NO180381B - DNA-konstruksjoner inneholdende en Kluyveromyces alfa-faktor ledersekvens for utskillelse av heterologe polypeptider, ekspresjonsvektor og fremgangsmåte til fremstilling av et heterologt polypeptid i gjær - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA-konstruksjoner inneholdende en kluyveromyces alfa-faktor ledersekvens for utskillelse av heterologe polypeptider, ekspresjonsvektor og fremgangsmåte til fremstilling av et heterologt polypeptid i gjær.

U.S. patentnummer 4,546,082 beskriver a-faktor forløpergenet til Saccharomyces cerevisiae og viser DNA-konstruksjoner av S. Cerevisiae ledersekvensen og heterologe gener som er nyttige for den utskillende uttrykkingen av de heterologe genene.

EPA 0 116 201 beskriver en aktuell anvendelse av S. cerevisiae a-faktor ledersekvens for å utskillende uttrykking av human epidermal vekstfaktor i gjær. US patentsøknaden serie nr. 522,909, inngitt august 12, 1983, beskriver anvendelsen av "spacer-fri" S. cerevisiae a-faktor ledersekvenser for å oppnå mere effektiv utskillende uttrykking av heterologe gener.

Science (1985) 229:1212-1224 rapporterer anvendelsen av S. cerevisiae a-faktor sekvenser for å lede utskilling av prochymosin. Det ble rapportert at det meste av det produs-erte prochymosinet var tilstede i en intracellulær uopp-løselig form istedenfor å bli utskilt. Selv om invertase-lederen var mere effektiv i å lede utskilling av aktiverbar prochymosin, var det nødvendig med en omfattende mutant-screen for å tilveiebringe akseptable mengder prochymosin-utskilling.

Det har tidligere ikke vært noen demonstrasjon av produksjon av parings-feromoner (a-faktor og a-faktor) ved K. lactis-celler eller andre Kluyveromyces-spesies. Det at slike peptider ikke er blitt identifisert i K. lactis kan delvis være forårsaket av det faktum at paring i K. lactis er induserbart; mens i S. cerevisiae blir parings-feromonene produsert konstitutivt.

Bortsett fra tilgjengeligheten av de nevnte ledersekvensene for leding av utskillingen av heterologe polypeptider i gjær, er det fortsatt nødvendig med alternative sekvenser som kan tilveiebringe mere effektiv eller mere praktisk produksjon av bestemte polypeptider. Søkerene prøvde dermed å bestemme om en K. lactis a-faktor eksisterer og, hvis den eksisterer, om den vil være nyttig for å lede utskillingen av heterologe polypeptider, såsom prochymosin, i gjær.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer DNA-konstruksjoner basert på Kluyveromyces a-faktor ledersekvensen for å lede utskilling av heterologe polypeptider i gjær. Kluyveromyces transformantene som inneholder disse konstruksjonene tilveiebringer effektiv utskilling av polypeptidene, såsom prochymosin .

Et aspekt av oppfinnelsen er dermed en DNA-konstruksjon som koder for et protein med en aminosyresekvens som omfatter en funksjonell sekresjons-ledende Kluyveromyces a-faktor ledersekvens bundet til en heterolog polypeptidsekvens, et gjærprosesseringssignal for prosessering av nevnte protein til nevnte heterologe polypeptid mellom nevnte ledersekvens og nevnte heterologe polypeptidsekvens og en gjærpromoter ved 5'-enden av nevnte ledersekvens.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er en ekspresjonvektor som innbefatter et replikerende eller integrerende system som er funksjonelt i en gjærvert og en DNA-konstruksjon som koder for et protein med en aminosyresekvens som innbefatter en utskillings-ledende Kluyveromyces a-faktor ledersekvens bundet til en heterolog polypeptidsekvens via et gjærprosesseringssignal for prosessering av nevnte protein til nevnte heterologe polypeptid.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter et replikativt eller integrativt system for å tilveiebringe stabil opprettholdelse i gjær og en DNA konstruksjon som nevnt ovenfor.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å produsere et heterologt polypeptid i gjær innbefattende dyrking av gjær som inneholder ekspresjonsvektoren som ovenfor i et dyrkningsmedium under betingelser hvorved nevnte heterologe polypeptid blir uttrykt og utskilt av nevnte gjær som et "propolypeptid" og polypeptidet blir i hvert fall delvis prosessert til nevnte heterologe polypeptid. Figur 1 viser strategien som blir anvendt for å konstruere oligonukleotidprober som blir anvendt for å identifisere K.lactis a-faktor DNA. Figur 2 er den fullstendige sekvensen til et DNA-fragment som koder for a-faktoren til K. lactis. Figur 3 er en sammenligning mellom proteinsekvensen til K. lactis og S. cerevisiae a-faktorene. Figur 4 er en skjematisk representasjon av K. lactis og S. cerevisiae a-faktorene. Figur 5 er en sammenligning mellom DNA-sekvensene til genene som koder for a-faktorene til K. lactis og S. cerevisiae. Figur 6 er en skjematisk representasjon av tre plasmider og konstruksjonene er beskrevet i detalj i eksemplene. Figur 7 er et reaksjonsskjema som viser binding av DNAet til K. lactis a-faktorlederen til DNAet for prochymosin. Figur 8 representerer sekvensen til pAB309 BamHI/Sall innskudd i pUC18.

Figur 9 er et diagram av plasmid pGB901.

Figur 10 er et diagram av plasmid pGBTeG418.

Figur 11 representerer sekvensene til primerene som blir anvendt for mutagenese av K. lactis a-faktor leder-DNA. Figur 12 representerer DNA-sekvensene rundt forbindelses-punktet i K. lactis a-faktor leder/prochymosin DNA-fusjonene.

I henhold til oppfinnelsen blir gjærceller anvendt for produksjon av modne heterologe polypeptider, hvor slike polypeptider kan bli høstet rett fra et næringsmedium. Polypeptidene blir produsert ved anvendelse av en DNA-konstruksjon som koder for en Kluyveromyces a-faktor ledersekvens og en prosesseringssignalsekvens festet til det heterologe polypeptidet som er av interesse, som kan være et enkelt heterologt polypeptid eller et flertall heterologe polypeptider separert med prosesseringssignalet. Den resulterende konstruksjonen koder for et prepropolypeptid som vil inneholde signalene for utskilling av prepropolypeptidet og prosessering av polypeptidet, enten intracellulært eller ekstracellulært, til det modne polypeptidet.

Konstruksjonene ifølge oppfinnelsen innbefatter en DNA-sekvens med følgende formel som koder for et propolypeptid:

hvori:

X er et kodon for lysin eller arginin

Y er et kodon for arginin;

W er et kodon for alanin eller prolin;

Z er et kodon for en aminosyre, fortrinnsvis et kodon for serin, lysin eller asparagin når W koder for prolin og et kodon for glutaminsyre, asparagin, asparaginsyre, eller serin når W koder for alanin;

Y er et helt tall på minst en eller vanligvis ikke mer enn 10, vanligvis på ikke mer enn fire, for monomerer og multi-merer;

Gen<*> er et gen forskjellig fra villtype Kluyveromyces a-faktor assosiert med ledersekvensen som er fremmed for en gjærvert, vanligvis et plantegen eller et pattedyrgen;

n er 0 eller et helt tall som vanligvis vil variere fra 1 til 8, vanligvis 3 til 7. n er fortrinnsvis 0.

I denne formelen definerer aminosyrene kodet av X, Y, og Z og W a-faktorprosesseringssignalet hvori aminosyrene kodet av X og Y definerer et dipeptidspaltesete og de som blir kodet av Z og W definerer en oligopeptidspacer. Siden n kan være null er spaceren valgfri. Hvis en spacer er tilstede, vil konstruksjonen vanligvis innbefatte tilleggssekvenser som tillater fjerning av N-terminale residier definert ved spaceren for å tilveiebringe det modne proteinet som blir kodet fra gen<*.>

I de fleste tilfeller vil konstruksjonene ifølge oppfinnelsen i det minste ha følgende formel:

som koder for et prepropolypeptid, hvori L er en Kluyveromyces ledersekvens som tilveiebringer utskilling av prepropolypeptidet og de andre symbolene er som definert ovenfor. En hvilken som helst Kluyveromyces ledersekvens kan bli anvendt som tilveiebringer utskilling, og ledersekvenser er generelt på omtrent 20 til 120 aminosyrer, vanligvis omtrent 30 til 100 aminosyrer, med en hydrofob region og med en metionin ved dets N-terminus.

Ledersekvensen, L, kan være en a-faktor ledersekvens med full lengde fra en hvilken som helst spesies for Kluyveromyces, såsom K. lactis og K. fragilis, eller et funksjonelt (dvs. evnen til å lede utskilling) fragment, mutasjon, enten konservativ eller ikke-konservativ, vanligvis ikke mer enn 5, mere vanlig er ikke mer enn 3 forskjellige aminosyrer, eller analoger derav. Funksjonelle fragmenter kan bli identifisert ved å lage konstruksjoner med forskjellige lengder i forhold til villtype sekvensen med full lengde og screene disse for deres evne til å lede utskilling. Gensekvensen for villtype K. lactis a-faktoren er ført opp i figur 2 hvor ledersekvensen er de DNA-kodende aminosyrene 1-83. DNA-sekvensen i figur 2 er ikke essensiell. En hvilken som helst sekvens som koder for en konvensjonell Kluyveromyces leder oligopeptid er tilstrekkelig. Forskjellige sekvenser vil bli translert mere eller mindre effektivt. Helst blir i det minste en hoveddel av de foretrukne gjærkodonene anvendt i sekvensen.

For tilveiebringing av nyttige DNA-sekvenser som kan bli anvendt som kassetter for ekspresjon, kan følgende sekvens bli benyttet:

hvori :

Tr står for en DNA-sekvens som koder for transkripsjonene regulatoriske signaler, spesielt promoteren og slike andre regulatoriske signaler som operatorer, aktivatorer, kapp-signal, eller annen sekvens som er innbefattet med transkripsjonen eller translasjonen kontroll;

d er 0 eller 1, den er 1 når y er større enn 1;

Tr-sekvensen vil generelt være minst omtrent 100 bp og ikke mer enn omtrent 2000 bp. Spesielt nyttig er anvendelse av Tr-sekvensen assosiert med ledersekvensen L, slik at et DNA-fragment kan bli anvendt som innbefatter transkripsjonelle-og translasjonene signalsekvensene som er assosiert med signalsekvensen som er endogen for verten. Man kan alternativt anvende andre transkripsjonene og translasjonene signaler for å tilveiebringe forøket produksjon av ekspresjonsproduktet.

De gjenværende symbolene er blitt definert ovenfor.

3'-terminus til gen<*> kan mye lettere bli manipulert i form av en konstruksjon som tillater innsetting av gen<*> inn i et unikt restriksjonssete i konstruksjonen. En slik foretrukket konstruksjon ville tilveiebringe et restriksjonssete som var i riktig leseramme som initieringskodonet ved innsetting av gen<*> inn i restriksjonssetet. En slik konstruksjon kan bli symbolisert som følger:

hvori:

de symbolene som tidligere er blitt definert av samme def inisj on;

a er 0 eller 1 som innbefatter at konstruksjonen enten har eller så har den ikke transkripsjonene og translasjonene signaler;

SC representerer et stoppkodon;

Te er en transkripsjonen termineringssekvens og kan også innbefatte andre signaler, f.eks. polyadenylering; og b er et helt tall som generelt vil variere fra omtrent 0 til 4, vanligvis fra 0 til 3, det innbefatter at gen<*> kan innbefatte dets egne stoppkodon.

Sekvensen oppstrøms fra gen<*> kan bli konstruert på en slik måte at den tilveiebringer hensiktsmessige restriksjonsseter som tillater at en gitt spesies av gen<*> kan bli erstattet med en annen spesies av gen<*>. Linkere og adaptere kan bli anvendt, om nødvendig, for å tilveiebringe en slik erstat-ning.

Konstruksjonen tilveiebringer en transportabel sekvens for innsetting inn i vektorer, som tilveiebringer det ønskede replikasjonssystem. Som det er blitt vist, kan det i noen tilfeller være ønskelig å erstatte villtypepromoteren assosiert med signal sekvensen med en annen promoter. I gjær kan promotere som er innbefattet med enzymene i den glykoly-tiske veien tilveiebringe høyere transkripsjonene hastig-heter. Disse promoterene er assosiert med slike enzymer som fosfoglukoisomerase, fosfofruktokinase, fosfotrioseisomerase, forsfoglukomutase, enolase, pyruvik-kinase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og alkohol-dehydrogenase. Disse promoterene kan bli satt inn oppstrøms for signalsekvensen. Den 5'-flankerende regionen til ledersekvensen kan bli opprettholdt eller erstattet med 3'-sekvensen til den alternative promoteren. Vektorer kan bli laget og er blitt rapportert som innbefatter promotere som har hensiktsmessige restriksjonsseter nedstrøms for promoteren for innsetting av slike konstruksjoner som beskrevet ovenfor.

Den endelige ekspresjonsvektoren vil innbefatte ekspresjons-kassetten og et replikerende system eller integrerende system som er funksjonelt i gjaerverten og tilveiebringer stabil opprettholdelse i gjaerverten. Vektoren kan eventuelt inneholde et replikasjonssystem som tillater kloning i en prokaryot. I tillegg vil en eller flere markører for selek-sjon bli innbefattet, som tillater selektivt trykk for opprettholdelse i verten. Vektoren kan innbefatte et høyt eller lavt kopiantall, og kopiantallet varierer generelt fra omtrent 1 til 200. Når det gjelder høy-kopi-antall vektorer, vil det generelt være minst 10, fortrinnsvis minst 20, og vanligvis ikke mere enn omtrent 150, vanligvis ikke over omtrent 100, kopiantall. Avhengig av gen<*> kan enten høye eller lave kopiantall være ønskelige, avhengig av effekten av vektoren på verten. Hvor nærvær av ekspresjonsproduktet til vektoren kan ha en ødeleggende effekt på levedyktigheten til verten, kan et lavt kopiantall være tilrådelig.

Forskjellige verter kan bli anvendt, spesielt mutanter som har ønskede egenskaper. En bør merke seg at avhengig av produksjonshastigheten til ekspresjonsproduktet til konstruksjonen, kan det hende at prosesseringsenzymet enten er tilstrekkelig eller ikke er tilstrekkelig for prosessering ved det produksjonsnivået. En mutant som har forsterket produksjon av prosesseringsenzymet (Dipeptidyl Amino Pepti-dase A og/eller lys-arg endopeptidase) kan være nødvendig eller forsterket produksjon av enzymet kan bli tilveiebragt ved anvendelse av en vektor. Produksjonen av enzymet bør generelt være lavere enn produksjonen av det ønskede ekspre-sj onsproduktet.

Det kan alternativt være situasjoner hvor intracellulær prosessering ikke er ønskelig. I denne situasjonen kan det være nyttig å ha en mutant, hvor utskilling oppstår, men hvor produktet ikke "blir prosessert. På denne måten kan produktet deretter bli prosessert in vitro.

Vertsmutanter som tilveiebringer kontrollert regulering av ekspresjonen kan med fordel bli anvendt. For eksempel, når det gjelder konstruksjonen ifølge oppfinnelsen hvor et sammenkoblet protein blir uttrykt, vokser transformantene sakte som et resultat av toksisiteten til det sammenkoblede proteinet. Ved inhibering av ekspresjonen i løpet av veksten, kan verten bli latt vokse til en høy tetthet før betingelsene blir forandret til tillatte betingelser for ekspresjon.

Som tidligere nevnt kan gen<*> ha en mengde sekvenser i tandem, enten de samme sekvensene eller forskjellige sekvenser, med mellomliggende prosesseringssignaler. På denne måten kan produktet bli prosessert helt eller delvis, med det resultat at en vil oppnå de forskjellige sekvensene enten i seg selv eller in tandem for påfølgende prosessering. I mange tilfeller kan det være ønskelig å tilveiebringe forskjellige sekvenser, hvor hver av sekvensene er en subenhet til et bestemt proteinprodukt.

Gen<*> kan kode for et hvilket som helst polypeptid som er av interesse. Polypeptidet kan være så lite som et oligopeptid på 8 aminosyrer eller være på 100.000 daltons eller høyere, vanligvis vil enkeltkjedene være på mindre enn omtrent 300.000 daltons, vanligvis mindre enn omtrent 150.000 daltons. Av spesiell interesse er polypeptider på omtrent 5.000 til 150.000 daltons, spesielt på omtrent 5.000 til 100.000 daltons. Illustrerende polypeptider som er av interesser innbefatter hormoner og faktorer, såsom vekst-hormon, somatomediner, og epidermal vekstfaktor; endokrine utskillinger, såsom luteiniserende hormon, tyroid-stimuler-ende hormon, oksytocin, insulin, vasopressin, renin, kalsi-tonin, folikkelstimulerende hormon, prolaktin osv.; hemato-poietiske faktorer, f.eks. erytropoietin, kolonistimulerende faktor, osv.; lymfokiner; globiner; globuliner, f.eks. immunoglobuliner; albuminer, f.eks. serumalbuminer såsom humant serumalbumin; interferoner, såsom a, p og S; repres-sorer; enzymer, f.eks. chymosin eller dets zymogener, a- og g-amylase, glukoamylase, pullulanase, xylanase, glukos-isomerase, cellulase, lipase, fosfolipase, osv; endorfiner, f.eks. P-endorfin, encefalin, dynorfin, osv.

Når man har fremstilt vektorene som inneholder konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, kan man deretter innføre disse inn i gjaerverten. Slekten og spesies av gjær er ikke kritisk. Eksempler på gjaerverter er Kluyveromyces og Saccharomyces. Innføringsmåten er konvensjonell, da det eksisterer mange forskjellige måter å innføre DNA inn i gjaerverten på. Se for eksempel Hinnen et al., Proe. Acad. Nati. Sei. USA

(1978) 75:1919-1933 eller Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165-1167 eller Stinchcomb et al., EPA 0 045 573. De resulterende transformantene kan deretter bli latt vokse i et egnet næringsmedium, hvor hensiktsmessig selektivt trykk blir opprettholdt på transformantene. Når ekspresjonen er induser-bar, kan man la gjæren vokse til høy tetthet og deretter indusere ekspresjonen. I de tilfellene hvor en vesentlig mengde av produktet kan bli opprettholdt i periplasma-området, kan man frigjøre produktet ved behandling av gjærcellene med et enzym såsom zymolase eller lyticase.

Produktet kan bli høstet på en hvilken som helst hensiktsmessig måte, innbefattende rensing av proteinet ved kromato-grafi, elektroforese, dialyse, oppløsningsmiddel-oppløsnings-middelekstraksjon, osv.

Følgende fremgangsmåte kan bli utført for å tilveiebringe gener som koder for a-faktorene fra Kluyveromyces spesies-stammene forskjellig fra K. lactis-stammen som er eksempli-fisert nedenfor. En radioaktivt merket oligonukleotidprobe som har en av strukturene som er ført opp i figur 1 blir fremstilt og anvendt for å føre spaltinger av genomisk DNA inn i plasmid og å anvende disse plasmidene for å transformere E. coli eller andre bakterielle stammer for å oppnå et plasmid-bibliotek. DNA fra koloniene kan deretter hensiktsmessig bli hybridisert til proben på nitrocellulosefiltrene.

DNA-segmentene identifisert ved hybridisering til probene identifisert ovenfor blir deretter spaltet med forskjellige restriksjonsenzymer og de resulterende fragmentene blir analysert ved Southern blot eller lignende analysemetoder ved anvendelse av de samme hybridiseringsprobene for å identifisere restriksjonsfragmentene med en størrelse som er egnet for DNA-sekvensanalyse. Identifiserte fragmenter blir deretter renset og klonet ved anvendelse av hensiktsmessige vektorer slik at tilstrekkelig DNA kan bli fremstilt for DNA-sekvensanalyse .

Ved anvendelse av disse teknikkene, kan Kluyveromyces a-faktorgener bli tilveiebragt fra stammer som er forskjellige fra de som er spesifikt identifisert heri.

I henhold til hensikten med oppfinnelsen, kan man tilveiebringe utskilling av en mengde forskjellige polypeptider, for å øke produktutbyttet, forenkle rensing, minimalisere degradering av det ønskede produktet og forenkle prosessering, utstyr, og konstruksjonsnødvendigheten. Anvendelse av næringsmidler basert på produktiviteten kan bli forsterket, slik at man oppnår mere økonomisk og mere effektiv produksjon av polypeptidene. Anvendelse av gjær har mange fordeler når det gjelder unngåing av endotoksiner, som kan være tilstede med prokaryoter og anvending av kjente teknikker, som er blitt utviklet for gjær over lengre tid, og teknikkene innbefatter isolering av gjærprodukter.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelser ytterligere.

EKSEMPLER

Identifikasjon og isolasjon av K. lactis a- faktor

Biologiske analyser av kultursupernatanter ble utført som beskrevet Julius et al., Cell (1983) 32:839; ved anvendelse av S. cerevisiae Mat a sst2-3 stamme RC687 som teststamme. K. lactis stamme CBS 141(a) ble latt vokse i et medium bestående av 0, 5% glukose, 0,17$ gjærnitrogenbase uten ammoniumsulfat (Difco), 0,002$ ammoniumsulfat. Etter fjerning av cellene ved sentrifugering, ble eddiksyre tilsatt til kultursupernatanten til en konsentrasjon på 0,1 M og kultursupernatanten ble sendt gjennom en Bio-Rex 70 kolonne (Biorad). Kolonnen ble vasket med 0,1 M eddiksyre, og deretter ble a-faktoren eluert med 80% EtOH/10 mM HC1. Eluatet ble fordampet til tørrhet og deretter løst opp i 0, 1% TFA/20% acetonitril og applisert på en revers-fase HPLC guard-kolonne. Kolonnen ble trinnvis vasket med oppløsninger inneholdende 0, 1% TFA og 20%, 40%, b0% og 80% acetonitril. b0%- fraksjonen, inneholdende a-faktoraktiviteten, ble deretter applisert på en analytisk C-18 HPLC kolonne og eluert med en gradient bestående av 20% til 80% acetonitril i 0, 1% TFA. Fraksjonene ble samlet og analysert for a-faktoraktivitet. Fraksjonene inneholdende a-faktoren ble tørket og utsatt for aminosyresekvensanalyse ved anvendelse av Applied Biosystems gassfase-proteinsekvensator modell 470A koblet til en 120A PTH-analysator-modell.

Hybridisasjonsscreening av plasmidbibliotekene.

Blandinger av oligonukleotider ble merket ved anvendelse av 7 [<32>P]-ATP og T4 polynukleotid-kinase. Disse oligonukleotid-probene ble anvendt for å probe Southern blot eller bakterielle kolonier ved 42° C i den følgende hybridiseringsoppløs-ningen: 4xSSC, 50 mM KH2P04 pH 7, 1% sarkosyl, 10% dekstransulf at, 200 jjg/ml sonikert, denaturert laksesperm DNA. Filtrene ble vasket i 2xSSC, 0, 1% SDS ved 42°C.

Et plasmidbibliotek i kloningsvektoren pJS109 (andre standard kloningsvektorer kan bli anvendt såsom pUC18 og pBR322 istedenfor pJS109), inneholdende innskudd som resulterer fra en begrenset Sau3AI spalting av genomisk DNA fra K. lactis-stamme SD11 (a trpl l_ac4), størrelse-fraksjonert for å rense fragmentene >5000 bp, ble screenet med disse probene ved utsåing av transformantene til E. coli stamme HB101 i en tetthet på 500-2000 kolonier pr. 80 mm skål L-agar inneholdende 100 jag/ml ampicillin. DNA ble overført fra koloniene til nitrocellulosefiltrene og disse filtrene ble hybridisert som beskrevet ovenfor. Områdene på de opprinnelige skålene som korresponderer med områdene med hybridiseringssignalene på filtrene ble plukket og på nytt utsådd og deretter på nytt testet ved hybridisering for å isolere enkelte kolonier med plasmider som inneholder hybridiseringssekvensene. Positive kolonier ble videre testet ved Southern blot analyse av DNA som var renset fra små kulturer.

Plasmider renset fra hybridiseringspositive kolonier ble spaltet med forskjellige restriksjonsenzymer og de resulterende fragmentene ble analysert ved Southern blot analyser ved anvendelse av de samme hybridiseringsprobene for å identifisere restriksjonsfragmentene med størrelser som egner seg for DNA-sekvensanalyse. Fragmentene som dermed ble identifiserte ble renset ved agarosegelelektroforese og klonet inn i hensiktsmessige MP18 og MP19 vektorer og DNA-sekvensanalyse ble utført.

Chymosinanalvser av kultursupernatantene

Cellene ble fjernet fra kulturene ved sentrifugering og de resulterende supernatantene ble surgjort til pH 2 ved tilsetting av 1 M H2SO4 og inkubert i 2 timer ved romtempera-tur. Oppløsningene ble deretter nøytralisert til pH 6 ved tilsetting av 2 M Tris base. Et volum på 50 pl av den hensiktsmessige fortynningen ble tilsatt til 200 pl av en suspensjon av 12% ikke-fet tørrmelk i 10 mM CaCl2 og inkubert ved 37°C helt til en klump ble dannet. En enhet chymosin-aktivitet er definert som mengden av aktivt chymosin som er nødvendig for å produsere en klump i løpet av 10 min. under disse betingelsene.

Resultater

De første 10 aminosyrene til K. lactis a-faktoren viste en bestemt homologi til den fra S. cerevisiae, med 6 identiske residier. Denne sekvensen er vist nedenfor:

Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln.

Denne proteinsekvensen ble anvendt for å konstruere et sett av oligonukleotider avledet til å være komplementær til det strukturelle genet som vist i figur 1. Oligonukleotider innbefattende alle mulige kodoner for et segment til a-faktor peptidet ble syntetisert som to grupperinger på 96 og 48 forskjellige molekyler.

Disse to grupperingene ble merket radioaktivt ved anvendelse av "y-[<32>P]-ATP og T4 polynukleotid-kinase og hver av disse ble anvendt for å probe et Southern blot av en restriksjons-spalting av K. lactis DNA. Gruppering 2 viste seg å tilveiebringe sterk hybridisering til et enkelt fragment i flere forskjellige spaltinger. Gruppering 2 ble dermed valgt for å screene plasmidbiblioteker av K. lactis genomt DNA.

Anvendelse av disse probene for å screene plasmidbibliotekene resulterte i isolasjon av et antall hybridiseringskloner. DNA-sekvensanalyse av en av disse klonene, afkl8b, viste at denne koder for et a-faktor-relatert peptid som ligner veldig mye på forløperen til S. cerevisiae a-faktor-peptidet. Det hybridiserende segmentet viste seg å være på et Pstl-EcoRI fragment på omtrent 1000 bp. Sekvensen av dette fragmentet er vist i figur 2.

Sammenligning av de avledete a-faktor forløperne til dette fragmentet er vist i figurene 3 og 4. Disse viser at de har ledersekvenser (aminosyrene 1-83 i figur 3) med identisk lengde med betraktelig sekvenshomologi. K. lactis forløperen inneholder derimot bare to seter for tilsetting av N-bundete karbohydratkjeder (figur 4). Spacerene til K. lactis repeterende sekvensene er i tillegg lengre enn de repeterende sekvensene til S. cerevisiae og viser en mere uensartet sekvens med X-Ala/Pro mønsteret istedenfor Glu/Asp-Ala sekvensene som finnes i S. cerevisiae. En sammenligning av DNA-sekvensene (figur 5) viser også en sterk grad av homologi i den kodende regionen.

En serie plasmider som er vist i figur 6 ble konstruert for å tilveiebrigne en fusjon av K. lactis a-faktor lederen til prochymosin uttrykt under transkripsjonen kontroll av en sterk promoter. Først ble et 673 bp SspI-EcoRI fragment fra afkl8b modifisert ved fylling av EcoRI overhenget med Klenow-enzym og tilsetting av Bglll-linkere til de butte endene. Dette fragmentet ble deretter satt inn i Bglll-setet som knytter promoteren og terminatorregionene til S. cerevisiae glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenasegenet (GAP) sammen. Denne kassetten ble klonet som et BamHI-fragment i pUC18, resulterende i pAB 307.

Fusjon av sekvensene som koder for a-lederen og bovint prochymosin ble deretter utført. Først ble pAB307 spaltet med Ncol og de kohesive endene ble gjort butte ved behandling med mungbønne-nuklease. Det resulterende produktet ble deretter spaltet med Sali. Til denne ble et EcoRV-Sall fragment på 2000 bp ligert (sekvensene vist i figur 7 og 8) inneholdende sekvenser som koder for prochymosin og S. cerevisiae GAP transkripsjonen termineringsregion. Dette fragmentet var avledet fra plasmid pJSlll hvori en Xbal-BamHI-adaptor var blitt satt til 5'-enden av et fragment inneholdende prochymosin cDNA festet til S. cerevisiae GAP transkripsjonen termineringsregion. Denne ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli stamme HB101 og en transformant som inneholder pAB309 ble isolert. Sekvensene rundt forbindelses-punktet til denne fusjonen er vist i figur 7, og sekvensen til hele BamHI-Sall innskuddet til pAB309 er vist i figur 8.

For å tillate transformering av K. lactis-stammene, ble et 3560 bp Hindlll fragment inneholdende E. coli kanamycin-resistensgen under transkripsjonen kontroll av S. cerevisae ADH1 promoteren satt inn innenfor 3'-regionen til K. lactis LAC4-genet satt inn i pAB309 for å tilveiebringe plasmid pAB312. Screening for innskuddet ble tilveiebragt ved restriksjonsspaltingsanalyse og undersøkt for riktig orient-ering.

3560 bp HindIII-fragmentet var avledet fra plasmid pGB901, og et diagram er vist i figur 9. Plasmid pGB901 ble konstruert ved ligering av (1) 3,6 kb Xbal-HaelI-fragment inneholdende laktasepromoteren til omtrent posisjon -90 fra laktase ATG-startkodonet isolert fra pUCla56 (beskrevet nedenfor), (2) et Haell-Sall-fragment med følgende nukleotidsekvens:

(3) et 5,1 kb SalI-Xbal-fragment som koder for prochymosin og et gen som utviser resistens mot antibiotika G418 fra pGB900 (beskrevet nedenfor), og (4) pUC19 spaltet med Xbal.

I løpet av konstruksjonen av plasmidet ble CG-sekvensen fjernet fra Haell-setet, og dannet dermed et Hindlll-sete ved denne posisjonen.

Plasmid pUCla56 ble konstruert som følger. Kromosomalt DNA ble isolert fra K. lactis-stamme CBS 2360, spaltet med Xhol, og separert i henhold til størrelse på en sukrosegradient. Fraksjoner som inneholdt laktasegenet ble detektert med en LAC4-probe etter applisering av DNAet på et nitrocellulose-filter. DNA som inneholdt LAC4-genet ble klonet inn i Xhol-setet til plasmid pPA153-215 (P.M. Andreoli, Mol. Gen. Genet.

(1985) 199:372-380). Dette tilveiebragte plasmid pPA31. Et Xbal-fragment fra pPA31 inneholdende laktasegenet ble subklonet inn i Xbal-setet til pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103-119) som tilveiebringer plasmid pUCla56.

Plasmid pGB900 ble konstruert ved ligering av (1) et 3,6 kb Hindlll-Xbal-fragment fra plasmid pGBTeG418 (vist i figur 10 og beskrevet nedenfor) inneholdende det G418 resistensgenet og (2) et Sal I-Hindi11-fragment fra plasmid pGB123 inneholdende prochymosingenet i pUC19 spaltet med Sali og Xbal. Plasmid pGB123 er beskrevet i Europa patentsøknad EPA 0 096 430.

Plasmid pGBTeG418 (figur 10) består av plasmid pPA215 som beskrevet av Andreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:372-380) og et 5,6 kb fragment bestående av det 3,7 kb BamHI K. lactis laktase-terminator-fragmentet (Breunig et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:2327-2341) og Tn5-genet (Reiss et al., EMBO J.

(1984) 3:3317-3322) som medfører resistens til G418 under ledelse av promoter alkohol-dehydrogenase I (ADHI) fra gjær, slik som det som er beskrevet av Bennetzen og Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257:3018-3025). Plasmid pGBTeG418 ble deponert til CBS i februar 26, 1987 under nummer CBS 184.87.

Plasmid pAB312 ble spaltet med EcoRV (for å tilveiebringe integrering til LAC4-regionen til K. lactis-genomet) og ble deretter anvendt for å transformere K. lactis-stamme 2UV21 (a ura3 trpl Iac4 [kil_°_] ) til G418 resistens ved anvendelse av LiCl-teknikken beskrevet av Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165-1167).

Et antall av disse transformantene, samt en ikke-transformert kontrollstamme, ble latt vokse i 36 t i 1 ml medium bestående av 1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose, 0, 17% gjærnitrogenbase, 50 pg/ml tryptofan og 50% pg/ml uracil. Kultursupernatantene ble deretter analysert for chymosin-aktivitet etter syreaktivering. Alle transformantene viste seg å skille ut mellom 100 og 120 enheter/ml aktiverbar chymosin.

Fjerning av spacer- kodoner ved in vitro mutagenese

Et 1900 bp Sacl-Hindlll fragment ble isolert fra pAB309 og klonet inn i MP19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103). Enkelt-trådet fag DNA ble fremstilt og anvendt som templat for in vitro mutagenese med oligonukleotidprimerne vist i figur 11. M13 fag MP19/akll.5 og MP19/akl2.2 ble preparert ved anvendelse av Primer #1 og Primer #2, respek-tivt .

Dobbelttrådet RF DNA ble preparert fra disse fagene, og 1100 bp SacI-StuI-fragmenter ble isolert fra hver. Disse fragmentene ble ligert til et 7100 bp SacI-Stul-fragment fra pAB312. De resulterende plasmidene pAB313 og pAB314 ble isolert med de sekvensforandringene som er illustrert i figur 12.

Plasmidene pAB313 og pAB314 ble anvendt for å transformere stammen 2UV21 til G418-resistens. Kulturene av transformantene 2UV21::pAB312, 2UV21::pAB313 og 2UV21::pAB314 ble dyrket og kultursupernatantene ble analysert for chymosinaktivitet som ovenfor. Resultatene av disse analysene er rapportert i tabell 1, nedenfor.

Hver av transformantene viste seg å utskille et enkelt prochymosin-relatert spesies bestemt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese av trikloreddiksyre-utfelte kultursupernatanter. Prochymosin-relatert protein utskilt av pAB312 transformantene viste seg å ha en noe høyere molekylvekt enn de som ble utskilt fra pAB313 og pAB314 transformantene bestemt ut i fra den elektroforetiske mobiliteten.

Celle-pelletene fra stammene ovenfor ble analysert for chymosin-aktivitet og ble funnet å inneholde mindre enn 2% av aktiviteten som ble målt i supernatantene. Kluyveromyces a-faktoren er omtrent 98% effektiv når det gjelder leding av utskillingen av prochymosin fra Kluyveromyces lactis.

Hovedspesies utskilt fra KRN303-1 og KRN304-4 ble renset ved preparativ SDS-polyakrylamidgelelektroforese og utsatt for gassfase-aminosyresekvensanalyse. N-terminalsekvensene til disse spesies er gitt nedenfor:

Disse resultatene indikerer at prochymosin-relaterte spesies utskilt fra KRN303-1 ikke har vært utsatt for noen prosessering av den amino-terminale spacer-sekvensen, mens spesies utskilt fra KRN304-4 har den autentiske modne prochymosin-aminoterminus.

Følgende organismer ble deponert til American Type Culture Collection 30. juni, 1987: HB101 pAB307, ATCC aksesjonsnr. 67454; HB101 pAB312, ATCC aksesjonsnr. 67455.

Claims (18)

1. DNA-konstruksjon, karakterisert ved at den koder for et protein med en aminosyresekvens som omfatter en funksjonell sekresjons-ledende Kluyveromyces a-faktor ledersekvens bundet til en heterolog polypeptidsekvens, et gjærprosesseringssignal for prosessering av nevnte protein til nevnte heterologe polypeptid mellom nevnte ledersekvens og nevnte heterologe polypeptidsekvens og en gjaerpromoter ved 5'-enden av nevnte ledersekvens.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved a t nevnte ledersekvens er full-lengde ledersekvensen til villtype Klu<y>verom<y>ces a-faktor.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte ledersekvens er ledersekvensen vist i figur 2.

4. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte ledersekvens er et funksjonelt fragment av full-lengde ledersekvensen til villtype Kluyveromyces a-faktor.

5 . DNA-sekvens ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte full-lengde sekvens er ledersekvensen vist i figur 2.

6. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte Kluyveromyces a-faktor ledersekvens er en Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens.

7 . DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at gjærprosesseringssignalet omfatter et basisk dipeptid spaltingssete og en spacer.

8. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at gjærprosesseringssignalet innbefatter et basisk dipeptid spaltingssete som er direkte bundet til N-terminus til nevnte heterologe polypeptid og mangler en spacer.

9. DNA-sekvens ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at nevnte basiske dipeptid spaltingssete omfatter minst en arginin.

10. DNA-sekvens ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte basiske dipeptid spaltningssete er lysin-arginin eller arginin-arginin.

11. DNA-konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte gjærpromoter er en a-faktor promoter eller en GAP promoter, i det nevnte Kluyveromyces a-faktor ledersekvens er en Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens, og nevnte Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens er koblet til nevnte heterologe polypeptidsekvens via et gjærprosesseringssignal som omfatter et lycin-arginin spaltningssete og en spacer.

12. DNA-konstruksjon ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte heterologe polypeptid er prochymosin.

13. DNA-konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte gjærpromoter er en a-faktor promoter eller en GAP promoter, nevnte Kluyveromyces a-faktor ledersekvens er en Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens og nevnte Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens er koblet til nevnte heterologe polypeptid sekvens via et gjærprosesseringssignal som innbefatter et. lysin-arginin spaltningssete koblet direkte til nevnte heterologe polypeptid og mangler en spacer.

14. DNA-konstruksjon ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte heterologe polypeptid er prochymosin.

15. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter et replikativt eller integrativt system for å tilveiebringe stabil opprettholdelse i gjær og en DNA-konstruksjon i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 14.

16. Fremgangsmåte til fremstilling av et heterologt polypeptid i gjær, karakterisert ved at den omfatter: dyrking av gjær inneholdende en ekspresjonsvektor ifølge krav 15 i dyrkningsmedium under betingelser hvorved nevnte heterologe polypeptid blir uttrykt i og utskilt av nevnte gjær som et pro-polypeptid som i det minste blir delvis prosessert til nevnte heterologe polypeptid.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt polypeptid i gjær ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte heterologe polypeptid blir utskilt under ledelse av en Kluyveromyces a-faktor ledersekvens.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16 og 17, karakterisert ved at nevnte Kluyveromyces a-faktor ledersekvens er en Kluyveromyces lactis a-faktor ledersekvens.