 간세포 사이의 상호작용을 모델링함으로써, 기계론적 및 약물 발견 실험에 적용가능한 기술을 생성하였다. 특히, 세포주 대신에 1차 세포를 이용함으로써, 이 공동배양 시스템은 생체내에서 이들 2종의 세포 유형의 병리생리학적 미세환경을 보다 충실하게 시뮬레이션한다 [20]. 공동배양 시스템은, 노력은 최소화하면서 품질은 최대화되도록 이들 세포를 수거하고 배양하기 위한 기존 프로토콜을 개선시킴으로써 실현가능하다 [21]. 이들 기술적 증진은 1차 세포를 사용하여 일관되고 재현가능한 결과를 전달하는데 유용하다.
miR-15a 및 miR-412가 HSC 활성화에 영향을 미치는 메카니즘 및 정도의 정의.
간 성상 세포 (HSC)는 간 내 모든 세포의 5% 내지 15%만을 차지하지만, 진행성 간 질환에서 그의 활성화 후 그의 막대한 섬유화유발 영향은 널리 인식되어 있다 [6, 7, 23, 24]. 여러 연구가 활성화된 HSC 대 정지 HSC에서의 차등 miRNA 발현을 입증하지만 [11-13], 활성화 과정 동안 miRNA의 기능은 여전히 대체로 불명확하다. 활성화된 HSC를 간 염증 및 섬유증의 해소 동안 HSC의 하나의 가능한 운명인 정지상태로 복귀시키는데 있어서의 miRNA의 역할은 훨씬 덜 이해되어 있다 [9, 25].
활성화된 HSC의 정지상태로의 복귀를 촉진하는 이들 miRNA를 확인하기 위해, 활성화된 HSC가 전체 게놈 miRNA 라이브러리로부터 개별 miRNA 모방체를 받은 후, 정지상태의 마커인 레티노이드를 갖는 세포내 지질 액적의 재출현을 찾도록 비편향 기능적 스크린을 설계하였다 (도 2). 지질 액적을 거의 갖지 않는 활성화된 HSC를 배양하는 96 웰 플레이트에서 조사를 수행하였다. 개별 miRNA를 각각의 웰 내로 형질감염시켰을 때, 웰 중 일부에서의 HSC는 3일 이내에 재형성된, BODIPY 염색 양성 지질 액적을 보여주었다. 이 초기 스크린은 15개 1차 히트를 생성하였다. miRNA인 miR-15a 및 miR-412를 인간 오르토로그의 존재 및 마우스 및 인간 HSC 둘 다에서 지질 액적을 재형성하는 능력에 기초하여 추가의 조사를 위해 선택하였다 (도 3). 새로 형성된 지질 액적은 자외선 하의 형광에 의해 입증되는 레티노이드 양성이었으며, 이는 정지 HSC에서의 것과 일치한다 (도 17). 형질감염된 HSC의 전체 크기는 10-100배 감소하여, 보다 정지-유사하게 되었다 (도 4). 추가로, miR-15a 또는 miR-412의 강제 발현은 활성화의 가장 중요한 유전자 마커 중 2종인 알파 평활근 액틴 (Acta2) 및 알파-1 유형 (Col1a1)을 하향조절하였다 (도 4).
보다 포괄적인 발현 분석의 경우, 심층-RNA 서열분석은 miR-15a 또는 miR-412를 받은 정지-유사 HSC가 활성화된 세포보다 정지 HSC에 40-50% 더 가까운 전반적 전사 프로파일을 갖는다는 것을 입증하였다 (도 18). 가장 놀랍게도, miR-15a 또는 miR-412에 의해 정지-유사하게 된 HSC는 진정한 정지 HSC와 유사한 기능적 표현형을 가졌다. 생체외 실험은 2종의 세포 유형이 공동배양된 경우에 정지-유사 HSC가 건강한 간세포에서 지방증을 유도하지 않았다는 것을 입증하였다. 대조적으로, 후보 miRNA로 처리되지 않은 활성화된 HSC 또는 NASH-HSC는 공동배양된 경우에 간세포 지방증을 유도하였다 (도 19). 마지막으로 예상된 바와 같이, miR-15a에 대해서는 유의하지 않았지만, 내인성 miR-15a 및 miR-412가 정지 HSC와 비교하여 활성화된 HSC에서 감소된 발현 수준을 가졌다 (도 7).
miR-15a 및 miR-412는 간 성상 세포와 관련하여 연구된 바 없다. 그러나, miR-15 패밀리는 심장에서 Tgf-베타 경로를 억제하여 잠재적으로 섬유증을 약화시키는 것으로 밝혀졌고 [26], 이는 또한 만성 림프구성 백혈병에서 중요한 종양 억제자로서 공지되어 있다 [27, 28]. 대조적으로, miR-412에 대한 구체적 문헌은 존재하지 않고, 따라서 이의 기능은 완전히 공지되어 있지 않다. miRNA는, 일반적으로, 통상적으로 22개 뉴클레오티드 길이이며 모든 생물학적 및 병리학적 과정에 관여하는 짧은 비-코딩 유전자이다. 이들은 그의 mRNA 표적 내의 상보적 서열과 불완전하게 염기-쌍형성함으로써 표적 코딩 유전자를 하향조절하여 분해 또는 번역 억제를 유도한다. 각각의 miRNA는 많은 상이한 코딩 유전자를 조절할 수 있는 반면, 각각의 표적 유전자는 유전자 조절 네트워크의 복잡한 층을 구성하는 많은 상이한 miRNA에 의해 조절될 수 있다. miRNA는 모든 포유동물 코딩 유전자의 약 50%를 직접 표적화하며, 이는 유전자 조절에서의 그의 광범위함을 입증한다 [29]. miRNA는 세포 증식 및 재프로그램화에 필수적인 것으로 나타났다 [30-32]. 그럼에도 불구하고, HSC 활성화 또는 정지상태로의 복귀에 있어서 miRNA의 역할은 탐구되지 않았다.
HSC에서의 miR-15a 및 miR-412의 유력한 정지상태-촉진 효과 및 작용 메카니즘은 본원에서 입증된 바와 같다. WISP1은 miR-15a의 직접적 표적으로서 확인되었지만, miR-15a 및 miR-412 둘 다에 대한 다른 관련 표적이 존재할 가능성이 있다. 수많은 예측 알고리즘이 서열 상보성에 기초하여 miRNA의 잠재적인 직접적 표적을 예측하지만, 이들 예측된 표적의 대부분은 실험적 검증을 견딜 수 있는 실제 표적이 아니다. 따라서, HSC의 RNA-Seq를 다양한 활성화 상태에서 수행하여 miR-15a 및 miR-412의 진정한 직접적 표적을 확인할 수 있는 발현 프로파일을 정의하였다.
다음 3종의 유형의 HSC를 심층-서열분석하였다: 1) 건강한 마우스로부터 새로 수거된 정지 HSC, 2) 세포 배양 디쉬에서 다수회 계대배양된 활성화된 HSC, 및 3) miR-15a 또는 miR-412를 받음으로써 활성화된 상태로부터 정지상태로 복귀된 정지-유사 HSC. 정지-유사 HSC는 miR-15a 또는 miR-412 모방체를 받은지 바로 3일 후에 서열분석되었기 때문에, mRNA 수준에서의 임의의 코딩 유전자의 감소는 직접적 miRNA 표적화의 결과일 수 있다. 따라서, miR-15a 또는 miR-412를 받은 후 mRNA 수준이 감소된 유전자 세트를 예측 알고리즘에 기초하여 잠재적인 직접적 표적 세트와 오버레이시켰다 [33] (도 20). 2개의 모 세트로부터 유래된 공통 유전자의 이러한 새로운 세트 (이제 표적 후보 세트라 부름)는 진정한 직접적 표적을 포함할 확률이 더 높다.
표적 후보 세트가 여전히 분석하기에 너무 많은 유전자를 갖기 때문에, HSC 활성화를 촉진하는 2가지 가장 널리 공지된 신호전달 경로의 일부인 것으로 공지된 표적 후보 유전자, 즉 Tgf-베타 및 Pdgf의 유전자를 선택하였다. PANTHER 분석을 사용하여 이들 2가지 경로의 일부인 유전자를 필터링한 경우에, 각각 miR-15a 및 miR-412에 대해 12 및 11개의 표적 후보가 남았다 (도 20) [34]. 이들 유전자는 구성적으로 활성인 루시페라제 유전자 뒤에 클로닝된 돌연변이체 miRNA 결합 서열을 갖거나 갖지 않는 리포터를 구축함으로써 시험할 수 있다. 이들 리포터 구축물 중 하나 및 miRNA 모방체를 293 세포 또는 1차 HSC 내로 공동-형질감염시킬 수 있다. 공동-형질감염된 miRNA가 이 서열에 어닐링하고 루시페라제 단백질의 번역을 억제할 수 있다면, 이는 코딩 유전자가 시험된 miRNA의 진정한 직접적 표적이라는 것을 나타낼 수 있다. 돌연변이체 결합 서열은 miRNA가 어닐링하는 것을 방지하고 루시페라제의 거의 정상적인 발현을 가능하게 할 것이며, 이는 시험된 코딩 유전자 서열이 진정한 miRNA 표적이라는 것을 추가로 지지한다. 실제 형태 및 돌연변이된 형태 둘 다에서 23개의 고-잠재적 표적 후보 유전자 서열이 루시페라제 벡터 내로 클로닝될 필요가 있기 때문에 이 실험은 시간 소모적일 것으로 예상된다. 그러나, 직접적 표적을 발견하는 것은 miRNA에 대한 작용 메카니즘을 규명하는데 있어서 대체불가능하다 [32].
지금까지, miR-15a 또는 miR-412를 활성화된 HSC로 전달하는 효과가 본원에 기재되었다. miR-15a 및 miR-412의 기능을 추가로 이해하기 위해, 이전에 기재된 바와 같은 CRISPR 기술을 사용하여 1차 HSC에서 이들 유전자를 결실시킴으로써 확정적 기능 상실 실험을 완료할 수 있다 [35].
1차 HSC에 대한 이러한 기술 사용의 실행가능성을 과거에 이용된 digit 결실 벡터를 전달함으로써 검증하였다 (도 21) [35]. 다음 3종의 표적화된 HSC 세포주를 생성할 수 있다: 1) miR-15a-널, 2) miR-412-널, 및 3) miR-15a/miR-412-널. 이들 miRNA 둘 다는 과다발현에 의해 HSC 정지상태를 촉진하였기 때문에, 그의 결실은, 특히 miR-15a/miR-412-이중 널 세포주에서 활성화된 표현형을 유발할 수 있는 것으로 예상된다. miRNA가 많은 기능적 중복을 갖는 것으로 공지되어 있기 때문에, 뚜렷이 다른 표현형의 결여가 또한 가능하다. 활성화 수준은 RNA-Seq를 통해 그의 전반적 발현을 정의하고 활성화된 및 정지 HSC 둘 다와 비교함으로써 결정할 수 있다. 플라스틱 및 매트리겔 상에서 배양하면서 형태 및 증식을 평가할 수 있다. 활성화된 야생형 HSC는 매트리겔 상에서 정지상태로 복귀하는 것으로 공지되어 있고 [36], 녹아웃 HSC의 표현형은 이러한 환경에서 특징화될 수 있다. miR-15a 또는 miR-412 결실이 HSC 활성화에 기여한다면, 이러한 효과는 매트리겔의 정지상태-촉진 효과를 극복할 수 있다. miRNA-결실된 HSC와 간세포와의 상호작용은 공동배양 시스템으로 평가할 수 있다. 활성화된 HSC는 공동배양된 간세포가 지방증이 되고 염증유발 매개체를 발현하도록 유발한다. miRNA-결실된 HSC는 또한 활성화된 야생형 HSC의 것보다 훨씬 더 큰 지방증유발 표현형을 갖는 것으로 평가될 수 있다. 마지막으로, 재구성 miR-15a 또는 miR-412가 각각의 결실 세포주에서 야생형 표현형을 구제할 수 있는지 시험할 수 있다. 결실된 miRNA의 재구성은, 이미 클로닝되었고 기능 획득 실험을 위해 사용된 miRNA-발현 피기백 벡터를 형질감염시킴으로써 달성할 수 있다.
miR-15a 또는 miR-412가 개별적으로 발현되었지만, 이들을 동일한 HSC에서 함께 발현시키는 것이 또한 본원에서 구체적으로 고려된다. 더욱이, 이들 miRNA 중 하나만을 전달하는 것은 전반적 유전자 발현 패턴을, 이들을 연결하는 전사 축을 따라 활성화된 상태로부터 정지상태로 약 절반쯤 이동시킬 수 있다 (도 11). 두 miRNA를 과다발현시키는 것은 miRNA 단독을 발현시키는 것보다 활성화된 HSC를 정지상태로 훨씬 더 가깝게 복귀시킬 수 있다. 이러한 기능 획득 실험은 단일 피기백 벡터에 두 miRNA를 클로닝하고 이를 활성화된 HSC 내로 형질감염시킴으로써 수행할 수 있다. 피기백 벡터는 miRNA 유전자의 게놈 내로의 통합을 가능하게 하여 이들을 구성적으로 발현시킬 수 있다 [17]. 두 miRNA를 동시에 발현하는 HSC는, RNA-Seq를 사용한 전반적 유전자 발현, 형태, MTT 검정을 사용한 증식, 및 이러한 공동배양 방법 사용시 간세포와의 상호작용을 비롯하여, 다른 HSC 세포주를 특징화하기 위한 본원에 기재된 유사한 파라미터로 표현형결정할 수 있다.
두 miRNA를 발현하는 1차 HSC의 표현형이 정지 HSC와 훨씬 더 가깝게 유사하다면, CCl4-유도된 간 섬유증 및 식이 유도된 NASH의 세팅에서 단일 miRNA를 과다발현하는 HSC로서 세포 요법을 시험할 수 있다. 이러한 HSC 세포주는 miR-15a 또는 miR-412 단독을 발현하는 HSC 세포주에서 관찰된 것보다 훨씬 더 많이 간 손상 및 섬유증을 예방하거나 감소시킬 수 있다.
간 섬유증 또는 NAFLD의 마우스 모델로의 miR-15a 또는 miR-412 전달 시험
NASH의 식이 모델로부터의 HSC를 miR-15a 또는 miR-412로 처리하고, 이들을 간세포에서 정지상태로 복귀시켰다 (도 12). 추가로, miR-15a 및 miR-412는 심지어 활성화를 촉진하는 배양 조건에서도 활성화된 HSC를 정지상태로 강제 복귀시키는 것으로 보인다. 이들 주요 생체외 관찰은, 특히 miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 HSC가 심지어 활성화 촉진 신호를 갖는 이환된 간에서도 정지-유사 상태를 유지할 수 있기 때문에, 전통적인 CCl4 마우스 모델에서 이들 miRNA가 생체내 전달되어 간 병리상태의 수준을 약화시킬 수 있는지 여부를 시험하는 것을 가능하게 하였다. 세포 접촉 및 가용성 매개체를 통해, 정지-유사 HSC는 간 내의 다른 세포 유형이 지방증, 염증 또는 섬유증을 촉진하는 그의 신호를 약화시키도록 유도할 수 있다.
살아있는 마우스에게 miRNA를 전달하는 상이한 방법들이 존재하지만, 주사된 HSC는 miR-15a 또는 miR-412를 구성적으로 발현함으로써 정지-유사하게 되었다. 따라서, 정지-유사 상태로 조작된 HSC를 사용하여 간 질환에 대한 새로운 세포 요법의 실행가능성을 추가로 시험하였다. 재프로그램화된 HSC를 4-주 CCl4 챌린지의 제3주 동안 1회 주사함으로써 본 실험을 수행하였다. 주사된 HSC가 간에 이식되었다는 것은, 간 세포 내에서 miRNA를 발현하는 피기백 벡터 내로 삽입된 GFP 신호의 방출을 가시화함으로써 확인하였다 [17] (도 8). 보다 중요하게는, 정지-유사 HSC로 처리된 마우스는 간에서의 감소된 풍선화, 아폽토시스, 염증 및 섬유증 (도 8) 및 보다 낮은 간 콜라겐 발현 (도 9)을 나타내는 조직학을 가졌다. 이러한 관찰을 고려하면서, 간 섬유증 및 NASH의 추가의 마우스 모델을 사용하여 간 지방증, 염증 및 섬유증을 치료하는데 있어서의 miR-15a 및 miR-412의 잠재력을 추가로 평가하도록 생체내 실험을 확장시킬 수 있다. 이들 miRNA가 오로지 HSC를 통해서만 또는 보다 광범위하게 다른 세포 유형을 통해서도 그의 기능을 발휘하는지 여부를 평가하기 위해, 세포 요법 대신 바이러스 벡터 또는 모방체를 사용하여 miRNA를 전신으로 전달할 수 있다. 모든 생체내 처리 실험에 대해, 간에서의 섬유화유발 유전자의 PCR, H&E 및 시리우스 레드 염색을 포함한 조직학, 간 히드록시프롤린 검정을 수행하고, 혈장 ALT를 측정함으로써 효능을 평가할 수 있다.
중간엽 줄기 세포 및 대식세포를 사용하여, 다수의 그룹들이 간 섬유증에 대한 세포 요법을 이미 수행하였고, 일부 성공이 있었다 [18]. 그러나, 이들 실험은 간 섬유증을 예방하거나 역전시키기 위해 처음 의도적으로 조작된 HSC를 이용한다. HSC는 별개의 콘제닉 마우스로부터 기원하였고, 500,000개의 세포를 CCl4의 4주 과정의 제3주에 1회 주사하였다. 초기 결과가 유력하지만, 간 조직학의 개선이 CCl4 투여의 제4주에 유발된 간 손상의 예방으로부터 비롯된 것인지 또는 CCl4 챌린지의 처음 3주 동안 발생한 손상의 역전으로부터 비롯된 것인지 여부는 불명확하다. 지금까지 CCl4 모델만이 사용되었다는 것을 고려하면, NASH에서의 이러한 세포 요법의 효과는 잘 이해되지 않는다. 마지막으로, 세포 요법의 유익한 효과는 1회 초과의 주사로 증가할 수 있다. 이들 중요한 질문에 답하기 위해, NASH의 CDAHFD 모델에 추가로 간 섬유증의 CCl4 모델 (경구 위관영양 100 ul의 40% CCl4 1주 2회)을 사용할 수 있다 [19]. 모든 세포 요법 실험을 위해, 500,000개의 정지-유사 HSC를 miR-15a 또는 miR-412로 재프로그램화할 수 있다. 모든 적절한 대조군, 예컨대 비처리 및 재프로그램화되지 않은 HSC로의 처리가 있는 군을 포함시킬 수 있다.
정지-유사 HSC가 간 섬유증을 예방하거나 역전시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 상이한 세포 주사 스케줄을 사용한 2개의 별개의 실험을 사용할 수 있다. 모든 CCl4 투여를 1주 2회 경구 위관영양에 의해 수행할 수 있다. 8주 동안 CCl4로 챌린지된 마우스에서는 정상적으로 진행성 섬유증이 발생한다. 재프로그램화된 HSC는 CCl4 챌린지의 8주 과정 동안 제2, 제4 및 제6주에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제8주의 종료시에 희생시킬 수 있다. 세포 요법이 대조군과 비교하여 기존 간 섬유증을 역전시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 재프로그램화된 HSC를 CCl4 챌린지의 8주 과정이 완료된 후 제9주 및 제11주에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제12주의 종료시에 희생시킬 수 있다. 콜린-결핍, L-아미노산 한정, 고지방 식이 (CDAHFD) 모델은 제3주까지 유의한 NASH를 발생시키고, 제9주까지 2기 섬유증 (0-4 척도)을 발생시킨다 [19]. 제5주에 세포 요법의 단일 주사 또는 제3주, 제5주 및 제7주에 3회 주사를 완료할 수 있다. 모든 마우스를 제9주의 종료시에 희생시킬 수 있다.
활성화된 인간 HSC가 miR-15a 또는 miR-412의 인간 오르토로그를 받은 후에 정지-유사 상태로 복귀할 수 있는 것으로 이전에 나타났다 (도 8). 이들 복귀된 세포는 레티노이드 양성 지질 액적을 재형성하였고, 공동배양된 인간 간세포성 암종 세포주 HepG2 및 Huh7로부터 염증유발 시토카인 발현을 감소시킬 수 있었다 (도 6). 인간 요법에 대한 발견을 해석하기 위한 가교로서, miR-15a 및 miR-412의 치료 잠재력을 결정하는데 있어서 간 섬유증의 CCL4 마우스 모델을 치료하기 위해 1차 인간 HSC를 사용할 수 있다. 인간 세포의 면역 거부를 예방하기 위해 선택된 중증 복합 면역 결핍 마우스 (SCID)에서 CCl4를 1주에 2회 위관영양으로 공급하여 간 섬유증을 유도할 수 있다. CCL4-기반 간 섬유증 모델은 다른 그룹들에 의해 SCID 마우스로 성공적으로 생성된 바 있다 [37]. 섬유증 예방 연구: 인간 HSC를 SCID 마우스에 CCL4 챌린지의 8주 과정 동안 제2, 제4 및 제6주에 주사할 수 있다. 섬유증 복귀 연구: 재프로그램화된 인간 HSC가 대조군과 비교하여 기존 간 섬유증을 역전시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, HSC를 0014 챌린지의 8주 과정이 완료된 후 제9주 및 제11주에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제12주의 종료시에 희생시킬 수 있다.
초기 실험은 miR-15a 또는 miR-412로 재프로그램화된 HSC를 주사하는 것이 CCl4-유도된 간 섬유증에서 콜라겐 발현 및 간 손상의 전체 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다. miRNA를 전달하는 한 방법은 miRNA를 발현하는 렌티바이러스를 주사하는 것이다. CCl4 섬유증 연구: miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 렌티바이러스를 CCl4 챌린지의 8주 과정 동안 제2, 제4 및 제6주에 꼬리 정맥 내로 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제8주의 종료시에 희생시킬 수 있다. CDAHFD NASH 연구: miR-15a 또는 miR-412를 발현하는 렌티바이러스를 CDAHFD 9주 동안 제3주, 제5주 및 제7주에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제9주의 종료시에 희생시킬 수 있다.
또 다른 전달 방법으로서, 지질 기반 담체 (B100 사이언티픽의 맥스서프레서™)에 패키징된 보다 안정한 화학적으로 변형된 miRNA 모방체 (엑시콘 및 인비트로젠) 주사의 실행가능성을 시험할 수 있다 [38, 39]. 렌티바이러스를 피함으로써, 이 방법 또는 그의 변형법은 인간에서 사용될 잠재력을 갖는다. CCl4 섬유증 연구: miR-15a 또는 miR-412를 함유하는 지질 담체를 CCl4 챌린지의 8주 과정 동안 제2, 제4 및 제6주에 꼬리 정맥 내로 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제8주의 종료시에 희생시킬 수 있다. CDAHFD NASH 연구: miR-15a 또는 miR-412를 함유하는 지질 담체를 CDAHFD 9주 동안 제3주, 제5주 및 제7주에 주사할 수 있다. 모든 마우스를 제9주의 종료시에 희생시킬 수 있다.
간 지방증, 염증 및 섬유증에서의 WISP1의 기능 정의.
miRNA가 일반적으로 다수의 코딩 유전자를 표적화함으로써 기능한다는 것을 안다면, 이들 2종의 후보는 간 염증 및 섬유증을 촉진하는 HSC 유전자를 하향조절할 가능성이 있다. miR-15a 및 miR-412에 의해 억제되는 많은 유전자가 존재할 가능성이 있지만, WISP1이 처음 실험적으로 검증된 miR-15a의 직접적 표적으로서 나타났다. WISP1은 CDAHFD 유도된 NASH-HSC 조건화 배지에서 여러 상향-분비 단백질 중 하나로서 처음 확인되었으며, 이는 >100종의 대표적인 시토카인, 케모카인 및 세포외 매트릭스 단백질을 보유하는 시토카인 어레이 블롯을 사용하여 검출되었다 (도 22). 보다 상세한 분석은 활성화된 HSC가 정지 HSC 수준의 거의 30배의 WISP1을 발현하였다는 것을 보여주었다 (도 23). WISP1은 Cyr61 (Ccn1), Ctgf (Ccn2), Nov (Ccn3), WISP1 (Ccn4), Wisp2 (Ccn5) 및 Wisp3 (Ccn6)을 포함하는 매트릭스 세포 단백질의 Ccn 패밀리의 구성원이다. Ctgf는 간에서 중요한 섬유화유발 인자로서 이미 확립되어 있다 [42]. 흥미롭게도, WISP1은 인간 특발성 폐 섬유증에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌고, 블레오마이신 챌린지된 마우스를 중화 WISP1 항체로 처리하는 것은 폐 섬유증의 약화를 유발하였다 [43]. 더욱이, 소규모 동물 연구는 WISP1을 차단하는 것이 CCl4 유도된 간 섬유증을 호전시킨다는 것을 보여주었다 [44]. 그러나, 간에서의 WISP1의 역할은 특히 NASH와 관련하여서는 상세하게 연구되지 않았다.
CDAHFD-유도된 NASH-HSC가 공동배양된 간세포에서 지방증을 촉진한다는 것을 안다면 (도 14, 16), WISP1은 이러한 표현형에 기여할 수 있다. 실제로, WISP1이 건강한 마우스로부터 수거된 HSC에서 과다발현된 경우에, 이들 세포로부터의 조건화 배지는 초기 건강한 1차 간세포에서 지방증을 유발하였다 (도 24). 또한, miR-15a는 3'-UTR 내에 2개의 잠재적 miR-15a 결합 서열을 함유하는 WISP1을 표적화하는 것으로 예측된다. 따라서, 추정 표적 서열 또는 그의 돌연변이된 변이체를 구성적으로 활성인 루시페라제 리포터 유전자 뒤에 클로닝하였다. 이들 리포터 중 하나를 miR-15a 모방체와 함께 공동-형질감염시킨 경우에, 야생형 서열을 갖는 리포터는 감소된 루시페라제 발현을 갖는 반면 돌연변이된 서열을 갖는 리포터는 그렇지 않았으며, 이는 miR-15a가 두 WISP1 표적 서열에 결합한다는 것을 나타낸다 (도 11). 이들 데이터 및 공개된 문헌을 고려하여, WISP1은 HSC에서 miR-15a 작용 중 일부를 달성하기 위한 주요 표적 유전자일 수 있고, 또한 NASH를 관리하기 위한 약물 표적일 수 있다. WISP1의 간 기능은 NASH에 대한 치료 표적으로서의 잠재력인 것으로 본원에서 고려된다.
WISP1이 miR-15a의 직접적 표적이지만, HSC 활성화 상태에 대한 그의 영향 및 NAFLD 발병기전에서의 그의 역할은 불명확하다. 골 형성에서 WISP1의 역할을 입증하기 위해 WISP1-널 마우스 계통을 생성하였지만, 간에서의 그의 기능은 연구되지 않았다 [45]. 이들 마우스는 가임성이고, 명백한 간 표현형을 갖지 않는다. 이들의 돌연변이체 대립유전자는 캘리포니아 대학교 데이비스의 MMRRC 시설 내 동결된 정자 및 배아에 보존되어 성공적인 돌연변이체 마우스 유래를 보장한다 (첨부 레터 참조). 먼저, WISP1-널 마우스로부터 HSC를 수거하고, 생체외에서 그의 표현형을 특징화함으로써, WISP1의 기능을 HSC에서 규명할 수 있다.
정지 상태의 야생형 HSC는 플라스틱 상에서 7-10일 배양한 후에 활성화되고, 본원에 제시된 RNA-seq 데이터는 이들 2개의 군 사이의 전반적 유전자 발현의 명확한 차이를 입증한다 (도 11). WISP1-널 HSC를 사용하는 병행 실험을 사용하여, WISP1 결실이 심지어 활성화-촉진 환경에서도 전반적 발현 프로파일을 HSC 정지상태로 변화시키는지 여부를 평가할 수 있다. WISP1-널 마우스로부터 HSC를 단리한 후에, 세포를 플라스틱 디쉬 상에서 1일 (정지) 또는 28일 (야생형에서 활성화됨) 동안 배양할 수 있다. 그의 전체 유전자 발현은 RNA-seq를 통해 결정할 수 있고, 이 결과를 야생형 HSC의 결과와 비교할 수 있다. 전반적 비교는 다차원 척도법 분석으로 수행할 수 있고, 상세한 분석을 위해 차등 발현된 유전자를 확인할 수 있다.
플라스틱 상에서 배양하면서 세포 형태, 증식 및 이동을 비교할 수 있다. 파라미터, 예컨대 크기, 세포 프로세스의 정도, 지질 액적의 존재 및 이들이 UV-형광 양성인지의 여부, 레티노이드 저장의 징후 및 정지상태를 사용하여 형태를 결정할 수 있다. WISP1-널 HSC가 정지 HSC와 유사하게 감소된 증식을 갖는 경우에 PCNA 및 Ki-67 면역염색으로 증식을 검사할 수 있다. 또한 과거에 수행된 바와 같이 세포 증식 속도를 정량화하기 위해 MTT 검정을 수행할 수 있다 [32]. 본원에 제시된 예비 데이터 및 공개된 문헌은 WISP1이 섬유화유발 유전자라고 가리키고 있기 때문에, WISP1을 결실시키는 것은 아마도 심지어 플라스틱 디쉬 상에서 배양되는 동안에도 HSC의 정지상태를 촉진할 수 있다. 최종적으로, 녹아웃 HSC에서 WISP1을 재구성하는 것은 야생형 표현형을 구제할 수 있다. 재구성 WISP1은 WISP1-발현 피기백 벡터를 형질감염시킴으로써 달성할 수 있다. WISP1-발현 벡터로 형질감염된 WISP1-널 HSC는 형질감염되지 않은 WISP1-널 세포에 대해 사용된 것과 동일한 시험관내 검정으로 특징화할 수 있다.
WISP1-널 HSC와 간세포와의 상호작용은 본원에 기재된 공동배양 시스템으로 평가할 수 있다. 활성화된 야생형 HSC는 공동배양된 간세포가 지방증이 되도록 유발한다 (도 14). WISP1을 과다발현하는 HSC는 근처 간세포가 훨씬 더 큰 중증도로 지방증이 되도록 유도한다 (도 24). WISP1-널 HSC는 약화된 지방증유발 표현형을 가질 수 있다. 공동배양 검정의 판독치는 지질 액적에 대한 BODIPY 염색 및 염증유발 인자의 발현을 측정하기 위한 공동배양된 간세포의 PCR을 포함한다.
표현형은 간 병리상태의 전체 중증도에 의해 평가할 수 있다. WISP1-널 마우스를 CCl4 및 CDAHFD로 챌린지하여 각각 독소 유도된 간 섬유증 및 NASH를 모델링할 수 있다. 그 결과 WISP1-널 마우스에 의해 지속된 간 손상을 야생형 마우스의 것과 평가할 수 있다. 폐를 포함한 다른 기관에서의 WISP1의 공지된 섬유화유발 역할을 고려하여, WISP1-널 마우스는 감소된 간 섬유증 및 아마도 심지어 감소된 지방증 및 염증을 가질 것으로 예상된다. 모든 생체내 실험에 대해, 간에서의 섬유화유발 유전자의 PCR, H&E 및 시리우스 레드 염색을 포함한 조직학, 간 히드록시프롤린 검정을 수행하고, 혈장 ALT를 측정함으로써 간 표현형을 평가할 수 있다. 마지막으로, 간 질환의 이들 마우스 모델로부터 수거된 HSC의 기능적 표현형을 결정할 수 있다.
CCl4 섬유증 모델: 수컷 야생형 및 WISP1-널 마우스를 매주 2회 CCl4 위관영양으로 챌린지할 수 있다. 이들은 8주 동안 CCl4를 받을 수 있고, 이들을 제8주의 종료시에 희생시킬 수 있다. CDAHFD NASH 모델: 야생형 및 WISP1-널 마우스에 대한 CDAHFD를 9주 동안 공급할 수 있다. 마우스의 절반을 제6주의 종료시에 희생시키고, 다른 절반을 제9주의 종료시에 희생시켜, 중등도 NASH (CDAHFD 6주) 및 2기 섬유증을 동반한 말기 NASH (CDAHFD 9주)에서의 WISP1의 역할을 정의할 수 있다.
HSC를 4주의 CCl4 및 3주의 CDAHFD로 챌린지된 마우스로부터 단리할 수 있다. 이들 HSC를 건강한 간세포와 함께 공동배양하여 이들이 지방증을 발생시키고 염증유발 인자를 발현하는지 여부를 결정할 수 있다. 그 결과를 동일한 챌린지를 겪은 야생형 HSC의 결과와 비교할 수 있다.
WISP1를 중화 항체로 차단하는 것은 마우스 폐에서 블레오마이신-유도된 손상을 약화시켰다 [43]. 유사하게, WISP1을 중화시키는 것은 NASH에서 발생하는 염증 및 섬유증의 수준을 감소시킬 수 있다. NASH의 마우스 모델을 WISP1 항체로 처리하고, 6 및 9주의 요법 후에 간 표현형을 평가할 수 있다.
CDAHFD NASH 모델: 야생형 마우스에 대한 CDAHFD는 9주 동안 공급할 수 있다. 처리군은 상업적으로 입수가능한 항체 (알앤디 시스템즈) [43] 또는 항체를 매주 주사에 의해 받을 수 있다 [46]. 대조군은 IgG를 받을 수 있다. 마우스의 절반을 제6주의 종료시에 희생시키고, 다른 절반을 제9주의 종료시에 희생시켜, 각각 섬유증을 동반한 중등도 및 말기 NASH에서 WISP1 차단의 효과를 시험할 수 있다.
추가로, NASH로부터의 HSC의 조건화 배지를 분석하여, 분비된 주변분비 또는 자가분비 인자를 확인할 수 있다. 질량 분광측정법을 통한 NASH-HSC 조건화 배지의 보다 상세한 분석은 약물 표적일 수 있는 다른 매개체를 확인할 수 있다. 마지막으로, 대표적인 마우스 모델이 존재하는 한, 본원에 기재된 공동배양 시스템을 사용하여 다른 간 질환을 연구할 수 있다. 예를 들어, 알콜-공급된 마우스에서 세포 유형을 단리함으로써 알콜성 간 질환에서 간세포와 HSC의 상호작용을 모델링할 수 있다 [47].
참고문헌 - 실시예 1/2:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 3 - HSC 단리 프로토콜
하기 프로토콜을 본원에 기재된 실험에 사용하여 HSC, 예를 들어 mod-Hep/HSC를 단리하였다.
1. 안지오캐쓰(angiocath) 또는 나비형 바늘의 보조로 문맥 정맥에 캐뉼라삽입한다.
2. 간을 37℃에서 6mL/분으로 다음 용액으로 관류한다:
30 mL HBSS (Ca2+ 및 Mg2+ 부재), 관류 시작 직후, IVC 절단,
30 mL 0.05% 콜라게나제 [0.5 mg/mL --> 50 mL의 경우, 500 ul의 50 mg/mL 콜라게나제 스톡] (예를 들어, 콜라게나제 B; 로슈(Roche) 11088815001).
3. 관류 후, 간을 조심스럽게 절제하고 (특히 담낭), 글리슨 피막을 제거한다.
4. 간을 멸균 비커 내로 옮기고, 매우 얇은 조각으로 절단한다.
5. 나머지 20 mL의 0.05% 콜라게나제를 첨가하고, 인큐베이터 내 37℃에서 30분 동안 유지한다 [DNAse (10 ug/mL) 첨가] (예를 들어, DNase I; 로슈 10104159001).
6. 상하로 피펫팅하고, 페트리 디쉬에서 세포 스트레이너 (70 um)로 여과한다. PBS + DNAse (10 ug/mL)를 45 mL까지 첨가한다.
7. x 50 g에서 3분 동안 원심분리하여 간세포를 제거하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.
8. x 635 g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화한다.
9. 45mL PBS + DNAse (10 ug/mL)로 세척하고, x 635 g에서 10분 동안 원심분리한다.
10. 세포 현탁액을 70 um 세포 스트레이너를 통해 여과한다.
11. 45 mL PBS + DNAse (10 ug/mL)로 세척하고, x 635 g에서 10분 동안 원심분리한다.
12. 상청액을 흡인한다. PBS를 펠릿에 6.5mL의 총 부피로 첨가한다.
13. 3.5 mL 퍼콜 (9부 퍼콜, 1부 10x PBS)을 10 mL의 총 부피로 첨가하고, 혼합하고, 15mL 튜브 (예를 들어, 퍼콜; 퍼콜 플러스, 지이 헬스케어(GE Healthcare) 17-5445-02)로 옮긴다.
14. 1 mL의 PBS를 칼럼의 상단에 조심스럽게 첨가한다.
15. 칼럼을 RT, 30분, x 1130 g (가속 9, 브레이크 0)에서 원심분리한다.
16. 원심분리 후에, HSC는 PBS와 35% 퍼콜 사이에 위치한 층에 존재한다.
17. HSC를 마이크로피펫으로 흡인하고, 10mL DMEM으로 세척하고, x 635 g x 6분에서 원심분리한다.
18. 상청액을 흡인한다.
19. 펠릿을 재현탁시키고, DMEM + 20% FBS + 1% P/S 중에 플레이팅한다.
실시예 4: 간 질환의 치료 및 예방을 위한 WISP1 억제 항체.
WISP1에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체는 간 질환, 예컨대 원발성 담즙성 담관염 (PBC) 및 자가면역 간염 (AIH)을 치료 및 예방하는데 사용될 수 있다.
구체적으로, WISP1을 억제하는 선두 후보는 항-WISP1 IgG1/IgG4 항체 및 IgG1 ADCC를 포함한다. 항-WISP1 항체를 조작하기 위해 사용되는 전략은 반감기 연장을 위한 Fc 조작; 2종의 항섬유화 표적을 동시에 억제할 수 있게 하는 이중특이적 항체 기술; 및 (1) 항체를 격리체로부터 표적 이화작용을 구동함으로써 촉매 약물로 전환시키고, (2) CoG, 투여 수준 및 투여 빈도를 극적으로 감소시키고, (3) 피하 투여의 가능성을 증가시키고, (4) 완전한 차단 잠재력에 대한 필요를 제거하는 스위핑 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항-WISP1 항체가 WISP1을 억제하는 능력을 평가하기 위해, 항체를 신선한 HSC에 대해 시험하였다. WISP1 항체 (Ab WISP1 또는 WISP IgG, 알앤디 시스템즈, 1μg/mL)를 조건화 배지와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, HSC에 적용하였다. 음성 대조군으로서, HSC를 조건화 배지와만 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 항체 대신에 재조합 WISP1 (Rc-WISP1, 100ng/mL)을 또한 HSC에 첨가하였다. HSC 샘플을 처리 48시간 후에 평가하였다 (도 38a). Rc-WISP1은, 예를 들어 수탁 # O54774로서 확인된 세포주로부터 수득된 WISP1-CCN4이고, 알앤디 시스템즈로부터 상업적으로 입수가능하다. Rc-WISP1은 HSC에서 인큐베이션 후 제1일 및 제2일에 유의하게 증가된 세포 수 (도 38b), Acta2 mRNA 발현 (도 38c) 및 Col1a1 mRNA 발현 (도 38d)을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 HSC가 재조합 WISP1의 존재 하에 활성화된다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 상업적으로 입수가능한 항-WISP1 IgG (Ab Wisp1)는 HSC에서 HSC 활성화를 방지하였고; 항-WISP1과의 인큐베이션은 rc WISP1과 함께 인큐베이션된 HSC와 비교하여 인큐베이션 후 제1일 및 제2일에 유의하게 감소된 세포 수 (도 38b), Acta2 mRNA 발현 (도 38c) 및 Col1a1 mRNA 발현 (도 38d)을 유발하였다.
이어서, 항-WISP1 IgG를 콜린 결핍, L-아미노산 한정, 고지방 식이-유도 지방증 (CDAHFD) 마우스 모델로부터 단리된 1차 간세포에 대해 시험하였다. 간 질환, 예를 들어 NALFD 및 바이러스성 간염의 특징은 이환된 간 세포에서의 지질 액적의 증가이다. 지질 액적의 존재를 평가하기 위해, BODIPY 염색을 사용한다. 예상된 바와 같이, 대조군 IgG로 처리된 CDAHFD 세포는 증가된 BODIPY 염색을 가졌다 (도 38e 및 38f). 대조적으로, 항-WISP1 IgG로 처리된 CDAHFD 세포는 대조군인 건강한 세포와 유사하게 감소된 BODIPY 염색을 가졌다 (도 38e 및 38f). 따라서, 본원에 제시된 데이터는 항-WISP1 IgG가 이환된 간 세포를 건강한 간 세포로 복귀시킬 수 있다는 것을 보여준다.
마지막으로, 항-WISP1 IgG가 HSC 이동을 조정할 수 있는 능력을 보여주기 위해, HSC를 배양하여 단층을 형성한 다음, 손상시켰다 (도 39a-도 39b). 세포를 60-mm 내 성장 배지에서 90% 전면생장률로 배양하였다. 멸균 P200 피펫 팁을 사용하여 단일 선형 스크래치 손상을 생성하였다. 세포를 PBS로 세척하여 부유 세포 파편을 제거하고, 재조합 Wisp1 단백질 (100 ng/mL, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스) 및 모노클로날 Wisp1 항체 (1 μg/mL, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 24시간 동안 재공급하였다. 스크레이프 손상을 도입하였을 때, 손상 12시간 및 24시간 후에, 도립 현미경을 사용하여 손상 봉합 또는 세포 이동을 사진촬영하였다. 영상 상에 놓인 표준 주형을 사용하여 각각의 시간에 디쉬 내 손상 가장자리들 사이의 면적을 측정하였다. 데이터는 초기 손상 면적 대비 손상 면적 (백분율)으로서 표현하였다. 손상된 면적은 공중 이용가능한 이미지J (NIH) 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
손상 후, HSC를 Rc WISP1 또는 항-WISP1 IgG와 함께 인큐베이션하였다. rc WISP1과 함께 인큐베이션된 HSC는 특히 12시간 시점 후에, 대조군 또는 항-WISP1 IgG 처리된 HSC와 비교하여 더 신속한 이동을 보여주었다. 대조적으로, 항-WISP1 IgG와 함께 인큐베이션된 HSC는 대조군 처리된 HSC와 유사한, 더 느린 이동을 유발하였다 (도 39a-도 39b). 항-WISP1 IgG는 Rc-WISP1로 처리된 HSC와 비교하여 손상 후 HSC 이동을 방지하였다. 이 결과는 WISP1을 억제하는 항체가 HSC 활성화 및 이동을 방지하여, 이들을 간 질환을 치료하는데 유용한 작용제로 만들 수 있다는 것을 확인시켜 준다.
서열
서열식별번호: 1은 인간 WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1 이소형 1 전구체를 코딩하는 아미노산 서열이다.
Figure pct00011
서열식별번호: 2는 인간 WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1 이소형 2 전구체를 코딩하는 아미노산 서열이다.
Figure pct00012
서열식별번호: 3은 인간 WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1 이소형 3 전구체를 코딩하는 아미노산 서열이다.
Figure pct00013
서열식별번호: 4는 인간 WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1 이소형 4 전구체를 코딩하는 아미노산 서열이다.
Figure pct00014
서열식별번호: 5는 인간 WNT1 유도성 신호전달 경로 단백질 1 (WISP1), 전사체 변이체 1, mRNA의 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
서열식별번호: 6은 마우스 WNT1-유도성-신호전달 경로 단백질 1 전구체의 아미노산 서열이다 [무스 무스쿨루스(Mus musculus)].
Figure pct00018
서열식별번호: 7은 마우스 WNT1 유도성 신호전달 경로 단백질 1 (Wisp1), 전사체 변이체 1, mRNA의 뉴클레오티드 서열이다 [무스 무스쿨루스].
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
서열식별번호: 8은 인간 MiR 15a의 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00022
서열식별번호: 9는 인간 Mir-412의 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00023
서열식별번호: 10은 마우스 MiR 15a의 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00024
서열식별번호: 11은 마우스 Mir-412의 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00025
서열식별번호: 12-31은 IgG에 대한 라투스(Rattus) 중쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00026
Figure pct00027
서열식별번호: 32-51은 IgG에 대한 라투스 경쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00028
Figure pct00029
서열식별번호: 52-71은 IgG에 대한 오비스 아리에스(Ovis aries) (양) 중쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00030
서열식별번호: 72-90은 IgG에 대한 오비스 아리에스 (양) 경쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00031
서열식별번호: 91-110은 IgG에 대한 카프라 히르쿠스(Capra hircus) (염소) 중쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00032
서열식별번호: 111-121은 IgG에 대한 레포리다에(Leporidae) (토끼) 중쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00033
서열식별번호: 122-141은 IgG에 대한 레포리다에 (토끼) 경쇄 상보성 결정 영역이다.
Figure pct00034
SEQUENCE LISTING <110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF LIVER DISEASE <130> 030258-093380WOPT <140> PCT/US2019/056910 <141> 2019-10-18 <150> 62/747,903 <151> 2018-10-19 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Trp Phe Leu Pro Trp Thr Leu Ala Ala Val Thr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ser Thr Val Leu Ala Thr Ala Leu Ser Pro Ala Pro Thr Thr Met 20 25 30 Asp Phe Thr Pro Ala Pro Leu Glu Asp Thr Ser Ser Arg Pro Gln Phe 35 40 45 Cys Lys Trp Pro Cys Glu Cys Pro Pro Ser Pro Pro Arg Cys Pro Leu 50 55 60 Gly Val Ser Leu Ile Thr Asp Gly Cys Glu Cys Cys Lys Met Cys Ala 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gly Asp Asn Cys Thr Glu Ala Ala Ile Cys Asp Pro His 85 90 95 Arg Gly Leu Tyr Cys Asp Tyr Ser Gly Asp Arg Pro Arg Tyr Ala Ile 100 105 110 Gly Val Cys Ala Gln Val Val Gly Val Gly Cys Val Leu Asp Gly Val 115 120 125 Arg Tyr Asn Asn Gly Gln Ser Phe Gln Pro Asn Cys Lys Tyr Asn Cys 130 135 140 Thr Cys Ile Asp Gly 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ccagaggcat ccatgaactt 960 cacacttgcg ggctgcatca gcacacgctc ctatcaaccc aagtactgtg gagtttgcat 1020 ggacaatagg tgctgcatcc cctacaagtc taagactatc gacgtgtcct tccagtgtcc 1080 tgatgggctt ggcttctccc gccaggtcct atggattaat gcctgcttct gtaacctgag 1140 ctgtaggaat cccaatgaca tctttgctga cttggaatcc taccctgact tctcagaaat 1200 tgccaactag gcaggcacaa atcttgggtc ttggggacta acccaatgcc tgtgaagcag 1260 tcagccctta tggccaataa cttttcacca atgagcctta gttaccctga tctggaccct 1320 tggcctccat ttctgtctct aaccattcaa atgacgcctg atggtgctgc tcaggcccat 1380 gctatgagtt ttctccttga tatcattcag catctactct aaagaaaaat gcctgtctct 1440 agctgttctg gactacaccc aagcctgatc cagcctttcc aagtcactag aagtcctgct 1500 ggatcttgcc taaatcccaa gaaatggaat caggtagact tttaatatca ctaatttctt 1560 ctttagatgc caaaccacaa gactctttgg gtccattcag atgaatagat ggaatttgga 1620 acaatagaat aatctattat ttggagcctg ccaagaggta ctgtaatggg taattctgac 1680 gtcagcgcac caaaactatc ctgattccaa atatgtatgc acctcaaggt catcaaacat 1740 ttgccaagtg agttgaatag ttgcttaatt ttgattttta atggaaagtt gtatccatta 1800 acctgggcat tgttgaggtt aagtttctct tcacccctac actgtgaagg gtacagatta 1860 ggtttgtccc agtcagaaat aaaatttgat aaacattcct gttgatggga aaagccccca 1920 gttaatactc cagagacagg gaaaggtcag cccgtttcag aaggaccaat tgactctcac 1980 actgaatcag ctgctgactg gcagggcttt gggcagttgg ccaggctctt ccttgaatct 2040 tctcccttgt cctgcttggg gttcatagga attggtaagg cctctggact ggcctgtctg 2100 gcccctgaga gtggtgccct ggaacactcc tctactctta cagagccttg agagacccag 2160 ctgcagacca tgccagaccc actgaaatga ccaagacagg ttcaggtagg ggtgtgggtc 2220 aaaccaagaa gtgggtgccc ttggtagcag cctggggtga cctctagagc tggaggctgt 2280 gggactccag gggcccccgt gttcaggaca catctattgc agagactcat ttcacagcct 2340 ttcgttctgc tgaccaaatg gccagttttc tggtaggaag atggaggttt accggttgtt 2400 tagaaacaga aatagactta ataaaggttt aaagctgaag aggttgaagc taaaaggaaa 2460 aggttgttgt taatgaatat caggctatta tttattgtat taggaaaata taatatttac 2520 tgttagaatt cttttattta gggccttttc tgtgccagac attgctctca gtgctttgca 2580 tgtattagct cactgaatct tcacgacaat gttgagaagt tcccattatt atttctgttc 2640 ttacaaatgt gaaacggaag ctcatagagg tgagaaaact caaccagagt cacccagttg 2700 gtgactggga aagttaggat tcagatcgaa attggactgt ctttataacc catattttcc 2760 ccctgttttt agagcttcca aatgtgtcag aataggaaaa cattgcaata aatggcttga 2820 ttttttaatg tcatttttcc ctcttatagt ctttctagct ccttttcaaa agacgagaat 2880 atctgatttt ctgataattt aggtgcttaa gcatccaaaa tacatgggac acacaaaaat 2940 ccaggaatcc cctgtagctt attccctctt tcccatcgga accagctctc atcacacatt 3000 taaaagatga ttctgtttac ccaatgctgc atattgaatg ttgtgtagtt attcacaggg 3060 aattctgtgc agtgtgcaga gagattccta aacgggaaaa ggactgggaa tacatcctcc 3120 ttactgtgac ctccccaaaa cctagtccag tgcaaggtat acagtggtgc tcattaaata 3180 cttgatgaat acaggaagct gtgcatgtgt tcctactttt attcgaagct ctcttcttcc 3240 aaagctacat gaaaatagaa ttttaacagt caaaatttta tattaagtgc cttagcaaaa 3300 gagacattta atatttcaaa gaaatgcata tgtatgtata catatatttg tgtatgcgta 3360 tgcaagaatt cttgtataaa gagaattcac tccatgaatg atctcttctg taagtcagtg 3420 tgaatcatgt tagattttct gagagtgaaa acacctgcca tctacaaatt acaaggctgg 3480 ataacagctc actccatttg aaattcagtg gaaacccaag agctaggttc ttactgaatt 3540 tgcatctcaa tttgggaaac tgaacttagc tttcaaagat cataggaagt ctggttggag 3600 aaactaggga ttattctggc aatgggtgca ggaaggtggt cagaataacc cagtcgccat 3660 tggttttgag aaacggaact atcttatgca gagcccggag ggcaagtctc agacccatgg 3720 gttgaagcca tggagaagga aatttggatc caatgtaatg aagcgctttc taagtcagaa 3780 tttccctgca atggtgtggc ctgattcaat aaaaattaag aataataaat ataatggaaa 3840 aaaatctcca ctgattgagt gtttacttgg tgccaagcac tatgctaagt tgttcattat 3900 tttatttaat tgttacagca attttgagta tgcatctttc actattttat aagtggaaaa 3960 gagaagtgcc cccaaaaagt tagagctcaa acagcagctt attctaccag cccctgctct 4020 tgcggaggcc tctggaaaag acctgaatga cacctattgg agaattacat ctacaagggg 4080 cttcaaacag accaaataga tcatcacctc tgtggtccct tgttaactat atgttctgag 4140 acaaaggaaa gctaccctaa gggttagtta acctttgctg aggaaattta cattcatact 4200 tagagtgaat tactcaggtg tgcttaggtg tgcaaaaggg aaggagacct gaattcacca 4260 agttaaatct tgctaaacct tatcataagc attttttgag cgcttagcat acaccaagcc 4320 ttgtggaagg tgctttcctg ccatatctca tttaatcctc acagcaaacc tatagaatat 4380 ggcattatca tctgagtctc acagaagttt agtcgtgtac tcaaggtctt accagctagt 4440 gaacagcaga ccaagactgg aaacccagga tagtctgata cctgagccat ctcttcttgt 4500 gctacgccta gttattctgt cccccaaatc aaaaggcatg acctttataa gaggcgcttt 4560 actgacaata gctgcaattt taactttgaa aatgattcag aattatcaaa gatagtagat 4620 tcgaatgaca tgattgtcta taatctcgct agccttgtac tgtgtgtgca tagcaattac 4680 agggaagtaa tctagctcct gactattatg ttgaactatg tcgctgcttt ttacaaactt 4740 gtcttgatcc aaagcagtca caatgataac cctgcatatc tgggaatcat aagtcaacta 4800 tgtatccctg tgtgtgtata tatatgtatg tatgtatcta ttttcaaact gtgatttaat 4860 atttaaatat tcctactgcc atttttgtga ctgaaaaact acacatgagg aaacgtctta 4920 gaattttcca atagaggaaa aataacactt gggcaatctg tcatgtttca caacagttct 4980 catttttctc atgatttgtg tagcgtggaa tgtgtttgct caatgtgaag ggttttcatt 5040 gctcaatttc tctgtgtaag tcttttcctt aaggtaataa accatcagca aagtcacata 5100 ctggagttgg tggcttttct tgtacaggca gttgttatga gacaatgatg gagcattgag 5160 catgttcaat aaatgtgcag atggtggaaa aaaa 5194 <210> 6 <211> 367 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Arg Trp Leu Leu Pro Trp Thr Leu Ala Ala Val Ala Val Leu Arg 1 5 10 15 Val Gly Asn Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ser Pro Thr Pro Thr Thr Met 20 25 30 Thr Phe Thr Pro Ala Pro Leu Glu Glu Thr Thr Thr Arg Pro Glu Phe 35 40 45 Cys Lys Trp Pro Cys Glu Cys Pro Gln Ser Pro Pro Arg Cys Pro Leu 50 55 60 Gly Val Ser Leu Ile Thr Asp Gly Cys Glu Cys Cys Lys Ile Cys Ala 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gly Asp Asn Cys Thr Glu Ala Ala Ile Cys Asp Pro His 85 90 95 Arg Gly Leu Tyr Cys Asp Tyr Ser Gly Asp Arg Pro Arg Tyr Ala Ile 100 105 110 Gly Val Cys Ala Gln Val Val Gly Val Gly Cys Val Leu Asp Gly Val 115 120 125 Arg Tyr Thr Asn Gly Glu Ser Phe Gln Pro Asn Cys Arg Tyr Asn Cys 130 135 140 Thr Cys Ile Asp Gly Thr Val Gly Cys Thr Pro Leu Cys Leu Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Pro Arg Leu Trp Cys Arg Gln Pro Arg His Val Arg Val Pro 165 170 175 Gly Gln Cys Cys Glu Gln Trp Val Cys Asp Asp Asp 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ctttgacaaa cgcccccggg ggctgaggaa ggctctccgc tgctctgatg ggccagccca 120 gtcctggccc agctccctgg agaggcatcc gcatcctctg ggctgagccg tagctcctgt 180 gacgctgact tccaggcatg aggtggctcc tgccctggac gctggcagcc gtggcagtcc 240 tgagggtggg caacatcctg gccacggccc tctctccaac ccccacaaca atgaccttca 300 ccccagcacc actagaggaa acgactacac gccccgaatt ctgcaagtgg ccatgtgagt 360 gcccacaatc cccacctcgc tgcccactgg gcgtcagcct aatcacagat ggctgtgaat 420 gctgtaagat atgtgcccag cagcttgggg acaactgcac agaggctgcc atctgtgacc 480 cacaccgggg cctctactgc gattacagtg gggatcgccc gaggtacgca ataggagtgt 540 gtgcacaggt ggtcggtgtg ggctgtgtcc tggatggcgt acgctacacc aatggcgagt 600 ccttccaacc caactgcagg tacaactgta cctgcattga tggcacggtg ggctgcacac 660 cgctgtgcct aagccccagg cccccacgcc tctggtgccg ccagccccgg cacgtgagag 720 tccctggcca gtgctgtgag cagtgggtgt gtgatgatga cgcaaggaga ccacgccaga 780 ctgcactgtt ggacaccaga gcctttgcag cgtcaggcgc cgtggagcaa cggtatgaga 840 actgcatagc ctacactagt ccctggagcc cctgctctac cacctgtggc ctaggtatct 900 ccactcggat ctctaacgtc aatgcccggt gctggccaga gcaggaaagt cgcctctgca 960 acctgcggcc atgtgatgtg gacatccaac tacacatcaa ggcagggaag aaatgcctgg 1020 ctgtgtacca gccagaggag gccacgaact tcactctcgc aggctgtgtc agcacacgca 1080 cctaccgacc caagtactgc ggagtctgta ctgacaatag gtgttgcatc ccctacaagt 1140 ccaagaccat cagtgtggat ttccagtgtc cagaggggcc aggtttctcc cggcaggtcc 1200 tatggattaa tgcttgcttc tgcaacctga gctgcaggaa tcctaacgat atctttgctg 1260 acttggaatc ttaccctgac ttcgaagaga ttgccaatta ggtgggtgtg tggctcaggg 1320 taaagttcca tgctgcaaag cagccagccc tttgtggtcc aggacttcac aattgagcct 1380 tatttcatct acttcctact cgattctgaa ttcccagttt ctgttcctgt tttgacaatc 1440 gtaatggccc aggagagtgc tgctcaggct cagacaatgg gttcctcctt ggggacattc 1500 tacatcattc caaggaaaac acatctctga ctgttcacaa tggaagcaaa gcctggccca 1560 gctagtctgg ctccagcctg ggcaagttgt cagaagttgt gatgggattg tccaaggaaa 1620 agcatcagct gaagaaccag tatcatgaag tccttcctca gatgccaagc ctagggatgc 1680 tgggatcctt tcagacagat ggatgggatt ggggacacag gaataagcta ttattttacc 1740 cttgccaaat gatactatcc tgggtatttc tgcctaaaac ataccaaaag tgttcttgtt 1800 ccactgatct gtatatcaca agtcaccaaa cattttccag gtgaggacca tagttgtgtc 1860 attctgtttt gctattgaaa atcattttaa aaagaaggaa aaaaaaaaaa gaaaagaaaa 1920 gaaagtcatt tcattaactt gggcactttc tcctctcacc ccatattcta taaagggcta 1980 aacttgggtt cttgttgatc aggaatgtaa tttgagaagt cttacttttg cagggagatg 2040 gtagccctca attcatcccg tagggatggg acaaggccag ccaatctttc aagccatagc 2100 tgggcaggtc actgaatctg ctgctggcca agttcttagg acaattagcc aaaatctggg 2160 cctctctctc cctagggttc atgggagttg gtagggaccg tagagtgact tgtctgttgt 2220 ctcaaaaagt aagatggaaa gatgttctca tggcccttag aagactcttt tgaagtctac 2280 gccagaccta acagaatatg tgcatcaaac aaacaagtgg atcaccctcc catggcctgg 2340 gtgacctcta gcagtcaccc agtgactgtg gtaaggccac agtagtccct ggacccagga 2400 caaatctttt ttgtttcagt gacctacttt acagcctcag tgtctatgaa gaaagttaac 2460 tcagttttct catctgaaga cagaagtcga ccagccattc agaaatgggg atctatttag 2520 tagtggtaaa cgttaaagag tttgtaagct aaagaaatat tttttttcct aagtgataat 2580 gaggttgtta 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ttctattgga aaaatctgcc ttaacagcta actctgtaag aacttccata 3480 ggagccataa gctagggtct tcccaggtat ccatcctctt ttgggaaact gagctgagca 3540 tcttcaacca aaggagttag ggtgatcatt gggaatagga gaaagggatg gccagggtag 3600 ctccatcgtt atttagaaac agacctggca tacagaacga ccagaggaac caaccttctt 3660 tgaaccaagg gaaaaagact tggatgtaat atatagaagc tttttctaat agtcagaaac 3720 agactttaat tgtatggcct ggttcaagga aagttaagaa tgtccattat cgttaaaaac 3780 aaaagtccat tattgatagc ttatttggtg ctaagcccta cggtgcattt tgtccggcta 3840 tcacttagca gagccatgct cagtacacag tctttctcta ttcaataaat agaaacgctg 3900 aagctcaaag gcactgagga gctgaggctc agaagcatgt ttagtccact ctatcagggg 3960 gggaagagat cttgacggaa cctaaatgac tactattgga aactcatatt tgaaagcttt 4020 cagaagtccc acccccaccc catccccaga tgcttagaaa ctaaagaagc aatgaggatg 4080 agctagcctt cagtgaagag gttcactact gcaccaagag tgaatgtctt aggtgtactt 4140 agtcattgga cagggagacc tgagtgagtt tgtgaacctg cagcttacta aaccttacaa 4200 tgagcatttg gagagccaag actgcttctc ggcgctttac tgacatggct tgcttaatct 4260 tctcagtgag cccaagagtc agggcgttac cactgcccat tttagggctg agaaagcaaa 4320 atctccagga gttaagtgat ttgctcaagt ttttaaccaa ccgaggcact gcagataaac 4380 tccgaagccc agtgtcatgt aacatgccca tgccatctct ccggacacgc agcccatttt 4440 cctgttccta aaccaaaggc tcagagtcac cagaaccaac tcacaggaca gtgcagaaat 4500 tctaatgtcg agggtgatta gagactgatc aaagaaagta atttcaaatg atatgattgt 4560 ttgtaagcac cctagttaat tctggactac atatgcatag agattgtgaa gaacattaca 4620 gcctgtgact ataacgttga cttctgtcat ttctttttaa agacttgttt tttttttttt 4680 actcaaagga cccacagtga cagccctgaa tggttgagaa gcattgatta gctgtgagtc 4740 ctgcatatgt atgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtatttgt atgtacttat ctattttcaa 4800 actgtgattg tgtatttaaa tattcctcct gccattttgt aagtgattac gcataaagaa 4860 acacctttga atgtcctaat aaaggagagc tagcccttgg gcggcctgtc acattttgcc 4920 actttcctca tttttctcat gatctgtgta gcagggaatg tgtttgttca accatgatga 4980 gttttcattg ttcaaattct ttgtttacag cttttctcct taaagcaata aatcatcagc 5040 aacagtaa 5048 <210> 8 <211> 83 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 ccuuggagua aaguagcagc acauaauggu uuguggauuu ugaaaaggug caggccauau 60 ugugcugccu caaaaauaca agg 83 <210> 9 <211> 91 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 cugggguacg gggauggaug gucgaccagu uggaaaguaa uuguuucuaa uguacuucac 60 cugguccacu agccguccgu auccgcugca g 91 <210> 10 <211> 84 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 10 cccuuggagu aaaguagcag cacauaaugg uuuguggaug uugaaaaggu gcaggccaua 60 cugugcugcc ucaaaauaca agga 84 <210> 11 <211> 80 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 11 ggguauggga cggauggucg accagcugga aaguaauugu uucuaaugua cuucaccugg 60 uccacuagcc gucggugccc 80 <210> 12 <211> 216 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 12 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met 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Rattus rattus <400> 34 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asn Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Lys Phe Tyr Pro Arg Asp Ile 130 135 140 Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Ala Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Gln Ser His Asn Leu Tyr Thr 180 185 190 Cys Gln Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Ala Lys Asn 195 200 205 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<223> Description of Unknown: Leporidae sequence <400> 134 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Lys Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val 65 70 75 80 Gln Cys Asn Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Gly 85 90 95 Ala Thr Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu 100 105 110 <210> 135 <211> 110 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Leporidae sequence <400> 135 Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp 85 90 95 Asp Ala Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu 100 105 110 <210> 136 <211> 110 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Leporidae sequence <400> 136 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ala Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu 100 105 110 <210> 137 <211> 112 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Leporidae sequence <400> 137 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ser Gly Trp Tyr Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu 100 105 110 <210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Leporidae sequence <400> 138 Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser 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Claims (60)

  1. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 간 질환이 알라질 증후군; 알콜-관련 간 질환; 알파-1 항트립신 결핍; 자가면역 간염; 양성 간 종양; 담도 폐쇄증; 간경변증; 크리글러-나자르 증후군; 갈락토스혈증; 길버트 증후군; 혈색소증; 간성 뇌병증; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 간신 증후군; 임신 중 간내 담즙정체 (ICP); 리소솜 산 리파제 결핍 (LAL-D); 간낭; 간암; 신생아 황달; 비-알콜성 지방간 질환; 비-알콜성 지방간염; 원발성 담즙성 담관염 (PBC); 원발성 경화성 담관염 (PSC); 진행성 가족성 간내 담즙정체 (PFIC); 라이 증후군; 제I형 글리코겐 축적 질환; 경피증; 및 윌슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, WISP1이 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4로 이루어진 군으로부터 선택된 스플라이스 변이체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, WISP1이 표적 세포에서 억제되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표적 세포가 포유동물 세포인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적 세포가 간 성상 세포, 섬유모세포 또는 근섬유모세포인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 간 성상 세포가 정지 세포인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항체 또는 항체 시약이 직접 주사, 정맥내 전달, 피하 주사, 근육 주사, 경피, 경구 또는 비강 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, WISP1을 억제하는 것이 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, WISP1의 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 억제되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, WISP1의 수준이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
  14. WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 간 질환을 치료 또는 예방하기 위해 제제화되는 조성물.
  18. a. 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Acta2, Col1a1의 수준을 검출하는 단계;
    b. (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계;
    c. 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Acta2, Col1a1을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및
    d. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, (a) 전에, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 또는 경피증인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 조직, 백혈구 연층, 혈청 또는 조직인 방법.
  22. 제18항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
  24. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 및 경피증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, WISP1이 WISP1v, WISP1vx 및 WISP1델타 엑손 3-4로 이루어진 군으로부터 선택된 스플라이스 변이체인 방법.
  27. 제24항에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
  29. 제27항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 작용제가 직접 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 비강 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  32. 제24항에 있어서, WISP1을 억제하는 것이 WISP1 활성을 억제하거나 또는 WISP1 단백질 수준을 감소시키는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, WISP1의 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 억제되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, WISP1의 수준이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과만큼 감소되는 것인 방법.
  35. 제24항에 있어서, WISP1이 표적 세포에서 억제되는 것인 방법.
  36. WISP1을 억제하는 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 조성물.
  39. a. 대상체의 생물학적 샘플에서 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2의 수준을 검출하는 단계;
    b. (a)의 측정치를 참조 수준과 비교하는 단계;
    c. 참조 수준과 비교하여 (a)에서 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 단계; 및
    d. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, (a) 전에, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 간 질환이 원발성 담즙성 담관염, 자가면역 간염, 알파 1 항트립신 결핍, 비-알콜성 지방간염 또는 경피증인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 조직, 백혈구 연층, 혈청 또는 조직인 방법.
  43. 제39항에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
  45. 제43항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
  47. 간 성상 세포를 WISP1을 억제하는 작용제와 접촉시키는 단계 및 세포를 작용제의 발현이 가능하도록 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, WISP1을 억제하는 작용제를 발현하는 조작된 간 성상 세포 또는 그의 집단을 생성하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 세포가 정지 세포인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 접촉이 세포를 작용제 또는 작용제를 코딩하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 접촉이 형질도입, 뉴클레오펙션, 전기천공, 직접 주사 및/또는 형질감염을 포함하는 것인 방법.
  51. 제47항에 있어서, WISP1을 억제하는 작용제가 소분자, 항체 또는 항체 시약, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 바이러스 벡터, miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 마이크로RNA가 마이크로RNA15a 또는 miRNA412인 방법.
  53. 제51항에 있어서, WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약이 mab1680, AF1680, SAB2501114, ab60114 및 ab65943으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 항체 또는 항체 시약 아미노산 서열이 서열식별번호: 1-4, 6 또는 12-120 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 상동성을 포함하는 것인 방법.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포를 포함하는 세포주.
  56. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 간 성상 세포 또는 그의 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  57. 간 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포, 제55항의 세포 또는 제56항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  58. 섬유증의 감소를 필요로 하는 대상체에게 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포, 제55항의 세포 또는 제56항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법.
  59. a. 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Acta2, Col1a1을 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및
    b. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 항체 또는 항체 시약을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  60. a. 참조 수준과 비교하여 증가된 WISP1 및/또는 Yap, Col1a1, Acta2를 갖는 대상체를 간 질환을 갖는 것으로 확인하는 검정의 결과를 받는 단계; 및
    b. 간 질환을 갖는 대상체에게 WISP1을 억제하는 작용제 시약을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
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