PT88115B - Processo para a preparacao de construcoes de adn que contem uma sequencia guia do factor de kluyveromyces, de vectores de expressao que contem estas construcoes e de polipeptideos codificados por este adn - Google Patents

Processo para a preparacao de construcoes de adn que contem uma sequencia guia do factor de kluyveromyces, de vectores de expressao que contem estas construcoes e de polipeptideos codificados por este adn Download PDF

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Description

A presente invenção pertence ao domínio da tecnologia do ADN recombinante. Mais concretamente relacio
- 1 7S3X2ÊÍ— na-se com a utilização de sequências guia do factor α de Kluyveromyces para dirigir a secreção de polipeptídeos heterólogos em levedura.
Antecedentes
A patente Norte-Smericana n9 546 082 descreve o gene percursor do factor α de Saccharomyces cerevisiae e pretende mostrar construções de ADN da sequência guia de S. cerevisiae e genes heterólogos que são úteis para expressão secretória dos genes heterólogos.
A EPA 0 116 201 descreve o uso efectivo da sequência guia do factor α de S. cerevisiae para se obter a expressão secretória do factor de crescimento da epiderme humana em leveduras. 0 pedido de Patente Norte-Americana requerido simultaneamente com o N9 de série 522 909 depositado em 12 de Agosto de 1983, descreve o uso de sequências guia do factor a. de S. cerevisiae sem espaçador para se obter uma expressão secretória mais eficiente de genesheterólogos.
Em Science (1985) 229 : 1219-1224 descreve-se o uso de sequências do factor a de S. cerevisiae para dirigir a secreção de proquimosina. Foi relatado que a maior parte da proquimosina produzida estava presente numa forma insolúvel intracelular em vez de ser segregada. Apesar de o guia de invertase ser mais eficiente em dirigir a secre ção de proquimosina activável, era necessária uma extensa selecção de mutantes a fim de produzir quantidades razoáveis de secreção de proquimosina.
Não tem havido nenhuma demonstração prévia da produção de feromonas de acasalamento (factor a e factor a) por células de K. lactis ou de outras espécies de Kluyveromyces. Egta impossibilidade de identificar estes peptideos em K. lactis pode ser devida em parte ao facto de que o acasalamento em K. lectis é inductível, enquanto que em S. cerevislae as feromonas de acasalamento são produzidas constitutivamente.
Não obstante a disponibilidade das sequências guia acima mencionadas para dirigir a secreção de polipeptideos heterólogos em levedura, continua a haver necessidade de sequências alternativas que possam fornecer uma produção mais eficiente ou mais prática de polipeptídeos específicos. Eeste modo, os requerentes procuraram determinar se existe um factor 4/ de K. lactis e, no caso de existir, se pode ser útil para dirigir secreções de polipeptídeos heterólogos, como por exemplo de proquimosina, em leveduras.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a construcções de ADN baseadas na sequência guia do factor de Kluyveromlces para dirigir a secreção de polipeptídeo heterólogos em levedura. Os transformantes de Kluyverom.yces que contém essas construcções proporcionam uma secreção eficiente de polipeptideos, tais como e proquimosina.
Deste modo, um aspecto da presente invenção é ums construcção de ADN que codifica para uma proteína cuja sequência de ácidos aminados compreende uma sequência guia do factorg^de Kluyverotnyces que dirige a secreção ligada a uma sequência polipeptidica heteróloga por meio de sinais de processamento de levedura para o processamento da referida protèina no polipeptídeo heterólogo.
Outro aspecto da presente invenção é um vector de expressão que contém um sistema de replicação ou de integração funcional numa levedura hospedeira e uma construcção de ADN que codifica para uma proteína cuja sequência de ácidos aminados compreende uma sequência guia do factor de Kluyveromyces que dirige para a secreção
- 5 ligada a uma sequência de polipeptideos heteróiogos por meio de um sinal de processamento de levedura para o processamento da referida proteína no referido polipeptideo heterólogo.
Ainda outro aspecto da presente invenção consiste num processo para a produção de um polipeptídeo heterólogo em levedura compreendendo a cultura de leveduras que contém o vector de expressão conforme indicado acima em meio de cultura sob condições em que o referido polipeptideo heterólogo é expresso em e segregado pela referida levedura sob a forma de propolipeptídeo e o polipeptideo é, pelo menos, parcialmente processado no referido polipeptideo heterólogo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra a estratégia utilizada pera a criação de sondas oligonucleótidicas utilizadas para identificação do ADN do factor de K. lactis.
A Figura 2 é a sequência completa de um fragmento de ADN que codifica para o factor de K. lactis.
A Figura 5 é uma comparação da sequência proteica dos factores CZ- de K« lactis e de S. cerevisisa
A Figura 4 é uma representação esquemática dos factores de K. lactis e de S. cerevisiae.
A Figura 5 é uma comparação das sequências de ADN de genes que codificam para os factores CZz de K. lactis e de S. cerevisiae.
A Figura 6 é uma representação esquemática de três plasmídeos cujas construcções são descritas
em pormenor noa exemplos.
A Figura 7 é um esquema de reacção que mostra o modo de ligação do ADN para o guia do factor de K. iacti s ao ADN para a proquimosina.
A Figura 8 representa a sequência da inserção Bam HI / Sal 1 de pAB3O9 em pUC18.
A Figura 9 é um diagrama do plasmídeo
PGB901.
A Figura 10 é um diagrama do plasmídeo pGBT e G4-18.
A Figura 11 representa as sequências dos iniciadores utilizados para mutagénese do ADN do guia do factor de K. lactis.
A Figura 12 representa as sequências de ADN adjacentes às junções nas fusões guia do factor de de K.lactis / ADN de proquimosina.
DESCRIÇÃO DOS MODOS ESPECÍFICOS DE CONCRETIZAÇÃO
De acordo com a presente invenção, utilizam-se células de levedura para a produção de polipeptídeos heterologos maduros, podendo estes polipeptídeos ser isolados directamente a partir de um meio nutriente. Os polipeptídeos são produzidos por meio da utilização de uma construcção de ADN que codifica para um guia do factor cc/ de Kluyveromyces e de uma sequência de sinal de processamento ligada ao polipeptídeo heterólogo de interesse, o qual pode ser um polipeptídeo heterólogo simples ou uma pluralidade de polipeptídeos heterólogos separados por sinais de processamento. A construção resultante codifica para um prepropolipeptídeo, o qual conterá os sinais para secreção
- 5 do prepropoliptídeo e para processamento do polipeptídeo, quer de forma intracelular quer de forma extracelular, para dar o polipeptídeo maduro.
As construcções da presente invenção compreenderão uma sequência de ADN que possui a seguinte fórmula que codifica para um propolipeptídeo:
(XY-(ZW)n-Gene*)y em que:
X é um codão para lisina ou arginina;
Y é um codão para arginina;
W é um codão para alanina ou prolina;
Z é um codão para um ácido aminado, de preferência um codão para serina, lisina ou asparagina quando W codifica para prolina, e um codão para ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico ou serina quando W codifica para alanina;
Y é um número inteiro com o valor de pelo menos um e, normalmente, não mais de 10, mais normalmente não mais de quatro, correspondendo a monómeros e a multímeros:
Gene é um gene diferente do gene do factor de Kluyveromyces de tipo selvagem, associado com a sequência guia que é estranha a uma levedura hospedeira, normal mente um gene de uma planta ou de mamífero;
n é 0 ou um número inteiro variando geralmente de 1 a 8, normalmente de 3 a 7· Le preferência n ó 0.
Nesta fórmula os ácidos aminados codifi cados por X, Y, Z e W definem o sinal de processamento do factor Cny no qual os ácidos aminados codificados por X e Y definem um ponto de cisão de dipeptídeo e os codificados por Z e W definem um espaçador olipeptídico. Como indicado pelo facto de que n pode ser zero, o espaçador é opcional. Se estiver presente um espaçador, a construção incluirá normalmente sequências adicionais que permitem a remoção de resíduos de N-terminais definidos pelo espaçador para dar origem à proteína madura codificada pelo Gene*.
Na sua maior parte, as construcções da presente invenção terão, pelo menos, a fórmula seguinte:
L-(XY-(ZW)n-Gene*)y codificando para um prepropolipeptídeo, em que L é uma sequência guia de Kluyveromyces que proporciona a secreção do prepropolipeptídeo e os outros símbolos possuem os significados definidos anteriormente. Pode utilizar-se qualquer sequência guia de Kluyveromyces que proporcione a secreção, sendo as sequências guia geralmente de cerca de 20 a 120 ácidos aminados, normalmente cerca de 30 a 100 ácidos aminados, possuindo uma região hidrofóbica e possuindo uma metionina na sua extremidade N-terminal·.
A sequência guia, L, pode ser uma sequência guia de factor integral de qualquer espécie de Kluyveromyces, como por exemplo de K. lactia e de K, fragilis, ou um fragmento funcional (isto é, capaz de dirigir a secreção, uma mutação quer conservativa quer não conservativa, normalmente com não mais do que 5 ácidos aminados diferentes, mais normalmente não mais do que 3, ou análogos. 5! possível identificar fragmentos funcionais po£ preparação de construcções com vários comprimentos da sequência do tipo selvagem integral e selecção pela sua capacidade para dirigir a secreção. A sequência genética para ao factor CL/ de K. lactis de tipo selvagem é apresenta da na Pigura 2, sendo a sequência guia o ADN que codifica para os ácidos aminados 1-83. A sequência de ADN da Pigura 2 não é essencial. Qualquer sequência que codifica para um oligopeptídeo guia de Klyveromyces é suficiente. Sequências diferentes serão mais ou menos eficientemente traduzidas.
- 7 s
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De preferência são utilizados na sequência pelo menos uma maioria de codões preferidos de fermento.
Na obtenção de sequências de ADN úteis para utilização como blocos integrados (cassetes) pa ra expressão, pode empregar-se de modo conveniente a seguinte sequência;
Tr-L-(XY-(ZW)n-(Gene*)d)y em que:
Tr significa uma sequência de ADN que codifica para os sinais de regulação da transcrição, particularmente o promotor e os outros sinais de regulação, como operadores, activadores. sinal de cobertura ou outras sequências envolvidas na regulação da transcrição ou da tradução;
d é 0 ou 1, sendo 1 quando Y é maior do que 1;
A sequência Tr terá em geral pelo menos cerca de 100 Pb e não mais do que cerca de 2000 pb. E particularmente útil o emprego da sequência Tr associada com a sequência guia L, de tal modo que pode ser utilizado um fragmento de ADN que inclua as sequências de sinal de transcrição e de tradução associadas com a séquência de sinal endógena ao hospedeiro. Em alternativa, é possível utilizar outros sinais de transcrição e de tradução a fim de possibilitar uma produção mais elevada do produto da expressão,
Os restantes símbolos foram definidos anteriormente.
A extremidade 3'-terminal do Gene* pode ser manipulada muito mais facilmente sob a forma duma construcção que permite a inserção do Gene num local de restrição singular na conrstrução. Esta construção preferida
proporcionará um local de restrição com a inserção do Gene no local de restrição em concordância de quadro com o codão de início. Esta construção pode ser simbolizada como se segue:
(Tr)a-L-XY-(ZW)n-(SC)b-Te em que:
os símbolos anteriormente definidos tem o mesmo significado;
a é 0 ou 1, significando que a construção pode ter ou não os sinais de transcrição e de tradução;
SC representa um codão de paragem;
Te é uma sequência de terminação de transcrição e pode incluir outros sinais, por exemplo um sinal de poliadenilação; e b é um número inteiro que em geral variará desde cerca de 0 até 4, mais habitualmente desde 0 a 3, devendo compreender-se que o Gene pode incluir o seu próprio codão de paragem.
A sequência a montante do Gene pode ser projectada a fim de proporcionar locais de restrição convenientes a fim de permitir que uma dada espécie do Gene seja substituida por outra espécie do Gene . Para esta substituição podem utilizar-se ligantes e adaptadores.
A construção proporciona uma sequência móvel para inserção em vectores que proporcionam o sistema de replicação pretendido. Conforme já indicado, em alguns casos pode ser conveniente substituir o promotor de tipo selvagem associado com a sequência de sinal por um pro- 9 motor diferente. Em leveduras os promotores envolvidos com enzimas na via glicolitica podem proporcionar altas taxas de transcrição. Estes promotores estão associados com enzimas como fosfoglucoisomerase, fosfofrutoquinase. isomerase de fosfotriose, fosfoglucomutase, enolase, quinase, pirúvica, deidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato e deidrogenase de álcool·,, Estes promotores podem ser inseridos a montante da sequência de sinal. A região 5’ adjacente à sequência guie pode ser conservada ou pode ser substituida com a sequência 3' do promotor alternativo. Podem preparaa?-se vectores e encontram-se descrições que incluem promotores com locais de reatrição convenientes a juzante do promotor para inserção destas construções, conforme descrito anteriormente.
vector de expressão final conterá um bloco integrado de expressão e um sistema replicativo ou integrativo que é funcional na levedura hospedeira e proporciona uma manutenção estável nesta levedura. Opcional mente o vector pode conter um sistema de replicação que permite a clonagem num procarionte. Além disso, pode incluir-se um ou vários marcadores para selecção, os quais permitirão uma pressão de selecção para manutenção no hospedeiro. Além disso, o vector pode ser um vector de alto ou de baixo número de cópias, sendo o número de cópias em geral de 1 a 200. Com vectores de alto número de cópias, o número de cópias será pelo menos 10, de preferência pelo menos 20 e nor malmente não mais do que 150, mais normalmente não mais do que 100. Conforme o Gene , pode ser desejável usar um número de cópias alto ou baixo, de acordo com o efeito do vector no hospedeiro. Quando a presença do produto da expressão do vector pode ter um efeito prejudicial sobre a viabilidade do hospedeiro, pode ser mais indicado um número de cópias reduzido.
Podem utilizar-se vários hospedeiros, particularmente mutantes com as propriedades desejadas. Deverá notar-se que, conforme a taxa de produção do produto de expressão da construção, a enzima de processamento pode
ser adequada ou não para o processamento a este nível de produção. Por conseguinte, pode ser conveniente um mutante | com produção melhorada da enzima de processamento (dipepti- dil-amino-peptidase A e/ou a endopeptidase de lys-arg) ou pode proporcionar-se uma produção mais elevada da enzima por meio de um vector. Geralmente, a produção da enzima deverá ser de uma ordem mais baixa do que a produção do produto de expressão desejado.
Sm alternativa, podem ocorrer situações em que não é pretendido o processamento intracelular. Nesta situação, será útil ter um mutante em que ocorra secreção mas o produto não é processado. Deste modo, o produto pode ser subsequentemente processado in vitro.
!
Os mutantes hospedeiros que proporcionam uma regulação da expressão comandada podem ser utilizados com vantagem. Por exemplo, com as construções da presente invenção com expressão de uma proteína de fusão, os transformantes tem um crescimento lento que parece ser resultante da toxicidade da proteína de fusão. Deste modo, inibindo a expressão durante o crescimento, é possível cultivar o hospedeiro até uma alta densidade antes de alterar as condições para condições permissivas da expressão.
Para além disso, conforme já indicado, o Gene pode ter uma phralidade de sequências em série, sejam sequências iguais ou diferentes, com intervenção de sinais de processamento. Deste modo, o produto pode ser processado integralmente ou em parte, com o resultado de que as sequências serão obtidas separadamente ou em série para processamento subsequente. Em muitas situações pode ser desejável proporcionar diferentes sequências, sendo cada sequência uma subunidade de um produto proteico particular.
Gene pode codificar para qualquer tipo de polipeptídeo de interesse. 0 polipeptídeo pode ter
apenas a dimensão de um oligopeptídeo de 8 ácidos aminados ou pode ter 100 000 Daltons ou mais. Normalmente, aa cadeias simples terão menos do que cerca de 300 000 Daltons e mais habitualmente menos do que cerca de 150 000 Daltons. São de interesse particular os polipeptídeos de cerca de 5 000 a 150 000 Daltons, mais particularmente de cerca de 5 000 a 100 000 Daltons. Polipeptídeos de interesse incluem, por exemplo, hormonas e factores, tais como hormona de crescimento, somatomedinas e factor de crescimento epidérmico; secreções endócrinas, tais como hormona de luteinização, hormona de estimulação da tiróide, oxitocina, insulina, vasopressina, renina, calcitonina, hormona de estimulação dos folículos, prolactina, etc., factores hematopoiéticos, por exemplo eritropoietina, factor de estimulação de colónias, etc.? linfoquinas; globinas; globúlinas, por exemplo imunoglobulinas; albuminas, por exemplo albuminas do soro tais como albumina do soro humano; interferões, tais como α, β e <§ ; repressores; enzimas, por exemplo quimosina ou os seus zimogénios, a e β-amilase, glucoamilase, pululanase, xilanase, isômeros de glucose, celulose, lipase, fosfolipase, etc.; endorfinas, por exemplo β-endorfina, encefalina, dinorfina, etc..
Uma vez prepardos os vectores que contem as construções de acordo com a presente invenção, estes podem ser introduzidos na levedura hospedeira. O género e a espécie da levedura não são críticos. Exemplos de leveduras hospedeiras são Kluyveromyces e Saccharomyces. O modo de introdução é convencional, havendo uma ampla variedade de maneiras de introdução de ADN na levedura hospedeira. Ver, por exemplo, Hinnen et al., Proc. Acad. Natl. Sei. USA (1978) 75; 1919-1933 ou Das et al.. J. Facteriol, (1984) 158: 1165-1167 ou Stinchcomb et al., EPA O 045 573. Os transformantes resultantes podem então ser cultivados num meio nutriente apropriado, mantendo uma pressão de selecção sobre os transformantes. Quando a expressão é inductível, pode-se deixar crescer a levedura até uma densidade elevada e em seguida in12 duzir a expressão. Nas situações em que uma proporção substancial do produto pode ser conservada no espaço periplásmico, é possível provocar a libertação do produto por tratamento das células de levedura com uma enzima, como seja zimolase ou liticase.
O produto pode ser separado por qualquer método conveniente, incluindo a purificação da proteína por cromatografia, electroforese, diálise, extracção solvente-solvente, etc..
A fim de se obterem genes que codificam para factores α de estirpes de espécies de Kluyveromyces diferentes da estirpe de K.lactis exemplificada anteriormente pode seguir-se o procedimento seguinte. Prepara-se uma sonda oligonucleotídica com uma marcação radioactiva com qualquer das estruturas apresentadas na Figura 1 e usa-se esta sonda para sondar produtos da digestão de ADN genómico da outra estirpe. Em alternativa, pode utilizar-se para sonda um fragmento com uma translacção de encaixe do gene do factor α de S. cerevisiae. lima técnica útil consiste em inserir segmentos do produto da digestão limitada de ADN genónico com uma endonuclease num plasmídeo e na utilização destes plasmídeos para transformar E. coll ou outra estirpe bacteriana a fim de se obter um banco de plasmídeos. 0 ADN das colónias pode então ser convenientemente hibridado com a sonda em filtros de nitrocelulose.
Os segmentos de ADN identificados por hidrididação com as sondas identificadas anteriormente são então digeridos com várias enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são analizados pelo método de mancha de Southern ou por um método de análise similar usando as mesmas sondas de hibridação a fim de identificar fragmentos de restrição de uma dimensão adequada para análise de sequência de ADN. Os fragmentos identificados são então purificados e clonados usando vectores apropriados a fim de se poder preparar ADN suficiente para uma análise de sequência de ADN.
Usando estas técnicas é possível obter-se genes do factor a de Kluyveromyces a partir de estirpes diferentês das especificamente identificadas na presente memória descritiva.
De acordo com a presente invenção, é possível conseguir a secreção de uma ampla variedade de poliDeptídeos melhorando consideravelmente o rendimento no produto, simplificando a purificação, minimizando a degradação do produto pretendido e simplificando o processamento, o equipamento e as necessidades técnicas. Para além disso, a utilização dos nutrientes baseada na produtividade pode ser consideravelmente melhorada de modo que se torna possível conseguir uma produção mais económica e mais eficiente dos polipeptídeos. A utilização de leveduras tem, além disso, muitas vantagens evitando endotoxinas que podem estar presentes com procariontes e empregando técnicas conhecidas que foram desenvolvidas para leveduras durante longos peróiodos, incluindo o isolamento de produtos das leveduras.
Os exemplos que se seguem ilgstram mais em pormenor a presente invenção. Estes exemplos não se destinam de qualquer modo a limitar o âmbito da invenção.
EXEMPLOS
Identificação e Isolamento do factor α de K.lactis
Levaram-se a efeito análise biológicas de sobrenadantes de culturas conforme descrito em Julius et al., Cell (1983) 32: 839, usando para estirpe de ensaio a estirpe S. cereviáae Mat a sst2-3 RC687. Cultivou-se a estirpe de K. lactis CBS 141 (a) num meio constituído por 0,5% de glucose, 0,17% de base de azoto de levedura sem sulfato de amónio (D^fco) e 0,002% de sulfato de amónio. Após separação das células por centrifugação, adicionou-se ácido acético ao sobrenadante da cultura até uma concentração de 0,1 M e ο
passou-se ο sobrenadante da cultura através de uma coluna Bio-Rex 70 (Biorad). Lavou-se a coluna com ácido acético O,1 M e em seguida eluiu-se o factor α com EtOH a 80%/HCl 10 mM. Evaporou-se o eluído até à secura e em seguida dissolveu-se em TFA a O,1%/acetonitrilo a 20% e aplicou-se a uma coluna de guarda de HPLC de fase inversa. Lavou-se a coluna sucessivamente com soluções contendo 0,1 % de TFA e 20 %, %, 60 % e 80 % de acetonitrilo. A fracção de 60 %, contendo a actividade do factor a, foi então aplicada a uma coluna analítica C-18 de HPLC e foi eluída com um gradiente de 20 % a 80 % de acetonitrilo em TFAa 0,1 %. Recolheram-se fracções e analisou-se a actividade do factor a. As fracções contendo o factor aforam secas e submetidas a análise de sequência dos ácidos aminados usando o sequenciador de proteínas em fase gasosa Modelo 470A da Applied Biosystems acoplado ao analisador modelo 120A PTH.
Selecção por hibridação de bancos de plasmideos
Marcaram-se conjuntos de oligonucleótidos utilizando /-32_/-ATP e guinase de polinucleótido T4. Estas sondas oligonucleótidicas foram usadas para sondar manchas de Southern ou colónias bacterianas a 42°C na seguinte solução de hibridação:
4xSSC, KH2PO4 50 mM e pH 7, 1 % de sarcosil, 10 % de sulfato de dextrano, 200 „ug/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e tratado com ultra-sons. Os filtros foram lavados em 2xSSC e 0,1 % de SDS a 42°C.
Seleccionou-se com estas sondas um banco de plasmicideos no vector de clonagem pJSlO9 (podem ser usados outros vectores normais de clonagem como pUCl8 e pBR322 em vez de pJS109) contendo inserções resultantes de uma digestão limitada de ADN genómico de K.lactis estirpe SDll (a tripl lac4) com Sau 3AI, fraccionada de acordo com a dimensão a fim de purificar os fragmentos 5000 pb, por meio da inoculação de transformantes da estirpe de E.coli
ΗΒ101 até uma densidade de 500 a 2000 colónias por placa de L-agar de 80 mm contdndo 100 jig/ml de ampicilina. Transferiu-se o ADN das colónias para filtros de nitrocelulose e hibridaram-se estes filtros conforme descrito anteriormente. Retiraram-se as éreas das placas originais correspondentes às regiões dos sinais de hibridação nos filtros e inocularam-se nouamente e em seguida ensaiaram-se nonamente por hibridação para isolar colónias simples com plasmídeos conten do sequências de hibridação. As colónias positivas foram ainda ensaiadas por análise de mancha de Southern do ADN purificado a partir de pequenas culturas.
Os plasmídeos purificados a partir de colónias positivas em relação à hibridação foram digeridos com várias enzimas de restrição e os fragmentos resultantes foram analisados por análise de mancha de Southern usando as mesmas sondas de hibridação a fim de identificar fragmentos de restrição de dimensão adequada para análise de sequência de ADN. Os fragmentos identificados deste modo foram purificados por electroforese em gel de agarose e foram clonados em vectores apropriados MP18 e MP19, levando-se a efeito análise de sequência de ADN.
Análise da quimosina nos sobrenadantes das culturas
Separaram-se as células das culturas por centrifugação e acidificaram-se os sobrenadantes resultantes até pH 2 por adição de H2SO4 1 M e incubaram-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida neutralizaram-se as soluções até pH 6 por adição de tris base 2 M. Adicionou-se um volume de 50 zul de uma diluição apropriada a 200 /ul de uma suspensão de leite em pó magro a 12 % em CaCl2 10 mM e incubou-se a 37°C até coalhar. Uma unidade de actividade de quimosina é definida como a quantidade de quimosina activa necessária para provocar a coagulação em 10 min nas mesmas condições.
Resultados
Os primeiros 10 ácidos aminados do factor α de K.lactis apresentaram uma homologia inequívoca com os de S.cerevisiae, com 6 resíduos idênticos. Esta sequência é apresentada em seguida:
Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln.
Esta sequência proteica foi usada para projectar um conjunto de oligonucleótidos deduzidos a fim de serem complementares ao gene estrutural, conforme apresentado na Figura 1. Sintetizaram-se os oligonucleótidos incluindo todos os codões possíveis para um segmento do peptideo factor α sob a forma de dois conjuntos de 96 e 48 moléculas diferentes.
Estes dois conjuntos foram marcados radioactivamente usando / 3 2p/-ATP e quinase de polinucleótido T4 e cada um deles foi usado para sondar uma mancha de Southern de um produto da digestão de restrição de ADN de K.lactis. Verificou-se que o conjunto número 2 apresentava hidração forte com um único fragmento em vários produtos diferentes de digestão. Deste modo, o conjunto número 2 foi escolhido para escrutinar bancos de plasmideo de ADN genómico de K.lactis.
A utilização destas sondas para escrutinar bancos de plasmideo deu como resultado o isolamento de vários clones φιβ hibridam. Por análise de sequência de ADN de um destes clones, ctfkl8b, verificou-3e que este codifica para um peptídeo relacionado com o factor α que apresenta uma grande semelhança com o precursor do peptídeo do factor a de S.cerevisiae. Verificou-se que o segmento que hibrida se encontra num fragmento Pst I-Eco de cerca de 1000 pb. A sequência deste fragmento é apresentado na Figura 2.
Nas Figuras 3 e 4 apresenta-se a comparação dos precursores dp factor a deste fragmento. Conforme se pode verificar, estes precursores possuem sequências guia (ácidos aminados 1 a 83 na Figura 3) de comprimento idêntico com uma bomologia de sequência considerável. 0 precursor de K.lactis, no entanto, contém apenas dois locais para a adição de cadeias de bidratos de carbono ligadas a N (Figura 4).
Além disso, os espaçadores das repetições de K.lactis são mais compridos do que os de S.cerevisiae e apresentam uma sequência mais diferente com o padrão X-Ala/Pro em vez das sequências Glu/Asp-Ala encontradas em S.cerevisiae. Uma comparação das sequências de ADN (Figura 5) também mostra um alto grau de bomologia ao longo da região de codificação.
Uma série de plasmídeos apresentados na Figura 6 foram construídos a fim de proporcionar uma fusão entre o guia do factor a de K.lactis e a proquimosina expressa sob regulação de transcrição de um promotor forte.
Em primeiro lugar, modificou-se um fragmento Ssp I - Eco RI de 673 pb de afk 18b por preenchimento da saliência do corte por Eco RI por enzima de Klenow e adição de adaptadores Bgl II às extremidades alinhadas. Este fragmento foi em seguida inserido num local Bgl II unindo as regiões do promotor e do terminador do gene da gliceraldeído-3-fosfato-dei- | drogenase (GAP) de S.cerevisiae. Este bloco integrado de expressão foi clonado sob a forma dum fragmento Bam HI em pUC18, dando como resultado o plasmídeo pAB3O7.
Levou-se então a efeito a fusão das sequências que codificam para o guia a e para a proquimosina bovina. Em primeiro lugar digeriu-se pAB3O7 com Nco I e as extremidades coesivas foram alinhadas por tratamento com nuclease de Phaseolus aureus (mung bean). 0 produto resultante foi em seguida digerido com Sal I. Ligou-se a este produto um fragmento Eco RV- Sal I de 2000 pb (sequências apresentadas nas Figuras 7 e 8) contendo sequências que codificam para a proquimosina e a região de terminação de transcrição fb.
υ
GAP de S.cerevisiae.Este fragmento foi derivado do plasmídeo pJSlll no qual se tinha adicionado um adaptador Xba I- Bam HI à extremidade 51 de utn fragmento contendo ADNc de proquimosina fundido com a região de terminação de transcrição GAP de S.cerevisiae. Usou-se esta mistura de ligação para transformar a estirpe de E.coli HB1O1 isolou-se um transformante contendo o plasmídeo pAB3O9. As sequências próximas da junção desta fusão são apresentadas na Figura 7 e a sequência da inserção Bam HI - Sal I de pAB3O9 é apresen tada na Figura 8.
A fim de permitir a transformação de estirpes de K.lactis,inseriu-se um fragmento Hind III de 3560 pb contendo o gene de resistência de E.coli à canamicina sob regulação de transcrição do promotor ADH1 de S.cerevisiae inserido na região 31 do gene LAC4 de K.lactis no plasmídeo pAB3O9 a fim de se obter o plasmídeo pAB312. A selecção em relação à ocorrência do inserção foi efectuada por análise de digestão de restrição e verificou-se no que respeita à orientação correcta.
O fragmento Hind III de 3560 pb foi derivado a partir do plasmídeo pGB901, de que se apresenta um diagrama na Figura 9. O plasmídeo pGB901 foi construido por ligação (1) do fragmento Xba I - Hae II de 3,6 kb contendo o promotor de lactase até cerca da posição -90 a partir do codão de início ATG de lactase isolado a partir de pUCla56 (descrito seguidamente), (2) um fragmento Hae II - Sal I com a seguinte sequência de nucleótidos:
5' TTAAC ACTTGAAATT TAGGAAAGAG GAGAATTTGG CAAAAAAAAT AAAAAAAAAA TAAACACG 3'
3’ CGCGAATTG TGAACTTTAA ATCCTTTCTC GTCTTAAACC GTTTTTTTTA TTTTTTTTTT ATTTGTGCAG CT 5’ (3) um fragmento Sal I - Xba I de 5,1 kb que codifica para a proquimosina e um gene que confere resistência ao anti- 19 -
biótico G418 de pGB900 (descrito seguidamente) e (4) pUC19 cortado com Xba I.
Durante a construção do plasmídeo a sequência CG do local Hae II foi removida inadvertidamente, criando um local Hind III nesta posição.
O plasmídeo pUCla56 foi construido ί como se segue. Isolou-se ADN cromossomal a partir da estirpe de K.lactis CBS 2360, cortou-se com Xho Ie separou-se em função da dimensão num gradiente de sacarose. As fracções contenj do o gene de lactose foram detectadas com uma sonda LAC4 í
í apos depósito do ADN num filtro de nitrocelulose. O ADN contendo o gene LAC4 foi clonado no local Xho I do plasmídeo pPAl53-215 (P.M.Andreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199; 372I -380) dando origem ao plasmídeo pPA31. Subclonou-se um fragi [ mento Xba I de pPA31 contendo o gene de lactose no local
I i Xba I de pUCl9 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119) dando origem ao plasmídeo pUCla56.
ί 0 plasmídeo pGB900 foi construido por j ligação de (1) um fragmento Hind III - Xba I de 3,6 kb do plasmídeo pGBTeG418 (apresentado na Figura 10 e descrito seguidamente) contendo o gene de resistência a G418 e (2) um fragmento Sal I - Hind III do plasmídeo pGB123 contendo o gene da proquimosina em pUC19 cortado com Sal I e Xba I. O plasmídeo pGB123 encontra-se descrito no Pedido de Patente Europeia EPA O 096 430.
plasmídeo pGBTeG418 (Figura 10) é constituido pelo plasmídeo pPA215 conforme descrito por AndreofLi,
Mol. Gen. Genet. (1985) 199; 372-380), um fragmento de 5,6 kb constituido pelo fragmento do terminador de lactase de K.lactis Bam HI (Breunig et al., Nucleic Acids Res. (1984)
12: 2327-2341) e o gene Tn5 (Reiss et al., EMBO J. (1984) 3j 3317-3322) que confere resistência a G418 sob a direcção do promotor de deidrogenase I de álcool (ADHI) de levedura se- 20 -
melhante ao descrito por Bennetzen e Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257; 3018-3025). 0 plasmldeo pGBTeG418 foi depositado na CBS em 26 de Fevereiro de 1987 sob o número CBS 184.87.
O plasmldeo pAB312 foi digerido com Eco
RV (a fim de dirigir a integração para a região LAC4 do genoma de K.lactis) e foi em seguida usado para transformar a estirpe K.lactis 2UV21 (a ura3 trpl lac4 C kil°) para conferir resistência a G418 usando a técnica de LiCl descrita por Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158; 1165-1167).
Alguns destes transformantes, bem como uma estirpe não transformada para comparação, foram cultivados durante 36 horas em 1 ml de meio constituido por 1 % de extracto de levedura, 2% de peptona, e 2% de glucose,
0,17 % de base de azoto de levedura, 50 zug/ml de triptofano e 50 ,ug/ml de uracilo. Os sobrenadantes das culturas foram em seguida analisados para determinação da actividade de quimosina após activação por ácido. Verificou-se que todos os transformantes segregavam entre 100 e 120 unidades/ml de quimosina aceitável.
Eliminação dos codões espaçadores por mutaqánese In vltro
Isolou-se o fragmento Sac I - Hin dlll de 1900 pb a partir do plasmldeo pAB3O9 e clonou-se em MP19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103). Preparou-se ADN fágico de cadeia simples e usou-se como molde para mutagé nese in vitro com«os iniciadores oligonucleotídicos apresentados na Figura 11. Os fagos M13 MP19/cckll.5 e MPl9/akl2.2 foram preparados usando o iniciador // 1 e o iniciador // 2, respectivamente.
Preparou-se ADN de dupla cadeia a partir destes fagos e isolaram-se fragmentos Sac I - Stu I de 1100 pb de cada um. Estes fragmentos foram ligados a um fragmento Sac I - Stu I de 7100 pb do plasmldeo pAB 312.
Os plasmídeos resultantes pAB313 e pAB314 foram isolados com as alterações de sequência ilustradas na Figura 12.
Os plasmídeos pAB313 e pAB314 foram usados para transformar a estirpe 2UV21 para conferir resistên cia a G418. Cultivaram-se os transformantes 2UV21::pAB312, 2UV21::pAB313 e 2UV21::pAB314 e analisaram-se os sobrenadantes das culturas para determinação da actividade de quimosina do mesmo modo descrito anteriormente. Os resultados destas análises são apresentados no Quadro 1 seguinte.
Quadro 1
Estirpe Hospedeiro Piasmídeo Actividade de Quimosina
(unidades/ml de cultura)
2UV21 2UV21 - 2
KRN3O3-1 2UV21 pAB312 256
KRN3O4-4 2UV21 pAB313 175
KRN3O5-2 2UV21 pAB314 206
Verificou-se gue todos os transformantes segregaram uma única espécie relacionada com quimosina de acordo com.os resultados de electroforese em gel de poliacrilamida de sobrenadantes da cultura precipitados por ácido tricloroacético. Verificeu-se por determinação da mobilidade electroforética que a proteína relacionada com a proquimosina segregada pelos transformantes pAB312 tinha um peso molecular ligeiramente superior ao das proteínas segregadas pelos transformantes pAB313 e pAB314.
Os agregados celulares das estirpes anteriores foram analisados para determinação da actividade de quimosina e verificou-se que continham menos do que 2% da
actividade medida nos sobrenadantes. Deste modo, o factor oc de Kluyverotnyces tem uma eficiência de aproximadamente 98% na direcção da secreção da proquimosina de Kluyveromyces lactis.
As espécies maioritárias segregadas por KRN3O3-1 e KRN3O4-4 foram purificadas por electroforese preparativa em gel de poliacrilamida de SDS e foram submetidas a análise de sequência de ácidos aminados em fase gasosa. As sequências N-têrminais destas espécies são dadas seguidamente :
KRN3O3-1
10 15
Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro
KRN304-4
5
Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile
Estes resultados indicam que a espécie relacionada com a proquimosina segregada por KRN3O3-1 não sofreu qualquer processamento da sequência do espaçador amino-terminal, enquanto que a espécie segragada por KRN3O4-4 possui a extremidade amino-terminal da proquimosina madura autentica.
Os seguintes organismos foram depositados na American Type Culture Collection em 30 de Junho de 1987: HB101 pAB3O7, ATCC NS de acesso 67454/ HB101 pAB312, ATCC N2 de acesso 67455.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em pormenor por meio de ilustrações e de exemplos para fins de clareza de compreensão, será óbvio que podem ser praticadas certas alterações e modificações no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação de uma cons trução de ADN caracterizado por se integrar uma sequência de ADN que codifica para a sequência guia do factor α de Kluyveromyces dirigindo para a secreção e uma sequência de ADN que codifica para uma séquência polipeptídica heteróloga de tal modo que, na proteína codificada, a sequência guia do factor α e a sequência heteróloga referidas estão ligadas.
    - 2fi Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência guia do factor a de Kluyveromyces estar ligada à sequência polipeptídica heteróloga por meio de um sinal de processamento em levedura para o processamento da referida proteína no referido polipeptídeo heterólogo.
    _ 3« Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a construção de ADN obtida conter também um promotor de levedura na extremidade 51.
    _ 4s _
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência guia ser a sequência guia integral do factor α de Kluyveromyces de tipo selvagem.
    - 5§ Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a sequência guia ser a sequência guia representada na figura 2.
    - 6Ô Processo dd acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência guia ser um fragmento funcio nal da sequência guia integral do factor α de Kluyveromyces de tipo selvagem.
    - 7® Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a sequência guia integral ser a sequência guia representada na figura 2.
    - 8« Processo de acordo com a reivimdicação 1 caracterizado por a sequência guia do factor α de Kluyveromyces ser a sequência guia do factor ade Kluyveromyees lactls.
    - 9a Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o sinal de processamento em levedura con ter um local de cisão dipeptídico básico e um espaçador.
    .-χ·
    10«
    Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o sinal de processamento em levedura conter um local de cisão dipeptídico básico directamente fun dido à extremidade N-terminal do polipeptídeo heterólogo e n ter um espaçador.
    - 11« Processo de acordo com qualquer das reivindicações 9 ou 10 caracterizado por o local de cisão di peptídico básico ser lisina-arginina ou arginina-arginina.
    - 12« Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o promotor de levedura ser um promotor de factor α ou um promotor GAP, a sequência guia do factor α de Kluyveromyces ser a sequência guia do factor α de Kluyveromyces lactis e a sequência guia do factor α de Kluvveromyces lactis estar ligada à sequência polipeptídica beteróloga por meio de um sinal de processamento de levedura que contém um local de cisão lisina-arginina e um espaçador.
    - 13« Processo de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por o polipeptídico heterólogo ser quimosina.
    - 14â Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o promotor de levedura ser um promotor de factor α ou um promotor GAP, a sequência guia do factor a i de Kiuyveromyces ser a sequência guia do factor a de Kluyvero myces lactis e a sequência guia do factor a de Kluyveromyces lactis estar ligada à sequência polipeptídica heteróloga por meio de um sinal de processamento de levedura que inclui !
    um local de cisão lisina-arginina fundindo directamente ao polipeptídeo heterólogo e não tem um espaçador.
    !
    - 15a Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o polipeptídeo heterólogo ser quimosina,
    Processo para a preparação de um vector de expressão caracterizado por conter um sistema de replicação ou de integração destinado a providenciar para uma manutenção estável na levedura e uma construção de ADN obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15.
    - 17a Processo para a preparação de um polipeptídeo heterólogo em levedura caracterizado por compreender as fases de:
    cultivar uma levedura contendo o vector de expressão obtido de acordo com a reivindicação 16 num meio de cultura sob condições tais que o referido polipeptídeo heterólogo seja expresso na referida levedura e segregací a partir deste sob a forma de um polipeptídeo, sendo o propolipeptídeo pelo menos em parte processado no referido polipeptídeo heterólogo.
    - 18â Processo melhorado para a produção de um polipeptídeo heterólogo em levedura no qual o polipeptídeo heterólogo é segregado sob o comando de uma sequência guia de factor α caracterizado por a sequência guia de factor α ser uma sequência guia de factor α de Kjuyveromyces.
    - 19a _
    Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por a sequência guia de factor a de Kluvveromyces ser uma sequência guia de factor a de Kluyveromyces lactis.
    As requerentes declaram que o primeiro desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América em 28 de Julho de 1987, sob o número de série 0 78,551.
    Lisboa,27 de Julho de 1988
PT88115A 1987-07-28 1988-07-27 Processo para a preparacao de construcoes de adn que contem uma sequencia guia do factor de kluyveromyces, de vectores de expressao que contem estas construcoes e de polipeptideos codificados por este adn PT88115B (pt)

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