JP2022512735A - 肝疾患を治療するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書には、肝疾患を治療するための方法および組成物が記載されている。本発明の態様は、対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することに関する。本発明の別の態様は、対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現するＨＳＣを投与することに関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／７４７，９０３号の特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、この文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は、肝疾患の治療に関する。
肝臓は、代謝産物を濾過し、タンパク質を合成する非常に重要な臓器であり、消化に必要な生化学物質を産生することができる。具体的には、肝臓は、胆汁を産生して、脂肪を分解し、脂質を乳化する。慢性および進行性の肝疾患は、胆汁の蓄積、重度の炎症、瘢痕化、および線維症に結び付き得る肝臓の胆管の進行性破壊をもたらす場合がある。健常肝臓組織が瘢痕組織に置き換わると、肝機能は益々損なわれてしまう。一部の肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ））の場合、生存率を向上させることができる薬物は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）のみである。残念ながら、ＵＤＣＡ治療患者のおよそ４０％は、この療法に対して十分な応答を示さない。したがって、ＰＢＣなどの肝疾患の治療には、より有効な治療薬が必要とされている。
本明細書に記載の発明は、部分的には、ｍｉＲＮＡ－１５ａ、ｍｉＲＮＡ－４１２、および抗ＷＩＳＰ１抗体によるＷＩＳＰ１の阻害が、肝臓の線維形成進行に中心的な役割を果たす細胞タイプである活性化肝星細胞（ＨＳＣ）の静止状態を誘導したという知見に関する。ｍｉＲ－１５ａおよびＷＩＳＰ１ ＩｇＧは、ＷＩＳＰ１を直接的に標的として、活性化ＨＳＣにおけるこのタンパク質の線維形成促進機能を抑制することができることが本明細書にさらに示されている。
したがって、本明細書に記載の一態様は、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法である。
任意の態様の一実施形態では、肝疾患は、アラジール症候群；アルコール関連肝疾患；アルファ１－アンチトリプシン欠損症；自己免疫性肝炎；良性肝腫瘍；胆道閉鎖症；肝硬変；クリグラー－ナジャー症候群；ガラクトース血症；ジルベール症候群；ヘモクロマトーシス；肝性脳症；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；肝腎症候群；妊娠性肝内胆汁うっ滞症（ＩＣＰ）；リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）；肝嚢腫；肝臓がん；新生児黄疸；非アルコール性脂肪性肝疾患；非アルコール性脂肪性肝炎；原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）；原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）；ライ症候群；Ｉ型糖原病；強皮症；およびウィルソン病からなる群から選択される。
任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１は、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４からなる群から選択されるスプライスバリアントである。
任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される。
任意の態様の一実施形態では、抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である。
任意の態様の一実施形態では、対象は哺乳動物である。
任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される。任意の態様の一実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞である。任意の態様の一実施形態では、標的細胞は、肝星細胞、線維芽細胞、または筋線維芽細胞である。任意の態様の一実施形態では、肝星細胞は、静止状態にある。
任意の態様の一実施形態では、抗体または抗体試薬は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、経口、経皮、または経鼻投与により投与される。
任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害すること、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減することである。任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１の活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく阻害される。任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１のレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく低減される。
本明細書に記載の別の態様は、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
任意の態様の一実施形態では、組成物は、肝疾患を治療または予防するために製剤化されている。
本明細書に記載の別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを検出すること；（ｂ）（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること；（ｃ）参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること；ならびに（ｄ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること、を含む方法を提供する
任意の態様の一実施形態では、本方法は、（ａ）の前に、対象から生物学的試料を得ることをさらに含む。
任意の態様の一実施形態では、生物学的試料は、血液試料、組織、バフィーコート、血清、または組織である。
本明細書に記載のさらに別の態様は、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することを含む方法を提供する。
任意の態様の一実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。任意の態様の一実施形態では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である。
任意の態様の一実施形態では、作用剤は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、経口、経皮、または経鼻投与により投与される。
本明細書に記載の別の態様は、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
本明細書に記載の別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２のレベルを検出すること；（ｂ）（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること；（ｃ）参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること；ならびに（ｄ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与すること、を含む方法を提供する。
本明細書に記載のさらに別の態様は、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現する遺伝子操作された肝星細胞またはその集団を生成するための方法であって、細胞を、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤と接触させること、および作用剤の発現を可能にするのに十分な時間にわたって細胞を培養すること、を含む方法を提供する。
任意の態様の一実施形態では、細胞は、静止状態にある。
任意の態様の一実施形態では、接触は、細胞を、作用剤または作用剤をコードするベクターと接触させることを含む。任意の態様の一実施形態では、接触は、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注射、および／またはトランスフェクションを含む。
本明細書に記載の別の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかにより生成される肝星細胞を含む細胞株を提供する。
本明細書に記載の別の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかにより生成される肝星細胞またはその集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本明細書に記載の別の態様は、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法のいずれかにより生成された細胞、本明細書に記載の生成された細胞のいずれか、または本明細書に記載の生成された細胞を含む医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。
本明細書に記載の別の態様は、対象の線維症を低減するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法のいずれかにより生成された細胞、本明細書に記載の生成された細胞のいずれか、または本明細書に記載の生成された細胞を含む医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２レベル（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質レベルなど）が増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること；ならびに（ｂ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること、を含む方法である。
本明細書で提供される別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２レベルが増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること；ならびに（ｂ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤試薬を投与すること、を含む方法である。
定義
便宜的に、本明細書、例、および添付の特許請求の範囲で使用されている一部の用語および語句の意味を下記に提供する。別様の記述がない限り、または状況が別様に示唆しない限り、以下の用語および語句は、下記に提供されている意味を含む。定義は、特定の実施形態の説明を助けるために提供されており、特許請求されている技術を限定することは意図されていない。本技術の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。別様の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本技術が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用法と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書内で提供される定義が優先するものとする。
免疫学および分子生物学の一般用語の定義は、以下の文献に見出すことができる：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)。こうした文献の内容はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「改善」という用語は、治療的処置を指し、目的は、肝疾患、例えば肝線維症に関連付けられる状態の進行または重症度を逆行、緩和、改善、阻害、緩徐、または止めることである。「治療すること」という用語は、肝疾患の少なくとも１つの有害効果または症状、例えば、黄疸、静脈瘤出血を低減または緩和すること、線維症、瘢痕、および腹水を低減することを含む。１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減される場合、治療は、一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減されるかまたは停止した場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーを改善することだけでなく、治療が存在しない場合に予想されることになるものと比較して、症状の進行もしくは悪化を休止させること、または少なくとも緩徐すること、または逆行させることも含む。有益なまたは望ましい臨床結果としては、これらに限定されないが、１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定した（つまり悪化しない）状態、疾患進行の遅延もしくは緩徐、疾患状態の改善もしくは緩解、寛解（部分的かまたは全体的かに関わらず）、および／または死亡率減少が挙げられ、これらは、検出可能であるかまたは検出不能であるかを問わない。疾患の「治療」という用語は、疾患の症状または副作用からの救済（緩和療法を含む）を提供することも含む。
本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、方法論（例えば、本明細書に記載のような組成物の投与など）の作用のため疾患状態が生じない任意の方法論を指す。一態様では、予防は、疾患が、未治療対照で生ずる程度には確立されないことを意味する場合もあることが理解される。したがって、疾患の予防は、対象が疾患を発症し得る可能性を、未治療対象（例えば、本明細書に記載の方法または組成物で治療されていない対象）と比べて低減させることを包含する。
本明細書で使用される場合、「投与する」および「注射する」という用語は、本明細書に記載の細胞、例えば肝星細胞または作用剤を対象内に配置する状況であって、配置は、所望の効果（例えば、ＷＩＳＰ１レベルまたは活性の減少）が生み出されるように、導入された細胞または作用剤が肝臓またはその領域などの所望の部位に少なくとも部分的に局在化されることをもたらす方法または経路によりなされる、状況では、同義的に使用される。本明細書に記載の作用剤または細胞は、送達された作用剤、細胞、または細胞の成分の少なくとも部分が作用可能であり続ける対象の所望の場所への送達をもたらす任意の適切な経路により投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間と短くてもよく、例えば、２４時間～数日間であってもよく、数年と長くてもよく、つまり長期間であってもよい。一部の実施形態では、「投与する」という用語は、１つまたは複数の作用剤または細胞を含む医薬組成物を投与することを指す。投与は、それを必要とする対象への直接注射（例えば、標的細胞に直接投与される）、皮下注射、筋肉注射、経口、または経鼻送達により行うことができる。投与は、局所的であってもよくまたは全身性であってもよい。
「患者」、「対象」、および「個体」という用語は、本明細書では同義的に使用され、予防的治療を含む治療が提供される動物、特にヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では同義的に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの哺乳動物、およびニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳動物を含む。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとしての実験動物または代用動物である。別の実施形態では、対象は、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、ラット、モルモット、ハムスターなど）を含む家畜化動物である。対象は、以前に肝疾患の治療を受けたことがあってもよく、または肝疾患の治療を受けたことがまったくない。対象は、以前に肝疾患を有すると診断されたことがあってもよく、または肝疾患と診断されたことがまったくない。
「減少する」、「低減される」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書では、特性、レベル、または他のパラメーターが、統計的に有意な量だけ減少または小さくなることを意味するために使用される。一部の実施形態では、「低減する」、「低減」、または「減少する」、または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の治療が存在しない場合）と比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも大きな減少を含むことができる。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害または低減を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体の正常範囲内であると認められるレベルまでの低下であってもよい。例えば、ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することであるか、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減させることである。
「増加された」、「増加する」、または「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、一般に、特性、レベル、または他のパラメーターが、統計的に有意な量だけ増加することを意味するために使用される。一切の疑義を回避するため、「増加された」、「増加する」、または「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％増加を含む１００％までの増加、または参照レベルと比較して１０～１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、少なくとも約２０倍の増加、少なくとも約５０倍の増加、少なくとも約１００倍の増加、少なくとも約１０００倍の増加、もしくはそれよりも大きな増加を意味する。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」は、正常なそれ以外は影響を受けていない細胞集団または組織（例えば、健常対象から得られた生物学的試料、または以前の時点で対象から得られた生物学的試料、例えば、肝疾患を有すると診断される前の患者から得られた生物学的試料、または本明細書で開示の作用剤または組成物と接触したことがない生物学的試料）を指す。
本明細書で使用される場合、「適切な対照」は、未治療のそれ以外は同一の細胞または集団（例えば、本明細書に記載の作用剤もしくは組成物と接触しなかったか、または非対照細胞と比較して同じ様式で接触しなかった、例えば期間が異なっていた生物学的試料）を指す。
「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性なしで対象（例えば、哺乳動物またはヒト）に投与することができる化合物および組成物を指すことができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、活性成分と組み合わせても、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任意の材料または物質を含むことができる。例としては、これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩溶液などの標準的な医薬担体のいずれか、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤が挙げられる。「薬学的に許容される担体」という用語は、組織培養培地を除外する。医薬担体の非限定的な例としては、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、ポリマーマイクロスフェア、またはポリマー－薬物コンジュゲートなどの粒子またはポリマーに基づくビヒクルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１」または「ＷＩＳＰ１」または「ＣＣＮ４」という用語は、細胞接着、遊走、増殖、分化、および生存を含む数多くの多様な細胞機能を有する、ＷＩＳＰ１遺伝子によりコードされるマトリクス細胞タンパク質である。肝臓では、ＷＩＳＰ１は、筋線維芽細胞に対して活性化された際に肝星細胞（ＨＳＣ）により分泌される。また、ＷＩＳＰ１は、オートクリン系を介して、コラーゲンの活性化および分泌を加速させることによりＨＳＣに影響を及ぼして、線維症を促進する。ＣＣＮ４、ＷＩＳＰ１ｃ、ＷＩＳＰ１ｉ、ＷＩＳＰ１ｔｃ、ＷＩＳＰ１－ＯＴ１、およびＷＩＳＰ１－ＵＴ１としても知られるＷＩＳＰ１の配列は、少なからぬ種で知られており、例えば、ヒトＷＩＳＰ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８８４０）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１９１７９８．１）およびｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２０４８６９．１）である。ＷＩＳＰ１は、その天然に存在するバリアント、分子、および対立遺伝子を含む、ヒトＷＩＳＰ１を指すことができる。ＷＩＳＰ１は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、およびブタなどの哺乳動物ＷＩＳＰ１を指す。配列番号５の核酸配列は、ＷＩＳＰ１をコードする核酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ＷＩＳＰ１活性」という用語は、ＷＩＳＰ１の細胞機能を指し、例えば、ＷＩＳＰ１は、ＨＳＣでは、コラーゲンの活性化および分泌を加速して線維症を促進し、ｐ５３媒介性アポトーシスを減衰させ、ＷＩＳＰ１は、他の細胞タイプでは、ＴＮＦ誘導性細胞死を阻害することができる。例えば、ＷＩＳＰ１活性の増加は、細胞によるコラーゲン沈着の増加を指す場合がある。ＷＩＳＰ１活性は、アルファ平滑筋アクチン発現の誘導、またはＩＬ－６のような一部の炎症性サイトカインの発現を指す場合がある。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらのアナログの単位が組み込まれた任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの一方の核酸鎖であってもよい。あるいは、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。一態様では、核酸はＤＮＡであってもよい。別の態様では、核酸はＲＮＡであってもよい。好適なＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含んでいてもよい。好適なＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡを含んでいてもよい。
「作用剤」という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「作用剤」は、これらに限定されないが、合成のおよび天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性実体を含む、任意の化学的実体または部分であってもよい。一部の実施形態では、作用剤は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物であり、限定ではないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの改変物および組合せなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、作用剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分としては、マクロライド、レプトマイシン、および関連天然産物またはそれらのアナログを含む、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分が挙げられた。化合物は、所望の活性および／または特性を有することが公知であってもよく、または多様な化合物のライブラリーから選択してもよい。
作用剤は、１つまたは複数の化学クラスに由来する分子、例えば有機分子であってもよく、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを挙げることができる。また、作用剤は、１つまたは複数のタンパク質に由来する融合タンパク質、キメラタンパク質（例えば、関連分子または異なる分子の機能的に重要な領域のドメインスイッチングまたは相同組換え）、合成タンパク質、または置換、欠失、挿入、および他のバリアントを含む他のタンパク質変異型であってもよい。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ分子、またはそれらの抗原特異的抗体断片（これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、クローズドコンフォメーション多重特異性抗体（closed conformation multispecific antibody）、ジスルフィド連結ｓｃｆｖ、ダイアボディを含む）を指し、天然で抗体を産生する任意の種に由来するか、または組換えＤＮＡ技術により作出されるかを問わず、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、もしくは細菌のいずれから単離されるかを問わない。
別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。ＶＨ領域（例えば、免疫グロビンポリペプチドの部分）は、本明細書の他所に記載されているＶＨセグメントと同じではないことに留意されたい。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と称されるより保存された領域が散在している「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に規定されている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照；これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに接続されている一連のアミノ酸残基を指定するために同義的に使用される。
本明細書で使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原と特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含んでいてもよい。本態様のいずれかの一部の実施形態では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含んでいてもよい。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）を含んでいてもよい。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照；この文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる））ならびに完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプおよび組合せ）の構造的特徴を有してもよい。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）を含む任意の供給源に由来してもよく、霊長類化抗体であってもよい。抗体としては、ミディボディ、ナノボディ、ヒト化抗体、およびキメラ抗体なども挙げられる。抗体試薬は、抗体断片であってもよい。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関わらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸アナログを含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多く、「ペプチド」という用語は、小型ポリペプチドに関して使用されることが多いが、当技術分野におけるこうした用語の用法は重複している。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、本明細書では同義的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の等価物、バリアント、断片、およびアナログが挙げられる。
本明細書に記載の種々の実施形態では、記載されている特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在するかまたは別様の）、対立遺伝子、ホモログ、保存的修飾バリアント、および／または保存的置換バリアントが包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸または低パーセンテージのアミノ酸を変更する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、改変が、アミノ酸の化学的類似アミノ酸との置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的修飾バリアント」であることを認識するであろう。そのような保存的修飾バリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えてであり、それらを除外しない。
本明細書に記載のように、「抗原」は、抗体の結合部位に結合する分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドに結合し、抗体応答をｉｎ ｖｉｖｏにて亢進することが可能である。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子、またはそれらの部分であってもよい。「抗原決定基」という用語は、抗原結合性分子により、より具体的には前記分子の抗原結合性部位により認識される、抗原上にあるエピトープを指す。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、相互作用、例えば抗原に対する抗体の結合の強さを指し、解離定数（ＫＤ）として定量的に表すことができる。アビディティは、抗原結合性分子（本明細書に記載の抗体試薬など）と関連抗原との結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗原結合性分子上にあるその抗原結合性部位との親和性、および抗原結合性分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。典型的には、抗原結合性タンパク質（本明細書に記載の抗体試薬など）は、１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満、好ましくは１０－７～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満、より好ましくは１０－８～１０－１２モル／リットルの解離定数ＫＤで（つまり、１０５～１０１２リットル／モルまたはそれよりも大きな、好ましくは１０７～１０１２リットル／モルまたはそれよりも大きな、より好ましくは１０８～１０１２リットル／モルの結合定数（ＫＡ）で）それらの同種または特異的抗原に結合することになる。１０－４ｍｏｌ／リットルよりも大きな任意のＫＤ値（または１０４Ｍ－１よりも低い任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。意味がある（例えば、特異的である）とみなされる生物学的相互作用のＫＤは、典型的には、１０－１０Ｍ（０．１ｎＭ）～１０－５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低くなる。好ましくは、本明細書に記載の抗体試薬上にある結合部位は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは５００ｐＭ未満などの１０ｎＭ未満の親和性で、所望の抗原に結合することになる。抗体試薬と抗原または抗原決定基との特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析、ならびに／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合的結合アッセイ、ならびに当技術分野でそれ自体公知であるそれらの異なる変法、ならびに本明細書に記載のような他の技法を含む、それ自体公知である任意の好適な様式で決定することができる。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」または「特異性」という用語は、２つの分子、化合物、細胞、および／または粒子間の化学的相互作用を指し、第１の実体は、非標的である第３の実体に結合するよりも大きな特異性および親和性で第２の標的実体に結合する。本態様のいずれかの一部の実施形態では、特異的結合は、第３の非標的実体に対する親和性よりも、少なくとも１０倍の、少なくとも５０倍の、少なくとも１００倍の、少なくとも５００倍の、少なくとも１０００倍の、またはそれよりも大きな、第２の標的実体に対する第１の実体の親和性を指すことができる。したがって、本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、本明細書に記載の作用剤（例えば、抗体試薬）が、例えば、所与の抗原のアミノ酸配列を含むペプチドなどの標的に、１０－５Ｍ（１００００ｎＭ）もしくはそれ未満、例えば、１０－６Ｍもしくはそれ未満、１０－７Ｍもしくはそれ未満、１０－８Ｍもしくはそれ未満、１０－９Ｍもしくはそれ未満、１０－１０Ｍもしくはそれ未満、１０－１１Ｍもしくはそれ未満、または１０－１２Ｍもしくはそれ未満のＫＤで結合する能力を指す。例えば、本明細書に記載の作用剤が、抗原を含む第１のペプチドに１０－５Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合するが、別の無作為に選択されたペプチドには結合しない場合、その作用剤は、第１のペプチドと特異的に結合すると言われる。特異的結合は、例えば、作用剤の親和性およびアビディティ、ならびに作用剤の濃度により影響を受ける場合がある。当業者であれば、好適な細胞および／またはペプチド結合アッセイで作用剤を滴定することなど、任意の好適な方法を使用して、作用剤が標的と選択的に結合する適切な条件を決定することができる。
「発現」という用語は、適用可能な場合、これらに限定されないが、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳、およびタンパク質フォールディング、修飾、およびプロセシングを含む、ＲＮＡおよびタンパク質の産生に関与し、適切な場合はタンパク質を分泌する細胞プロセスを指す。「発現産物」としては、遺伝子から転写されるＲＮＡ、および遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳により得られるポリペプチドが挙げられる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結していると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにてＲＮＡへと転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよくまたは含んでいなくともよい。
本明細書で使用される場合、細胞または臓器に関して使用される場合の「接触」という用語は、細胞と、作用剤、表面、ホルモンなどとの物理的接触を可能にする様式で、作用剤、表面、ホルモンなどを細胞に導入すること、およびｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、または他の発現産物などの作用剤の細胞での発現を可能にする遺伝子構築物またはベクターなどのエレメントを導入することを両方とも包含する。作用剤を発現するように遺伝子改変された細胞は、作用剤と「接触」しており、作用剤を発現する細胞子孫も同様であることが理解されるべきである。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）またはそれよりも大きな差を意味する。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、提示されている規定の要素に加えて、他の要素も存在することができることを意味する。「含む（comprising）」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「からなる（consisting of）」という用語は、本明細書に記載のような組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分を指し、実施形態のその説明に挙げられていない一切の要素が除外される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的で新規のまたは機能的な特色に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別様であると示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、状況が明らかに別様であると示さない限り、「および」を含むことが意図されている。本開示の実施または試験には、本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を下記に記載する。略語「例えば（e.g.）」は、ラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
さらに、状況により別様に必要とされない限り、単数形は、複数を含むものとし、複数形は、単数を含むものとする。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連列挙項目の１つまたは複数のありとあらゆる考え得る組合せ、ならびに選択肢（「または」）で解釈される場合は組合せの欠如を指し、包含する。
さらに、本発明の組成物の量、用量、時間、および温度などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」という用語は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動性を包含することを意味する。作業例または別様に示されている場合を除いて、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す数値はすべて、全ての場合において「約」という用語により修飾されていると理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用される場合の「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。
別様の説明がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、それら自体様々であってもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の範囲は、特許請求の範囲によってのみ規定される。
特定されている特許および他の刊行物はすべて、例えば、本開示に関連して使用することができるそのような刊行物に記載の方法論を説明および開示するために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。こうした刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示について提供されているに過ぎない。この点に関して、以前の開示であるとしてもまたはいかなる他の理由によっても、本発明者らがそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。こうした文書の日付に関する記載または内容に関する表現はすべて、本出願人らが入手可能な情報に基づくものであり、こうした文書の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も構成するものではない。
研究計画の模式図である：目的１ ｍｉＲ－１５ａのおよびｍｉＲ－４１２の機序および機能を探索、目的２ それらの処置潜在力を検査、ならびに目的３ ｍｉＲ－１５ａの周知の標的ＷＩＳＰ１の機能を解明。ＨＳＣは、肝星細胞を表す語である。 活性化肝星細胞を静止状態に戻す候補を同定するための全ゲノムマイクロＲＮＡ模倣物ライブラリーをスクリーニングした実験の流れの模式図である。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２が過発現された場合（上列）にナイルレッド染色陽性脂肪滴の再形成によって実証された、活性化マウス肝星細胞（ＨＳＣ）が静止状態に戻ったことを示す図である。ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のヒトオルソログが過発現された場合（下列）に脂肪滴の再形成によって実証されて、活性化ヒトＨＳＣが静止状態に戻ったことも示す。 活性化肝星細胞（ＨＳＣ）へのｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２送達が、静止状態のものへの形態における変化を生じたことを示す図である。図４Ａは、すべての写真が同じ拡大率を用いて撮られたことから、ＨＳＣの大きさが１０～１００分の１に減少したことを示す（すべてのパネルについて同じスケールバー）。図４Ｂは、最初に活性化されたＨＳＣにおけるｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の強制発現が、ｑＰＣＲを用いて測定されたアルファ平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）およびアルファ１ Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）を下方制御したことを示す。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 上記と同様。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２トランスフェクト肝星細胞（ＨＳＣ）が機能的表現型を有することを示す図である。ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて処置された活性化ＨＳＣは、共培養された肝細胞において脂肪症を生じなかった。陰性対照マイクロＲＮＡを用いて処置された活性化ＨＳＣは、共培養された肝細胞において脂肪症を誘導した。ｑＨＳＣ、静止肝星細胞；Ａｃ－ＨＳＣ、活性化肝星細胞；ｍｉＲ－Ｎｅｇ、マイクロＲＮＡ陰性対照。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を受けた活性化ヒトＨＳＣと共培養されたＨｅｐＧ２細胞は、炎症性サイトカインの発現が減少していた（左パネル）ことを示す図である。ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を受けた活性化ヒトＨＳＣと共培養されたＨｕｈ７細胞は、一部の炎症性サイトカインの発現が減少していた（右パネル）。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 内在性ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、ｍｉＲ－１５ａについては有意でないが、静止ＨＳＣと比較して活性化初代ＨＳＣにおいて発現レベルが減少していたことを示す図である。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 ＣＣｌ４チャレンジおよび細胞治療注射についてのスケジュールの模式図（図）である。上列：脾臓に注射され肝臓に移植されたｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて再プログラム化された静止様ＨＳＣ、ｍｉＲＮＡ発現を駆動するベクターに組み込まれたＧＦＰシグナルを産生する肝臓によって証明された。中列：静止様ＨＳＣを受けたＣＣｌ４チャレンジマウスは、Ｈ＆Ｅ染色を用いて実証されて、肝臓のアポトーシスおよび炎症が減少していた。下列：静止様ＨＳＣを受けたＣＣｌ４チャレンジマウスは、シリウスレッドを用いて染色された肝線維症が減少していた。線維症の相対的レベルは定量された。ＣＣｌ４、ＨＳＣを注射しないＣＣｌ４経管栄養；ＨＳＣ対照、ＣＣｌ４経管栄養および空ＧＦＰ－ベクターを含むＨＳＣ注射；ＨＳＣ ｍｉＲ－１５ａ、ＣＣｌ４経管栄養およびｍｉＲ－１５ａ－ＧＦＰ－ベクターを含むＨＳＣ注射；ＨＳＣ ｍｉＲ－４１２、ＣＣｌ４経管栄養およびｍｉＲ－４１２－ＧＦＰ－ベクターを含むＨＳＣ注射。 再プログラム化された静止様ＨＳＣを用いた細胞療法は、ＣＣｌ４を用いてチャレンジされたマウスに、ｑＰＣＲによって測定された全肝臓においてアルファ１ Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）の発現の減少を生じたことを示す図である。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 ヒト原発性胆汁性胆管炎における肝星細胞がアルファ平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）と共存しているＷＩＳＰ１を発現したことを示す図である。 ２つの予測されるＷＩＳＰ１標的配列の内のいずれか１つを含有するレポーターを用いて同時トランスフェクトされたｍｉＲ－１５ａ模倣物がルシフェラーゼ発現を減少させた一方で、変異配列を含有するレポーターには影響を与えず、ｍｉＲ－１５ａが両方のＷＩＳＰ１標的配列に結合することを示す図である。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 低および高拡大率での静止ＨＳＣを示す図である（左カラム）。高拡大率表示は、ＢＯＤＩＰＹ染色を用いた蛍光緑の数個の脂肪滴を明らかに示している（挿入図）。右カラム：低および高拡大率での活性化ＨＳＣ。活性化細胞は、より大きく、脂肪滴を欠いており、ＢＯＤＩＰＹを用いて染色されない（挿入図）。ＨＳＣ、肝星細胞。 標準食（左カラム）およびＣＤＡＨＦＤ（右カラム）を与えられたマウスの比較を示す図である。ＣＤＡＨＦＤを与えられたマウスは初期のＮＡＳＨを３週間で発症し、体のサイズの増加、肉眼的および顕微鏡的脂肪肝、ならびにシリウスレッド染色によってわずかな線維症を示す。ＣＤＡＨＦＤ、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食。 未チャレンジマウス由来対照肝星細胞（ＨＳＣ）、またはＣＤＡＨＦＤチャレンジＮＡＳＨマウス由来ＨＳＣのいずれかと健常な肝細胞（Ｈｅｐ）との共培養を示す実験の模式図である。上列：対照マウス由来ＨＳＣと共培養された肝細胞は、ＢＯＤＩＰＹを用いて染色されたごくわずかな脂肪滴を示した。下列：ＮＡＳＨマウス由来ＨＳＣと共培養された肝細胞は、顕著に多い脂肪滴を示した。ＣＤＡＨＦＤ、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食。 ＮＡＳＨマウス由来の肝星細胞（ＨＳＣ）と共培養された肝細胞が、ｑＰＣＲを用いて測定されて、対照ＨＳＣと共培養された場合と比較して、いくつかの炎症性サイトカイン（inflammatory cytokine）およびケモアトラクタントを高レベルで発現したことを示す図である。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 肝細胞（Ｈｅｐ）における脂肪蓄積の誘導が、ＮＡＳＨ肝星細胞（ＨＳＣ）由来の馴化培地が正常な肝細胞に適用された場合に達成され得ることを示す図である。上列：静止ＨＳＣ（ｑＨＳＣ）培地が健常な肝細胞に適用された場合、脂肪症は誘導されなかった。下列：ＮＡＳＨ－ＨＳＣ培地は、最初は健常な肝細胞において脂肪症を誘導した。脂肪滴はＢＯＤＩＰＹを用いて染色された。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を活性化肝星細胞（ＡｃＨＳＣ）に送達することが、静止肝星細胞（ｑＨＳＣ）におけるものと一致して、紫外線下の蛍光によって証明されるレチノイド陽性である脂肪滴の再形成を誘導したことを示す図である。 多次元スケーリングを用いて分析されたＲＮＡ配列決定データが、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を受けた静止様ＨＳＣが、活性化細胞よりも静止ＨＳＣに近い全体的な転写プロファイル４０～５０％を有することを示す図である。ＨＳＣ、肝星細胞。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２トランスフェクト肝星細胞（ＨＳＣ）が機能的表現型を有することを示す図である。上列：ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて処置された活性化ＨＳＣは、共培養された肝細胞において脂肪症を生じなかった。陰性対照ｍｉｃｒｏＲＮＡを用いて処置された活性化ＨＳＣは、共培養された肝細胞において脂肪症を誘導した。ｑＨＳＣ、静止肝星細胞：Ａｃ－ＨＳＣ、活性化肝星細胞；ｍｉＲ－Ｎｅｇ、マイクロＲＮＡ陰性対照。下列：ＮＡＳＨのＣＤＡＨＦＤモデルから採取されたＨＳＣは、共培養肝細胞において脂肪症を誘導した。ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を発現するレンチウイルスを用いて感染させたこれらの同じＨＳＣは、隣接する肝細胞において脂肪症を誘導するそれらの能力を主張している。 ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを受けた後の肝星細胞においてｍＲＮＡレベルが減少した遺伝子のセットと予測アルゴリズムに基づく潜在的な直接標的のセットとの重なりが、真のｍｉＲＮＡ標的を含む可能性が高い標的候補セットを産生したことを示す図である。標的候補セットの遺伝子は、ＴｇｆベータまたはＰｄｇｆシグナル伝達経路の部分であるものを選択することによってさらに選別された。 ＣＲＩＳＰＲ技術が初代肝星細胞において使用され得ることを示す図である。初代細胞でこの技術を使用する実行可能性は、長い非コードＲＮＡ Ｄｉｇｉｔ欠失ベクターを送達することによって検証された、ホモ接合性ノックインは、新規ＰＣＲバンド、ピューロマイシン構築物を含む１つのおよびネオマイシン構築物を含む別の対立遺伝子の出現を用いて確認される。Ｃｔｌ、対照構築物；ＫＩ、ノックイン構築物。 ＞１００個のサイトカイン、ケモカインおよび細胞外マトリクスタンパク質のタンパク質ブロットが、ＣＤＡＨＦＤを用いたマウス由来のＨＳＣが健常マウス由来のものと比較してＷＩＳＰ１分泌上昇したＮＡＳＨを誘導したことを示す図である。ＣＭ、馴化培地。 活性化肝星細胞（ＡｃＨＳＣ）が静止肝星細胞（ｑＨＳＣ）よりも３０倍近く高いＷＩＳＰ１を発現したことを示す図である。肝細胞（Ｈｅｐ）もＷＩＳＰ１を発現したが、活性化肝星細胞よりも顕著に少ない。Ｌｖ、全肝臓。データは、平均＋／－ＳＤとして表されている。 ＷＩＳＰ１を過発現する肝星細胞由来の馴化培地が健常マウスから採取された肝細胞において脂肪症を誘導したことを示す図である。ＣＭ、馴化培地。 ＷＩＳＰ１がヒト疾患に関与することを示す模式図である。 ＷＩＳＰ１が、分泌マトリクス細胞タンパク質のＣＣＮファミリーのメンバーであることを示す模式図である。 肝星細胞が肝線維症の重要なドライバーであることを示す模式図である。 肝星細胞（ＨＳＣ）活性化を示す模式図である。 ＷＩＳＰ１が活性化ＨＳＣにおいて高度に上方制御されており、ｍｉＲ－１５ａの直接の標的であることを示す図である。（図２９Ａ）ＮＡＳＨマウスの活性化肝星細胞によって分泌されたＷＩＳＰ１。（図２９Ｂ）予測されるＷＩＳＰ１標的配列を含有するレポーターを用いて同時トランスフェクトされたｍｒＲ－１５ａ模倣物は、ルシフェラーゼ発現を減少させた。 上記と同様。 ＷＩＳＰ１およびＹａｐ １が互いに相互活性化することを示す図である。（図３０Ａ）ＷＩＳＰ１およびＹＡＰ ｍＲＮＡはｑＨＳＣにおいてｒｃ－ＷＩＳＰ１処置によって増加した。（図３０Ｂ）ＹＡＰ１活性化は、ｑＨＳＣにおいてｒｃ－ＷＩＳＰ１処置によって誘導された。（図３０Ｃ）ＷＩＳＰ１発現は、ｍｉＲＮＡによって再プログラム化されたＨＳＣにおけるＹＡＰ１過剰発現によって増加した。 肝臓および肺線維症でのＷＩＳＰ阻害の役割を支持する既存の文献を示す表である。（図３１Ａ）抗ＷＩＳＰ１ ｍＡｂはＣＣｌ４誘導肝線維症を減弱した。（図３１Ｂ）抗ＷＩＳＰ１ ｍＡｂはブレオマイシン誘導肺線維症を減弱した。 ＷＩＳＰ１中和抗体が胆管線維症を減弱することを示す図である。（図３２Ａ）ＷＩＳＰ１に対する中和抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの処置は、胆管結紮（ＢＤＬ）誘導肝線維症を減少させた。（図３２Ｂ）示された条件でのコラーゲン発現。 ＷＩＳＰ１は、一般的およびまれなヒト線維性肝疾患において分泌されることを示す図である。（図３３Ａ）ＷＩＳＰ１は、ＮＡＳＨのＨＳＣにおいて上方制御された。（図３３Ｂ）ＷＩＳＰ１は、いくつかのまれな線維性肝疾患のＨＳＣにおいて上方制御された。 ＷＩＳＰ１が、肝臓炎症および線維症についての新規分泌線維化ドライバーであることを示す図である。（図３４Ａ）ＮＡＦＬＤマウス由来活性化ＨＳＣは、ＷＩＳＰ１を分泌する。（図３４Ｂ）ＷＩＳＰ１過発現ＨＳＣは、健常な共培養初代肝細胞（ＢＯＤＩＰＹ株）において脂肪症を誘導する。 Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置が、ｋｉ６７によって測定されるＨＳＣ増殖を加速することを示す図である。 ヒトおよびマウスｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の配列アライメントを示す図である。 ＨＳＣによって発現されるＷＩＳＰ１が、自己活性化オートクリンおよび脂肪症促進（pro-steatotic）パラクリン効果を有することを示す図である。図３７Ａは、マウスにおける組換えＷＩＳＰ１処置によって誘導されたＨＳＣ増殖および活性化を示している。図３７Ｂは、対照およびＲｃＷｉｓｐ１の免疫組織化学を示している。 Ｒｃ ＷＩＳＰ１およびＷｉｓｐ ＩｇＧが、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食モデル誘導脂肪症（ＣＤＡＨＦＤ）由来のＮＡＳＨ－ＨＳＣを処置し、線維症を予防することを示す図である。１μｇ／ｍｌ ＷＩＳＰ１抗体は、ＨＳＣに適用する前に馴化培地で１時間、３７℃でインキュベートされた。図３８Ａは、処置および試料採取のタイムラインを示している。図３８Ｂは、対照、Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置およびＡｂ ＷＩＳＰ１処置細胞の細胞数を示している。図３８Ｃは、ｑＨＳＣ、対照、Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置およびＡｂ ＷＩＳＰ１処置細胞のＡｃｔａ２ ｍＲＮＡ発現を示している。図３８Ｄは、ｑＨＳＣ、対照、Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置およびＡｂ ＷＩＳＰ１処置細胞のＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡ発現を示している。図３８Ｅは、対照、Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置およびＡｂ ＷＩＳＰ１処置細胞の免疫組織化学を示している。図３８Ｆは、対照、Ｒｃ ＷＩＳＰ１処置およびＡｂ ＷＩＳＰ１処置細胞のＢＯＤＩＰＹ染色面積割合の定量を示している。 上記と同様。 上記と同様。 ＷＩＳＰ１がＨＳＣ移動を調節することを実証する図である。図３９Ａは、Ｒｃ－ＷＩＳＰ１およびＷＩＳＰ１ ＩｇＧの存在および非存在でのＨＳＣ移動の画像である。図３９Ｂは、対照ＨＳＣと比較した、Ｒｃ－ＷＩＳＰ１およびＷＩＳＰ１ ＩｇＧを用いて処置されたＨＳＣの相対的創傷面積を示している。ＷＩＳＰ１ ＩｇＧを用いて処置されたＨＳＣは、２４時間以内で対照ＨＳＣと類似した相対的創傷面積を示し、ＷＩＳＰ１ ＩｇＧがＨＳＣ活性化および移動を妨げられることを確認している。 上記と同様。
肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ））は、肝内胆管の進行性破壊、胆汁うっ滞、門脈周囲炎症、および最終的には硬変末期肝疾患に至る胆管線維症に結び付く場合がある。ＰＢＣなどの肝疾患は、病因不明の自己免疫障害として顕在化する場合があるが、遺伝的要因および環境的要因の両方が肝疾患を引き起こす可能性が高い。
ＷＩＳＰ１は、筋線維芽細胞に対して活性化された際に肝臓の肝星細胞（ＨＳＣ）により分泌されるタンパク質である。また、ＷＩＳＰ１は、オートクリン系を介して、コラーゲンの活性化および分泌を加速させることによりＨＳＣに影響を及ぼして、線維症を促進する。なかでも、肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１－アンチトリプシン欠損症、非ヒト疾患、ミオアルコール性脂肪性肝炎（myoalcholic steatohepatitis）、および強皮症）の線維芽細胞は、ＷＩＳＰ１を高度に発現する。したがって、これは、ＷＩＳＰ１の阻害が、肝臓の疾患を治療するための戦略であることを示す。
肝星細胞は、類洞周囲空間（ディッセ腔としても知られている）に見出される、肝臓の脂肪貯蔵周皮細胞である。静止状態のＨＳＣは、細胞質内の脂肪滴の存在により区別される。肝臓が損傷すると、星細胞が活性化される場合がある。活性化ＨＳＣは増殖し、細胞質内の脂肪滴が低減する。活性化ＨＳＣは、コラーゲンおよび瘢痕形成を促進するメディエーターを分泌する線維形成促進性筋線維芽細胞になる。
本明細書に記載の方法は、ＷＩＳＰ１がＨＳＣにて上方制御されることを示す。ＷＩＳＰ１を、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２で阻害すると、この阻害は、独立して、肝臓の線維形成進行に中心的な役割を果たす細胞タイプである活性化肝星細胞（ＨＳＣ）の静止状態を誘導する。さらに、ｍｉＲ－１５ａは、ＷＩＳＰ１を直接的に標的として、活性化ＨＳＣにおけるこのタンパク質の線維形成促進機能を抑制する。ＷＩＳＰ１阻害剤は、マイクロＲＮＡおよびその標的を使用してＨＳＣの静止状態を促進するため、ＰＢＣなどの肝疾患における進行性肝線維症を制御するための有用な療法である。
肝疾患の治療および／または予防
本明細書に記載の方法および組成物は、対象の肝疾患を治療および／または予防するために使用される。例示的な肝疾患としては、これらに限定されないが、アラジール症候群；アルコール関連肝疾患；アルファ１－アンチトリプシン欠損症；自己免疫性肝炎；良性肝腫瘍；胆道閉鎖症；肝硬変；クリグラー－ナジャー症候群；ガラクトース血症；ジルベール症候群；ヘモクロマトーシス；肝性脳症；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；肝腎症候群；妊娠性肝内胆汁うっ滞症（ＩＣＰ）；リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）；肝嚢腫；肝臓がん；新生児黄疸；非アルコール性脂肪性肝疾患；非アルコール性脂肪性肝炎；原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）；原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）；ライ症候群；Ｉ型糖原病；強皮症；およびウィルソン病が挙げられる。一実施形態では、肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、および強皮症である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、肝不全、例えば、肝合成および代謝機能の不全を有する対象を治療するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、劇症または重度急性肝不全（例えば、以前は健康だった個体において＜８週間で発症する、脳症を伴う肝不全）；超急性肝不全（例えば、以前は健康だった個体において＜１４日間で発症する、脳症を伴う肝不全）；急性肝不全（例えば、以前は健康だった個体において＜２６週間で発症する、脳症を伴う肝不全）；慢性肝不全（例えば、脳症を伴わない肝不全）；または慢性肝炎の急性増悪（例えば、脳症の発症を伴う慢性肝不全）を有する対象を治療するために使用される。熟練の開業医であれば、標準的な方法、例えば、チャイルド－ピュースコア（総ビリルビン、アルブミン、ＩＮＲ、腹水、および肝性脳症の複合指標）、ＭＥＬＤスコア（血清ビリルビン、クレアチニン、およびＩＮＲが使用される）、またはＰＥＬＤスコア（ＭＥＬＤと同様であるが、小児患者向けである）、またはＭＥＴＡＶＩＲスコア（試料中の線維症のレベルを評価する）を使用して、肝疾患（例えば、肝不全）の重症度を評価することができる。
ＭＥＴＡＶＩＲ
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、肝線維症を有する対象を治療するために使用される。肝線維症は、熟練の臨床医であれば、例えばＭＥＴＡＶＩＲスコアを使用して診断することができる。ＭＥＴＡＶＩＲスコアは、２つのスコア：線維症スコアおよび活性スコアを提供する。線維症スコアは、肝臓の炎症の量（炎症の強度／組織の分解）を記述するために使用される。例えば、Ｆ０：線維症なし；Ｆ１：中隔を有しない門脈線維症；Ｆ２：少数の中隔を有する門脈線維症；Ｆ３：肝硬変を伴わない多数の中隔；Ｆ４：肝硬変。活性スコアは、線維症の度合いがどの程度急速に進行するかに関する予測である。例えば、Ａ０：活性なし；Ａ１：軽度の活性；Ａ２：中程度の活性；およびＡ３：重度の活性。一実施形態では、本明細書に記載の方法で治療される対象は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、もしくはＦ４、および／またはＡ１、Ａ２、Ａ３のＭＥＴＡＶＩＲスコアを有する。
別の態様では、本明細書には、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法が記載されている。
一態様では、本明細書には、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することを含む方法が記載されている。
種々の実施形態では、ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される。一実施形態では、標的細胞は、ＷＩＳＰ１を高度に発現し、疾患状態、例えば肝疾患をもたらす肝臓細胞、例えば、適切な対照、例えば、健常非疾患肝臓細胞と比較して増加したレベルのＷＩＳＰ１を発現する肝臟細胞である。当業者であれば、標準的な技法を使用し、それぞれＰＣＲに基づくアッセイまたはウエスタンブロッティングを使用して、細胞におけるＷＩＳＰ１のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを評価することができる。
別の実施形態では、標的細胞は、肝星細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、肝臓の類洞周囲空間に見出される周皮細胞である。当業者であれば、例えば、塩化金の選択的染色または細胞質内の脂肪滴の視覚化を使用して、細胞がＨＳＣであるか否かを決定することができる。一実施形態では、ＨＳＣは静止状態にある。静止状態のＨＳＣは、当業者であれば、非増殖細胞の細胞質内に脂肪滴が存在することにより識別することができる。活性ＨＳＣは、当業者であれば、細胞の増殖、細胞質内の脂肪滴の低減、ならびに／またはコラーゲンおよび瘢痕形成を促進するメディエーターの分泌を評価することにより識別することができる。
一実施形態では、標的細胞は、線維芽細胞、例えば、肝線維芽細胞である。一実施形態では、標的細胞は、筋線維芽細胞である。筋線維芽細胞は、線維芽細胞および平滑筋細胞の両方の特色を有する。線維芽細胞および筋線維芽細胞は、例えば、当業者であれば、例えば、顕微鏡検査により、それぞれ線維芽細胞マーカーまたは線維芽細胞および平滑筋細胞マーカーを選択することにより、容易に識別することができる。
一実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
別の態様では、本明細書には、肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを測定すること；（ｂ）（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること；（ｃ）参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること；ならびに（ｄ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること、を含む方法が記載されている。
さらに別の態様では、本明細書には、肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを測定すること；（ｂ）（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること；（ｃ）参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルが増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること；ならびに（ｄ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与すること、を含む方法が記載されている。
ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルを測定するためのアッセイとしては、これらに限定されないが、ＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡレベルを評価するためのＰＣＲに基づくアッセイ、またはＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２タンパク質レベルを評価するためのウエスタンブロッティングが挙げられる。一実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、参照レベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも大きく、または少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、もしくはそれよりも大きく増加する。一実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡレベルである。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２タンパク質レベルである。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」は、健常対象、例えば、肝疾患を有していない対象の、それ以外は同一の生物学的試料を指す。
一実施形態では、本明細書に記載の本方法は、（ａ）の前に、対象から生物学的試料を得ることをさらに含む。本明細書で使用される場合、生物学的試料は、血液試料、組織試料、バフィーコート試料（例えば、遠心分離後の高レベルの白血球細胞および血小板を含有する抗凝固処理血液試料の画分）、血清試料、または肝臟生検試料を指す。生物学的試料は、当技術分野で公知である一般的で適切な技法を使用して得ることができる。例えば、組織試料は、生検により得ることができ、血液試料は、指穿刺採血または静脈内採血から得ることができる。
種々の実施形態では、生物学的試料は、以前に肝疾患と診断されているかまたは以前には肝疾患と診断されていない対象から採取される。別の実施形態では、生物学的試料は、肝疾患を有すると疑われる対象、例えば、肝疾患の少なくとも１つのリスク因子、例えば、通常摂取と比較したアルコール摂取の増加を有する対象から採取される。
本明細書で提供される別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２レベルが増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること；ならびに（ｂ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法である。
本明細書で提供される別の態様は、対象の肝疾患を治療するための方法であって、（ａ）参照レベルと比較してＷＩＳＰ１、Ｙａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、および／またはＡｃｔａ２レベルが増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること；ならびに（ｂ）肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤試薬を投与することを含む方法である。
ＷＩＳＰ１、Ｙａｐ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ １０４１３）、Ｃｏｌ１ａ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ １２７７）、および／またはＡｃｔａ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ ５９）レベルを測定するためのアッセイとしては、これらに限定されないが、ＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡレベルを評価するためのＰＣＲに基づくアッセイ、またはＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２タンパク質レベルを評価するためのウエスタンブロッティングが挙げられる。アッセイ（例えば、ＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡレベルを評価するためのＰＣＲに基づくアッセイ、またはＷＩＳＰ１および／もしくはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２タンパク質レベルを評価するためのウエスタンブロッティング）は、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤（例えば、抗体または抗体試薬）を投与する熟練の開業医により実施することができる。あるいは、アッセイは、別の個人が（つまり、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤（例えば、抗体または抗体試薬）を投与する開業医によってではなく）実施してもよい。アッセイの結果は、任意の手段により、例えば、郵便運搬業者、電話通信（例えば、ファクシミリ）、電子通信（例えば、電子医療記録、電子メール（ｅメール））などにより受け取ることができる。一実施形態では、治療は、アッセイの結果を受け取った後の任意の時点で（例えば、少なくとも１秒後、１分後、１時間後、１日後、１週間後、１か月後、１年後、またはそれよりも後で）対象に投与される。
一実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、参照レベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも大きく、または少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、もしくはそれよりも大きく増加する。一実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡレベルである。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２レベルは、ＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２タンパク質レベルである。
別の態様では、本明細書には、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法を使用して生成された細胞のいずれか、または本明細書に記載の方法を使用して生成された細胞を含む医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法が記載されている。
本明細書で提供される別の態様では、本明細書に記載の方法を使用して生成された抗体または抗体試薬、作用剤、細胞、本明細書に記載の組成物、医薬組成物のいずれかを使用して、対象の肝臓の線維症を治療または低減することができる。一態様では、本明細書には、線維症、例えば肝線維症を低減するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法を使用して生成された細胞のいずれか、または本明細書に記載の方法を使用して生成された細胞を含む医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法が記載されている。
一実施形態では、対象は、肝疾患を有すると以前に診断されている。別の実施形態では、対象は、作用剤の投与前に肝疾患を有すると診断されている。当業者であれば、例えば、当技術分野の標準的な技法を使用して、肝疾患を有する対象を診断することができる。例えば、肝機能検査と呼ばれる血液検査；ＣＴスキャン、超音波、もしくはＭＲＩスキャンなどの非侵襲的画像診断；または組織生検。肝機能検査は、肝臓特異的な酵素、例えば、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、またはビリルビンのレベルが評価される血液検査を指す。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、アルブミン、またはビリルビンのレベルのわずかな上昇でさえ、肝疾患を示すことができる。肝疾患を評価するためのさらなる検査は、本明細書に記載されている（例えば、チャイルド－ピュースコア、ＭＥＴＡＶＩＲスコア、ならびにＰＥＬＤおよびＭＥＬＤスコア）。
別の実施形態では、本明細書に記載の作用剤は、標的細胞のＷＩＳＰ１スプライスバリアントを阻害する。例示的なＷＩＳＰ１スプライスバリアントとしては、これらに限定されないが、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４が挙げられる。
別の実施形態では、ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することである。ＷＩＳＰ１活性は、ＷＩＳＰ１遺伝子または遺伝子産物の機能の、任意の現在公知の活性であってもよく、またはこれから発見される活性であってもよい。例えば、ＷＩＳＰ１は、ＨＳＣでは、コラーゲンの活性化および分泌を加速させて線維症を促進し、ｐ５３媒介性アポトーシスを減衰させ、他の細胞タイプでは、ＴＮＦ誘導性細胞死を阻害する。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１活性は、適切な対照と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも大きく阻害される。
本明細書で使用される場合、「適切な対照」は、本明細書に記載の作用剤もしくは組成物と接触していないそれ以外は同一の試料におけるＷＩＳＰ１活性のレベルを指すか、または作用剤もしくは組成物の投与前の対象におけるＷＩＳＰ１活性のレベルである。さらに、適切な対照は、健常対象、例えば、肝疾患を有しない個体におけるＷＩＳＰ１活性のレベルであってもよい。当業者であれば、例えば、ＨＳＣにおけるコラーゲンの活性化および分泌を測定／評価／定量化することにより、ＷＩＳＰ１の活性の機能読取りを使用して、ＷＩＳＰ１の活性を決定することができる。
別の実施形態では、ＷＩＳＰ１の阻害は、細胞におけるＷＩＳＰ１レベル、例えば、遺伝子発現レベルまたは遺伝子産物レベルを阻害することである。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１レベルは、適切な対照と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも大きく阻害される。本明細書で使用される場合、「適切な対照」は、本明細書に記載の作用剤もしくは組成物と接触していないそれ以外は同一の試料におけるＷＩＳＰ１のレベルになるか、または作用剤もしくは組成物の投与前の対象におけるＷＩＳＰ１のレベルである。さらに、適切な対照は、健常対象、例えば、肝疾患を有していない個体におけるＷＩＳＰ１のレベルであってもよい。当業者であれば、例えば、ＨＳＣにおけるコラーゲンの活性化および分泌を測定／評価することにより、ＷＩＳＰ１の活性の機能読取りを使用して、ＷＩＳＰ１の活性を決定することができる。当業者であれば、ＷＩＳＰ１のタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルを、例えば、それぞれウエスタンブロッティングまたはＰＣＲに基づくアッセイを使用して評価／測定することができる。
作用剤
一態様では、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、肝疾患を有するかまたは有するリスクのある対象に投与される。一実施形態では、作用剤は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡである。
本明細書に記載の作用剤は、例えば、投与時に、細胞におけるＷＩＳＰ１の存在、量、活性、および／またはレベルを阻害する場合、ＷＩＳＰ１の阻害に有効であるとみなされる。
作用剤は、例えば、細胞におけるＷＩＳＰ１の転写または翻訳を阻害することができる。作用剤は、細胞におけるＷＩＳＰ１の活性（例えば、ＷＩＳＰ１の発現）を阻害することができるか、または活性を変更することができる（例えば、活性がもはや生じないか、もはや適切に生じないか（例えば、野生型ＷＩＳＰ１活性と比較して）、または低減された速度で生じる）。
一実施形態では、作用剤は、ｍｉＲＮＡ４１２およびｍｉＲＮＡ１５ａを除外する。別の実施形態では、作用剤は、いかなるｍｉＲＮＡ４１２またはｍｉＲＮＡ１５ａ模倣物も除外する。
作用剤は、それが投与される形態で直接的に機能することができる。あるいは、作用剤は、細胞への核酸配列の導入ならびに細胞内でのＷＩＳＰ１の核酸および／またはタンパク質阻害剤の産生をもたらすその転写など、ＷＩＳＰ１を阻害する何らかのものを産生するように修飾されていてもよくまたは細胞内に使用してもよい。一部の実施形態では、作用剤は、限定ではないが、合成のおよび天然に存在する非タンパク質性実体を含む、任意の化学的実体または部分である。ある特定の実施形態では、作用剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分としては、マクロライド、レプトマイシン、および関連天然産物、またはそれらのアナログを含む、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分が挙げられた。作用剤は、所望の活性および／または特性を有することが公知であってもよく、または多様な化合物のライブラリーから識別してもよい。
種々の実施形態では、作用剤は、ＷＩＳＰ１を阻害する小分子である。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、１モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、１モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を挙げることができる化学作用剤を指す。
小分子をスクリーニングするための方法は当技術分野で公知であり、例えば、所望の標的（例えば、ＷＩＳＰ１ポリペプチド）に対して、ＷＩＳＰ１活性またはレベルの阻害に効率的である小分子を識別するために使用することができる。
本明細書で提供される一態様は、本明細書に記載のＷＩＳＰ１を阻害する作用剤のいずれかを含む組成物である。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態では、組成物は医薬組成物である。
ＷＩＳＰ１を阻害するポリペプチド
一実施形態では、本明細書には、肝疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、標的細胞においてＷＩＳＰ１を阻害するポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む方法が記載されている。
「ＷＩＳＰ１結合性ポリペプチド」という用語は、目的の所望の抗原（例えば、ＷＩＳＰ１ポリペプチド）と特異的に結合し、リンカーまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結されている本明細書に記載の抗原結合性ドメインの１つまたは複数を含むＩｇ様タンパク質であるポリペプチドを指す。結合性タンパク質は、一部の実施形態では、二重可変ドメイン（ＤＶＤ－Ｉｇ）結合タンパク質であってもよい。「リンカーポリペプチド」は、ペプチド結合により接合されている２つまたはそれよりも多くのアミノ酸残基を含み、１つまたは複数の抗原結合性部分を連結するために使用される。そのようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である（例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123を参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２００８１３号の配列番号１９７、１９８、１９９、および２００を参照。この文献は、代表的な例のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害するポリペプチドは、異種性である。本明細書で使用される場合、「異種性」は、宿主細胞、例えば、異種性ポリペプチドを発現する細胞では通常は産生されず、むしろ宿主細胞とは異なる生物に由来するポリペプチドを指す。例えば、本明細書で使用されるＷＩＳＰ１阻害剤は、例えば、細菌細胞に由来し、例えば哺乳動物細胞で発現される。
一部の実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害するポリペプチドは、配列番号１～４または６と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％相同性である。本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「相同性」または「相同的」という用語は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後で、標的染色体またはポリペプチド上にある対応する配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして規定される。ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列相同性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技術内にある種々の様式で達成することができる。当業者であれば、比較しようとする配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。一部の実施形態では、例えば、ＷＩＳＰ１結合性断片またはポリペプチドの核酸またはアミノ酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミノ酸配列）は、配列が、ＷＩＳＰ１の対応する天然または未編集核酸配列（例えば、ゲノム配列）またはアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高度に同一である場合、「相同性」であるとみなされる。
本明細書に記載の種々の実施形態では、記載されている特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在するかまたは別様の）、対立遺伝子、ホモログ、保存的修飾バリアント、および／または保存的置換バリアントが包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード化配列の単一アミノ酸または低パーセンテージのアミノ酸を変更する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、変更が、アミノ酸の化学的類似アミノ酸への置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的修飾バリアント」であることを認識するであろう。そのような保存的修飾バリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えてであり、それらを除外しない。
所与のアミノ酸は、類似の物理化学的特色を有する残基により置き換えられてもよく、例えば、１つの脂肪族残基が別の脂肪族残基に置換されるか（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いになど）、または１つの極性残基が別の極性残基に置換される（ＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間など）。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特色を有する領域全体の置換は、周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つで試験して、所望の活性、例えば、リガンド媒介性受容体活性および天然または参照ポリペプチドの特異性が保持されることを確認することができる。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（１）無極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分割することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、こうしたクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うだろう。特定の保存的置換としては、例えば、以下のものが挙げられる；ＡｌａをＧｌｙにまたはＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎにまたはＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａにまたはＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎにまたはＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕにまたはＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅにまたはＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに、またはＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに、またはＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに、またはＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；および／またはＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに、またはＬｅｕに。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載のアミノ酸配列の１つの機能的断片であってもよい。本明細書で使用される場合、「機能的断片」は、当技術分野で公知の、または本明細書の下記に記載されているアッセイに従って野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書に開示されている配列の保存的置換を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載のようなポリペプチドまたは分子のバリアントであってもよい。一部の実施形態では、バリアントは、保存的修飾バリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、天然ヌクレオチド配列の突然変異により得ることができる。「バリアント」は、本明細書で言及される場合、天然または参照ポリペプチドと実質的に相同性であるが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換のため、天然または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然または参照ＤＮＡ配列と比較した場合、ヌクレオチドの１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、非バリアントポリペプチドの活性を保持するバリアントタンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。多種多様なＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発手法が当技術分野で公知であり、当業者であれば適用することができる。
バリアントアミノ酸またはＤＮＡ配列は、天然または参照配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であってもよい。天然配列と突然変異配列との間の相同性の度合い（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために広く使用されている自由に使用可能なコンピュータープログラム（例えば、初期設定のＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することにより決定することができる。
天然アミノ酸配列の変更は、当技術分野で公知の少なからぬ技法のいずれかにより実現することができる。突然変異は、例えば、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位によりフランキングされている、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発手順を使用して、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような変更をなすための技法は十分に確立されており、例えば、以下の文献により開示されたものが挙げられる：Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号明細書および第４，７３７，４６２号明細書。こうした文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。また、ポリペプチドの正しい立体構造の維持に関与しないシステイン残基はいずれも、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止するために、一般にセリンで置換されていてもよい。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、その安定性を向上させるか、またはオリゴマー化を促進してもよい。
ＷＩＳＰ１を阻害する抗体
本実施形態のいずれかの一態様では、本明細書には、肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、標的細胞においてＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法が記載されている。
種々の実施形態では、本明細書に記載の作用剤は、ＷＩＳＰ１に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体試薬である。
別の実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ＷＩＳＰ１ポリペプチドと特異的に結合する。別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号１～４または配列番号６のアミノ酸配列と特異的に結合する。
本明細書で使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原と特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含んでいてもよい。本態様のいずれかの一部の実施形態では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含んでいてもよい。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）を含んでいてもよい。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照；この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））ならびに完全な抗体を包含する。
抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプおよび組合せ）の構造的特徴を有してもよい。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）を含む任意の供給源に由来してもよく、霊長類化抗体であってもよい。抗体としては、ミディボディ、ナノボディ、イントラボディ、ヒト化抗体、およびキメラ抗体なども挙げられる。
本態様のいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体試薬である。別の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ポリクローナル抗体である。さらに別の実施形態では、ヒト化抗体は、治療に使用するためのものである。
本明細書に記載の抗ＷＩＳＰ１抗体は、単一特異性抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。「単一特異性抗体」という用語は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、本明細書で使用される場合、抗体がどのように生成されたかに関わりなく、単一分子組成の抗体またはその断片の調製物を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ヒツジ、またはヤギ）に由来する重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも部分が、より「ヒト様」になるように、つまりヒト生殖系列可変配列とより類似するように変更されている抗体を指す。したがって、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むように遺伝子操作または設計されているキメラ抗体の形態である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体またはアクセプター抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含んでいてもよい。こうした修飾は、抗体性能をさらに洗練させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また、ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも部分を含むことになる。さらなる詳細は、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。本明細書で使用される場合、「複合ヒト抗体（composite human antibody）」または「脱免疫化抗体（deimmunized antibody）」は、可変ドメインからＴ細胞エピトープを低減または排除するように設計された特定のタイプの遺伝子操作またはヒト化抗体である。
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。こうした非ヒトアミノ酸残基は、「インポート（import）」残基と呼ばれることが多く、典型的には「インポート（import）」可変ドメインから取られる。ヒト化は、げっ歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび同僚らの方法に従って実施することができる（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインのかなり少ない部分が、非ヒト種に由来する対応する配列により置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基がげっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
ある特定の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、イントラボディである。イントラボディは、細胞内で標的と機能的に結合する細胞内抗体である（一般に、Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)；およびRondon and Marasco, Annu Rev Microbiol, 51:257-83 (1997)；米国特許第６，００４，９４０号明細書；および米国特許第５，５８１，８２９号明細書を参照；こうした文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。イントラボディを産生するための方法は、例えば、国際公開第２００２／０８６０９６号パンフレットに記載のようなものが、当業者に周知である。抗体は、通常は、少なくとも約１ｍＭのＫＤ、より通常は少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１０μＭ、より典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、より好ましくは少なくとも約３μＭ、またはそれよりも良好なＫＤで結合することになる。
一実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、中和抗体である。一実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、非中和抗体である。
一部の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体はキメラである。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、抗体または抗体をコードする配列の状況で使用される場合、異なる動物種に由来する２つまたはそれよりも多くのセグメントまたは部分により特徴付けられる免疫グロブリン分子を指す。例えば、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト哺乳動物抗体に由来し、免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。キメラ抗体の可変セグメントは、典型的には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分に、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分に連結されている。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、不死化Ｂ細胞（国際公開第８７／０２６７１号パンフレット；この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）などの様々なヒト細胞から、周知の手順に従って単離することができる。抗体は、軽鎖および重鎖定常領域を両方とも含有していてもよい。重鎖定常領域は、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、および場合によってはＣＨ４領域を含んでいてもよい。治療目的のためには、ＣＨ２ドメインを欠失または削除してもよい。例えば、抗原特異性が適切であるマウスまたは他の種の抗体分子に由来する遺伝子を、生物学的活性が適切であるヒト抗体分子に由来する遺伝子と共にスプライシングすることにより、「キメラ抗体」を産生するために開発された技法が、当技術分野で公知である（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984)；Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)；Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)；こうした文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載の組成物および方法の一部の実施形態では、ＷＩＳＰ１結合性ドメインは、可変軽鎖配列、可変重鎖配列、またはその両方を含む。
当業者であれば理解するように、全長抗体の各重鎖は、重鎖可変ドメイン（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（本明細書では、ＬＣＶＲをＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域で分散されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。この構造は、当業者に周知である。鎖は、通常は、ジスルフィド結合を介して互いに連結されている。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」、つまり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が特異的抗原結合のため必要である、重鎖または軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、カバットにより規定される通りの「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基（つまり、おおよそ、軽鎖可変ドメインの残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）および／または「超可変ループ」に由来する残基（つまり、おおよそ、軽鎖可変ドメインの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含んでいてもよい。一部の例では、相補性決定領域は、カバットにより規定されるＣＤＲ領域、および超可変ループの両方に由来するアミノ酸を含んでいてもよい。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な単一の重鎖または軽鎖可変領域に生じる３つのＣＤＲの群を指す。こうしたＣＤＲの正確な境界は、異なる方式により規定が異なっている。カバットにより記載の方式（Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)）は、抗体の任意の可変領域に適用可能な一義的な残基付番方式を提供するだけではなく、３つのＣＤＲを規定する正確な残基境界も提供する。こうしたＣＤＲは、カバットＣＤＲと呼ばれる場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび同僚ら（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)およびChothia et al., Nature 342:877-883 (1989)）は、カバットＣＤＲ内のある特定のサブ部分が、アミノ酸配列のレベルの多様性が大きいにも関わらず、ほとんど同一のペプチド骨格立体構造をとることを見出した。こうしたサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３として指定され、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域および重鎖領域を指す。こうした領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ばれる場合があり、カバットＣＤＲと重複する境界を有する。カバットＣＤＲと重複するＣＤＲを規定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（FASEB. 9:133-139 (1995)）およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)）により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界規定は、上記方式の１つに厳密に従わなくともよく、特定の残基または残基の群またはＣＤＲ全体でさえ、抗原結合に著しくは影響を及ぼさないという予測または実験的知見に照らして、境界を短縮または延長させることができるものの、それにも関わらずカバットＣＤＲと重複するだろう。また、一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより規定される通りの「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基を含むと記述することができる。本明細書で使用される組成物および方法では、こうした方式のいずれに従って規定されたＣＤＲでも使用することができるが、好ましい実施形態では、ＩＭＧＴまたはＡｂｙｓｉｓにより規定されるＣＤＲが使用される。それにもかかわらず、ＣＤＲの境界は、こうした付番慣習のいずれかを参照すれば明白である。
免疫グロブリン定常（Ｃ）ドメインは、重（ＣＨ）鎖または軽（ＣＬ）鎖定常ドメインを指す。マウスおよびヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。重鎖に関して、本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ（α）、デルタ（Δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、またはミュー（μ）重鎖であってもよい。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、記載されている抗体の重鎖は、ヒトアルファ（α）、デルタ（Δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、またはミュー（μ）重鎖を含んでいてもよい。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当技術分野に記載されている。例えば、米国特許第５，６９３，７８０号明細書およびＫａｂａｔ ＥＡら（１９９１年）上記を参照されたい。
したがって、本明細書に記載の組成物および方法の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１は、非ＩｇＧフレームワークで構成されている。
本明細書で使用される場合、「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、１つまたは複数のＣＤＲを提供する抗体を指す。例示的な実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるかまたは由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。一部の実施形態では、ドナー抗体は、アクセプター抗体とは異なるアイソタイプのものである。ヒト化抗体の状況では、「ドナー抗体」という用語は、１つまたは複数のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％を提供する抗体またはコードする核酸配列を指す。一部の実施形態では、「アクセプター」という用語は、定常領域を提供する抗体アミノ酸またはコードする核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域および定常領域の１つまたは複数を提供する抗体アミノ酸またはコードする核酸配列を指す。具体的な実施形態では、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％を提供またはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１つまたは複数の特定の位置には生じない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有していてもよい。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域は、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体、または市販の抗体）であってもよく、例えば、それらに由来してもよく、またはそれらから得ることができる。
ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、Ｖ－ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブのｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／に見出される）またはＩＭＧＴ（商標）のｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／に見出される）に列挙されている配列から選択される。本明細書で開示されている技術の別の実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、米国特許出願公開第２０１１／０２８０８００号明細書の表３および表４に記載されている配列から選択される。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物および方法は、一部の実施形態では、抗体の「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」を含んでいてもよい。抗体の「抗原結合性断片」または「ＷＩＳＰ１結合性断片」という用語は、抗原（例えば、ＷＩＳＰ１）と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。
抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により実施され得る。また、そのような抗体断片の実施形態は、二重可変ドメイン（ＤＶＤ－Ｉｇ）フォーマットなどの二特異性、二重特異性、または多重特異性フォーマットに組み込まれていてもよく、２つまたはそれよりも多くの異なる抗原と特異的に結合することができる。抗体の「抗原結合性部分」という用語内に包含される抗原結合性断片の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ward et al. (1989) Nature, 341: 544-546；国際公開第９０／０５１４４号パンフレット）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一タンパク質鎖として製作されることを可能にする合成リンカーにより接合されていてもよい（例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883を参照されたい）。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」という用語内に包含されることが意図されている。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も包含される。
一部の実施形態では、抗体試薬は、二特異性モノクローナル抗体である。
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーが使用されており、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することが強制され、２つの抗原結合性部位が作出される二価二特異性抗体である（例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123); Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, N.Y. (2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)を参照）。加えて、単鎖抗体としては、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「線状抗体」も挙げられる（Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用され、インタクト抗体のパパイン消化により生成することができる。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域であってよくまたはバリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン：ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ部分のアミノ酸残基を置き換えて抗体エフェクター機能を変更することは、当技術分野で公知である（米国特許第５，６４８，２６０号明細書および第５，６２４，８２１号明細書）。抗体のＦｃ部分は、幾つかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ならびに抗体および抗原－抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。一部の場合では、こうしたエフェクター機能は治療用抗体にとって望ましいものであるが、他の場合では、治療目的に応じて不要または有害でさえあり得る。ある特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれ、Ｆｃγ受容体および補体Ｃ１ｑとの結合によりＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態では、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が、抗体のエフェクター機能が変更されるように置き換えられている。
本明細書に記載のような、ＷＩＳＰ１と特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードするＤＮＡ配列。また、核酸配列は、例えば、相同性哺乳動物（例えば、マウス）配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインまたはフレームワーク領域のコード配列を用いることにより（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または本明細書の他所にも記載のように、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で接合することにより、修飾されていてもよい。
そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインの代わりに用いてもよく、またはそのような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の１つの抗原結合性部位の可変ドメインの代わりに用いて、１つの目的の抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合性部位および異なる目的の抗原に対して特異性を有する別の抗原結合性部位を含むキメラ二価抗体を作出してもよい。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、抗体またはそのＷＩＳＰ１結合性断片は、それが由来する重鎖可変領域配列のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、重鎖可変領域配列のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つを含む。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、前記アミノ酸配列に由来する重鎖可変フレームワーク領域は、前記アミノ酸配列からなるが、最大で１０個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入、好ましくは最大で１０個のアミノ酸置換が存在する。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、前記アミノ酸配列に由来する重鎖可変フレームワーク領域は、前記アミノ酸配列からなり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が、対応する非ヒト、霊長類、またはヒト重鎖可変フレームワーク領域の類似位置に見出されるアミノ酸に置換されている。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトまたは霊長類抗体のＶＨに由来する１つ、２つ、３つ、または４つすべてのＶＨフレームワーク領域をさらに含む。本明細書に記載の重鎖ＣＤＲ配列と共に使用するために選択される抗体の霊長類またはヒト重鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一性を有してもよい。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、霊長類またはヒト重鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、本明細書に記載の抗体のいずれかの重鎖フレームワーク領域と、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性（またはそれよりも高い同一性）を有する天然霊長類またはヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来する。具体的な実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒト重鎖可変サブファミリー（例えば、サブファミリー１～７の１つ）に由来する１つ、２つ、３つ、または４つすべてのＶＨフレームワーク領域をさらに含む。
本明細書に記載の態様の一部のそのような実施形態では、抗体またはそのＷＩＳＰ１結合性断片は、それが由来する軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の１つ、２つ、３つ、または４つを含む。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、前記アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、前記アミノ酸配列からなるが、最大で１０個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入、好ましくは最大で１０個のアミノ酸置換が存在する。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、前記アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、前記アミノ酸配列からなり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が、対応する非ヒト、霊長類、またはヒト軽鎖可変フレームワーク領域の類似位置に見出されるアミノ酸に置換されている。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトまたは霊長類抗体のＶＬに由来する１つ、２つ、３つ、または４つすべてのＶＬフレームワーク領域をさらに含む。本明細書に記載の軽鎖ＣＤＲ配列と共に使用するために選択される抗体の霊長類またはヒト軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一性を有してもよい。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、霊長類またはヒト軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、本明細書に記載の抗体のいずれかの軽鎖フレームワーク領域と、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性（またはそれよりも高い同一性）を有する天然霊長類またはヒト抗体軽鎖フレームワーク領域に由来する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒト軽鎖可変カッパサブファミリーに由来する１つ、２つ、３つ、または４つすべてのＶＬフレームワーク領域をさらに含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒト軽鎖可変ラムダサブファミリーに由来する１つ、２つ、３つ、または４つすべてのＶＬフレームワーク領域をさらに含む。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域および／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域に沿った１つまたは複数のＣＤＲの位置は様々であってもよく、つまり、目的の抗原との免疫特異的結合が維持される限り（例えば、実質的に、例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が維持される）、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸位置だけより短くてもよくまたはより長くてもよい。例えば、一部の実施形態では、ＣＤＲを規定する位置は、様々であってもよく、つまり、目的の抗原との免疫特異的結合が維持される限り（例えば、実質的に、例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が維持される）、ＣＤＲのＮ末端境界および／またはＣ末端境界を、本明細書に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ位置と比べて１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸だけシフトさせることにより、より短くてもよくまたはより長くてもよい。他の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域および／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域に沿った１つまたは複数のＣＤＲの長さは、目的の抗原との免疫特異的結合が維持される限り（例えば、実質的に、例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が維持される）、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多くのアミノ酸だけ、様々であってもよい（例えば、より短くてもよくまたはより長くてもよい）。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、１つ、２つ、またはそれよりも多くの突然変異（例えば、アミノ酸置換）を、本明細書に記載の抗体のいずれかのＦｃ領域またはその断片（例えば、カバット付番方式（例えば、カバットのＥＵインデックス）に従った付番による、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）および／またはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１～４４７）および／またはヒンジ領域）に導入して、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更する。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号明細書に記載のように、１つ、２つ、またはそれよりも多くの突然変異（例えば、アミノ酸置換）を、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変更されるように（例えば、増加または減少するように）Ｆｃ領域（ＣＨ１ドメイン）のヒンジ領域に導入する。ＣＨ１ドメインのヒンジ領域のシステイン残基の数を変更して、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にしてもよく、または抗体の安定性を変更してもよい（例えば、増加または減少させてもよい）。
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、１つ、２つ、またはそれよりも多くの突然変異（例えば、アミノ酸置換）を、本明細書に記載の抗体のＦｃ領域またはその抗原結合性断片（例えば、カバット付番方式（例えば、カバットのＥＵインデックス）に従った付番による、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）および／またはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１～４４７）および／またはヒンジ領域）に導入して、エフェクター細胞の表面にあるＦｃ受容体（例えば、活性化Ｆｃ受容体）に対する抗体の親和性を増加または減少させる。Ｆｃ受容体に対する抗体の親和性を減少または増加させる、抗体のＦｃ領域またはその断片における突然変異、およびそのような突然変異をＦｃ受容体またはその断片に導入するための技法は、当業者に公知である。Ｆｃ受容体に対する抗体の親和性を変更するためになすことができる、抗体のＦｃ受容体における突然変異の例は、例えば、Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、ならびに国際公開第０２／０６０９１９号パンフレット；国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、および国際公開第９７／３４６３１号パンフレットに記載されている。こうした文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
「ＣＤＲ移植抗体」という用語は、ヒトＣＤＲの１つまたは複数（例えば、ＣＤＲ３）がマウスＣＤＲ配列で置き換えられているヒト重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体など、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数の配列が別の種のＣＤＲ配列に置き換えられている抗体を指す。本明細書に記載のＣＤＲ移植抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数が、本明細書に記載の非ヒト抗体のＣＤＲ配列で置き換えられている、ヒト抗体に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。
本明細書に記載の抗ＷＩＳＰ１抗体を遺伝子操作して、治療に使用するために結合特異性または薬物動態特性を向上させることができる。結合の特異性は、例えば、１つまたは複数の無関連のまたは異なる抗原との競合と比較して、抗原（例えば、ＷＩＳＰ１またはそのポリペプチド断片）を使用する競合アッセイによりアッセイすることができる。ＷＩＳＰ１と特異的に結合する作用剤、抗体、または他のリガンドを選択するためには、様々なイムノアッセイ形式が適切である。特異的結合は、例えば、本明細書に記載の作用剤（例えば、ポリペプチドまたは抗ＷＩＳＰ１抗体）の親和性およびアビディティならびに作用剤の濃度により影響を受ける場合がある。当業者であれば、好適な結合アッセイにて作用剤を滴定することなどの任意の好適な方法を使用して、本明細書に記載の作用剤がＷＩＳＰ１と選択的に結合する適切な条件を決定することができる。
本明細書で使用される場合、「枢要な（key）」残基という用語は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に対して、他のものよりも大きな影響を示す可変ドメイン内のある特定の残基を指す。枢要な残基としては、これらに限定されないが、以下のものの１つまたは複数が挙げられる：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ－またはＯ－グリコシル化部位のいずれでもよい）、稀少残基、抗原と相互作用することが可能な残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、カノニカル残基（canonical residue）、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの接触残基、ベルニエ帯（Vernier zone）内の残基、ならびに可変重鎖ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ規定と第１の重鎖フレームワークのカバット規定との間で重複する領域にある残基。
本明細書に記載の抗ＷＩＳＰ１抗体は、遺伝子操作された抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」という用語は、人間の手により操作されている態様を指す。例えば、遺伝子座は、その遺伝子座において天然ではその順序では一緒に連結されていない２つまたはそれよりも多くの配列が、遺伝子操作された遺伝子座では互いに直接的に連結されるように人間の手により操作されている場合、「遺伝子操作された」とみなされる。例えば、本発明の一部の実施形態では、遺伝子操作された遺伝子座は、非天然Ｖセグメントを有する種々のＩｇ配列を含み、それらはすべて、天然に見出されるが、同じ遺伝子座には見出されないか、または天然の遺伝子座にはその順序では見出されない。一般的な慣行であり、当業者であれば理解するように、遺伝子操作されたポリヌクレオチド（および／またはそのようなポリヌクレオチドを含む細胞もしくは動物）の子孫および複製は、実際の操作が以前の実体に対して実施されたとしても、典型的には依然として「遺伝子操作された」と呼ばれる。
ＷＩＳＰ１結合性ポリペプチド、抗体、抗体試薬、またはそれらの抗原結合性部分は、抗体抗原結合性部分と１つまたはそれよりも多くの他のタンパク質またはペプチドとの共有結合によるまたは非共有結合による付随により形成されるより大きな免疫接着分子の一部または分子の組成物であってもよい。そのような免疫接着分子の例としては、ストレプトアビジンコア領域を使用して四量体ｓｃＦｖ分子を製作すること（Kipriyanov et al. (1995) Human Antibod. Hybridomas 6:93-101）、ならびにシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して二価ビオチン化ｓｃＦｖ分子を製作すること（Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、抗体全体のパパインまたはペプシン消化などの従来技術を使用して、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、その抗原結合性部分、および免疫接着分子は、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。また、抗体の抗原結合性部分などの標的結合性タンパク質は、二重可変ドメイン（ＤＶＤ－Ｉｇ）の一部であってもよい。
任意の特定の標的抗原（例えば、ＷＩＳＰ１）に対して治療的および／または特異的である抗体および抗体試薬は、当業者であれば、公知の抗体または抗体試薬から、例えば、ＦＤＡ承認の治療用抗体試薬および／またはそれらの標的特異性に従ってカタログに列挙されている市販の抗体試薬から容易に選択される。
別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、当技術分野で公知の任意の抗ＷＩＳＰ１抗体、またはこれから発見されることになる任意の抗ＷＩＳＰ１抗体である。当技術分野で公知の例示的な抗ＷＩＳＰ１抗体としては、これらに限定されないが、Ａｂｃａｍが販売する抗ＷＩＳＰ１抗体（例えば、ａｂ６０１１４；ａｂ６５９４３）、ＲＮＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（例えば、ｍａｂ１６８０）、およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（例えば、ＳＡＢ２５０１１１４）が挙げられる。
別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、下記の表１（抗体の表）から選択される。別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、配列番号１２～１２０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。
Figure 2022512735000002
Figure 2022512735000003
別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体は、任意の公知の、またはこれから発見されることになる非ヒト抗ＷＩＳＰ１抗体に由来するヒト化抗ＷＩＳＰ１抗体である。
一実施形態では、抗体または抗体試薬は、ＷＩＳＰ１をコードするアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸配列に結合する。
別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬は、配列番号１の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、または配列番号１の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬は、配列番号１の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号１の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えばＷＩＳＰ１と結合し、ＷＩＳＰ１レベルおよび／または活性の阻害をもたらすのに十分である。
ある特定の実施形態では、抗体または抗体試薬は、種々のヒトＷＩＳＰ１アイソフォームをコードするアミノ酸配列（配列番号２、３、または４）に対応するアミノ酸配列に結合する。
別の実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬は、配列番号２、３、または４の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、または配列番号２、３、もしくは４の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬は、配列番号２、３、または４の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号２、３、または４の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えばＷＩＳＰ１と結合し、ＷＩＳＰ１レベルおよび／または活性の阻害をもたらすのに十分である。
別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、マウスＷＩＳＰ１をコードするアミノ酸配列（配列番号６）に対応するアミノ酸配列に結合する。
別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号６の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、または配列番号６の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一実施形態では、抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬は、配列番号６の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号６の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えばＷＩＳＰ１と結合し、ＷＩＳＰ１レベルおよび／または活性の阻害をもたらすのに十分である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書には、配列番号１２～１２０の可変重鎖および軽鎖配列によりコードされる１つまたは複数のＣＤＲを含む１つまたは複数の可変ドメインを含むヒト化抗体が記載されている。
別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体または抗体試薬ＣＤＲは、配列番号１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号１２～１２０のいずれか１つと少なくとも９０％相同性を有するアミノ酸配列を含む。
言い換えれば、一部の実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、配列番号１～４、６、または配列番号１２～１２０と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％相同性である。
他の実施形態では、例えば、ＷＩＳＰ１結合性断片または抗ＷＩＳＰ１抗体の核酸配列またはアミノ酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミノ酸配列）は、配列が、ＷＩＳＰ１と特異的に結合する抗体の対応する天然または未編集核酸配列（例えば、ゲノム配列）またはアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高度に同一である場合、「相同性」であるとみなされる。
本明細書で提供される一態様は、本明細書に記載の抗ＷＩＳＰ１抗体または抗体試薬のいずれかを含む組成物である。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態では、組成物は医薬組成物である。
ＷＩＳＰ１を阻害する核酸
一実施形態では、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、マイクロＲＮＡの配列など、ＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列に相補的な合成核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合し、転写、翻訳、またはスプライシングのレベルで発現を停止させることにより、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的の発現を阻止するように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で遺伝子、例えば、ＷＩＳＰ１にハイブリダイズするように設計されている相補的核酸配列である。したがって、標的に対して十分に相補的な、つまり細胞環境の状況において十分に良好におよび十分な特異性でハイブリダイズして所望の効果を発揮するオリゴヌクレオチドが選択される。例えば、ＷＩＳＰ１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＷＩＳＰ１遺伝子（例えば、配列番号５）またはマウスＷＩＳＰ１遺伝子（例えば、配列番号７）のコード配列の部分に相補的な、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれよりも多くの塩基を含んでいてもよい。
一実施形態では、ＷＩＳＰ１を、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳ、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、任意のゲノム編集系を使用して細胞のゲノムから欠失させる。一実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むために使用されるゲノム編集系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ではない。これにより、少量のＣａｓ酵素／タンパク質を保持する細胞での望ましくない細胞死を防止することができる。本明細書では、Ｃａｓ酵素またはｓｇＲＮＡはいずれも各々が異なる誘導性プロモーターの制御下で発現され、それにより各々の一過性発現がそのような干渉を防止することを可能にすることも企図される。
１つまたは複数のｓｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼをコードする核酸を各々ｉｎ ｖｉｖｏで投与される必要がある場合、アデノウイルス関連ベクター（ＡＡＶ、adenovirus associated vector）の使用が特に企図される。核酸をゲノム編集／断片化系の両成分（例えば、ｓｇＲＮＡ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ）に同時に送達するための他のベクターとしては、エプスタインバー、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などのレンチウイルスベクターが挙げられる。ＲＮＡ誘導ゲノム編集系の成分の各々（例えば、ｓｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ）は、当技術分野で公知のように、または本明細書に記載のように、別々のベクターで送達することができる。
一実施形態では、作用剤は、ＲＮＡ阻害によりＷＩＳＰ１を阻害する。所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であってもよい。本態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性核酸は、阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である。ＲＮＡｉは、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。
ｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または人工ｍｉＲＮＡであってもよい。一実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、標的、例えば、ＷＩＳＰ１の発現および／または活性の阻害をもたらす。本態様のいずれかの一部の実施形態では、作用剤は、ＷＩＳＰ１を阻害するｓｉＲＮＡである。本態様のいずれかの一部の実施形態では、作用剤は、ＷＩＳＰ１を阻害するｓｈＲＮＡである。
当業者であれば、例えば、公的に利用可能な設計ツールを使用して、ＷＩＳＰ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを設計することができるだろう。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡは、一般的には、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ラファイエット、米国コロラド州）またはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、米国ミズーリ州）などの企業を使って製作される。
本態様のいずれかの一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであってもよい。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用されることになる条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分な程度に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的であり、一般には完全に相補的である相補性の領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来してもよい。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含むため、２つの鎖は、好適な条件下で組み合わせるとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、安定性または他の有益な特色が増強されるように化学的に修飾することができる。本発明で特徴付けられている核酸は、"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のものなど、当技術分野で十分に確立されている方法により合成および／または修飾することができる。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、作用剤は、ＷＩＳＰ１を阻害するｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、平均の長さが２２個ヌクレオチドである小型非コードＲＮＡである。こうした分子は、通常はｍＲＮＡ分子内の３’非翻訳（３’ＵＴＲ）領域にある相補配列に結合することにより作用し、それにより標的ｍＲＮＡの分解またはｍＲＮＡ翻訳の阻害を促進する。マイクロＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用は、不完全なワトソン－クリック塩基対合によりｍＲＮＡに対する配列特異的結合を指図するマイクロＲＮＡの６～８個ヌクレオチド領域である「シード配列」として知られるものにより媒介される。哺乳動物では、９００種よりも多くのマイクロＲＮＡが発現されることが公知である。これらの多くは、それらのシード配列に基づいてファミリーにグループ化することができ、それにより類似のマイクロＲＮＡの「クラスター」を識別することができる。ｍｉＲＮＡは、細胞内で、例えばネイキッドＤＮＡとして発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、細胞内で発現される核酸により、例えばネイキッドＤＮＡとしてコードされていてもよく、またはベクター内に含有される核酸によりコードされていてもよい。
一実施形態では、ＷＩＳＰ１をダウンモジュレートする作用剤は、ｍｉＲＮＡ－１５ａである。ｍｉＲＮＡ－１５ａは、肝臓を含む少なからぬ臓器において遺伝子発現を調節する非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ－１５ａ配列は、少なからぬ種のもの、例えばヒトｍｉＲＮＡ－１５ａ、例えばｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ０００００６９、およびマウスｍｉＲＮＡ－１５ａ、例えばｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ００００５６４が公知である。ヒトｍｉＲＮＡ－１５ａは、配列番号８の配列を含む。ｍｉＲＮＡ－１５ａは、天然に存在するバリアント、分子、およびそれらの対立遺伝子を含む、ヒトｍｉＲＮＡ－１５ａを指すことができる。例えば、ｍｉＲＮＡ－１５ａは、配列番号１０の配列を有するマウスｍｉＲＮＡ－１５ａであってもよい。
一実施形態では、作用剤、例えばｍｉＲＮＡ－１５Ａは、配列番号８の配列に対応する配列を有するか、または配列番号８の配列を含むか、または配列番号８の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、作用剤、例えばｍｉＲＮＡ－１５ａは、配列番号１０の配列に対応する配列を有するか、または配列番号１０の配列を含むか、または配列番号１０の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、ＷＩＳＰ１をダウンモジュレートする作用剤は、ｍｉＲＮＡ－４１２である。ｍｉＲＮＡ－４１２配列は、少なからぬ種のもの、例えばヒトｍｉＲＮＡ－４１２、例えばｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ０００１４６４、およびマウスｍｉＲＮＡ－４１２、例えばｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ０００１１６４が公知である。ヒトｍｉＲＮＡ－４１２は、配列番号９の配列を含む。ｍｉＲＮＡ－４１２は、天然に存在するバリアント、分子、およびそれらの対立遺伝子を含む、ヒトｍｉＲＮＡ－１５ａを指すことができる。例えば、ｍｉＲＮＡ－１５ａは、配列番号１１の配列を有するマウスｍｉＲＮＡ－４１２であってもよい。
一実施形態では、作用剤、例えばｍｉＲＮＡ－４１２は、配列番号９の配列に対応する配列を有するか、または配列番号９の配列を含むか、または配列番号９の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、作用剤、例えばｍｉＲＮＡ－４１２は、配列番号１１の配列に対応する配列を有するか、または配列番号１１の配列を含むか、または配列番号１１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
作用剤は、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を用いる場合など、標的遺伝子（例えば、ＷＩＳＰ１）の遺伝子サイレンシングをもたらすることができる。これには、標的の細胞内のｍＲＮＡレベルが、作用剤が存在しない場合に細胞に見出されるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少を伴う。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少する。当業者であれば、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、ウエスタンブロッティングまたはＰＣＲに基づくアッセイにより、細胞内見出される遺伝子（例えば、ＷＩＳＰ１）レベルを検出することにより、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが、例えばＷＩＳＰ１を標的としてそれを下方制御するのに有効であるか否かを容易に評価することができるだろう。
作用剤は、ベクターに含有されていてもよく、したがってベクターをさらに含んでいてもよい。外因性遺伝子の標的哺乳動物細胞への移入に有用な多くのそのようなベクターが利用可能である。ベクターは、エピソーム性であってもよく、例えば、プラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来ベクターであってもよく、または相同組換えもしくはランダム組込みにより、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターにより、標的細胞ゲノムに組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株との組合せも使用を見出すことができ、その場合、カプシドタンパク質は標的細胞の感染に機能性であるだろう。通常は、細胞およびウイルスを、培養培地で少なくとも約２４時間インキュベートすることになる。次いで、短期間にわたって、一部の応用では、例えば２４～７３時間にわたって、または少なくとも２週間にわたって細胞が培養培地中で成長することを可能にし、分析前に５週間またはそれよりも長期間にわたって成長することを可能にしてもよい。広く使用されるレトロウイルスベクターは「欠損性」であり、つまり、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製には、パッケージング細胞株での成長が必要である。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への送達のためにまたは異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、ベクターは、ウイルス性であってもよくまたは非ウイルス性であってもよい。「ベクター」という用語は、適正な制御エレメントが付随する場合に複製が可能であり、遺伝子配列を細胞へと移入することができる任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターとしては、これらに限定されないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上にある転写調節配列に連結されたそこに含有されている核酸配列からのＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、ＷＩＳＰ１阻害剤）の発現を指図するベクターを指す。発現される配列は、必ずというわけではないが多くの場合、細胞に対して異種性であるだろう。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでいてもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有していてもよく、したがって発現ベクターを、２つの生物で、例えば、発現のためにはヒト細胞で、ならびにクローニングおよび増幅のためには原核生物宿主で維持することが可能である。「発現」という用語は、適用可能な場合は、これらに限定されないが、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳およびタンパク質フォールディング、修飾、ならびにプロセシングを含む、ＲＮＡおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質分泌に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」としては、遺伝子から転写されるＲＮＡ、および遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳により得られるポリペプチドが挙げられる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結している場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにてＲＮＡへと転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよくまたは含んでいなくともよい。
組込み型ベクターでは、それらが送達するＲＮＡ／ＤＮＡは、宿主細胞染色体に恒久的に組み込まれる。非組込み型ベクターは、エピソーム性のままであり、これは、そこに含有されている核酸が宿主細胞染色体に組み込まれることは決してないことを意味する。組込み型ベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
非組込み型ベクターの１つの例は、非組込み型ウイルスベクターである。非組込み型ウイルスベクターは、それらのゲノムが宿主ＤＮＡに組み込まれないため、組込み型レトロウイルスがもたらすリスクが排除される。１つの例は、エプスタインバーｏｒｉＰ／核抗原－１（「ＥＢＮＡ１」）ベクターであり、これは、自己複製を制限することが可能であり、哺乳動物細胞で機能することが知られている。エプスタイン－バーウイルスに由来する２つのエレメントであるｏｒｉＰおよびＥＢＮＡ１を含有するため、ＥＢＮＡ１タンパク質とウイルスレプリコン領域ｏｒｉＰとの結合は、哺乳動物細胞におけるプラスミドの比較的長期間にわたるエピソーム性存在を維持する。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターは、この特定の特徴のため、組込みのないｉＰＳＣの生成に理想的である。別の非組込み型ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
別の非組込み型ウイルスベクターは、ＲＮＡセンダイウイルスベクターであり、これは、感染細胞の核に進入することなくタンパク質を産生することができる。Ｆ欠損センダイウイルスベクターは、少数回の継代にわたって感染細胞の細胞質に存在し続けるが、急速に希釈され、数回の継代（例えば、１０回の継代）後に完全に失われる。
非組込み型ベクターの別の例は、ミニサークルベクターである。ミニサークルベクターは、プラスミド骨格が放出され、真核生物プロモーターおよび発現させようとするｃＤＮＡのみが残る環状化ベクターである。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へとパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、核酸を細胞へと移入するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで使用することができる。多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で公知である。
遺伝子操作された肝星細胞（ＨＳＣ）
一態様では、本明細書には、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現する肝星細胞またはその集団を生成するための方法であって、細胞を、本明細書に記載のＷＩＳＰ１を阻害する作用剤のいずれかと接触させること、および作用剤の発現を可能にするのに十分な時間にわたって細胞を培養することを含む方法が記載されている。
一実施形態では、細胞は、静止細胞である。静止細胞を識別するための方法は、本明細書の上記に記載されている。
一実施形態では、接触は、細胞を、作用剤または作用剤をコードするベクターと接触させることを含む。例えば、接触は、これらに限定されないが、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注射（例えば、ＨＳＣへの）、および／またはトランスフェクションを含んでいてもよい。当業者であれば、当技術分野で公知の技法を使用して、細胞を、本明細書に記載の作用剤と接触させることができる。
一実施形態では、作用剤は、ｍｉＲＮＡである。一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である。
一実施形態では、細胞は、標準的な培養条件下で、２０％（重量／容積）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％（重量／容積）ペニシリン／ストレプトマイシンで補完されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養される。
一実施形態では、細胞は、作用剤の発現を可能にするために、少なくとも１時間にわたって培養される。別の実施形態では、細胞は、作用剤の発現を可能にするために、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４時間、またはそれよりも長い時間にわたって培養される。当業者であれば、当技術分野の標準的な技法、例えば、ｍｉＲＮＡ発現を検出するためのＰＣＲに基づくアッセイを使用して、作用剤が培養後に細胞内で発現されたか否かを決定することができる。
一実施形態では、細胞は、作用剤を一過性に発現する。別の実施形態では、作用剤の発現は、例えば、細胞の子孫が作用剤を発現するように、細胞のゲノムに組み込まれている。
一態様は、本明細書に記載の方法を使用して生成されるＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現するＨＳＣを含む細胞株を提供する。ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現するＨＳＣは、例えば、肝疾患の治療を必要とする対象に投与するために、例えば、薬学的に許容される担体中に存在してもよい。
別の態様は、本明細書に記載の方法を使用して生成されたＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現するＨＳＣの集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
組成物および医薬組成物
一態様では、本明細書には、本明細書に記載の作用剤のいずれかを含む組成物が記載されている。一態様では、本明細書には、本明細書に記載の作用剤のいずれかを含む医薬組成物が記載されている。
別の態様では、本明細書には、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を含む組成物が記載されている。別の態様では、本明細書には、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を含む医薬組成物が記載されている。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬組成物は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの本明細書に記載の作用剤を含んでいてもよい。例えば、組成物は、ＷＩＳＰ１を阻害するｓｉＲＮＡおよび抗ＷＩＳＰ１抗体試薬を含んでいてもよい。あるいは、組成物は、２つの抗ＷＩＳＰ１抗体試薬を含んでいてもよい。
本態様のいずれかの一実施形態では、組成物は、肝疾患の治療または予防のために製剤化されている。本明細書に記載の方法を臨床使用するために、本明細書に記載のＷＩＳＰ１を阻害する作用剤（例えば、抗体、抗体試薬、またはそれらのＷＩＳＰ１結合性断片）の投与は、非経口投与、例えば、静脈内；粘膜、例えば鼻腔内；眼、または他の投与様式のための医薬組成物または医薬製剤への製剤化を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の作用剤は、対象において有効な治療をもたらす、任意の薬学的に許容される担体化合物、材料、または組成物と共に投与することができる。したがって、本明細書に記載の方法で使用するための医薬製剤は、本明細書に記載のような抗体またはその抗原結合性断片を、１つまたは複数の薬学的に許容される成分と組み合わせて含有していてもよい。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書で使用される場合、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、封入材料、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、または抗体もしくはその抗原結合性断片の安定性、溶解性、もしくは活性の維持に関与する溶媒封入材料などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容」されなければならない。「賦形剤」、「担体」、または「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書では同義的に使用される。
本明細書に記載のＷＩＳＰ１の作用剤または阻害剤の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体または抗原結合性断片を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存するために調製することができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒性であり、以下のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。例示的な凍結乾燥抗体製剤は、国際公開第９７／０４８０１号パンフレットに記載されている。この文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
任意選択で、しかしながら好ましくは、本明細書に記載の組成物を含む製剤は、薬学的に許容される塩、典型的には、例えば塩化ナトリウムを、好ましくはおおよそ生理学的濃度で含有する。任意選択で、本発明の製剤は、薬学的に許容される保存剤を含有してもよい。一部の実施形態では、保存剤濃度は、典型的には容積／容積で０．１～２．０％の範囲である。好適な保存剤としては、医薬品分野で公知のものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンは、保存剤の例である。任意選択で、本発明の製剤は、０．００５～０．０２％の濃度の薬学的に許容される界面活性剤を含んでいてもよい。
また、本明細書に記載の作用剤（例えば、抗体、抗体試薬、およびそれらのＷＩＳＰ１結合性断片）を含む組成物の治療用製剤は、治療される特定の適応症に必要な１つよりも多くの活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。あるいは、組成物は、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、または成長阻害剤を含んでいてもよい。そのような分子は、好適には、意図されている目的のために有効な量の組合せで存在する。
また、本明細書に記載の作用剤を含む組成物の治療用製剤の活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに、例えば、コアセルベーション技法によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されていてもよい。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
一部の実施形態では、医薬組成物は、脂質ビヒクルをさらに含む。例示的な脂質ビヒクルとしては、これらに限定されないが、リポソーム、ミセル、エクソソーム、脂質エマルジョン、および脂質－薬物複合体が挙げられる。
一部の実施形態では、医薬組成物は、粒子またはポリマーに基づくビヒクルをさらに含む。例示的な粒子またはポリマーに基づくビヒクルとしては、これらに限定されないが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ポリマーマイクロスフェア、またはポリマー－薬物コンジュゲートが挙げられる。
一部の実施形態では、徐放性調製物を使用することができる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または抗原結合性断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態であるマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ－グルタミン酸およびｙエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日間よりも長期にわたって分子の放出を可能にし、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化抗体が長期間にわたって体内に留まると、３７℃にて水分に曝露された結果として変性または凝集する場合があり、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機序が、チオ－ジスルフィド交換による分子間Ｓ－－Ｓ結合形成であることが判明した場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により達成することができる。
本明細書に記載の方法では、非経口投与などのｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される治療用製剤は、滅菌することができ、滅菌は、滅菌濾過膜による濾過、または当業者に公知の他の方法により容易に実現される。
投与
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のようなＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することを含む、肝疾患を有するかまたは有すると診断された対象の治療に関する。肝疾患を有する対象は、医師であれば、状態を診断するための現行方法を使用して識別することができる。この疾患を特徴付け、診断の助けとなる肝疾患の症状および／または合併症は、当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、倦怠感、体重喪失、痛み、皮膚および／または眼の黄変、ならびに暗色尿が挙げられる。例えば、肝疾患の診断の助けとなり得る検査としては、これらに限定されないが、例えば、血液検査、非侵襲的画像診断、および／または組織生検が挙げられる。肝疾患の家族歴も、対象がその状態を有する可能性が高いか否かを決定するための、または肝疾患の診断を行うための助けになるだろう。
本明細書に記載の作用剤および組成物（例えば、ＷＩＳＰ１を阻害するもの）は、肝疾患を有するかまたは有すると診断された対象に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、肝疾患の少なくとも１つの症状を緩和するために、有効量の作用剤を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「肝疾患の少なくとも１つの症状を緩和する」とは、肝疾患に関連付けられる任意の状態または症状（例えば、倦怠感、体重喪失、痛み、皮膚および／もしくは眼の黄変、または暗色尿）を改善することである。そのような低減は、任意の標準技法で測定した場合、等価な未治療対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも大きい。本明細書に記載の作用剤および組成物を対象に投与するための様々な手段が当業者に公知である。一実施形態では、作用剤は、全身的にまたは局所的に（例えば、肝臓に）投与される。一実施形態では、作用剤は静脈内投与される。一実施形態では、作用剤は、連続的に、間隔を置いて、または散発的に投与される。作用剤の投与経路は、送達される作用剤のタイプ（例えば、ｍｉＲＮＡ、細胞、またはＲＮＡｉ）に合わせて最適化されることになり、熟練の開業医により決定することができる。
本明細書に記載の作用剤および医薬組成物は、対象に有効な治療をもたらす任意の適切な経路により、それを必要とする対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、「投与する」および「導入する」という用語は同義的に使用され、本明細書に記載の作用剤または医薬組成物（例えば、抗体、抗体試薬、またはそれらのＷＩＳＰ１結合性断片）を、所望の効果が生み出されるように、感染またはがんの部位などの所望の部位においてそのような作用剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路により、対象内に配置することを指す。作用剤または医薬組成物は、作用剤を全身的にまたは所望の表面もしくは標的に送達する任意の投与様式により対象に投与することができ、投与様式としては、これらに限定されないが、注射、注入、点滴注入、および吸入投与を挙げることができる。腸における不活化から種々の作用剤を保護することができる限り、経口投与形態も企図される。「注射」としては、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
作用剤（例えば、抗体、抗体試薬、およびそれらのＷＩＳＰ１結合性断片）は、良質な医学のための原則（good medical practice）に準拠するように製剤化、用量化、および投与される。この状況で考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の対象、個々の対象の臨床状態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に知られている他の要因が挙げられる。投与しようとする作用剤の「治療有効量」は、そのような考慮事項により束縛され、がんを改善、治療、もしくは安定化するために；無増悪期間（無増悪生存期間）を延長するために；または肝疾患の発症もしくは再発を治療もしくは予防するために必要とされる最小量を指す。例えば、作用剤は、一部の実施形態では、任意選択で、感染症を予防または治療するために現在使用されている１つまたは複数の追加の治療剤と共に製剤化される。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中に存在する作用剤（例えば、抗体およびそのＷＩＳＰ１結合性断片）の量、障害または治療のタイプ、および上記で考察されている他の要因に依存する。これらは、概して、本明細書の上記で使用されたものと同じ投薬量および投与経路で、または従前に使用されている投薬量の約１～９９％で使用される。
投薬量
本明細書に記載のように、肝疾患を治療する場合、作用剤（例えば、抗体、抗体試薬、またはそれらのＷＩＳＰ１結合性断片）の適切な投薬量は、上記で規定されているような治療しようとする肝疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、作用剤が予防目的または治療目的のいずれで投与されるのか、以前の治療適応症、対象の臨床歴および作用剤に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存することになる。作用剤は、一度にまたは一連の治療にわたって対象に好適に投与される。併用療法レジメンでは、本明細書に記載の作用剤および１つまたは複数の追加の治療剤は、治療上有効なまたは相乗的な量で投与される。
本明細書で使用される場合、「単位剤形」は、好適な投与１回の投薬量を指す。例として、単位剤形は、送達デバイス、例えば、注射器または静脈内点滴バッグに配置される治療薬の量であってもよい。一実施形態では、単位剤形は、単回投与で投与される。別の実施形態では、１つよりも多くの単位剤形を同時に投与してもよい。
本明細書に記載の作用剤の投薬量は、医師が決定してもよく、必要に応じて、観察された治療効果に合わせて調整してもよい。治療の期間および頻度に関して、熟練の臨床医であれば、治療がいつ治療利益をもたらすのかを決定するために、およびさらなる細胞を投与するか否か、治療を中断するか否か、治療を再開するか否か、または治療レジメンに他の変更をなすか否かを決定するために、対象をモニターするのが典型的である。投薬量は、サイトカイン放出症候群などの有害副作用を引き起こすほど大きな量であってはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、および性別により異なることになり、当業者であれば決定することができる。投薬量は、任意の合併症が起こった場合、個々の医師が調整することもできる。
治療剤の投薬量範囲は、効力に依存し、所望の効果を生み出すのに十分な程度に大きな量を包含する。投薬量は、許容できない有害副作用を引き起こすほど大きな量であってはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、および性別により異なることになり、当業者であれば決定することができる。投薬量は、任意の合併症が起こった場合、個々の医師が調整することもできる。一部の実施形態では、投薬量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、用量範囲は、５μｇ／ｋｇ体重～１００μｇ／ｋｇ体重である。あるいは、用量範囲を滴定して、血清レベルを１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬに維持してもよい。全身投与の場合、対象には、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれよりも多くの量などの治療量で投与することができる。こうした用量は、1つまたは複数の別々の投与により、または持続注入により投与することができる。数日間またはそれよりも長期間にわたる反復投与の場合、治療は、状態に応じて、例えば、上記に記載の方法または当技術分野で公知の方法により測定して肝疾患が治療されるまで持続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。
組合せ療法
一実施形態では、本明細書に記載の作用剤または組成物は、単独療法として使用される。一実施形態では、本明細書に記載の作用剤は、肝疾患の他の公知の作用剤および療法と組み合わせて使用することができる。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象の障害罹患の経過中に、２つの（またはそれよりも多くの）異なる治療が対象に送達されていることを意味し、例えば、対象が障害（肝疾患）を有すると診断された後で、障害が治癒もしくは解消されたかまたは治療が他の理由で中止される前に、２つまたはそれよりも多くの治療が送達される。一部の実施形態では、１つの治療の送達は、第２の治療の送達が開始される時点で依然として生じているため、投与期間の点で重複が存在する。これは、本明細書では、「同時」または「並行送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が開始される前に終了する。いずれの場合の一部の実施形態では、併用投与のため、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、第２の治療がより少ない場合でも等価な効果が見られるか、または第２の治療は、第２の治療が第１の治療の非存在下で投与された場合よりも大きな程度に症状を低減するか、または類似の状況が第１の治療で見られる。一部の実施形態では、送達の結果は、症状の低減、または障害に関連する他のパラメーターが、他方の非存在下で送達された一方の治療で観察されるものよりも大きいことである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であってもよく、完全に相加的であってもよく、または相加的よりも大きくてもよい。送達の結果は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達された時点で依然として検出可能であることであってもよい。本明細書に記載の作用剤および少なくとも１つの追加の療法は、同時に、同じもしくは別々の組成物で、または連続して投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載の作用剤を最初に投与し、次に追加の作用剤を投与してもよく、または投与の順序を逆にしてもよい。作用剤および／もしくは他の治療剤、手順、またはモダリティは、活動性障害の期間中に、または寛解もしくはより低い活動性疾患の期間中に投与してもよい。作用剤は、別の治療の前に、治療と並行して、治療後に、または障害の寛解中に投与してもよい。
肝疾患を治療するために現在使用されている治療薬としては、これらに限定されないが、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ、ウルソジオール、ＩＮＮ、ＮＡＮ、ＡＡＮ、またはＵＳＡＮとしても知られている）、コレスチラミン、スタノゾロール、ナルトレキソン、リファンピシン、ピオグリタゾン、メトホルミン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、レチノールエステル、ビタミンＡ、肝臓透析、または肝臓移植、または当技術分野で公知である肝疾患の任意の他の治療が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載の作用剤または組成物は、別の療法と一緒には投与されない。具体的には、本明細書に記載の作用剤または組成物は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ、ウルソジオール、ＩＮＮ、ＮＡＮ、ＡＡＮ、またはＵＳＡＮとしても知られている）、コレスチラミン、スタノゾロール、ナルトレキソン、リファンピシン、ピオグリタゾン、メトホルミン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、レチノールエステル、ビタミンＡ、肝臓透析、または肝臓移植、または当技術分野で公知である肝疾患の任意の他の治療とは一緒に投与されない。
組み合わせて投与される場合、作用剤もしくは組成物および追加の作用剤（例えば、第２もしくは第３の作用剤）またはすべては、個々に使用される各作用剤の量または投薬量よりも、例えば単独療法の場合よりも高いか、低いか、または同じである量または用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、作用剤、追加の作用剤（例えば、第２もしくは第３の作用剤）、またはすべての投与量または投薬量は、個々に使用される各作用剤の量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）。他の実施形態では、所望の効果（例えば、肝疾患の治療）をもたらす、作用剤、追加の作用剤（例えば、第２もしくは第３の作用剤）、またはすべての量または投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々に必要とされる各作用剤の量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）。
非経口剤形
本明細書に記載の作用剤の非経口剤形は、これらに限定されないが、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋肉内、および動脈内を含む、種々の経路により対象に投与することができる。非経口剤形の投与は、典型的には、夾雑物に対する患者の自然防御を迂回するため、非経口剤形は、好ましくは、無菌性であるか、または患者に投与する前に滅菌することが可能である。非経口剤形の例としては、これらに限定されないが、注射可能な溶液、薬学的に許容される注射用のビヒクルに溶解または懸濁可能な乾燥製品、注射可能な懸濁物、制御放出性非経口剤形、およびエマルジョンが挙げられる。
「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を指す。「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、本明細書で使用される場合、腫瘍部位などの標的部位、組織、または臓器に対して直接的に投与すること以外の治療剤の投与を指し、そのため治療剤は対象の循環系に進入し、したがって代謝および他の類似プロセスに供される。他の実施形態では、作用剤は、障害が許容する場合、例えば直接注射により局所的に投与され、注射は定期的に繰り返すことができる。
本開示の非経口剤形を提供するために使用することができる好適なビヒクルは、当業者に周知である。例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：無菌水；ＵＳＰ注射用水；生理食塩溶液；グルコース溶液；これらに限定されないが、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、ならびに乳酸リンゲル注射などの水性ビヒクル；これらに限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの水混和性ビヒクル；ならびにトウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクル。
本明細書に記載の方法を使用した療法の継続期間は、医学的に指示される限り、または所望の治療効果（例えば、本明細書に記載のもの）が達成されるまで継続されることになる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片の投与は、１か月間、２か月間、４か月間、６か月間、８か月間、１０か月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、１０年間、２０年間、または最長で対象の生涯年数の期間にわたって継続される。
制御放出剤形および遅延放出剤形
本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、作用剤または組成物は、制御放出手段または遅延放出手段により対象に投与される。理想的には、医学的治療における、最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小量の薬物物質を使用して最小限の時間で状態を治癒または制御することにより特徴付けられる。制御放出製剤の利点としては以下のものが挙げられる：１）薬物の活性が延長されること；２）投与頻度が低減されること；３）患者コンプライアンスが増加すること；４）薬物の総使用量が少なくなること；５）局所性または全身性副作用が低減されること；６）薬物蓄積が最小化されること；７）血中濃度の変動が低減されること；８）治療効力が向上すること；９）薬物活性の増強または喪失が低減されること；および１０）疾患または状態を制御する速度が向上すること。（Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)）。制御放出製剤は、式（Ｉ）の化合物の作用開始、作用持続期間、治療窓内の血漿レベル、およびピーク血中濃度を制御するために使用することができる。特に、制御放出または長期放出剤形または製剤を使用すると、薬物の過少投与（つまり、最小治療レベルを下回る）ならびに薬物の毒性レベルを超える投与の両方から生じ得る有害効果および安全性懸念の可能性を最小限に抑えつつ、作用剤の最大有効性が達成されることを保証することができる。
様々な公知の制御放出または長期放出剤形、製剤、およびデバイスを、本明細書に記載の任意の作用剤と共に使用するために適合させることができる。例としては、これらに限定されないが、米国特許第３，８４５，７７０号明細書；第３，９１６，８９９号明細書；第３，５３６，８０９号明細書；第３，５９８，１２３号明細書；第４，００８，７１９号明細書；第５６７４，５３３号明細書；第５，０５９，５９５号明細書；第５，５９１，７６７号明細書；第５，１２０，５４８号明細書；第５，０７３，５４３号明細書；第５，６３９，４７６号明細書；第５，３５４，５５６号明細書；第５，７３３，５６６号明細書；および第６，３６５，１８５号明細書に記載のものが挙げられる。こうした文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。こうした剤形は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（ＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム、またはマイクロスフェア、またはそれらの組合せを使用して、１つまたは複数の活性成分の徐放または制御放出を提供し、所望の放出プロファイルを種々の割合で提供することができる。加えて、イオン交換材料を使用して、本開示の化合物の固定化吸着塩形態を調製することができ、したがって薬物の制御送達をもたらすことができる。具体的な陰イオン交換体の例としては、これらに限定されないが、ＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）Ａ５６８およびＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）ＡＰ１４３（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ、スプリングハウス、ペンシルベニア州、米国）が挙げられる。
効力
例えば、肝疾患を治療するための、本明細書に記載の作用剤の効力は、当業者により決定することができる。しかしながら、治療は、この用語が本明細書で使用されるように、肝疾患の徴候または症状の1つもしくは複数が有益な様式で変更された場合、他の臨床的に認められる症状がよくなったかもしくはさらに改善された場合、または所望の応答が、例えば本明細書に記載の方法による治療後に少なくとも１０％誘導された場合、「有効な治療」とみなされる。効力は、例えば、本明細書に記載の方法に従って治療される状態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率、または任意の他の適切な他の測定可能なパラメーター、例えば、倦怠感、痛み、体重喪失、もしくは暗色尿を測定することにより評価することができる。効力は、入院、または医学的介入の必要性（つまり、症状の進行）により評価されるような個体の悪化に至らないことによっても測定することができる。こうした指標を測定するための方法は、当業者に公知であり、および／または本明細書に記載されている。
効力は、本明細書に記載の状態の動物モデル、例えばマウスモデルにおいて、または場合によっては、肝疾患の適切な動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、治療の効力は、黄疸、倦怠感、悪心、嘔吐、尿色、腹痛などのマーカーに統計的に有意な変化が観察された場合、明白である。
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、肝疾患を有するまたは有すると診断された対象に投与することができる、疾患の少なくとも１つまたは複数の症状を緩和するために必要な、本明細書に記載の作用剤または組成物の量を指す。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与した際に特定の抗肝疾患効果を提供するのに十分な、作用剤または組成物の量を指す。また、有効量は、本明細書で使用される場合、種々の状況において、疾患の症状の発症を遅延させるか、疾患の症状の経過を変更するか（例えば、肝疾患の進行を緩徐するか）、または疾患の症状を逆行させる（例えば、肝疾患の症状を直すかまたは停止させる）のに十分な、作用剤の量を含むことになる。したがって、正確な「有効量」の指定は、一般に実用的ではない。しかしながら、いかなる所与の場合でも、適切な「有効量」は、当業者であれば日常的な実験作業を使用しただけで決定することができる。
一実施形態では、作用剤または組成物は、連続的に（例えば、ある期間にわたって一定のレベルで）投与される。作用剤の連続投与は、例えば、表皮パッチ、連続放出製剤、または装着型注射器（on-body injector）により達成することができる。
一実施形態では、作用剤または組成物は、間隔をおいて（例えば、所与の期間にわたって種々のレベルで）投与される。
有効量、毒性、および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な医薬手順により評価することができる。投薬量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて様々であってもよい。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、初期には細胞培養アッセイで推定することができる。また、動物モデルにおいて用量を製剤化して、細胞培養においてまたは適切な動物モデルにおいて決定されたＩＣ５０（つまり、症状の半最大阻害が達成される作用剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、中でも肝機能の測定または血液検査によりモニターすることができる。医師であれば、投薬量を決定し、必要に応じて、観察された治療効果に合わせて調整することができる。
本明細書で提供される本発明は、以下の番号付段落においてさらに説明することができる。
１．肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法。
２．肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、および強皮症からなる群から選択される、段落１に記載の方法。
３．ＷＩＳＰ１は、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４からなる群から選択されるスプライスバリアントである、段落１または２に記載の方法。
４．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．標的細胞は、哺乳動物細胞である、段落１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．標的細胞は、肝星細胞、線維芽細胞、または筋線維芽細胞である、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．肝星細胞は、静止状態にある、段落１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．抗体または抗体試薬は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、または経鼻投与により投与される、段落１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することであるか、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減させることである、段落１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ＷＩＳＰ１の活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく阻害される、段落１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＷＩＳＰ１のレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく低減される、段落１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬および薬学的に許容される担体を含む組成物。
１５．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～１４のいずれか１つに記載の組成物。
１６．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１～１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．肝疾患を治療または予防するために製剤化されている、段落１～１６のいずれか１つに記載の組成物。
１８．対象の肝疾患を治療するための方法であって、
ａ．対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを検出すること、
ｂ．（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること、
ｃ．参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること、ならびに
ｄ．肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること
を含む方法。
１９．（ａ）の前に、対象から生物学的試料を得ることをさらに含む、段落１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、または強皮症である、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．生物学的試料は、血液試料、組織、バフィーコート、血清、または組織である、段落１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することを含む方法。
２５．肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、および強皮症からなる群から選択される、段落１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．ＷＩＳＰ１は、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４からなる群から選択されるスプライスバリアントである、段落１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される、段落１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、段落１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、段落１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．作用剤は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、または経鼻投与により投与される、段落１～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することであるか、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減させることである、段落１～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．ＷＩＳＰ１の活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく阻害される、段落１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．ＷＩＳＰ１のレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく低減される、段落１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤および薬学的に許容される担体を含む組成物。
３７．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、段落１～３６のいずれか１つに記載の組成物。
３８．マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、段落１～３７のいずれか１つに記載の組成物。
３９．対象の肝疾患を治療するための方法であって、
ａ．対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを検出すること、
ｂ．（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること、
ｃ．参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること、ならびに
ｄ．肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与すること
を含む方法。
４０．（ａ）の前に、対象から生物学的試料を得ることをさらに含む、段落１～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、または強皮症である、段落１～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．生物学的試料は、血液試料、組織、バフィーコート、血清、または組織である、段落１～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、段落１～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、段落１～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１から４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現する遺伝子操作された肝星細胞またはその集団を生成するための方法であって、細胞を、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤と接触させること、および作用剤の発現を可能にするのに十分な時間にわたって細胞を培養することを含む方法。
４８．細胞は、静止状態にある、段落１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．接触は、細胞を、作用剤または作用剤をコードするベクターと接触させることを含む、段落１～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．接触は、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注射、および／またはトランスフェクションを含む、段落１～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、段落１～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、段落１～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、段落１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、段落１から５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．段落４６～５３のいずれか１つに記載の方法により生成される肝星細胞を含む細胞株。
５６．段落１～５５のいずれか１つに記載の方法により生成される肝星細胞またはその集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
５７．肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、段落１～５６のいずれか１つに記載の方法により生成される細胞、段落１～５６のいずれか１つに記載の細胞、または段落１～５６のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
５８．対象の線維症を低減するための方法であって、それを必要とする対象に、段落１～５７のいずれか１つに記載の方法により生成される細胞、段落１～５７のいずれか１つに記載の細胞、または段落１～５７のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
５９．対象の肝疾患を治療するための方法であって、
ａ．参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること、ならびに
ｂ．肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること
を含む方法。
６０．対象の肝疾患を治療するための方法であって、
ａ．参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること、ならびに
ｂ．肝疾患を有する対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤試薬を投与すること
を含む方法。
[実施例１]
進行性肝疾患に対する処置
肝疾患治療についてのまだ満たされていないニーズに応えて、本明細書において、肝臓の線維化の進行において中心的役割を演じる細胞型、活性化肝星細胞（ＨＳＣ）において静止状態を独立に誘導するマイクロＲＮＡ ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２が記載される。さらに、ｍｉＲ－１５ａは、活性化ＨＳＣにおいてその線維形成促進機能を阻止するようにＷＩＳＰ１を直接標的化する。マイクロＲＮＡおよびそれらの標的を使用してＨＳＣ静止状態を促進することによって、マイクロＲＮＡは、ＰＢＣにおける進行性肝線維症を管理するための有用な治療であり得る（図１）。特定の理論に束縛されることなく、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２がＨＳＣにおいて静止状態を誘導し、次にｍｉＲ－１５ａの周知の標的ＷＩＳＰ１の機能を解明できることが予測される。
本明細書に記載される研究は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２によって誘導された静止様ＨＳＣが、ＣＣｌ４チャレンジマウスにおいて肝損傷および線維症の改善をもたらしたことを示している。ＣＣｌ４モデルにおけるｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の有益な効果を考慮して、マウス処置研究は、胆汁うっ滞性線維症モデル、胆管結紮（ＢＤＬ）および３，５－ジエトキシカルボニル－１，４－ジヒドロコリジン（dihydrochollidine）（ＤＤＣ）を使用して拡張され得る。３つの異なるｍｉＲＮＡ送達系が検査され得る：１）ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を構成的に発現する静止様ＨＳＣを使用する細胞治療、２）尾静脈にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を発現するレンチウイルスを注射すること、および３）脂質ベースの担体にパッケージされたｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の化学的に修飾した模倣物を尾静脈に注射すること。対照および処置マウスは、結果を分析するために使用され得る。
本明細書に記載される研究は、ＭｉＲ－１５ａがＨＳＣにおいてその線維形成促進機能を阻止するようにＷＩＳＰ１を直接標的化できることを示している。ＢＤＬおよびＤＤＣチャレンジの設定でＷＩＳＰ１ヌルマウスの肝臓表現型は、規定され得る。チャレンジ後の肝損傷およびＨＳＣ機能障害の重症度は評価され、野生型マウスのものと比較される。胆汁うっ滞性線維症のマウスモデルは、ＷＩＳＰ１遮断抗体を用いて処置されてよく、次いで結果を分析するために使用され得る。
原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、以前は原発性胆汁性肝硬変と称された、は、肝臓内の胆管の進行性の破壊、胆汁うっ滞、門脈周囲の炎症および最終的に胆管線維症をもたらし、硬化性の末期肝疾患に至る潜行性の肝疾患である。遺伝的および環境的因子の両方が、疾患が顕在化するように相互作用すると考えられるが、不明確な病態形成を伴う自己免疫性障害である。興味深いことに、ＰＢＣは、女性に対する男性の疾患比９：１で男性よりはるかに女性を冒す。合衆国における年間１００万人当たりのＰＢＣの年齢調整された発生頻度は、女性４５名、男性７名であり、１００万人あたりの有病率は、女性６５４名、男性１２１名である［１］。
親水性胆汁塩ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、いまだにＰＢＣに対する延命効果が実証された唯一の薬物である。組織学的検査および生化学パラメーターの改善によって証明されて疾患進行を遅延させることが示されている。その作用の正確な機序は不明であるが、毒性の胆汁塩に対して胆管細胞を保護すると考えられている。残念ながら、ＵＤＣＡ処置個体の３０％～４０％は、最適以下応答の設定で疾患進行をまだ経験する［２］。この処置のギャップを埋めるために、多数のさまざまな作用剤が臨床試験下にあるが、オベチコール酸などの有名な被験薬の一部は、顕著な副作用を有し、延命効果についての証拠を欠いている［３］。
大部分の慢性肝疾患と同様に、ＰＢＣは炎症から線維症に進行する。この病理学的カスケードの際に、肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝線維化における中心的役割を演じていると考えられている［４～６］。ＨＳＣは、２つの形態で存在する。健常個体では、それらは静止状態にあり、複数のレチノイドリッチな脂肪滴によって特徴付けられる。しかし活性化されると、それらは、その脂肪滴を失い、線維形成促進筋線維芽細胞になり、コラーゲンおよび瘢痕形成を促進するメディエーターを分泌する［７、８］。肝線維症におけるＨＳＣの重要性は十分に確立されているが、この細胞型について未知であることはまだ多く残っている。
ＨＳＣに関する知識における複数のギャップの１つは、ＨＳＣ活性化状態を決定することにおけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割の現在の理解である。ＭｉＲＮＡは、短い、通常長さ２２ヌクレオチドである非コード遺伝子であり、すべての生物学的および病理学的プロセスに関与している。それらは、分解または翻訳阻害を誘導するそれらのｍＲＮＡ標内の相補性配列との不完全な塩基対合によって特定のコード遺伝子を下方制御する。各ｍｉＲＮＡは、多数の異なるコード遺伝子を制御できる一方で、各標的遺伝子は、遺伝子制御ネットワークの複雑な層を構成する多数の異なるｍｉＲＮＡによって制御され得る［９］。本明細書に記載される実験は、ｍｉＲＮＡが細胞増殖および再プログラム化に不可欠であることを示した［１０～１２］。それにも関わらず、ＨＳＣ活性化または静止状態への復帰におけるｍｉＲＮＡの役割は、完全には調査されていない。
グループは、ＨＳＣにおける全体的なｍｉＲＮＡ発現パターンの特性を明らかにしたが、それらの発現状況の機能的重要性は、大部分が不明である［１３～１５］。それに応じて、大規模発現プロファイリングに依存する代わりに、機能性スクリーニングが活性化ＨＳＣを静止状態に戻すようにするｍｉＲＮＡを体系的に同定するために開発され、この努力を通じてｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２を同定した。ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、これまで肝星細胞の文脈では研究されていなかった。しかし、ｍｉＲ－１５ファミリーは、線維症を潜在的に減弱するように心臓においてＴｇｆベータ経路を阻害することが見出された［１６］。これらのｍｉＲＮＡまたはそれらの下流の標的を通じてＨＳＣ静止状態を促進することは、ＰＢＣにおける線維化の進行を予防できる。この研究の目的は、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－４１２およびそれらの直接標的のＰＢＣの処置における治療効果を評価することである。
結果
本明細書に記載される不偏機能性スクリーニングは、プラスチック表面でそれらが増殖する場合に活性化されるＨＳＣの生来の傾向を利用する。ＨＳＣが活性化されると、それらは静止ＨＳＣでは豊富に存在する脂肪滴を失う。この有用な表現型二分法を利用して、活性化ＨＳＣをさらに静止様にするｍｉＲＮＡは、細胞質中において再形成される脂肪滴のレベルを追跡することによって探索された。ｍｉＲＮＡが、器官の発達、発癌または細胞の再プログラム化などの細胞プログラム全体に影響を与える、複数のコード遺伝子を同時に標的化することが周知であることから［１７］、単一のｍｉＲＮＡでさえ分化転換を誘導できると期待された。
活性化ＨＳＣの静止状態への復帰を促進するこれらのｍｉＲＮＡを同定するために、活性化ＨＳＣが全ゲノムｍｉＲＮＡライブラリー由来の個々のｍｉＲＮＡ模倣物を受けた後に、レチノイドを含む細胞内脂肪滴の再出現を静止状態のマーカーとしてスキャンした（図２）。実際に、一部のウエルのＨＳＣは、３日以内に再形成されたＢＯＤＩＰＹ染色陽性脂肪滴を示した。この初期スクリーニングは、１５個の主なヒットを示した。さらなる調査のためにＭｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２を、ヒトオルソログの存在ならびにマウスおよびヒトＨＳＣの両方において脂肪滴を再形成する能力に基づいて選択した（図３）。新たに形成された脂肪滴は、静止ＨＳＣにおけるものと一致して紫外線下での蛍光によって証明されるとおり、レチノイド陽性であった（データ未記載）。トランスフェクトされたＨＳＣの全体のサイズは、１０～１００分の１に減少し、さらに静止様になった（図４）。さらに、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の強制発現は、活性化、アルファ平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）およびアルファ１ Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ ａ１）の２つの最も重要な遺伝子マーカーを下方制御した（図４）。
さらに包括的な発現分析のために、ディープＲＮＡ配列決定は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を受けた静止様ＨＳＣが、活性化細胞よりも静止ＨＳＣに４０～５０％近い全体的転写プロファイルを有することを実証した（データ未記載）。さらに重要なことにｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２によって静止様になったＨＳＣは、真の静止ＨＳＣに類似する機能的表現型を有した。Ｅｘ ｖｉｖｏでの実験は、静止様ＨＳＣが健常な肝細胞において、２つの細胞型が共培養された場合に脂肪症を誘導しなかったことを実証した。対照的に、候補ｍｉＲＮＡを用いて処置されなかった活性化ＨＳＣは、それらが共培養された場合に肝細胞脂肪過多（hepatocyte steatosis）を誘導した（図５）。さらに、これらの復帰ＨＳＣは、共培養されたヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７からの炎症性サイトカイン発現を減少させることができた（図６）。最終的に、ｍｉＲ－１５ａについては有意ではなかったが（図７）、予測されたとおり、内在性ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、静止ＨＳＣと比較して活性化ＨＳＣにおいて発現レベルが減少しており、ｍｉＲ－４１２は、活性化を促進する培養条件において活性化ＨＳＣを静止状態に向けて復帰させると考えられる。このおよび他の重要なｅｘ ｖｉｖｏでの観察は、伝統的ＣＣｌ４マウスモデル（経口経管栄養１００ｕｌ、４０％ＣＣｌ４ １週間に２回）において肝臓の病態のレベルを減弱するためにこれらのｍｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで送達され得るかどうか、特にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを発現するＨＳＣが、活性化促進シグナルを有する疾患肝臓においてさえ静止様状態を維持できるかどうかを検査することを可能にした。細胞接触および可溶性メディエーターを通じて、静止様ＨＳＣは、炎症または線維症を促進するそれらのシグナルを弱めるように肝臓内で他の細胞型を誘導できる。
ｍｉＲＮＡを生存しているマウスに送達するためにさまざまな方法があるが、注射するために選択したＨＳＣは ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を構成的に発現することによってｅｘ ｖｉｖｏで静止様状態になった。再プログラム化されたＨＳＣを４週間のＣＣｌ４チャレンジの３週目に１回に注射した。肝臓に移植するように注射したＨＳＣは、ＧＦＰシグナルを発する肝細胞内で可視化により確認し、ｍｉＲＮＡを発現するｐｉｇｇｙＢａｃベクターを挿入した［１８］（図８）。さらに重要なことに、静止様ＨＳＣを用いて処置したマウスは、肝臓におけるバルーニング、アポトーシス、炎症および線維症の減少（図８）ならびに肝臓コラーゲン発現の低下を示す組織学を有した（図９）。
これら２つのｍｉＲＮＡ候補は、肝臓の炎症および線維症を促進するＨＳＣ遺伝子を下方制御すると考えられる。ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２によって阻止される多数の遺伝子がおそらくあるが、ＷＩＳＰ１は、ｍｉＲ－１５ａの実験的に検証された直接標的である。活性化ＨＳＣは、静止ＨＳＣのレベルの約３０倍のＷＩＳＰ１を発現し（データ未記載）、ヒトＰＢＣ中のＨＳＣは、正常な肝臓においてよりさらに多くＷＩＳＰ１を発現した（図１０）。最終的にｍｉＲ－１５ａは、その３’－ＵＴＲ内に２つの潜在的なｍｉＲ－１５ａ結合配列を含有するＷＩＳＰ１を標的化すると予測される。したがって、推定標的配列またはそれらの変異バリアントを構成的に活性なルシフェラーゼレポーター遺伝子の後にクローニングした。これらのレポーターの内の１つをｍｉＲ－１５ａ模倣物を用いて同時トランスフェクトした場合、野生型配列を含むレポーターは、ルシフェラーゼ発現を減少させた一方で、変異配列を含むレポーターはせず、ｍｉＲ－１５ａが両方のＷＩＳＰ１標的配列に結合することを示している（図１１）。ＷＩＳＰ１は、ＨＳＣにおいてｍｉＲ－１５ａ作用の一部を達成するための重要な標的遺伝子である。
胆管炎のマウスモデルにおけるｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の検査
ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を送達することは、ＰＢＣのための治療である：本明細書に記載される驚くべき結果を考慮して、ＰＢＣの処置におけるｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の可能性をさらに評価するためにｉｎ ｖｉｖｏでの実験を拡張した。これらのｍｉＲＮＡが、ＨＳＣを通じて単独で、または他の細胞型を通じてより広範にそれらの機能を発揮するのかを評価するために、ｍｉＲＮＡは、細胞治療の代わりにウイルスベクターまたは模倣物を使用して全身に送達され得る。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ処置実験について、有効性は、肝臓における線維形成促進遺伝子のＰＣＲを実施すること、Ｈ＆Ｅおよびシリウスレッド染色を含む組織学的検査、肝臓ヒドロキシプロリンアッセイならびに血漿ＡＬＴおよびアルカリホスファターゼの測定を実施することによって評価され得る。
ＰＢＣの各モデルは、ヒトＰＢＣを示すことに強弱を有する。この研究の目的のために、ｍｉＲＮＡ候補ならびに線維症および炎症の減少をもたらし得るＷＩＳＰ１の阻害を検査するためには、比較的早期に胆管線維症に着実に進行するモデルが必要である。ＰＢＣの遺伝的モデルの大部分は、肝線維症を生じないまたは非常にゆっくりと生じる［１９］。このため、胆管結紮（ＢＤＬ）によって外科的に誘発された、および３，５－ジエトキシカルボニ－１，４－ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）によって化学的に誘発された確実に線維症に達する２つの胆管炎モデルが利用され得る。顕著なレベルの胆汁うっ滞性線維症を発症するための所要時間があることから、すべての実験はＢＤＬモデルについては３週間後、ＤＤＣモデルについては４週間後に終了され得る［２０～２２］。
間葉系幹細胞およびマクロファージを使用して、複数のグループは、肝線維症のための細胞療法を既に試み、一定の成果をあげた［２３］。しかし、本明細書に記載される実験は、肝線維症を予防するために意図的に遺伝子操作されたＨＳＣを初めて利用する。初期のｉｎ ｖｉｖｏ処置結果は説得力があるが、胆管炎のマウスモデルにおいてこの細胞療法の効果を検査することは、これまでＣＣｌ４モデルだけが検査されてきたことを考慮すると、有用である。すべての細胞療法実験のために、注射は脾臓に行われ、静止様ＨＳＣ５００，０００個はｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて再プログラム化された。すべての適切な対照、例えば、処置を受けていない、および再プログラム化されていないＨＳＣを用いた処置を受けた対照群も含まれ得る。
２１日間ＢＤＬを用いてチャレンジされたマウスは、顕著な線維症を通常は発症する。再プログラム化されたＨＳＣは、ＢＤＬチャレンジの２１日間の過程の際の７および１４日目に注射され得る。すべてのマウスは、２１日目に屠殺される。２８日間ＤＤＣを用いてチャレンジされたマウスは、顕著な線維症を通常は発症する。再プログラム化されたＨＳＣは、ＤＤＣチャレンジの２８日間の過程の際の１４および２１日目に注射され得る。すべてのマウスは、２８日目に屠殺される。
最初の実験は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて再プログラム化されたＨＳＣを注射することが、ＣＣ１４誘発肝線維症においてコラーゲン発現および肝損傷の全体的なレベルを減少できることを実証した。細胞治療を通じてｍｉＲＮＡを送達することは、見込みがあると示されたが、他の送達方法は、調査されるべきである。１つの方法は、ｍｉＲＮＡを発現するレンチウイルスを注射することである。レンチウイルスは、ＢＤＬチャレンジの２１日間の過程の際の７および１４日目にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを尾静脈に発現できる。すべてのマウスは２１日目に屠殺される。レンチウイルスは、ＤＤＣチャレンジの２８日間の過程の際の１４および２１日目にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを発現できる。すべてのマウスは２８日目に屠殺される。
別の送達方法として、脂質ベースの担体（ＭａｘＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭ ｂｙ Ｂ１００ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にパッケージされたさらに安定な、化学的に修飾されたｍｉＲＮＡ模倣物（Ｅｘｉｑｏｎ ａｎｄ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を注射することの実行可能性は検査され得る［２４、２５］。レンチウイルスを避けることによって、この方法またはその変法は、ヒトにおいて使用される可能性を有する。担体は、ＢＤＬチャレンジの２１日間の過程の際の７および１４日目にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを含有して尾静脈に注射され得る。すべてのマウスは２１日目に屠殺される。担体は、ＤＤＣチャレンジの２８日間の過程の際の１４および２１日目にｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを含有して注射され得る。すべてのマウスは２８日目に屠殺される。
メスマウスにおいて肝線維症を誘導することが困難であることから、オスマウスは、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｖｏ処置研究のためにさらに有用である。検出力計算（power calculation）は、各群についてマウス８匹が、アルファ１ Ｉ型コラーゲンレベルにおける５０％減少を、ｐ値０．０１および９０％検出力（power）での測定において２０％標準偏差を有して検出するために使用され得ることを示している。ｍｉＲＮＡを用いたＨＳＣ処置の最も大きなチャレンジの１つは、オフターゲット効果を最小化するためにこの細胞型を特異的に標的化する送達系を開発することである。送達系は、特異性を改善するために最適化され得る。例えば、近年開発された２つの有望なＨＳＣ送達系は、ｐ７５ニューロトロフィン受容体ペプチド（ｐ７５ＮＴＲｐ）タグ化アデノウイルスおよびＡＡＶ６ベクターである［２６、２７］。
胆管炎のマウスモデルにおけるＷＩＳＰ１の機能の評価
ＭｉＲ－１５ａ標的Ｗｉｓｐｌは、ＰＢＣにおいて炎症および線維症を促進する：ＷＩＳＰ１は、Ｃｙｒ６１（Ｃｃｎ１）、Ｃｔｇｆ（Ｃｃｎ２）、Ｎｏｖ（Ｃｃｎ３）、ＷＩＳＰ１（Ｃｃｎ４）、Ｗｉｓｐ２（Ｃｃｎ５）およびＷｉｓｐ３（Ｃｃｎ６）を含むマトリクス細胞タンパク質のＣｃｎファミリーのメンバーである。Ｃｔｇｆは、肝臓における重要な線維形成促進因子として既に確立されている［２８］。
興味深いことに、ＷＩＳＰ１は、ヒト特発性肺線維症において上方制御されていることが見出されており、ブレオマイシンチャレンジマウスを中和ＷＩＳＰ１抗体を用いて処置することは、肺線維症の減弱を生じた［２９］。さらに、小動物研究は、ＷＩＳＰ１を遮断することがＣＣｌ４誘発肝線維症を回復させることを示した［３０］。しかし、肝臓におけるＷＩＳＰ１の役割は、特にＰＢＣの文脈では、詳細には研究されていない。
ＷＩＳＰ１は、ｍｉＲ－１５ａの直接標的であるが、ＨＳＣ活性化状態へのその影響およびＰＢＣ病態形成におけるその役割は、不明である。ＷＩＳＰ１ヌルマウス株は骨形成におけるＷＩＳＰ１の役割を実証するために作製されたが、肝臓におけるその機能は研究されなかった［３１］。これらのマウスは、繁殖力があり、顕性の肝臓の表現型を有さない。それらの変異対立遺伝子は、良好な変異マウス誘導を保証するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ ＤａｖｉｓのＭＭＲＲＣ施設で凍結精子および胚中に保存されている。
表現型は、肝臓の病態の全体の重症度によって評価され得る。ＷＩＳＰ１ヌルマウスは、ＢＤＬおよびＤＤＣを用いてチャレンジされ得る。ＷＩＳＰ１ヌルマウスによって維持される生じた肝損傷は、野生型マウスのものと比較され得る。肺を含む他の器官におけるＷｉｓｐｌの周知の線維形成促進の役割を考慮して、ＷＩＳＰ１ヌルマウスは、肝線維症の減少およびおそらく炎症の減少を有すると予測される。すべてのｉｎ ｖｉｖｏでの実験について、肝臓表現型は、肝臓における線維形成促進遺伝子のＰＣＲ、Ｈ＆Ｅおよびシリウスレッド染色を含む組織学的検査、肝臓ヒドロキシプロリンアッセイならびに血漿ＡＬＴおよびアルカリホスファターゼの測定を実施することによって評価され得る。最後に、胆管線維症のこれらのマウスモデルから採取されたＨＳＣの機能的表現型は、評価され得る。オス野生型およびＷＩＳＰ１ヌルマウスは、ＢＤＬを用いてチャレンジされ得る。それらは、２１日目に屠殺され得る。オス野生型およびＷＩＳＰ１ヌルマウスは、ＤＤＣを用いてチャレンジされ得る。それらは、２８日目に屠殺され得る。
次に、ＨＳＣは、２１日間のＢＤＬおよび２８日間のＤＤＣを用いてチャレンジされたマウスから単離され得る。これらのＨＳＣは、炎症性メディエーターが誘導されるかどうかを決定するために、健常な肝細胞と共に共培養され得る。結果は、同じチャレンジを受けた野生型ＨＳＣのものと比較され得る。
中和抗体を用いてＷＩＳＰ１を遮断することは、マウス肺においてブレオマイシン誘発線維症を減弱させた［２９］。同様に、Ｗｉｓｐｌを遮断することは、ＰＢＣにおいて生じる炎症および線維症のレベルを減少させることができる。胆管炎のマウスモデルは、ＷＩＳＰ１抗体を用いて処置され、肝臓表現型を評価され得る。
２１日間ＢＤＬを用いてチャレンジされたマウスは、顕著な線維症を通常は発症する。処置群は、ブレオマイシン誘発肺線維症を処置するために以前使用された市販のＷＩＳＰ１抗体を７および１４日目に受けることができる（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）［２９］。対照群は、ＩｇＧを受けることができる。すべてのマウスは、２１日目に屠殺され得る。ＤＤＣを用いて２８日間チャレンジされたマウスは、顕著な線維症を通常は発症する。ＷＩＳＰ１遮断抗体は、ＤＤＣチャレンジの２８日間の過程の際の１４および２１日目に注射され得る。すべてのマウスは、２８日目に屠殺され得る。
本明細書に記載されるとおり、ＷＩＳＰ１は、ｉｎ ｖｉｖｏでの炎症および線維症のレベルを減少するように抗体を用いて中和され得る炎症性および線維形成促進メディエーターである。したがって、ＷＩＳＰ１を遮断することは、胆管線維症も回復させることができると予測される。したがって、活性化ＨＳＣの馴化培地を分析することによって、分泌されたパラクリンまたはオートクリンメディエーターは同定され得る。活性化ＨＳＣ馴化培地のさらに詳細な分析は、薬物標的である他のメディエーターを同定するための質量分析を通じて分析され得る。
参考文献 実施例１：
Figure 2022512735000004
Figure 2022512735000005
Figure 2022512735000006
[実施例２]
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のための処置
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、次の５～１０年間で先進国において末期肝疾患、肝移植および肝細胞癌の最も一般的な原因になる可能性がある。現在、ＦＤＡ承認薬が存在しないことから、ＮＡＦＬＤをもたらし得る危険因子を低減することが管理の主な方法である。したがって、ＮＡＦＬＤに対する有効な治療を開発することは最も重要である。
活性化肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓の線維化の進行において中心的役割を演じることが周知であり、本明細書において示されるデータは、マイクロＲＮＡｓ ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２が、独立に活性化ＨＳＣを静止状態に戻すことを実証している。さらにｍｉＲ－１５ａは、活性化ＨＳＣにおいてその脂肪症促進および炎症性機能を阻止するようにＷＩＳＰ１を直接標的化する。特定の理論に束縛されることなく、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２が、次いでＮＡＦＬＤにおける線維化の進行を抑制できるＨＳＣの静止状態を促進することを仮定した。
Ｂ型およびＣ型肝炎に対する非常に有効な抗ウイルス治療の出現と共に、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、最も重篤な肝障害になった。いまやＮＡＦＬＤは、先進国世界では最も一般的な肝疾患と見なされており［１］、２０２５年までに、末期肝疾患、肝臓移植および肝細胞癌の主因になると予測されている［２、３］。疾患は、肥満、糖尿病および高脂血症が挙げられる危険因子の高い有病率のために６４００万人が罹患していると概算されている合衆国などの富裕国において特に一般的である。さらに、ＮＡＦＬＤの経済的負担は、年間の直接の医療費が約１０３０億ドルになると推定されて莫大である［４］。疾患は、脂肪肝として始まるが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および最終的には硬化性肝不全または肝細胞癌に進行する場合がある。ＮＡＦＬＤは、現在、危険因子を減少させることによって主に管理されている。しかし、これらの手段は、達成することがしばしば困難であり、それらを除外することさえ改善を保証しない［５］。ＮＡＦＬＤが肝臓に関連する罹患率の最も一般的な要因になり、現在それを管理する薬物がないことを考慮すると、より良い処置の選択肢が必要である。本明細書に記載されるのは、ＮＡＦＬＤのための新規治療を開発するための最初のステップである。
ＮＡＦＬＤは、脂肪症、炎症および線維症を通して段階的な様式で進行する。この病理学的カスケードの際に、肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝線維化において中心的役割を演じると考えられている［６～８］。ＨＳＣは、２つの形態で存在する。健常個体では、それらは静止状態であり、複数のレチノイドリッチな脂肪滴によって特徴付けられる（図１２）。しかし、活性化されると、それらは、脂肪滴を失い、線維形成促進筋線維芽細胞になり、コラーゲンおよび瘢痕形成を促進するメディエーターを分泌する（図１２）［９、１０］。
肝線維症におけるＨＳＣの重要性は十分に確立されているが、この細胞型についてわからないことは多くある。例えば、活性化ＨＳＣを静止状態に戻すことができる遺伝子はあるのか。ＨＳＣも線維症だけでなく初期ＮＡＦＬＤに関与し、脂肪症および炎症を促進するか。ＨＳＣが脂肪性肝炎または線維症に寄与する場合、これらのプロセスに関与する重要なメディエーターは何か。これらの疑問に応えることおよびより良い生物学的知見を得ることは、ＮＡＦＬＤを管理するための新規アイデアをもたらす可能性がある。
現在の知識における多数のギャップの１つは、ＨＳＣ活性化状態の決定におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割の理解が特に乏しいことである。グループは、ＨＳＣにおける全体的なｍｉＲＮＡ発現パターンをプロファイルしたが、それらの発現状態の機能的重要性はほとんど不明確である［１１～１３］。それに応じて研究は、ｍｉＲＮＡ機能を決定することに最初に注目し、ＨＳＣの活性化状態に影響を与える重要なｍｉＲＮＡを発見した。大規模発現プロファイリングに依存する代わりに、機能性スクリーニングおよびアッセイが活性化ＨＳＣを静止状態に戻すようにするｍｉＲＮＡを体系的に同定するために開発され、この努力を通じてｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２が同定された。これらのｍｉＲＮＡまたはそれらの下流の標的を通じてＨＳＣ静止状態を促進することは、ＮＡＦＬＤにおける線維化の進行を予防できる。
最終的に、線維症を生じる活性化ＨＳＣは、ＮＡＦＬＤに固有ではない。大部分の慢性肝疾患は、肝硬変に達する前の数年間について線維症を促進するＨＳＣを含む。したがって、治療剤がＨＳＣを標的化することによって線維化の進行の速度を減少できれば、ＮＡＦＬＤ以外の他の肝疾患においてこのアプローチを使用することができる。かかる治療の潜在的影響は、莫大である。確立された薬物療法を有する原発性胆汁性肝硬変または自己免疫性肝炎などの疾患についてさえ、線維化の進行を阻害する追加の作用剤は、これらの慢性の疾病を管理する能力を顕著に改善できる。結論として、ＮＡＦＬＤの重要性およびその線維化の進行においてＨＳＣが演じる中心的役割の両方を考慮して、本明細書に記載される研究の重要性は、広範囲にわたる。
いくつかの化合物は、ＮＡＦＬＤの処置について臨床試験中であるが、主な目標としてＨＳＣ活性化を妨げるまたは戻すことによるものはない［５、１４、１５］。それに応じて、最初の主な技術革新は、進行性の肝損傷および線維症を予防するための方法としてＨＳＣの活性化状態を管理するための試みから始まった。本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングは、プラスチック表面で増殖される場合に活性化されるＨＳＣの生来の傾向を利用した。ＨＳＣが活性化されると、それらは、静止ＨＳＣにおいて豊富に存在する脂肪滴を失う（図１２）。この有用な表現型二分法を利用して、活性化ＨＳＣをさらに静止様にするｍｉＲＮＡを細胞質において再形成される脂肪滴のレベルを追跡することについて探索した。ｍｉＲＮＡが、器官発達、発癌または細胞再プログラム化などの細胞プログラム全体に影響を与えるように複数のコード遺伝子を同時に標的化することが周知であることから［１６］、単一のｍｉＲＮＡでさえ、この分化転換を誘導できると判断された。実際に、不偏性調査を通じて、細胞内脂肪滴の再出現によって実証されるとおり、ＨＳＣを活性化状態から静止状態に戻すと考えられるいくつかのｍｉＲＮＡ候補は、同定された（図３）。これらのｍｉＲＮＡのサブセットは、遺伝子発現パターン、増殖速度および近くの肝細胞への影響を含む、ＨＳＣ静止状態に向けた他の表現型変化も生じた。ＨＳＣ活性化状態を管理するためにｍｉＲＮＡを利用するこの技術革新は、肝線維症を予防する全く新しい治療カテゴリー全体を開発するための基礎として役立つ。
第２の主な技術革新は、静止様ＨＳＣを使用する新規細胞治療の形態にある。初期スクリーニングおよび経過観察ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の模倣物を用いる一過性形質移入を使用して行われたが、ＨＳＣにおいていずれかのｍｉＲＮＡを構成的に発現するためにゲノムに組み込まれ得るｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターが次いで使用された場合［１７］、それらは、形態、発現および機能における劇的な変化を伴って静止様状態に持続的に分化転換すると考えられた。際立ったことに、これらの再プログラム化されたＨＳＣが００１４を用いてチャレンジされたマウスに注射された場合、それらは、肝臓に生着し、肝損傷および線維症のレベルを改善した。他のグループは、間葉系幹細胞またはマクロファージを使用する肝硬変の細胞治療を試みたが［１８］、遺伝子操作されたＨＳＣが肝線維症またはＮＡＳＨのための治療として使用されたのは、これが初めてである。
最近の主な技術革新は、本質的に技術的である。ＨＳＣがＮＡＳＨにおける肝線維症の主なドライバーであることが既に周知である場合、それらの作用を破壊することは可能である。しかし、この努力には根本的な課題がある。ＨＳＣ機能および作用の機序の研究を妨げる最も大きな障壁の１つは、機能的表現型および作用の機序を評価するための簡単なアッセイを可能にする、ＨＳＣと他の細胞型との相互作用についての良好なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの不足である。この必要性に対処するために、初代マウスＨＳＣおよび肝細胞を使用する共培養系が、これら２つの細胞型の近接近での肝臓微小環境を再構成するために開発された。さらに、この技術をＮＡＳＨのマウスモデルと組み合わせることによって、近くの肝細胞へのＮＡＳＨ－ＨＳＣの効果は、確実に測定され得る。興味深いことに、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食由来ＮＡＳＨ－ＨＳＣ（ＣＤＡＨＦＤモデル）（図１３）は、健常マウスから採取された共培養肝細胞において脂肪症を誘発し、炎症性サイトカインの発現を刺激した（図１４、１５）［１９］。このシグナル伝達は、共培養において２つの細胞型がトランスウエルによって分離され得ることから、細胞－細胞接触を必要とせず、ＨＳＣによる可溶性因子（複数可）の分泌を意味する。実際に、肝細胞における脂肪蓄積の誘導は、培養されたＮＡＳＨ－ＨＳＣからの馴化培地が共培養されることなく正常な肝細胞に適用される場合でも、再現され得る（図１６）。したがって、この系は、肝細胞において脂肪症および炎症性サイトカインを誘導するＨＳＣ分泌メディエーターの同定を可能にする。単純だが強いｅｘ ｖｉｖｏ系を使用してＮＡＦＬＤにおけるＨＳＣと肝細胞との間の相互作用をモデル化することによって、メカニズム的および創薬実験を受け入れられる技術は、創出された。特に、細胞株の代わりに初代細胞を利用することによって、この共培養系は、ｉｎ ｖｉｖｏでこれら２つの細胞型の病理生理学的微細環境をさらに正確にシミュレートする［２０］。共培養系は、これらの細胞を採取し、培養するための既存のプロトコールを改善することによって実行可能であり、それにより努力を最小化しながら品質は最大化される［２１］。これらの技術的強化は、初代細胞を使用して一貫性があり、再現性のある結果を発表するために有用である。
ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２がＨＳＣ活性化に影響を与える機序および程度の定義
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓において全細胞の５％から１５％を構成するだけだが、進行性肝疾患におけるその活性化後の非常に大きな線維形成促進の影響は、十分認識されている［６、７、２３、２４］。いくつかの研究は、活性化対静止ＨＳＣにおける差時的ｍｉＲＮＡ発現を実証したが［１１～１３］、活性化プロセスの際のｍｉＲＮＡの機能は、まだ大部分は不明である。静止状態に戻る活性化ＨＳＣの復帰におけるｍｉＲＮＡの役割は、ほとんど理解されていないが、肝臓の炎症および線維症の回復の際のＨＳＣの１つの可能性がある運命である［９、２５］。
静止状態に向けた活性化ＨＳＣの復帰を促進するこれらのｍｉＲＮＡを同定するために、活性化ＨＳＣが全ゲノムｍｉＲＮＡライブラリー由来の個々のｍｉＲＮＡ模倣物を受けた後に、レチノイドを含む細胞内脂肪滴、静止状態のマーカーの再出現を探すために不偏性の機能性スクリーニングが設計された（図２）。調査を、ほとんど脂肪滴を有さない活性化ＨＳＣを培養する９６ウエルプレートで実施した。個々のｍｉＲＮＡを各ウエルにトランスフェクトすると、一部のウエルのＨＳＣは、ＢＯＤＩＰＹ染色陽性脂肪滴が３日以内に再形成されたことを示した。この最初のスクリーニングは、１５個の主なヒットを生じた。ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２を、さらなる調査のためにヒトオルソログの存在ならびにマウスおよびヒトＨＳＣの両方における脂肪滴を再形成する能力に基づいて選択した（図３）。新たに形成された脂肪滴は、静止ＨＳＣにおいてと一致して、紫外線下の蛍光によって証明されてレチノイド陽性であった（図１７）。トランスフェクトしたＨＳＣの全体のサイズは、１０～１００分の１に減少し、さらに静止様になった（図４）。さらに、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２の強制発現は、活性化の２つの最も重要な遺伝子マーカー、アルファ平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）およびアルファ１型（Ｃｏｌ１ａ１）を下方制御した（図４）。
さらに包括的な発現分析のためにディープＲＮＡ配列決定は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を受けた静止様ＨＳＣが活性化細胞よりも静止ＨＳＣに４０～５０％近い全体的な転写プロファイルを有したことを実証した（図１８）。最も驚くべきことに、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２によって静止様になったＨＳＣは、真の静止ＨＳＣに類似する機能的表現型を有した。Ｅｘ ｖｉｖｏでの実験は、２つの細胞型が共培養された場合に静止様ＨＳＣが健常な肝細胞において脂肪症を誘導しなかったことを実証した。対照的に、候補ｍｉＲＮＡを用いて処置されていない活性化ＨＳＣまたはＮＡＳＨ－ＨＳＣは、それらが共培養された場合に肝細胞脂肪過多を誘導した（図１９）。最終的に、ｍｉＲ－１５ａについては有意でなかったが、予測されたとおり、内在性ｍｉＲ１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、静止ＨＳＣと比較して活性化ＨＳＣにおいて発現レベルが減少していた（図７）。
ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、肝星細胞の文脈では研究されていない。しかし、ｍｉＲ－１５ファミリーは、線維症を減弱する可能性がある心臓におけるＴｇｆベータ経路を阻害することが見出され［２６］、慢性リンパ性白血病における重要な腫瘍抑制因子としても周知である［２７、２８］。対照的に、ｍｉＲ－４１２については具体的な文献は存在せず、それによりその機能は、全く知られていない。ＭｉＲＮＡは、一般には、短い、通常は長さ２２ヌクレオチドである非コード遺伝子であり、すべての生物学的および病理学的プロセスに関与している。それらは、分解または翻訳阻害を誘導するそれらのｍＲＮＡ標的内の相補性配列との不完全が塩基対合によって、標的コード遺伝子を下方制御する。各ｍｉＲＮＡは、多数の異なるコード遺伝子を制御できる一方で、各標的遺伝子は、遺伝子制御ネットワークの複雑な層を構成する多数の異なるｍｉＲＮＡによって制御され得る。ｍｉＲＮＡは、すべての哺乳動物コード遺伝子の約５０％を直接標的化し、それらの広範な遺伝子制御を実証している［２９］。ｍｉＲＮＡが、細胞増殖および再プログラム化に不可欠であることが示された［３０～３２］。それにも関わらず、ＨＳＣ活性化または静止状態への復帰におけるｍｉＲＮＡの役割は、調査されていない。
本明細書において実証されたとおり、ＨＳＣにおけるｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の静止状態促進効果および作用の機序は説得力がある。ＷＩＳＰ１は、ｍｉＲ－１５ａの直接標的として同定されたが、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の両方についての他の関連する標的がある可能性がある。多数の予測アルゴリズムは、配列相補性に基づいてｍｉＲＮＡの潜在的な直接標的を予測するが、これらの予測される標的の大部分は、実験検証に耐え得る実際の標的ではない。したがって、ＨＳＣのＲＮＡ－Ｓｅｑは、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の真の直接標的を同定できる発現プロファイルを定義するために種々の活性化状態において実施された。
３種のＨＳＣをディープ配列決定した：１）健常マウスから新鮮採取した静止ＨＳＣ、２）細胞培養ディッシュで複数回継代させた（pass）活性化ＨＳＣ、および３）ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを受けることによって活性化状態から静止状態に復帰した静止様ＨＳＣ。静止様ＨＳＣをｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２模倣物のいずれかを受けたちょうど３日後に配列決定したことから、ｍＲＮＡレベルでの任意のコード遺伝子の減少は、直接ｍｉＲＮＡ標的化の結果であり得る。それにより、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを受けた後にｍＲＮＡレベルが減少した遺伝子のセットに予測アルゴリズムに基づいた潜在的な直接標的のセットを重ねた［３３］（図２０）。２つの親セット由来の共通遺伝子のこの新たなセット（今後、標的候補セットと呼ばれる）は、真の直接標的を含む可能性が高い。
標的候補セットは、分析するには多すぎる遺伝子をまだ有することから、ＨＳＣ活性化を促進する２つの最良の周知のシグナル伝達経路、ＴｇｆベータおよびＰｄｇｆ、の一部として周知である標的候補遺伝子を選択した。ＰＡＮＴＨＥＲ分析をこれら２つの経路の一部である遺伝子を選別するために使用した場合、それぞれ１２個および１１個の標的候補がｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２について残された（図２０）［３４］。これらの遺伝子は、構成的に活性なルシフェラーゼ遺伝子の後にクローニングされた変異ｍｉＲＮＡ結合配列を含むまたは含まないレポーターを構築することによって検査され得る。これらのレポーター構築物の１つおよびｍｉＲＮＡ模倣物は、２９３細胞または初代ＨＳＣのいずれかに同時トランスフェクトされ得る。同時トランスフェクトされたｍｉＲＮＡがこの配列にアニールし、ルシフェラーゼタンパク質の翻訳を阻止できる場合、コード遺伝子が検査したｍｉＲＮＡの真の直接標的であることを示し得る。変異結合配列は、ｍｉＲＮＡがアニールすることを妨げ、ルシフェラーゼの正常に近い発現を可能にするはずであり、検査したコード遺伝子配列が真のｍｉＲＮＡ標的であることをさらに支持する。２３個の高い可能性を有する標的候補遺伝子配列が実際のおよび変異された形態の両方でルシフェラーゼベクターにクローニングされる必要であることから、この実験は時間がかかると予測される。しかし、直接標的を見出すことは、ｍｉＲＮＡの作用の機序を解明することにおいて替えがきかないものである［３２］。
これまでに、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を活性化ＨＳＣに送達することの効果が、本明細書に記載された。ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の機能をさらに理解するために、機能実験の確定的な損失は、以前記載されたＣＲＩＳＰＲ技術を使用して初代ＨＳＣにおけるこれらの遺伝子を欠失させることによって完了され得る［３５］。
初代ＨＳＣでこの技術を使用する実行可能性は、既に利用されたデジット（digit）欠失ベクターを送達することによって検証された（図２１）［３５］。３個の標的化ＨＳＣ株は、生成され得る：１）ｍｉＲ－１５ａヌル、２）ｍｉＲ－４１２ヌル、および３）ｍｉＲ－１５ａ／ｍｉＲ－４１２ヌル。これらのｍｉＲＮＡの両方が過剰発現でＨＳＣ静止状態を促進することから、それらの欠失は、活性化表現型を、特にｍｉＲ－１５ａ／ｍｉＲ－４１２二重ヌル株において生じ得ることが予測される。ｍｉＲＮＡが多数の機能的重複性を有することが周知であることから、別々の表現型の欠如も可能性がある。活性化のレベルは、ＲＮＡ－Ｓｅｑを通じてそれらの全体発現を明らかにする、ならびに活性化および静止ＨＳＣの両方を比較することによって決定され得る。形態および増殖は、プラスチックおよびＭａｔｒｉｇｅｌで培養される間に評価され得る。活性化野生型ＨＳＣは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で静止状態に戻って復帰することが周知であり［３６］、ノックアウトＨＳＣの表現型は、この環境において特徴付けられ得る。ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２欠失がＨＳＣ活性化に寄与する場合、この効果は、Ｍａｔｒｉｇｅｌの静止状態促進効果を克服できる。肝細胞とｍｉＲＮＡ欠失ＨＳＣとの相互作用は、共培養系を用いて評価され得る。活性化ＨＳＣは、共培養肝細胞が脂肪性（steatotic）になり、炎症性メディエーターを発現するようにする。ｍｉＲＮＡ欠失ＨＳＣは、活性化される野生型ＨＳＣのものよりさらに大きい脂肪症促進表現型を有するとも評価される場合がある。最終的に、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を再構築することは、それぞれの欠失株において検査でき、野生型表現型をレスキューできる。欠失ｍｉＲＮＡの再構成は、既にクローニングされ、機能獲得実験のために使用されたｍｉＲＮＡ発現ｐｉｇｇｙＢａｃベクターをトランスフェクトすることによって達成され得る。
ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２は、個々に発現されたが、同じＨＳＣ中でそれらを一緒に発現することも本明細書において具体的に検討される。さらに、これらのｍｉＲＮＡの１つだけを送達することは、全体の遺伝子発現パターンを活性状態から静止状態に向けて、それらをつなぐ転写軸に沿っておよそ半分戻してシフトできる（図１１）。両方のｍｉＲＮＡを過発現することは、いずれかのｍｉＲＮＡを単独で発現するよりもさらに近く静止状態に向けて活性化ＨＳＣを復帰できる。この機能獲得実験は、単一のｐｉｇｇｙＢａｃベクターに両方のｍｉＲＮＡのクローニングし、それを活性化ＨＳＣにトランスフェクトすることによって実施され得る。ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、ｍｉＲＮＡ遺伝子のゲノムへの組み込みを可能にし、それらを構成的に発現する［１７］。両方のｍｉＲＮＡを同時に発現するＨＳＣは、ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用する全体的遺伝子発現、形態学、ＭＴＴアッセイを使用する増殖および、本共培養法を使用する肝細胞との相互作用を含む、他のＨＳＣ株を特徴付けるための本明細書に記載される同様のパラメーターを用いて表現型決定され得る。
両方のｍｉＲＮＡを発現する初代ＨＳＣの表現型が静止ＨＳＣにさらに近接に類似している場合、細胞療法は、ＨＳＣが単一のｍｉＲＮＡを過発現することから、ＣＣｌ４誘発肝線維症および食餌誘発ＮＡＳＨの設定で検査され得る。このＨＳＣ株は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを単独で発現するＨＳＣ株を用いて観察されたものよりもさらに肝損傷および線維症を予防または減少させることができる。
肝線維症またはＮＡＦＬＤのマウスモデルへのｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２送達の検査
ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いたＮＡＳＨの食餌モデル由来のＨＳＣを処置すること、およびそれらを肝細胞の静止状態に戻すこと（図１２）。さらに、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２は、活性化を促進する培養条件においてさえも活性化ＨＳＣを静止状態に戻すと考えられる。これらの重要なｅｘ ｖｉｖｏでの観察は、伝統的ＣＣｌ４マウスモデルにおいて、特に、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを発現するＨＳＣは、活性化促進シグナルを有する疾患肝臓においてさえ静止様状態を維持できることから、肝臓の病態のレベルを減弱するために、これらのｍｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで送達され得るかどうかの検査を可能にする。細胞接触および可溶性メディエーターを通じて、静止様ＨＳＣは、脂肪症、炎症または線維症を促進するそれらのシグナルを弱めるように、肝臓内の他の細胞型を誘導できる。
生存しているマウスにｍｉＲＮＡを送達するためのさまざまな方法があるが、注射されたＨＳＣは、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を構成的に発現することによって静止様になる。それにより、肝疾患のための新規細胞治療の実行可能性を静止様状態に遺伝子操作されたＨＳＣを使用してさらに検査した。この実験は、４週間のＣＣｌ４チャレンジの第３週に再プログラム化されたＨＳＣを１回注射することによって実施した。注射されたＨＳＣは肝臓に移植され、ｍｉＲＮＡを発現するｐｉｇｇｙＢａｃベクターに挿入されたＧＦＰシグナルを発することを肝細胞内で可視化することによって確認された［１７］（図８）。さらに重要なことに、静止様ＨＳＣを用いて処置したマウスは、肝臓においてバルーニング、アポトーシス、炎症および線維症の減少を示す組織像（図８）、および低い肝臓コラーゲン発現（図９）を有した。これらの観察を考慮して、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験は、肝線維症およびＮＡＳＨの追加のマウスモデルを使用して脂肪肝、炎症および線維症を処置することにおけるｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２の可能性をさらに評価するために拡張され得る。これらのｍｉＲＮＡが、ＨＳＣを通じて単独で、または他の細胞型を通じてより広範にそれらの機能を発揮するかどうかを評価するために、ｍｉＲＮＡは、細胞治療の代わりにウイルスベクターまたは模倣物を使用して全身に送達され得る。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ処置実験のために、有効性は、肝臓における線維形成促進遺伝子のＰＣＲ、Ｈ＆Ｅおよびシリウスレッド染色を含む組織学的検査、肝臓ヒドロキシプロリンアッセイおよび血漿ＡＬＴの測定を実施することによって評価され得る。
間葉系幹細胞およびマクロファージを使用して、複数のグループは、一定の成果を有して肝線維症のための細胞治療を既に実施した［１８］。しかし、これらの実験は、肝線維症を予防または元に戻すために意図的に遺伝子操作されたＨＳＣを始めて利用する。別個の類遺伝子性マウス由来のＨＳＣ、および細胞５００，０００個をＣＣｌ４の４週間の過程の第３週に１回注射した。最初の結果は説得力があるが、肝臓組織学的検査における改善が、４週間のＣＣｌ４投与から生じた肝損傷の予防から、またはＣＣｌ４チャレンジの最初の３週間で生じた損傷の反転からであるかは不明である。ＮＡＳＨにおけるこの細胞治療の効果は、これまでのところＣＣｌ４モデルだけが使用されたことを考えると十分理解されていない。最終的に、細胞治療の有益な効果は、１回より多い注射で増加する可能性がある。これらの重要な疑問に答えるために、肝線維症のＣＣｌ４モデル（経口経管栄養１００ｕｌ、４０％ＣＣｌ４ １週間に２回）は、ＮＡＳＨのＣＤＡＨＦＤモデルに加えて使用され得る［１９］。すべての細胞治療実験について、５００，０００個の静止様ＨＳＣは、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて再プログラム化され得る。処置を受けていないまたは再プログラム化されていないＨＳＣを用いた処置を受けた群などのすべての適切な対照は含まれ得る。
静止様ＨＳＣが肝線維症を予防または元に戻すことができるかどうかを検査するために、異なる細胞注射スケジュールを有する２つの別々の実験が使用され得る。すべてのＣＣｌ４投与は、経口経管栄養によって１週間に２回行われ得る。ＣＣｌ４を用いて８週間チャレンジされたマウスは、通常は進行性線維症を発症する。再プログラム化されたＨＳＣは、８週間の過程のＣＣｌ４チャレンジの第２、第４および第６週に注射され得る。すべてのマウスは、８週目の終わりに屠殺され得る。対照と比較して、細胞治療が既に存在する肝線維症を元に戻すことができるかどうかを検査するために、再プログラム化されたＨＳＣは、８週間の過程のＣＣｌ４チャレンジが完了した後の第９および第１１週に注射され得る。すべてのマウスは、１２週目の終わりに屠殺され得る。コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）モデルは、３週目までに顕著なＮＡＳＨおよび９週目までにステージ２線維症（０～４スケールで）を発症する［１９］。５週目に細胞治療の単回注射または３、５および７週目に３回の注射は完了され得る。すべてのマウスは、９週目の終わりに屠殺され得る。
活性化ヒトＨＳＣは、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のヒトオルソログを受けた後に静止様状態に復帰し得ることが以前示された（図８）。これらの復帰した細胞は、レチノイド陽性脂肪滴を再形成し、共培養されたヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７からの炎症性サイトカイン発現を減少させることができた（図６）。ヒト治療のために発見を転換する懸け橋として、初代ヒトＨＳＣは、ｍｉＲ１５ａおよびｍｉＲ－４１２の治療可能性を決定することにおいて肝線維症のＣＣＬ４マウスモデルを処置するために使用され得る。ＣＣｌ４は、ヒト細胞の免疫拒絶を予防するように選択された重症複合型免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ）において肝線維症を誘導するように１週間に２回経管栄養され得る。ＣＣＬ４ベースの肝線維症モデルは、他のグループによってＳＣＩＤマウスを用いて成功裏に作製された［３７］。線維症予防研究：ヒトＨＳＣは、ＳＣＩＤマウスにおける８週間の過程のＣＣＬ４チャレンジの際に第２、第４および第６週に注射され得る。線維症復帰研究：再プログラム化されたヒトＨＳＣが対照と比較して既に存在する肝線維症を元に戻すことができるかどうかを検査するために、ＨＳＣは、８週間の過程の００１４チャレンジが完了した後、第９および第１１週に注射され得る。すべてのマウスは、１２週目の終わりに屠殺され得る。
最初の実験は、ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２を用いて再プログラム化されたＨＳＣを注射することは、ＣＣｌ４誘発肝線維症においてコラーゲン発現および肝損傷の全体的なレベルを減少できることを実証した。ｍｉＲＮＡを送達する１つの方法は、ｍｉＲＮＡを発現するレンチウイルスを注射することである。ＣＣｌ４線維症研究：ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを発現するレンチウイルスは、ＣＣｌ４チャレンジの８週間の過程の際の第２、第４および第６週に尾静脈に注射され得る。すべてのマウスは、８週目の終わりに屠殺され得る。ＣＤＡＨＦＤ ＮＡＳＨ研究：ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを発現するレンチウイルスは、ＣＤＡＨＦＤの９週間の際の３、５および７週目に注射され得る。すべてのマウスは、８週目の終わりに屠殺され得る。
別の送達方法として、脂質ベースの担体（ＭａｘＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭ ｂｙ Ｂ１００ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にパッケージされたさらに安定な化学的に修飾されたｍｉＲＮＡ模倣物（Ｅｘｉｑｏｎ ａｎｄ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を注射することの実行可能性は、検査され得る［３８、３９］。レンチウイルスを回避することにより、この方法またはその変法は、ヒトにおいて使用される可能性を有する。ＣＣｌ４線維症研究：ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを含有する脂質担体は、８週間の過程のＣＣｌ４チャレンジの際に第２、第４および第６週に尾静脈に注射され得る。すべてのマウスは、８週目の終わりに屠殺され得る。ＣＤＡＨＦＤ ＮＡＳＨ研究：ｍｉＲ－１５ａまたはｍｉＲ－４１２のいずれかを含有する脂質担体は、ＣＤＡＨＦＤの９週間の過程の際の３、５および７週目に注射され得る。すべてのマウスは、９週目に屠殺され得る。
脂肪肝、炎症および線維症におけるＷＩＳＰ１の機能を定義
一般にｍｉＲＮＡが、複数のコード遺伝子を標的化することによって機能することを踏まえて、これら２つの候補は、肝臓の炎症および線維症を促進するＨＳＣ遺伝子を下方制御すると考えられる。ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－４１２によって阻止される多数の遺伝子がおそらくあるが、ＷＩＳＰ１は、ｍｉＲ－１５ａの最初に実験的に検証された直接標的として明らかになった。ＷＩＳＰ１は、ＣＤＡＨＦＤ誘発ＮＡＳＨ－ＨＳＣ馴化培地において分泌増加した（up-secreted）いくつかのタンパク質の１つとして最初に同定され、＞１００個の代表的なサイトカイン、ケモカインおよび細胞外マトリクスタンパク質を保持するサイトカインアレイブロットを使用して検出された（図２２）。さらに詳細な分析は、活性化ＨＳＣが静止ＨＳＣのレベルのおよそ３０倍のＷＩＳＰ１を発現したことを示した（図２３）。ＷＩＳＰ１は、Ｃｙｒ６１（Ｃｃｎ１）、Ｃｔｇｆ（Ｃｃｎ２）、Ｎｏｖ（Ｃｃｎ３）、ＷＩＳＰ１（Ｃｃｎ４）、Ｗｉｓｐ２（Ｃｃｎ５）およびＷｉｓｐ３（Ｃｃｎ６）を含む、マトリクス細胞タンパク質のＣｃｎファミリーのメンバーである。Ｃｔｇｆは、肝臓における重要な線維形成促進因子として既に確立されている［４２］。興味深いことに、ＷＩＳＰ１は、ヒト特発性肺線維症において上方制御されていることが見出され、中和ＷＩＳＰ１抗体を用いてブレオマイシンチャレンジマウスを処置することは、肺線維症の減弱を生じた［４３］。さらに、小動物研究は、ＷＩＳＰ１を遮断することがＣＣｌ４誘発肝線維症を回復させることを示した［４４］。しかし、肝臓におけるＷＩＳＰ１の役割は、特にＮＡＳＨの文脈では、詳細に研究されていない。
共培養肝細胞においてＣＤＡＨＦＤ誘発ＮＡＳＨ－ＨＳＣが脂肪症を促進することを踏まえて（図１４、１６）、ＷＩＳＰ１は、この表現型に寄与する可能性がある。実際に、ＷＩＳＰ１が健常マウスから採取されたＨＳＣにおいて過発現された場合、これらの細胞由来の馴化培地は、最初は健常な初代肝細胞において脂肪症を生じた（図２４）。さらに、ｍｉＲ－１５ａは、２つの潜在的なｍｉＲ－１５ａ結合配列をその３’－ＵＴＲ内に含有するＷＩＳＰ１を標的化することが予測される。したがって、推定標的配列またはその変異バリアントは構成的に活性なルシフェラーゼレポーター遺伝子の後ろにクローニングされた。これらのレポーターの１つをｍｉＲ－１５ａ模倣物と同時トランスフェクトした場合、野生型配列を含むレポーターはルシフェラーゼ発現を減少させ、一方変異配列を有するレポーターはさせず、ｍｉＲ－１５ａが両方のＷＩＳＰ１標的配列に結合することを示している（図１１）。これらのデータおよび公開された文献を考慮して、ＷＩＳＰ１は、ＨＳＣにおいてｍｉＲ－１５ａ作用の一部を達成するための重要な標的遺伝子である可能性があり、ＮＡＳＨを管理するための薬物標的である可能性もある。ＷＩＳＰ１の肝臓での機能が、ＮＡＳＨのための処置標的として可能性があることは本明細書において検討される。
ＷＩＳＰ１は、ｍｉＲ－１５ａの直接標的であるが、ＨＳＣ活性化状態へのその影響およびＮＡＦＬＤ病態形成におけるその役割は不明である。ＷＩＳＰ１ヌルマウス株は、骨形成におけるＷＩＳＰ１の役割を実証するために作製されたが、肝臓におけるその機能は研究されなかった［４５］。これらのマウスは、繁殖力があり、顕性の肝臓の表現型を有さない。それらの変異対立遺伝子は、良好な変異マウス誘導を保証するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ ＤａｖｉｓのＭＭＲＲＣ施設で凍結精子および胚中に保存されている（添付書類を参照されたい）。最初に、ＷＩＳＰ１の機能は、ＷＩＳＰ１ヌルマウスから採取し、それらの表現型をｅｘ ｖｉｖｏで特徴付けることによって、ＨＳＣにおいて解明され得る。
静止状態にある野生型ＨＳＣは、プラスチック上での７～１０日間の培養後で活性化され、本明細書において示されるＲＮＡ－ｓｅｑデータは、これらの２つの群間の全体的遺伝子発現における明らかな差異を実証している（図１１）。ＷＩＳＰ１ヌルＨＳＣを使用する並行実験は、活性化促進環境においてさえＷＩＳＰ１欠失が、全体的発現プロファイルをＨＳＣ静止状態のものに向けて変更するかどうかを評価するために使用され得る。ＷＩＳＰ１ヌルマウスからＨＳＣを単離した後、細胞は、１日間（静止状態）または２８日間（野生型での活性化）プラスチックディッシュで培養され得る。それらの全体的な遺伝子発現は、ＲＮＡ－ｓｅｑを通じて決定でき、野生型ＨＳＣのものの結果と比較される。全体的な比較は、多次元スケーリング分析を用いて行うことができ、差次的に発現された遺伝子は、詳細な分析のために同定され得る。
細胞形態、増殖および移動は、プラスチック上で培養されている間に比較され得る。形態は、サイズ、細胞プロセスの程度、脂肪滴の存在ならびにそれらがＵＶ蛍光陽性、レチノイド貯蔵および静止状態の徴候、であるかなどのパラメーターを使用して決定され得る。増殖は、ＷＩＳＰ１ヌルＨＳＣの増殖が減少している場合、静止ＨＳＣと同様にＰＣＮＡおよびＫｉ－６７免疫染色を用いて調べることができる。ＭＴＴアッセイは、既に行われた通り細胞増殖速度を定量するためにも実施され得る［３２］。本明細書において示される予備的データおよび公開された文献がＷＩＳＰ１は線維形成促進遺伝子であると示していることから、ＷＩＳＰ１を欠失させることは、ＨＳＣにおける静止状態を、おそらくプラスチックディッシュ上で培養されている間も促進できる。最終的にノックアウトＨＳＣにおいてＷＩＳＰ１を再構成することは、野生型表現型をレスキューできる。ＷＩＳＰ１を再構成することは、ＷＩＳＰ１発現ｐｉｇｇｙＢａｃベクターをトランスフェクトすることによって達成され得る。ＷＩＳＰ１発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＷＩＳＰ１ヌルＨＳＣは、トランスフェクトされていないＷＩＳＰ１ヌル細胞において使用された同じｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて特徴付けされ得る。
ＷＩＳＰ１ヌルＨＳＣと肝細胞との相互作用は、本明細書に記載される共培養系を用いて評価され得る。活性化野生型ＨＳＣは、共培養された肝細胞が脂肪性になるようにする（図１４）。ＷＩＳＰ１を過発現するＨＳＣは、近くの肝細胞がさらに重度に脂肪性になるようにする（図２４）。ＷＩＳＰ１ヌルＨＳＣは、減弱した脂肪促進性表現型を有し得る。共培養アッセイの読み出し情報は、脂肪滴についてのＢｏｄｉｐｙ染色および、炎症性因子の発現を測定する共培養肝細胞のＰＣＲを含む。
表現型は、肝臓の病態の全体的な重症度によって評価され得る。ＷＩＳＰ１ヌルマウスは、毒素誘発肝線維症およびＮＡＳＨをそれぞれモデル化するためにＣＣｌ４およびＣＤＡＨＦＤを用いてチャレンジされ得る。ＷＩＳＰ１ヌルマウスによって維持される生じた肝損傷は、野生型マウスのものを用いて評価され得る。肺を含む他の器官におけるＷＩＳＰ１の周知の線維形成促進の役割を考慮して、ＷＩＳＰ１ヌルマウスが、肝線維症の減少ならびに、おそらく脂肪症および炎症の減少さえも有することが予測される。すべてのｉｎ ｖｉｖｏでの実験について、肝臓表現型は、肝臓における線維形成促進遺伝子のＰＣＲ、Ｈ＆Ｅおよびシリウスレッド染色を含む組織学的検査、肝臓ヒドロキシプロリンアッセイならびに血漿ＡＬＴ測定を実施することによって評価され得る。最後に、肝疾患のこれらのマウスモデルから採取されたＨＳＣの機能的表現型は、決定され得る。
ＣＣｌ４線維症モデル：オス野生型およびＷＩＳＰ１ヌルマウスは、ＣＣｌ４経管栄養を用いて１週間に２回チャレンジされ得る。それらは、ＣＣｌ４を８週間受ける場合があり、８週目の終わりに屠殺され得る。ＣＤＡＨＦＤ ＮＡＳＨモデル：ＣＤＡＨＦＤについて野生型およびＷＩＳＰ１ヌルマウスは、９週間給餌され得る。中等度のＮＡＳＨ（ＣＤＡＨＦＤ、６週間）およびステージ２線維症を有する末期ＮＡＳＨ（ＣＤＡＨＦＤ、９週間）におけるＷＩＳＰ１の役割を定義するために、半分のマウスは６週目の終わりに、他の半分は９週目の終わりに屠殺され得る。
ＨＳＣは、４週間のＣＣｌ４および３週間のＣＤＡＨＦＤを用いてチャレンジされたマウスから単離され得る。これらのＨＳＣは、それらが脂肪症を発症し、炎症性因子を発現するかどうかを決定するために、健常な肝細胞と共培養され得る。結果は、同じチャレンジを受けた野生型ＨＳＣのものと比較され得る。
中和抗体を用いてＷＩＳＰ１を遮断することは、マウス肺におけるブレオマイシン誘発損傷を減弱した［４３］。同様に、ＷＩＳＰ１を中和することは、ＮＡＳＨにおいて生じる炎症および線維症のレベルを減少できる。ＮＡＳＨのマウスモデルは、ＷＩＳＰ１抗体を用いて処置でき、治療の６および９週間後に肝臓表現型を評価し得る。
ＣＤＡＨＦＤ ＮＡＳＨモデル：野生型マウスへのＣＤＡＨＦＤは、９週間給餌され得る。処置群は、市販の抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）［４３］または抗体［４６］のいずれかを１週間ごとの注射によって受ける。対照群は、ＩｇＧを受ける。線維症を有する中等度のおよび末期のＮＡＳＨにおけるＷＩＳＰ１遮断の効果をそれぞれ検査するために、半分のマウスは６週目の終わりに、他の半分は９週目の終わりに屠殺され得る。
さらに、ＮＡＳＨ由来のＨＳＣの馴化培地を分析して、分泌されたパラクリンまたはオートクリン因子は同定され得る。質量分析を通じたＮＡＳＨ－ＨＳＣ馴化培地のさらに詳細な分析は、薬物標的である可能性がある他のメディエーターを同定できた。最終的に、本明細書に記載される共培養系は、代表的なマウスモデルがあれば他の肝疾患を研究するために使用され得る。例えば、肝細胞のＨＳＣとの相互作用は、アルコール給餌マウスにおいて細胞型を単離することによってアルコール性肝疾患においてモデル化され得る［４７］。
参考文献 実施例１／２：
Figure 2022512735000007
Figure 2022512735000008
Figure 2022512735000009
Figure 2022512735000010
Figure 2022512735000011
[実施例３]
ＨＳＣ単離プロトコール
次のプロトコールは、ＨＳＣ、例えば、ｍｏｄ－Ｈｅｐ／ＨＳＣを単離するための本明細書に記載される実験において使用される。
１．血管カテーテルまたは翼状針を用いて門脈静脈にカニューレを導入
２．溶液を３７℃、６ｍＬ／分で用いて肝臓を灌流：
３０ｍＬ ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）、灌流開始直後、ＩＶＣ切断
３０ｍＬ ０．０５％コラーゲナーゼ［０．５ｍｇ／ｍＬ－－＞５０ｍＬのために、５００ｕｌの５０ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼ保存液］（例えば、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｂ；Ｒｏｃｈｅ １１０８８８１５００１）
３．灌流後、肝臓を注意深く（特に、胆のう）切除、グリソン鞘を除去
４．肝臓を滅菌ビーカーに移し、極薄い片に切断
５．残りの２０ｍＬの０．０５％コラーゲナーゼを加え、インキュベーター中、３７℃、３０分間保持［ＤＮＡｓｅ（１０ｕｇ／ｍＬ）を加える］（例えば、ＤＮａｓｅＩ；Ｒｏｃｈｅ １０１０４１５９００１）
６．ピペットで上下させ、ペトリ皿でセルストレーナー（７０ｕｍ）を用いてろ過。ＰＢＳ＋ＤＮＡｓｅ（１０ｕｇ／ｍＬ）を４５ｍＬまで加える
７．ｘ５０ｇ、３分間の遠心分離によって肝細胞（hepatotocyte）を除去、上清を新たなチューブに移す
８．ｘ６３５ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿
９．４５ｍＬ ＰＢＳ＋ＤＮＡｓｅ（１０ｕｇ／ｍＬ）を用いて洗浄、ｘ６３５ｇ、１０分間遠心分離
１０．７０ｕｍセルストレーナーを通して細胞懸濁物をろ過
１１．４５ｍＬ ＰＢＳ＋ＤＮＡｓｅ（１０ｕｇ／ｍＬ）を用いて洗浄、ｘ６３５ｇ、１０分間遠心分離
１２．上清を吸引、沈殿にＰＢＳを総体積６．５ｍＬまで加える
１３．３．５ｍＬパーコール（パーコールを９、１０ｘＰＢＳを１）を総体積１０ｍＬまで加え、混合し、１５ｍＬチューブに移す（例えば、パーコール；Ｐｅｒｃｏｌｌ ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－５４４５－０２）
１４．カラムの上部に１ｍＬのＰＢＳを注意深く加える
１５．カラムを室温、３０分間、ｘ１１３０ｇ）遠心分離（加速９、ブレーキ０）
１６．遠心分離後、ＨＳＣはＰＢＳと３５％パーコールとの間に位置する層にある
１７．マイクロピペットを用いてＨＳＣを吸引し、１０ｍＬ ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ｘ６３５ｇｘ６分間遠心分離
１８．上清を吸引
１９．沈殿を再懸濁し、ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓに蒔く
[実施例４]
肝疾患の処置および予防のためのＷＩＳＰ１を阻害する抗体
ＷＩＳＰ１に特異的に結合し、阻害する抗体は、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）および自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）などの肝疾患を処置および予防するために使用され得る。
具体的には、ＷＩＳＰ１を阻害する主力候補として、抗（ant）－ＷＩＳＰ１ ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体およびＩｇＧ１ ＡＤＣＣ）が挙げられる。抗ＷＩＳＰ１抗体を遺伝子操作するために使用される戦略として、これだけに限らないが、半減期延長のためのＦｃ遺伝子操作；２つの抗線維化標的の阻害を同時に可能にする二重特異性抗体技術；ならびに、（１）標的異化反応を駆動することによって、実体を触媒作用薬物に隔離することから抗体をそらす、（２）ＣｏＧ、投薬レベルおよび投薬頻度を劇的に減少させる、（３）皮下投薬の可能性を増加させる、ならびに（４）可能性を完全に遮断する必要性を省く、スイーピング技術が挙げられる。
ＷＩＳＰ１を阻害する抗ＷＩＳＰ１抗体の能力を評価するために、抗体を新鮮ＨＳＣ上で検査した。ＷＩＳＰ１抗体（Ａｂ ＷＩＳＰ１またはＷＩＳＰ ＩｇＧ、ＲＮＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１μｇ／ｍＬ）を馴化培地を用いて１時間、３７℃でインキュベートし、ＨＳＣに適用した。陰性対照として、ＨＳＣを馴化培地だけを用いてインキュベートした。陽性対照として、抗体の代わりに組換えＷＩＳＰ１（Ｒｃ－ＷＩＳＰ１、１００ｎｇ／ｍＬ）もＨＳＣに加えた。ＨＳＣ試料を処置４８時間後に評価した（図３８Ａ）。Ｒｃ－ＷＩＳＰ１、例えば、ＷＩＳＰ１－ＣＣＮ４は、受託番号Ｏ５４７７４として同定される細胞株から得る、およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販で入手できる。Ｒｃ－ＷＩＳＰ１は、ＨＳＣにおいてインキュベーション後１日目および２日目に細胞数（図３８Ｂ）、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡ発現（図３８Ｃ）およびＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡ発現（図３８Ｄ）の顕著な増加が見出され、ＨＳＣが組換えＷＩＳＰ１の存在下で活性化されたことを示している。驚くべきことに市販で入手できる抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧ（Ａｂ Ｗｉｓｐ１）は、ＨＳＣにおいてＨＳＣ活性化を妨げた；抗ＷＩＳＰ１を用いたインキュベーションは、ｒｃ ＷＩＳＰ１を用いてインキュベートしたＨＳＣと比較して、インキュベーション後１日目および２日目に細胞数（図３８Ｂ）、Ａｃｔａ２ ｍＲＮＡ 発現（図３８Ｃ）およびＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡ発現（図３８Ｄ）の顕著な低減を生じた。
次に、抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧを、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸限定高脂肪食誘発脂肪症（ＣＤＡＨＦＤ）マウスモデルから単離した初代肝細胞において検査した。肝疾患、例えば、ＮＡＬＦＤおよびウイルス性肝炎の顕著な特徴は、疾患肝臓細胞中の脂肪滴の増加である。脂肪滴の存在を評価するために、ＢＯＤＩＰＹ染色が使用される。予測されるとおり、対照ＩｇＧを用いて処置したＣＤＡＨＦＤ細胞は、ＢＯＤＩＰＹ染色が増加した（図３８Ｅおよび３８Ｆ）。対照的に、抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧを用いて処置したＣＤＡＨＦＤ細胞は、対照、健常細胞と同様にＢＯＤＩＰＹ染色が減少した（図３８Ｅおよび３８Ｆ）。したがって、本明細書において示されるデータは、抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧが疾患肝臓細胞を健常な肝細胞に戻せることを示している。
最終的に、ＨＳＣ移動を調節する抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧの能力を示すために、ＨＳＣを単層を形成するように培養し、次いで損傷した（図３９Ａ～図３９Ｂ）。細胞を増殖培地で６０ｍｍディッシュに９０％コンフルエンスで培養した。単一の直線状の掻創を滅菌Ｐ２００ピペットチップを使用して作製した。浮遊している細胞デブリを除くために細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、組換えＷｉｓｐ１タンパク質（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびモノクローナルＷｉｓｐ１抗体（１μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を２４時間加えた。創傷閉鎖または細胞移動を、倒立顕微鏡を使用して掻創が導入された時、傷害１２および２４時間後に写真撮影した。各時点でのディッシュ中の創傷の縁の間の面積を画像に置いた標準的テンプレートを使用して測定した。データは、初期の創傷面積と比較した創傷面積（百分率）として表した。創傷面積は、公開されているＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して決定した。
傷害に続いて、ＨＳＣをＲｃ ＷＩＳＰ１または抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧのいずれかとインキュベートした。ｒｃ ＷＩＳＰ１を用いてインキュベートしたＨＳＣは、特に１２時間後の時点で、対照または抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧ処置ＨＳＣと比較してより急速な移動を示した。対照的に、抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧを用いてインキュベートしたＨＳＣは、対照処置ＨＳＣと同様の遅い移動を生じた（図３９Ａ～図３９Ｂ）。抗ＷＩＳＰ１ ＩｇＧは、Ｒｃ－ＷＩＳＰ１を用いて処置したＨＳＣと比較して傷害後にＨＳＣ移動を妨げた。この結果は、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体が、ＨＳＣ活性化および移動を妨げることができ、それらを肝疾患を処置するための有用な作用剤にすることを確認している。
配列
配列番号１は、ヒトＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１アイソフォーム１前駆体をコードするアミノ酸配列である。
Figure 2022512735000012
配列番号２は、ヒトＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１アイソフォーム２前駆体をコードするアミノ酸配列である。
Figure 2022512735000013
配列番号３は、ヒトＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１アイソフォーム３前駆体をコードするアミノ酸配列である。
Figure 2022512735000014
配列番号４は、ヒトＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１アイソフォーム４前駆体をコードするアミノ酸配列である。
Figure 2022512735000015
配列番号５は、ヒトＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１（ＷＩＳＰ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。
Figure 2022512735000016
Figure 2022512735000017
Figure 2022512735000018
配列番号６は、マウスＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１前駆体のアミノ酸配列である［マウス（Mus musculus）］。
Figure 2022512735000019
配列番号７は、マウスＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質１（Ｗｉｓｐ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である［マウス（Mus musculus）］。
Figure 2022512735000020
Figure 2022512735000021
Figure 2022512735000022
配列番号８は、ヒトＭｉＲ １５ａのヌクレオチド配列である。
Figure 2022512735000023
配列番号９は、ヒトＭｉｒ－４１２のヌクレオチド配列である。
Figure 2022512735000024
配列番号１０は、マウスＭｉＲ １５ａのヌクレオチド配列である。
Figure 2022512735000025
配列番号１１は、マウスＭｉｒ－４１２のヌクレオチド配列である。
Figure 2022512735000026
配列番号１２～３１は、ＩｇＧについてのクマネズミ属（Rattus）重鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000027
Figure 2022512735000028
配列番号３２～５１は、ＩｇＧについてのクマネズミ属（Rattus）軽鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000029
配列番号５２～７１は、ＩｇＧについてのヒツジ（Ovis aries）（ヒツジ）重鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000030
配列番号７２～９０は、ＩｇＧについてのヒツジ（Ovis aries）（ヒツジ）軽鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000031
配列番号９１～１１０は、ＩｇＧについてのヤギ（Capra hircus）（ヤギ）重鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000032
配列番号１１１～１２１は、ＩｇＧについてのウサギ科（Leporidae）（ウサギ）重鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000033
配列番号１２２～１４１は、ＩｇＧについてのウサギ科（Leporidae）（ウサギ）軽鎖相補性決定領域である。
Figure 2022512735000034

Claims (60)

  1. 肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与することを含む方法。
  2. 前記肝疾患は、アラジール症候群；アルコール関連肝疾患；アルファ１アンチトリプシン欠損症；自己免疫性肝炎；良性肝腫瘍；胆道閉鎖症；肝硬変；クリグラー－ナジャー症候群；ガラクトース血症；ジルベール症候群；ヘモクロマトーシス；肝性脳症；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；肝腎症候群；妊娠性肝内胆汁うっ滞症（ＩＣＰ）；リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）；肝嚢腫；肝臓がん；新生児黄疸；非アルコール性脂肪性肝疾患；非アルコール性脂肪性肝炎；原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）；原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）；ライ症候群；Ｉ型糖原病；強皮症；およびウィルソン病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＷＩＳＰ１は、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４からなる群から選択されるスプライスバリアントである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項１に記載の方法。
  6. ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記標的細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記標的細胞は、肝星細胞、線維芽細胞、または筋線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記肝星細胞は、静止状態にある、請求項６に記載の方法。
  10. 前記抗体または抗体試薬は、直接注射、静脈内送達、皮下注射、筋肉注射、経皮、経口、または経鼻投与により投与される、請求項１に記載の方法。
  11. ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することであるか、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減させることである、請求項１に記載の方法。
  12. ＷＩＳＰ１の活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく阻害される、請求項１１に記載の方法。
  13. ＷＩＳＰ１のレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく低減される、請求項１１に記載の方法。
  14. ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬および薬学的に許容される担体を含む組成物。
  15. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項１４に記載の組成物。
  17. 肝疾患を治療または予防するために製剤化されている、請求項１４に記載の組成物。
  18. 対象の肝疾患を治療するための方法であって、
    ａ．対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＡｃｔａ２、Ｃｏｌ１ａ１のレベルを検出すること、
    ｂ．（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること、
    ｃ．参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ａｃｔａ２、Ｃｏｌ１ａ１が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること、ならびに
    ｄ．肝疾患を有する前記対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること
    を含む方法。
  19. （ａ）の前に、前記対象から生物学的試料を得ることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、または強皮症である、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記生物学的試料は、血液試料、組織、バフィーコート、血清、または組織である、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項１８に記載の方法。
  24. 肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与することを含む方法。
  25. 前記肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、および強皮症からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＷＩＳＰ１は、ＷＩＳＰ１ｖ、ＷＩＳＰ１ｖｘ、およびＷＩＳＰ１デルタエクソン３～４からなる群から選択されるスプライスバリアントである、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記作用剤は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、または経鼻投与により投与される、請求項２４に記載の方法。
  32. ＷＩＳＰ１の阻害は、ＷＩＳＰ１活性を阻害することであるか、またはＷＩＳＰ１タンパク質レベルを低減させることである、請求項２４に記載の方法。
  33. ＷＩＳＰ１の活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく阻害される、請求項３２に記載の方法。
  34. ＷＩＳＰ１のレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも大きく低減される、請求項３２に記載の方法。
  35. ＷＩＳＰ１は、標的細胞において阻害される、請求項２４に記載の方法。
  36. ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤および薬学的に許容される担体を含む組成物。
  37. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、請求項３７に記載の組成物。
  39. 対象の肝疾患を治療するための方法であって、
    ａ．対象の生物学的試料中のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２のレベルを検出すること、
    ｂ．（ａ）の測定値を参照レベルと比較すること、
    ｃ．参照レベルと比較して（ａ）のＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別すること、ならびに
    ｄ．肝疾患を有する前記対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を投与すること
    を含む方法。
  40. （ａ）の前に、前記対象から生物学的試料を得ることをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記肝疾患は、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、非アルコール性脂肪性肝炎、または強皮症である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記生物学的試料は、血液試料、組織、バフィーコート、血清、または組織である、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項４３に記載の方法。
  47. ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤を発現する遺伝子操作された肝星細胞またはその集団を生成するための方法であって、前記細胞を、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤と接触させること、および前記作用剤の発現を可能にするのに十分な時間にわたって前記細胞を培養することを含む方法。
  48. 前記細胞は、静止状態にある、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記接触は、前記細胞を、作用剤または前記作用剤をコードするベクターと接触させることを含む、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記接触は、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注射、および／またはトランスフェクションを含む、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤は、小分子、抗体または抗体試薬、ペプチド、ゲノム編集系、ウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  52. 前記マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ１５ａまたはｍｉＲＮＡ４１２である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬は、ｍａｂ１６８０、ＡＦ１６８０、ＳＡＢ２５０１１１４、ａｂ６０１１４、およびａｂ６５９４３からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記抗体または抗体試薬のアミノ酸配列は、配列番号１～４、６、または１２～１２０のいずれか１つと少なくとも７０％相同性である、請求項５１に記載の方法。
  55. 請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法により生成される肝星細胞を含む細胞株。
  56. 請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法により生成される肝星細胞またはその集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  57. 肝疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞、請求項５５に記載の細胞株、または請求項５６に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
  58. 対象の線維症を低減するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞、請求項５５に記載の細胞株、または請求項５６に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
  59. 対象の肝疾患を治療するための方法であって、
    ａ．参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ａｃｔａ２、またはＣｏｌ１ａ１が増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること、ならびに
    ｂ．肝疾患を有する前記対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する抗体または抗体試薬を投与すること
    を含む方法。
  60. 対象の肝疾患を治療するための方法であって、
    ａ．参照レベルと比較してＷＩＳＰ１および／またはＹａｐ、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２が増加した対象を、肝疾患を有すると識別するアッセイの結果を受け取ること、ならびに
    ｂ．肝疾患を有する前記対象に、ＷＩＳＰ１を阻害する作用剤試薬を投与すること
    を含む方法。
JP2021521144A 2018-10-19 2019-10-18 肝疾患を治療するための組成物および方法 Pending JP2022512735A (ja)

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