ES2930351T3 - Un dímero de IL-22 para su uso en el tratamiento de enterocolitis necrosante - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para prevenir y/o tratar la enterocolitis necrosante u otras inflamaciones intestinales usando una IL-22, un dímero o un multímero de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un dímero de IL-22 para su uso en el tratamiento de enterocolitis necrosante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al área de las tecnologías biológicas y médicas, en particular, esta invención se refiere al uso de dímeros de IL-22 para prevenir y/o tratar inflamaciones intestinales en niños, como la enterocolitis necrosante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enterocolitis necrosante (La NEC) es una de las principales causas de muerte en bebés prematuros. Se caracteriza por inflamación intestinal y necrosis del epitelio intestinal y pérdida de la barrera intestinal, lo que lleva a la translocación bacteriana. La NEC se desencadena por una respuesta inflamatoria exagerada que resulta en necrosis intestinal. La inflamación inducida por NEC lleva a la disfunción de la barrera intestinal, la pérdida de células madre intestinales y la curación deficiente de la mucosa. La NEC puede llevar además a la inflamación sistémica, afectando a órganos distantes como el cerebro y colocando a los bebés afectados en un riesgo sustancialmente aumentado de retrasos en el desarrollo neurológico.

La prevalencia media de la NEC es de aproximadamente el 7% entre los bebés con un peso al nacer entre 500 g y 1500 g. Debido a los avances en la atención obstétrica y neonatal, la población de bebés prematuros en riesgo de NEC sigue aumentando. La tasa estimada de muerte asociada con la NEC varía entre el 20% y el 30%, y la tasa más alta se encuentra entre los bebés que requieren cirugía. Las estrategias de tratamiento actuales para la NEC incluyen descompresión abdominal, reposo intestinal, antibióticos intravenosos de amplio espectro, hiperalimentación intravenosa y cirugía, como colocación de drenaje peritoneal y laparotomía con resección del intestino enfermo. La lactancia materna sigue siendo la estrategia preventiva más eficaz para la NEC. Sin embargo, los métodos preventivos y terapéuticos actuales para la NEC no logran reducir la incidencia de la NEC y las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas en los recién nacidos. Hay una clara necesidad de un método eficaz para prevenir y/o tratar la NEC.

La interleucina-22 (IL-22), también conocida como factor inducible derivado de células T relacionado con IL-10 (IL-TIF), es una glicoproteína expresada y secretada por células T activadas y células asesinas naturales (células NK). Las células T activadas son principalmente células CD4+, especialmente células Th1, células Th17 y células Th22 activadas por la vía de CD28, entre otras. La expresión de ARNm de IL-22 se identificó originalmente en células T simuladas con IL-9 y mastocitos en células de bazo murinas así como en estimuladas con Concanavilina A (Con A) (L. Dumoutier et al., J. Immunology, 164:1814). -1819, 2000). El ARNm de IL-22 humana se expresa principalmente en células T periféricas tras la estimulación por anti-CD3 o Con A.

La US2013171100, concedida ahora como US8945528, divulga el uso de IL-22 en el tratamiento de la hepatitis vírica. La WO2015/067199 divulga el uso del dímero de IL-22 en la fabricación de un medicamento para administración intravenosa. La WO2015/070077 divulga el uso de IL-22 en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped gastrointestinal. La WO2014/145016 divulga polipéptidos de IL-22 y proteínas de fusión de IL-22 Fc y sus métodos de uso. Good et al. analizan el papel de la señalización de IL-22 en la patogénesis de NEC (The Journal of Immunology, 2015, vol. 194, N° 1, Suplemento 52.39). Parks et al. analizan el papel de la señalización de IL-22 en la regulación de la salud y la enfermedad intestinal (Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2016, vol.

3, N° 85, páginas 1-13). Sugimoto et al. analizan que IL-22 mejora la inflamación intestinal en un modelo de ratón con colitis ulcerosa (The Journal of Clinical Investigation, vol. 118, N° 2, páginas 534-544).

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud proporciona un dímero de IL-22 y una composición farmacéutica que comprende un dímero de IL-22 para su uso en métodos para tratar y/o prevenir la enterocolitis necrosante (NCE) en un individuo como niños en (como recién nacidos).

En un aspecto de la presente solicitud, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir y/o tratar la NEC en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, la NEC es NEC en etapa I. En algunas realizaciones, la NEC es NEC en etapa II. En algunas realizaciones, la NEC es NEC en etapa III.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el individuo es un bebé prematuro, como un bebé prematuro. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé con bajo peso al nacer (por ejemplo, un bebé con muy bajo peso al nacer o un bebé con un peso al nacer extremadamente bajo, como un bebé con un peso al nacer de aproximadamente 500 g a aproximadamente 1000 g).

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la cantidad eficaz del dímero de IL-22 da como resultado la inhibición de TLR4 en el individuo.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la cantidad eficaz del dímero de IL-22 da como resultado la inhibición de citoquinas proinflamatorias (como IL-6) y/o enzimas inducidas por inflamación (como la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)) en el individuo.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la cantidad eficaz del dímero de IL-22 promueve la diferenciación y/o el crecimiento de células secretoras (como células caliciformes, células de Paneth, etc.) en el intestino del individuo.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la cantidad eficaz del dímero de IL-22 regula uno o más genes de defensa del huésped en el individuo seleccionados del grupo que consiste en Defa-ps1, Defa22, Defa29, Reg3g, Reg3b, Reg3d, Reg3a, Reg4 y Reg1.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización. En algunas realizaciones, la subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización. En algunas realizaciones, la subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector. En algunas realizaciones, el conector tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el conector tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos dos cisteínas capaces de formando enlaces disulfuro intermoleculares. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc. En algunas realizaciones, el fragmento Fc es un fragmento Fc de inmunoglobulina humana (como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende dominios CH2 y CH3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el fragmento Fc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 de cada una de las subunidades monoméricas tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 se administra en la cantidad eficaz de 1 pg/kg a 200 pg/kg, como de 2 pg/kg a 200 pg/kg, de 1 pg/kg a 100 |jg/kg, de 5 pg/kg a 80 pg/kg, o de 10 pg/kg a 45 pg/kg.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 se administra no más de una vez a la semana, como no más de una vez al mes o no más de una vez cada tres meses.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 se muestra como en la Fórmula I:

M1-L-M2 (I)

en donde,

M1 es un primer monómero de IL-22,

M2 es un segundo monómero de IL-22, y

L es una fracción de fusión que conecta dicho primer monómero y dicho segundo monómero y está dispuesto entre ellos.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 retiene la actividad biológica de IL-22 y tiene una vida media en suero de más del doble de la del primer o segundo monómero. En algunas realizaciones, la vida media en suero del dímero de IL-22 es más larga que tres, cinco o diez veces la del primer y/o el segundo monómero.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la fracción de fusión L se selecciona del grupo que consiste en:

(i). un péptido corto que comprende de 3 a 50 aminoácidos; y

(ii). un polipéptido de Fórmula II:

-ZYZ- II

en donde,

Y es una proteína transportadora,

Z es nada, o uno o más péptidos cortos que comprenden de 1 a 30 aminoácidos, y

"-" es un enlace químico o un enlace covalente.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el "-" es un enlace peptídico.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, Z tiene una longitud de 5-50 residuos de aminoácidos.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, Z comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, Z tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la proteína transportadora contiene por lo menos dos cisteínas capaces de formar enlaces disulfuro intermoleculares.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la proteína transportadora está dispuesta en el extremo N-terminal del monómero de IL-22. En algunas realizaciones, la proteína transportadora está dispuesta en el extremo C-terminal del monómero de IL-22.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la proteína transportadora es albúmina o fragmento Fc de IgG humana. En algunas realizaciones, el fragmento Fc contiene los dominios CH2 y CH3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el fragmento Fc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el dímero de IL-22 está formado por dos subunidades monoméricas en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22, un dominio de dimerización y, opcionalmente, un conector que conecta el dominio de IL-22 y el dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 es un monómero de IL-22, el dominio de dimerización comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina humana (como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), el conector opcional es un péptido que conecta el monómero de IL- 22 y el fragmento Fc, y el dímero se forma mediante la conexión de dos dominios de dimerización (como los fragmentos Fc) a través de uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el número de dichos enlaces disulfuro es 2-4.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la subunidad monomérica de cada dímero de IL-22 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el primer monómero y el segundo monómero del dímero de IL-22 son idénticos. En algunas realizaciones, el primer monómero y el segundo monómero son diferentes.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la actividad biológica del dímero de IL-22 se selecciona de una o más actividades biológicas en un grupo que consiste en:

(a) inhibir TLR4 en el individuo;

(b) inhibir una o más citoquinas proinflamatorias (como IL-6) y/o enzimas inducidas por inflamación (como iNOS) en el individuo;

(c) promover la diferenciación y/o el crecimiento de células secretoras (como células caliciformes, células de Paneth, etc.) en el intestino del individuo; y

(d) regular uno o más genes de defensa del huésped en el individuo seleccionado del grupo que consiste en Defa-ps1, Defa22, Defa29, Reg3g, Reg3b, Reg3d, Reg3a, Reg4 y Reg1.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un dímero de IL-22 para su uso en la prevención y/o tratamiento de NEC. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un dímero de IL-22 de Fórmula I:

M1-L-M2 (I)

en donde,

M1 es un primer monómero de IL-22;

M2 es un segundo monómero de IL-22; y

L es una fracción de fusión que conecta dicho primer monómero y dicho segundo monómero y está dispuesta entre ellos. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 retiene la actividad biológica de IL-22 y tiene una vida media en suero de más del doble de la del primer o del segundo monómero.

Se entiende que el aspecto y las realizaciones de la invención descritas en la presente incluyen aspectos y realizaciones "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "o" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descrita en la presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en".

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es una ilustración de un dímero de IL-22 ejemplar de acuerdo con la presente invención. En la figura, "-" representa un conector y el objeto de forma ovalada etiquetado con "IL-22" representa un monómero de IL-22. Las FIGS. 2A y 2B son ilustraciones de dímeros de IL-22 ejemplares de acuerdo con la presente invención. En las figuras, "-" representa un conector de aminoácidos y el objeto de forma ovalada etiquetado con "IL-22" representa un monómero de IL-22. Como se ilustra en la FIG. 2A, el objeto de forma ovalada etiquetado con "C" representa una proteína transportadora en la que la IL-22 está dispuesta en el extremo N-terminal de la proteína transportadora. Como se ilustra en la FIG. 2B, el objeto con forma de medio óvalo marcado con "Fc" representa un fragmento Fc que es un dominio de dimerización, lo que muestra que se forma un dímero mediante el acoplamiento de dos fragmentos Fc a través de enlaces disulfuro.

Las FIGS. 3A y 3B son ilustraciones de dímeros de IL-22 ejemplares de acuerdo con la presente invención. En las figuras, "-" representa un conector de aminoácidos, el objeto de forma ovalada etiquetado con "IL-22" representa un monómero de IL-22. Como se ilustra en la FIG. 3A, el objeto de forma ovalada etiquetado con "C" representa una proteína transportadora en la que la IL-22 está dispuesta en el extremo C-terminal de la proteína transportadora. Como se ilustra en la FIG. 3B, el objeto con forma de medio óvalo etiquetado con "Fc" representa un fragmento Fc que es un dominio de dimerización, lo que muestra que se forma un dímero mediante el acoplamiento de dos fragmentos Fc a través de enlaces disulfuro.

La FIG. 4 muestra imágenes de microscopía confocal y cuantificaciones de células de Paneth y células caliciformes en el intestino delgado de ratones deficientes en IL-22Ra1 intestinal y de tipo salvaje. El panel superior de las imágenes muestra los resultados de la tinción con H&E. El panel central de las imágenes muestra los resultados de la inmunotinción contra la lisozima (rojo) secretada por las células de Paneth y los núcleos (DAPI, azul). El panel inferior de las imágenes muestra resultados de inmunotinción contra Muc2 (rojo) que es secretado por células caliciformes y núcleos (DAPI, azul).

La FIG. 5 muestra la hibridación in situ contra Reg3g, un péptido antimicrobiano secretado por las células de Paneth, en muestras de intestino de ratones de tipo salvaje (panel izquierdo) y deficientes en IL-22Ra1 intestinal (panel derecho).

La FIG. 6A muestra la distribución celular de NF-kB (verde) en células IEC-6 en varias condiciones. En las FIGS.

6A-11B, rIL-22 es un dímero de IL-22 de ejemplo que tiene dos subunidades monoméricas, cada una de las cuales comprende la SEQ ID NO: 4.

La FIG. 6B muestra los resultados de qRT-PCR de la expresión de IL-6 en células IEC-6 en varias condiciones. La FIG. 7 muestra imágenes de microscopía confocal de enteroides de ratón (paneles superiores) y humanos (paneles inferiores) que se trataron con control (paneles de la izquierda) o un dímero de IL-22 (paneles de la derecha). Los enteroides se tiñeron para enterocitos (E-cadherina, verde), células caliciformes (Muc2, rojo) y núcleos (DAPI, azul).

La FIG. 8 muestra un mapa de calor de los niveles de expresión de genes de defensa del huésped seleccionados en enteroides del intestino delgado tratados con un dímero de IL-22 ejemplar en comparación con el control. La FIG. 9 muestra imágenes de microscopía confocal y cuantificaciones de células caliciformes y células de Paneth en ratones de tipo salvaje tratados con un dímero de IL-22 o IgG (control). Las células caliciformes se tiñeron contra Muc2 (verde), las células Paneth se tiñeron contra lisozima (rojo) y los ácidos nucleicos se tiñeron con DAPI (azul).

La FIG. 10 muestra la expresión de TLR4 en el íleon terminal de ratones de tipo salvaje tratados con un dímero de IL-22 o IgG (control) según se determinó por qRT-PCR.

Ka FIG. 11A muestra la tinción con H&E del íleon terminal de ratones en el grupo de control, el grupo NEC inducido o el grupo NEC tratado con dímero de IL-22.

La FIG. 11B muestra los niveles de expresión de ¡NOS en el intestino de ratones según se determinó por qRT-PCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud proporciona dímeros de IL-22 para su uso en métodos de prevención y/o tratamiento de NEC en un individuo mediante la administración (como la administración intravenosa) al individuo de una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. Los inventores de la presente solicitud descubrieron por primera vez el papel de la señalización de IL-22 para contrarrestar la patogénesis de NEC. Usando un modelo murino para la NEC, los inventores han demostrado que la IL-22 es altamente eficaz en el tratamiento de la NEC y puede atenuar significativamente la gravedad de la NEC in vivo. Los inventores han descubierto además que la IL-22 puede proteger las células epiteliales intestinales de la inflamación in vitro e in vivo, inhibe la señalización de TLR4 y la expresión de citoquinas proinflamatorias en sentido descendente y enzimas inducidas por inflamación, promueve la diferenciación y el crecimiento de células caliciformes y células de Paneth, y regula la expresión de genes de defensa del huésped en ratones y enteroides humanos.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento de la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22..

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de ⁱL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento de la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde que cada subunidad monomérica comprende un dominio de lL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, cada una de las cuales comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento de la n Ec en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, cada una de las cuales comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de la NEC implica un método para inhibir la inflamación en un individuo (como un recién nacido) que tiene la NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de lL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para inhibir la inflamación en un individuo (como un recién nacido) con riesgo de tener NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inhibir la inflamación en un individuo (como un recién nacido) que tiene o está en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de lL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de lL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para proteger las células epiteliales intestinales contra la inflamación en un individuo (como un recién nacido) que tiene NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para proteger las células epiteliales intestinales contra la inflamación en un individuo (como un recién nacido) con riesgo de tener NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para proteger las células epiteliales intestinales contra la inflamación en un individuo (como un recién nacido) que tiene o está en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para reducir uno o más síntomas de la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para reducir uno o más síntomas de NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de ⁱL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para reducir la morbilidad y/o la mortalidad de un individuo (como un recién nacido) que tiene NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para reducir la morbilidad y/o la mortalidad de un individuo (como un recién nacido) en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de lL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para reducir la morbilidad y/o la mortalidad de un individuo (como un recién nacido) que tiene o está en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para mejorar la calidad de vida en un individuo (como un recién nacido) que tiene NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de lL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para mejorar la calidad de vida en un individuo (como un recién nacido) en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención de NEC implica un método para mejorar la calidad de vida en un individuo (como un recién nacido) que tiene o está en riesgo de tener NEC, que comprende administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización que comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del dímero de IL-22 da como resultado uno o más (como cualquiera de 1, 2, 3, 4 o más) de los criterios de valoración del tratamiento que incluyen, pero no se limitan a: (a) inhibición de TLR4 (como expresión o señalización) en el individuo; (b) inhibir una o más citoquinas proinflamatorias (como IL-6) y/o enzimas inducidas por inflamación (como iNOS) en el individuo; (c) promover la diferenciación y/o el crecimiento de células secretoras (como células caliciformes, células de Paneth, etc.) en el intestino del individuo; y (d) regular uno o más genes de defensa del huésped en el individuo seleccionados del grupo que consiste en Defaps1, Defa22, Defa29, Reg3g, Reg3b, Reg3d, Reg3a, Reg4 y Reg1. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de NEC en un individuo, que comprende la administración (como la administración intravenosa) al individuo de una cantidad eficaz de un dímero de IL-22, en donde la cantidad eficaz del dímero de IL-22 da como resultado uno o más (como cualquiera de 1, 2, 3, 4 o más) de los criterios de valoración del tratamiento descritos anteriormente. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir y/o tratar la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como la administración intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22, en donde la cantidad eficaz del dímero de IL-22 inhibe TLR4 (como la expresión o la señalización) en el individuo. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de TLR4 disminuye por lo menos aproximadamente cualquiera de 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más en comparación con el nivel de TLR4 antes del tratamiento. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento de NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22, en donde la cantidad eficaz del dímero de IL-22 inhibe la expresión de una o más citoquinas proinflamatorias (como IL-6) y/o enzimas inducidas por inflamación (como iNOS) en el individuo. En algunas realizaciones, el nivel de la citoquina proinflamatoria o la enzima inducida por la inflamación disminuye en por lo menos aproximadamente cualquiera de 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más en comparación con el nivel previo al tratamiento. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de ⁱL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir y/o tratar la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22, en donde la cantidad eficaz de dímero de IL-22 promueve la diferenciación y/o el crecimiento de células secretoras (como células caliciformes y/o células de Paneth) en el intestino del individuo. En algunas realizaciones, el número de células secretoras (como células caliciformes o células de Paneth) aumenta en por lo menos aproximadamente cualquiera de 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más en comparación con el número anterior al tratamiento. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como el fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir y/o tratar la NEC en un individuo (como un recién nacido), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22, en donde la cantidad eficaz del dímero de IL-22 regula uno o más genes de defensa del huésped (como regular por incremento Defa-ps1, Defa22, Defa29, Reg3g, Reg3b y/o Reg3d, y/o regular por disminución Reg3a, Reg4 y/o Regl). En algunas realizaciones, uno o más genes de defensa del huésped (como Defa-ps1, Defa22, Defa29, Reg3g, Reg3b y/o Reg3d) están regulados por incremento por al menos aproximadamente cualquiera de 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x en comparación con el nivel previo al tratamiento. En algunas realizaciones, uno o más genes de defensa del huésped (como Reg3a, Reg4 y/o Reg1) están regulados por disminución por al menos aproximadamente cualquiera de 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x en comparación con el nivel anterior al tratamiento. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8.

Como se usa en la presente, el término "terapia" se refiere a la administración de un dímero de IL-22 a un individuo con necesidad de ello para curar, aliviar, mejorar, reducir, retrasar y/o afectar a la enfermedad, el síntoma o la predisposición del individuo.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, como "que trata" o "tratar") es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen resultados clínicos. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: disminuir uno más de los síntomas que resultan de la enfermedad, disminuir la extensión de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o más medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, aumentar la calidad de vida y/o prolongar la supervivencia. En algunas variaciones, el dímero de IL-22 reduce la gravedad de uno o más síntomas asociados con la NEC en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% en comparación con el síntoma correspondiente en el mismo individuo antes del tratamiento o en comparación con el síntoma correspondiente en otros individuos que no reciben el tratamiento. También se incluye en "tratamiento" una reducción de la consecuencia patológica de la NEC u otras inflamaciones intestinales.

Como se usa en la presente, el término "que previene" o "prevenir" se refiere a un enfoque para evitar, retrasar o reducir la probabilidad de aparición, inicio o reaparición de una enfermedad.

El término "cantidad eficaz" se refiere a una dosis de un dímero de IL-22 que puede lograr el objetivo del tratamiento en el individuo con necesidad de ello. Un experto en la técnica entenderá que la "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar dependiendo de las vías de administración, los tipos de excipientes usados y la combinación con otros medicamentos.

El término "individuo", "individuo a tratar" o "sujeto" se refiere a un mamífero, como los humanos. Un individuo incluye, pero no se limita a, humanos, bovinos, equinos, felinos, caninos, roedores o primates. En algunas realizaciones, el individuo es humano. En algunas realizaciones, el individuo tiene NEC. En algunas realizaciones, el individuo corre el riesgo de tener NEC.

Como se usa en la presente, un individuo "en riesgo" es un individuo que está en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección, como NEC. Un individuo "en riesgo" puede o no tener una enfermedad detectable, y puede haber presentado o no una enfermedad detectable antes de los métodos de tratamiento descritos en la presente. "En riesgo" indica que un individuo tiene uno o más de los denominados factores de riesgo, que son parámetros medibles que se correlacionan con el desarrollo de la enfermedad (por ejemplo, NEC), que se describen en la presente. Un individuo que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad (por ejemplo, NEC) que una persona sin estos factores de riesgo. Por ejemplo, un bebé prematuro se considera "en riesgo de tener NEC" si el bebé prematuro tiene uno o más (como cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) de los factores de riesgo de la n Ec , incluyendo pero no limitados a, bajo peso al nacer (por ejemplo, menos de 1000 g), baja edad de gestación (como nacimiento antes de las 28 semanas), intolerancia alimentaria, alimentación con fórmula, uso de fortificante de la leche materna, uso de bloqueadores H2, corioamnionitis, sepsis, infecciones, primer ciclo de antibióticos prolongado (como más de aproximadamente 5 días), conducto arterioso permeable, tratamiento con indometacina, glucocorticoides e indometacina en la primera semana de vida, ausencia de catéter arterial umbilical, ventilación mecánica, transfusiones, madre positiva para VIH, uso prenatal de cocaína, asfixia perinatal, puntuación de Apgar menor de 7 a los 5 minutos, raza negra, glucocorticoides prenatales, infusión de morfina y parto vaginal. En algunas realizaciones, un individuo prematuro tardío (como cerca de las 37 semanas de edad gestacional) o nacido a término se considera "en riesgo de tener NCE" si el bebé prematuro tardío o nacido a término tiene uno o más (como cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de los factores de riesgo de la NEC, incluyendo pero no limitados a, cardiopatía congénita cianótica, policitemia, restricción del crecimiento intrauterino, alimentación con fórmula, enfermedad hipertensiva materna, madre positiva para VIH, catéteres umbilicales, transfusión de intercambio, asfixia perinatal, ventilación mecánica, sepsis, uso de drogas ilícitas maternas, síndrome de dificultad respiratoria y puntuación de Apgar menor de 7 a los 5 minutos. Factores de riesgo ejemplares de NEC se describen, por ejemplo, en Gephart SM et al., "Necrotizing Enterocolitis Risk," Adv. Neonatal Care, 2012; 12(2): 77-89.

Los métodos descritos en la presente son particularmente adecuados para ciertas poblaciones de pacientes, como recién nacidos, bebés prematuros y bebés con bajo peso al nacer. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé. En algunas realizaciones, el individuo es un recién nacido de no más de cualquiera de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o 1 año de edad. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé prematuro. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé prematuro, es decir, un bebé con una edad de gestación de no más de 37 semanas al nacer. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé prematuro que tiene una edad de gestación de no más de 37 semanas, 36 semanas, 35 semanas, 34 semanas, 33 semanas, 32 semanas, 31 semanas, 30 semanas, 29 semanas, 28 semanas, 27 semanas, 26 semanas o menos semanas al nacer. En algunas realizaciones, el bebé es un bebé extremadamente prematuro, es decir, un bebé que tiene una edad de gestación de menos de 25 semanas al nacer. En algunas realizaciones, el bebé es un bebé muy prematuro, es decir, un bebé que tiene una edad de gestación de menos de 32 semanas al nacer. En algunas realizaciones, el bebé es un bebé moderadamente prematuro, es decir, un bebé que tiene una edad de gestación de 32 semanas a 34 semanas al nacer. En algunas realizaciones, el bebé es un bebé prematuro tardío, es decir, un bebé que tiene una edad de gestación de 34 semanas a 36 semanas al nacer. En algunas realizaciones, el bebé es un bebé nacido a término.

En algunas realizaciones, el individuo es un bebé con bajo peso al nacer. En algunas realizaciones, el individuo tiene un peso al nacer de no más de 2 kg, 1,5 kg, 1,25 kg, 1 kg, 900 g, 800 g, 700 g, 600 g, 500 g o menos. En algunas realizaciones, el individuo tiene un peso al nacer de 500 g a 1000 g. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé de muy bajo peso al nacer (VLBW), es decir, un bebé que tiene un peso al nacer de menos de 1500 g. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé con un peso al nacer extremadamente bajo, es decir, un bebé que tiene un peso al nacer de menos de 1000 g. En algunas realizaciones, el individuo es un bebé con un peso al nacer de 500 g a 1000 g.

En algunas realizaciones, el individuo a tratar tiene una puntuación de gravedad de NEC de Bell de 1 o más, de 2 o más, o de 3 o más. Ver, por ejemplo, Bell MJ: Neonatal necrotizing enterocolitis. N Engl J Med 298:281-282, 1978. En algunas realizaciones, el individuo a tratar está en riesgo de tener NEC. En algunas realizaciones, el individuo a tratar se caracteriza por características clínicas y radiográficas típicas de NEC. En algunas realizaciones, el individuo a tratar muestra uno o más síntomas de NEC, que incluyen pero no se limitan a, apnea, bradicardia, inestabilidad de la temperatura, distensión abdominal, íleo intestinal, heces sanguinolentas, distensión abdominal, emesis biliosa, mala perfusión sistémica, neumatosis intestinal, peritonitis, edema de la pared abdominal, crepitación, hipotensión, insuficiencia renal, trombocitopenia, neumoperitoneo y fallo multiorgánico.

Como se describe en la presente, pueden prevenirse o tratarse varios tipos de NEC. En algunas realizaciones, el NEC es el NEC en etapa I. En algunas realizaciones, el NEC es NEC en etapa II. el NEC es NEC en etapa III.

En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método para tratar y/o prevenir la NEC en un recién nacido (por ejemplo, bebé prematuro o bebé con bajo peso al nacer), que comprende administrar (como administrar por vía intravenosa) al recién nacido una cantidad eficaz de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, se proporciona un dímero de IL-22 para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de NEC en un recién nacido (por ejemplo, bebé prematuro o bebé de bajo peso al nacer), que comprende administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) al recién nacido una cantidad eficaz de un dímero de IL-22 que comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc (como un fragmento Fc de IgG humana). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9. En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización está en el extremo C-terminal del dominio de IL-22. En algunas realizaciones, cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 4 y 6-8. En algunas realizaciones, el recién nacido es un bebé prematuro. En algunas realizaciones, el recién nacido es un bebé de muy bajo peso al nacer, o un bebé de extremadamente bajo peso al nacer, como un bebé con un peso al nacer de 500 g a 1000 g.

La NEC puede diagnosticarse y el tratamiento puede evaluarse con varios métodos, que incluyen pero no se limitan a, radiografía abdominal, radiografía de tórax, tomografía computarizada (TC), imagenología por resonancia magnética (MRI) u otras tecnologías de visualización interna. Además, pueden usarse métodos experimentales y clínicos que incluyen, pero no se limitan a, hexosaminidasa sérica, amilina plasmática, actividad de p-glucosidasa citosólica sérica, citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias plasmáticas, isoenzimas de creatinina quinasa sérica, relación de oxigenación cerebro-esplácnica, tonometría GI, monitorización del pH rectosigmoideo, EGF urinario, D-lactato, o tromboxano, e hidrógeno del aliento, para diagnosticar o evaluar el criterio de valoración del tratamiento para la NCE. Ver, por ejemplo, Schnabl KL et al., "Necrotizing enterocolitis: A multifactorial disease with no cure," World J. Gastroenterol. 2008; 14(14): 2142-2161; and Neu J. and Walker WA, "Necrotizing Enterocolitis" New Eng. J. Med. 2011; 364 (3): 255-264. La eficacia del tratamiento puede evaluarse usando cualquiera de los métodos de diagnóstico de NEC descritos anteriormente para evaluar uno o más criterios de valoración antes y después del tratamiento con el dímero de IL-22. En algunas realizaciones, pueden evaluarse los biomarcadores de inflamación como TLR4, las citoquinas proinflamatorias (como IL-6), las enzimas inducidas por la inflamación (como iNOS) y los genes de defensa del huésped (como los péptidos antimicrobianos), por ejemplo, mediante qRT-PCR o inmunohistoquímica en una muestra del individuo (por ejemplo, muestra de biopsia intestinal) antes o después del tratamiento para evaluar la eficacia del tratamiento.

IL-22

Como se usa en la presente, los términos "interleucina 22" e "IL-22" se usan indistintamente para referirse en términos generales a cualquier IL-22 nativa o variantes funcionales de la misma, como la IL-22 de cualquier fuente de mamífero, incluyendo primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). El término abarca IL-22 no procesada de "longitud completa", así como cualquier forma de IL-22 que resulte del procesamiento en la célula. Por ejemplo, la presente invención abarca tanto la IL-22 de longitud completa que contiene la secuencia líder N-terminal como la forma madura de la IL-22. La secuencia líder (o péptido señal) puede ser la secuencia líder endógena de IL-22 o una secuencia líder exógena de otra proteína secretora de mamífero. En ciertas realizaciones, la secuencia líder puede ser de una proteína secretora eucariota o procariota. El término también abarca variantes naturales de ⁱL-22, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas, y variantes diseñadas de IL-22 que tienen por lo menos cualquiera de un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la IL-22 nativa. La invención también contempla variaciones de secuencia menores, especialmente sustituciones de aminoácidos conservadoras de IL-22 que no afectan a la función y/o actividad de IL-22 (por ejemplo, unión al receptor de IL-22). En algunas realizaciones, la IL-22 tiene la misma secuencia de aminoácidos que la IL-22 humana o murina como describe por Dumoutier et al. en la Patente de Estados Unidos N° 6.359.117. En algunas realizaciones, la IL-22 tiene la misma actividad biológica que la IL-22 de origen natural. En algunas realizaciones, la IL-22 es IL-22 humana, IL-22 humana recombinante, IL-22 murina o IL-22 murina recombinante.

El péptido precursor de la IL-22 humana nativa consiste en 179 residuos de aminoácidos, mientras que el péptido maduro consiste en 146 residuos de aminoácidos. Dumoutier informó por primera vez sobre las secuencias de ADN clonadas de IL-22 de ratón y humano (Dumoutier, et al., 2000; Patente de Estados Unidos N° 6.359.117 y Patente de Estados Unidos N° 6,274,710). IL-22 se expresa principalmente en células T activadas (especialmente células Th17), células de bazo estimuladas con lectina (Dumoutier JI 2002), células NK estimuladas con IL-2/IL-12 (Wolk, K et al., J. Immunology, 168:5379-5402, 2002), y en una serie de órganos y tejidos incluyendo el intestino, el hígado, el estómago, los riñones, los pulmones, el corazón, el timo, el bazo, tras la estimulación con lipopolisacáridos (LPS), en los que se encuentra una expresión aumentada de IL-22 en esos órganos y tejidos. La IL-22 lleva a cabo su función biológica mediante la combinación del receptor II,-22R1 y el receptor IL-10R2. IL-22R1 es un receptor específico de IL-22 y se expresa en piel, riñón, sistema digestivo (páncreas, intestino delgado, hígado, intestino grueso y colon) y sistema respiratorio (pulmón y bronquios). Investigaciones publicadas demostraron que la IL-22 es un inmunomodulador.

IL-22 también incluye IL-22 pegilada y proteínas IL-22 modificadas covalentemente. Por ejemplo, la IL-22 de la presente invención puede polimerizarse mediante la modificación con cualquier polietilenglicol (PEG) activado con un peso molecular de 5.000-100.000 con el propósito de prolongar su vida media. Los protocolos detallados pueden consultarse en Greenwald et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 2465; Caliceti et al., IL Farmaco, 1993, 48,919; Zalipsky and Lee, Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992). Se prefiere PEG activo ramificado de múltiples brazos (CN ZL02101672.0, WO9932139, PCT/US95/0755, PCT/US94/13013, US 4,640,835, US 4,496,689, US 4,301,144, US 4,670,417, US 4,791,192, US 4,179,337).

Como se usa en la presente, "IL-22", "dominio de IL-22" o "monómero de IL-22" se refiere a formas monoméricas de IL-22, a menos que se indique lo contrario.

Dímeros de IL-22

El método comprende administrar un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización. Como se usa en la presente, "dominio de dimerización" se refiere a un dominio de proteína que enlaza un primer dominio de IL-22 con un segundo dominio de IL-22, lo que permite la formación de un dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es una subunidad monomérica de una proteína dimérica o fragmento de proteína, den onde la dimerización de dos dominios de dimerización en el dímero de IL-22 permite la formación del dímero de IL-22. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es un fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es una cremallera de leucina. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es albúmina, como albúmina humana.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende un primer dominio de IL-22, un dominio de dimerización y un segundo dominio de IL-22. En algunas realizaciones, el extremo C-terminal del primer dominio de IL-22 está unido al extremo N-terminal del dominio de dimerización a través de un primer conector. En algunas realizaciones, el extremo N-terminal del segundo dominio de IL-22 está unido al extremo C-terminal del dominio de dimerización a través de un segundo conector. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es una proteína monomérica o un fragmento de proteína. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es un conector peptídico.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 de la presente invención tiene la estructura de Fórmula I: M1-L-M2 I

en donde,

M1 es un primer monómero de IL-22,

M2 es un segundo monómero de IL-22, y

L es una fracción de fusión que conecta dicho primer monómero y dicho segundo monómero y está dispuesta entre ellos.

En algunas realizaciones de acuerdo con cualquiera de los usos descritos anteriormente, la fracción de fusión L se selecciona del grupo que consiste en:

(i) . un péptido corto que comprende de 3 a 50 aminoácidos; y

(ii) . un polipéptido de Fórmula II:

-ZYZ- II

en donde,

Y es una proteína transportadora,

Z es nada, o uno o más péptidos cortos que comprenden de 1 a 30 aminoácidos, y

"-" es un enlace químico o un enlace covalente.

Las FIGS. 1-3B ilustran las estructuras representativas de los dímeros de IL-22 de la presente invención, en los que la proteína transportadora incluye, entre otros, fragmentos Fc de IgG humana (como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG 4) y albúmina humana.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 de la presente invención comprende dos subunidades monoméricas, en las que cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización. Cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 está directamente enlazado al dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 se enlaza al dominio de dimerización a través de un conector, como un conector peptídico. El dominio de IL-22 puede estar en el extremo C-terminal o N-terminal del dominio de dimerización. En algunas realizaciones, la proteína transportadora del dímero de IL-22 está formada por dos dominios de dimerización mediante dimerización. En algunas realizaciones, los dos dominios de dimerización se dimerizan entre sí a través de uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el número de enlaces disulfuro entre los dos dominios de dimerización es 2 o 4.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende un primer dominio de IL-22, un segundo dominio de IL-22 y un conector (como un conector peptídico) dispuesto entre ellos. En la SEQ ID NO: 5 se muestra una secuencia de aminoácidos de un dímero de IL-22 ejemplar en la que los residuos de aminoácidos 1-146 representan IL-22, los residuos de aminoácidos 147-162 representan el conector y los residuos de aminoácidos 163-308 representan otra IL-22.

SEQ ID NO: 5

APIS SHCRLDK SNF QQP YITNRTFML AKE ASLADNNTD VRLIGEKLFHGV SMSERC YLM

KQ VLNF TLEE VLFPQ SDRF QP YMQE VVPFL ARL SNRL S TCHIEGDDLHIQRN V QKLKDT

VKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGSGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ

PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQS

DRF QP YMQE Y YPFL ARL SNRL STCHIEGDDLHIQRN Y QKLKDT VKKLGE S GEIK AIGEL

DLLFMSLRNACI

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende por lo menos una porción de un fragmento Fc como el dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es un fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización es un fragmento Fc de IgG humana como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El término "región Fc", "dominio Fc" o "Fc" se refiere a una región de unión a antígeno no C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc nativas y regiones Fc variantes. En algunas realizaciones, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no, sin afectar a la estructura o estabilidad de la región Fc. A menos que se especifique de otro modo en la presente, la numeración de residuos de aminoácidos en la región IgG o Fc es de acuerdo con el sistema de numeración EU para anticuerpos, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

En algunas realizaciones, el fragmento Fc es una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de IgG que comprende una región bisagra (que comienza en Cys226), un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El término "región bisagra" o "secuencia bisagra", como se usa en la presente, se refiere a la secuencia de aminoácidos localizada entre los dominios globulares en un anticuerpo, como el polipéptido entre el dominio CH1 y el dominio CH2 en la cadena pesada de una IgG. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos CPPCP (SEQ ID NO: 11), una secuencia que se encuentra en la región bisagra de IgG1 nativa. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende una región Fc de IgG4 (por ejemplo, dominios CH2 y CH3) y una región bisagra que comprende la secuencia CPPCP (SEQ ID NO: 11) para facilitar la dimerización. En algunas realizaciones, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos ERKCC (SEQ ID NO: 14), una secuencia que se encuentra en la región bisagra de IgG2 nativa.

En algunas realizaciones, el fragmento Fc comienza en la región bisagra y se extiende hasta el extremo C-terminal de la cadena pesada de IgG. En ciertas realizaciones particulares, el fragmento Fc comprende la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG4. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG2. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende la región bisagra que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, el fragmento Fc no comprende parte de la región bisagra, como los residuos de aminoácidos primero a quinto de la región bisagra de IgG. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende una región bisagra truncada que tiene un número reducido de cisteínas capaces de formar enlaces disulfuro en comparación con la región bisagra de tipo salvaje de una IgG. En algunas realizaciones, el fragmento Fc no comprende la SEQ ID NO: 14 en la región bisagra. En algunas realizaciones, un fragmento Fc que comprende una región bisagra truncada tiene una posibilidad reducida de malapareamiento en la región bisagra. Se entiende que dentro del alcance de la invención se contemplan las sustituciones conservadoras de aminoácidos de la región Fc sin afectar a la estructura deseada y/o la estabilidad de Fc.

En la SEQ ID NO: 4 se muestra una secuencia de aminoácidos de un monómero de IL-22 ejemplar con un fragmento Fc, que se usa para formar un dímero de IL-22 ejemplar, en la que los residuos de aminoácidos 1-146 representan una IL-22, los residuos de aminoácidos 147-162 representan el conector, y los residuos de aminoácidos 163-385 representan el fragmento Fc de la IgG2 humana. Los dos monómeros de IL-22 con el fragmento Fc forman un dímero mediante el acoplamiento de los fragmentos Fc.

SEQ ID NO: 4

APIS SHCRLDK SNF QQP YITNRTFML AKE ASLADNNTD VRLIGEKLFHGV SMSERCYLM KQ VLNF TLEE VLFPQ SDRF QP YMQE VVPFL ARL SNRL S T CHIEGDDLHIQRN V QKLKDT VKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGSGGGSGGGGSGGGGSVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 6 se muestra una secuencia de aminoácidos de un monómero de IL-22 ejemplar con un fragmento Fc, que se usa para formar un dímero de IL-22 ejemplar, en la que los residuos de aminoácidos 1-146 representan una IL-22, los residuos de aminoácidos 147-152 representan el conector, y los residuos de aminoácidos 153-375 representan el fragmento Fc de IgG2 humana. Los dos monómeros de IL-22 con el fragmento Fc forman un dímero mediante el acoplamiento de los fragmentos Fc.

SEQ ID NO: 6

APIS SHCRLDK SNF QQP YITNRTFML AKE ASLADNNTD VRLIGEKLFHGV SMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDT VKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIASTKGPVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MI SRTPE VT C V V VD V SHEDPEV QFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN S TFR Y Y S VLT V V HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL Y SKLTVDKSRW QQGNVF SC S VMHEALHNHYT QK SL SL SPGK

En la SEQ ID NO: 7 se muestra una secuencia de aminoácidos de un monómero de IL-22 con un fragmento Fc, que se usa para formar un dímero de IL-22 ejemplar, en la que los residuos de aminoácidos 1-223 representan el fragmento Fc de IgG2 humana, los residuos de aminoácidos 224-239 representan el conector y los residuos de aminoácidos 240-385 representan una IL-22. Los dos monómeros de IL-22 con el fragmento Fc forman un dímero mediante el acoplamiento de los fragmentos Fc.

SEQ ID NO: 7

VECPPCP APP V AGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC V VVD V SHEDPEV QFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRYY S VLT VVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPASIEKTISKTKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFL Y SKLTVDKSRW QQGNVF SC S VMHE ALHNH YTQKSL SL SPGKGSGGGSGGGGS GGGGS API S SHCRLDK SNF Q QP YITNRTFML AKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGV SM SE RC YLMKQ VLNF TLEEVLFPQ SDRF QP YMQE VVPFL ARL SNRLS T CHIEGDDLHIQRN V Q KLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

En la SEQ ID NO: 8 se muestra una secuencia de aminoácidos de un monómero de IL-22 con un fragmento Fc, que se usa para formar un dímero de IL-22 ejemplar, en la que los residuos de aminoácidos 1-223 representan el fragmento Fc de IgG2 humana, los residuos de aminoácidos 224-229 representan el conector y los residuos de aminoácidos 230-375 representan una IL-22. Los dos monómeros de IL-22 con el fragmento Fc forman un dímero mediante el acoplamiento de los fragmentos Fc.

SEQ ID NO: 8

VECPPCP APP V AGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC V VVD V SHEDPE V QFNW YVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTFRVV S VLTVVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPASIEKTISKTKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKASTKGPAPISSH

CRLDKSNF QQPYITNRTFMLAKEASL ADNNTDVRLIGEKLFHGV SMSERC YLMKQVLN

F TLEE VLFPQ SDRF QP YMQE VVPFL ARL SNRL S T CHIEGDDLHIQRN V QKLKDT VKKLG

ESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI

Como se usa en la presente, el término "péptido conector", "conector peptídico" o "conector" se refiere a un oligopéptido dispuesto entre un monómero de IL-22 y la proteína transportadora, o un monómero de IL-22 (o dominio de ⁱL-22) y un dominio de dimerización, y que conecta los dos dominios/fragmentos entre sí. No hay ninguna restricción especial sobre la longitud del conector. Un conector suele tener una longitud de 5 a 50 residuos de aminoácidos. En general, un conector no afecta ni afecta significativamente al plegamiento y la conformación apropiados formados por la configuración de los dos monómeros de IL-22.

En algunas realizaciones, el conector comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) . una secuencia de aminoácidos con 3-16 residuos de aminoácidos hidrófobos Gly o Pro, como Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro (SEQ ID NO: 12);

(b) . una secuencia de aminoácidos codificada por múltiples sitios de clonación. Tales secuencias habitualmente contienen de 5 a 20 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 10 a 20 residuos de aminoácidos;

(c) . una secuencia de aminoácidos de una proteína distinta del monómero IL-22, como una secuencia de aminoácidos de IgG o albúmina; y

(d) . una secuencia de aminoácidos que comprende cualquier combinación de (a), (b) y (c) anteriores.

En algunas realizaciones, el conector tiene la secuencia de GSGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1) o ASTKGP (SEQ ID NO: 10).

Además, puede añadirse una secuencia de aminoácidos que no afecte a la actividad biológica del monómero de IL-22 al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del monómero o subunidad monomérica de IL-22. En algunas realizaciones, dicha secuencia de aminoácidos añadida es beneficiosa para la expresión (por ejemplo, péptido señal), purificación (por ejemplo, etiqueta 6 x His, el sitio de escisión del péptido señal del factor a de Saccharomyces cerevisiae (Glu-Lys-Arg, SEQ ID NO: 13), y/o mejora de la actividad biológica del dímero IL-22.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 se fusiona con el extremo N-terminal del dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 se fusiona con el extremo C-terminal del dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 está directamente enlazado al dominio de dimerización. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 y el dominio de dimerización están enlazados a través de un conector (por ejemplo, un conector peptídico de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, un conector que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el dominio de dimerización del dímero de IL-22 comprende una cremallera de leucina.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un monómero de IL-22 y por lo menos una porción de un fragmento Fc de inmunoglobulina ("el fragmento Fc", también referido en la presente como "región Fc"). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 se fusiona con el extremo N-terminal del fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 se fusiona con el extremo C-terminal del fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 está enlazado directamente al fragmento Fc. En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 y el fragmento Fc están enlazados a través de un conector (por ejemplo, un conector peptídico de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, un conector que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10). En algunas realizaciones, el dominio de IL-22 tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende por lo menos dos cisteínas capaces de formar enlaces disulfuro intermoleculares. En algunas realizaciones, el número de enlaces disulfuro entre los fragmentos Fc es 2 o 4. En algunas realizaciones, el fragmento Fc está truncado en el extremo N-terminal, por ejemplo, carece de los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio Fc de inmunoglobulina completo. En algunas realizaciones, el fragmento Fc se deriva de IgG2. En algunas realizaciones, el fragmento Fc se deriva de IgG4. En algunas realizaciones, el fragmento Fc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9.

SEQ ID NO: 2 (fragmento Fc)

VECPPCP APP V AGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC V VVD V SHEDPE V QFNW YVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTFRVV S VLTVVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPASIEKTISKTKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS

DGSFFL Y SKLT VDKSRWQQGNVF S C S VMHEALHNF1YTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 3 (dominio de IL-22)

APIS SHCRLDKSNF QQP YITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGV SMSERC YLM

KQ VLNF TLEE VLFPQ SDRF QP YMQE VVPFL ARL SNRL S T CHIEGDDLHIQRN V QKLKDT

VKKLGESGEDCAIGELDLLFMSLRNACI

SEQ ID NO: 9 (fragmento Fc)

ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWY

VDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVV S VLTVVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPAPIEKTI

SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTP

PMLD SDGSFFL Y SKLT VDKSRWQQGNVF SC SVMHEALHNHYTQK SL SLSPGK

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de la SEQ ID NO: 8.

La invención abarca modificaciones a los polipéptidos descritos en la presente, incluyendo proteínas funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente a sus propiedades, y variantes que tienen una actividad potenciada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en la presente. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativa y perjudicialmente la actividad funcional, mutaciones no conservadoras que no cambian significativa y perjudicialmente la actividad funcional, o uso de análogos químicos.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un residuo de aminoácido hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos de aminoácidos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un residuo de metionilo N-terminal o una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de las subunidades monoméricas incluyen la fusión con el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido, o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del dímero de IL-22.

En las proteínas se encuentran comúnmente veinte aminoácidos. Esos aminoácidos pueden agruparse en nueve clases o grupos en base a las propiedades químicas de sus cadenas laterales. A la sustitución de un residuo de aminoácido por otro dentro de la misma clase o grupo se hace referencia en la presente como sustitución "conservadora". Con frecuencia pueden realizarse sustituciones conservadoras de aminoácidos en una proteína sin alterar significativamente la conformación o función de la proteína. Por el contrario, las sustituciones de aminoácidos no conservadoras tienden a alterar la conformación y la función de una proteína. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). (Ver la Tabla 1 a continuación)

T l 1: E m l l ifi i n min i

En algunas realizaciones, la sustitución conservadora de aminoácidos comprende sustituir cualquiera de glicina (G), alanina (A), isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos alifáticos; serina (S) por treonina (T) y viceversa; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; lisina (K) por arginina (R) y viceversa; fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W) por cualquier otro de estos aminoácidos aromáticos; y metionina (M) por cisteína (C) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservadoras, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) frecuentemente pueden ser intercambiables, al igual que la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina y, algunas veces, con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en lugares en los que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y las diferentes pK de estos dos residuos de aminoácido no son significativas. Otros cambios más pueden considerarse "conservadores" en ambientes particulares (ver, por ejemplo, Biochemistry en las págs. 13-15, 2a ed. Lubert Stryer ed. (Stanford University); Henikoff et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1992) 89:10915-10919; Lei et al., J. Biol. Chem. (1995) 270(20):11882-11886).

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 tiene una vida media en suero que es significativamente más larga que la de un monómero de IL-22 (como la IL-22 nativa). En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 tiene una vida media en suero de por lo menos aproximadamente cualquiera de 15, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o más horas. En algunas realizaciones, mientras que la dosis de dímero de IL-22 es de 2 pg/kg, la vida media en suero es de por lo menos cualquiera de 15, 30, 50, 100, 150 o 200 horas. En algunas realizaciones, mientras que la dosis de dímero de IL-22 es de 10 pg/kg, la vida media en suero es de por lo menos cualquiera de 50, 100, 150 o 200 horas. En algunas realizaciones, mientras que la dosis de dímero de IL-22 es de 30 pg/kg, la vida media en suero es de por lo menos aproximadamente cualquiera de 100, 150, 200 o 250 horas. En algunas realizaciones, mientras que la dosis de dímero de IL-22 es de 45 pg/kg, la vida media en suero es de por lo menos cualquiera de 100, 150, 200, 250, 300, o 350 horas.

Preparación de dímeros de IL-22

Los dímeros de IL-22 pueden expresarse usando tecnología de ADN recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica una IL-22, o una subunidad monomérica de IL-22, puede insertarse en un vector de expresión de proteínas o de clonación replicable en sitios de restricción usando técnicas conocidas. En algunas realizaciones, se inserta una única secuencia de nucleótidos que codifica una IL-22 o una subunidad monomérica de IL-22 en un vector de clonación o expresión. En algunas realizaciones, pueden insertarse por separado una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de IL-22 y una secuencia de nucleótidos que codifica la región del péptido de extensión en un vector de clonación o expresión de tal manera que cuando la secuencia de nucleótidos se expresa como una proteína, se forma un polipéptido continuo. En algunas realizaciones, pueden insertarse por separado una secuencia de nucleótidos que codifica un conector, una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de dimerización, y una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de IL-22 en un vector de clonación o expresión de tal manera que cuando la secuencia de nucleótidos se expresa como una proteína, se forma un polipéptido continuo. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una IL-22, o una subunidad monomérica de IL-22 puede fusionarse con una secuencia de nucleótidos que codifica una etiqueta de afinidad o identificación como, pero no limitada a, una etiqueta His, etiqueta FLAG, etiqueta SUMO, etiqueta GST, etiqueta de anticuerpo o etiqueta MBP. En algunas realizaciones, el vector de clonación o expresión puede luego transfectarse o transformarse en células eucariotas o procariotas usando técnicas conocidas. En algunas realizaciones, la IL-22 o las subunidades monoméricas pueden expresarse in vitro.

La célula huésped de expresión puede ser cualquier célula capaz de expresar IL-22, subunidades monoméricas o dímeros de IL-22. Las células huésped de expresión procariotas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, Escherichia coli, Erwinia, Klesbsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Pseudomonas, y Streptomyces. Las células eucariotas, como hongos o levaduras, también pueden ser adecuadas para la expresión de IL-22, subunidades monoméricas o dímeros de IL-22, por ejemplo, pero no limitadas a, Saccharomyces, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces waltii, Kluyveromyces drosophilarum, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Penicillium, Tolypocladium, Synechococcus y Aspergillus. Las células de plantas o algas también pueden ser adecuadas para la expresión de iL-22, subunidades monoméricas o dímeros de IL-22, como Chlamydomonas. Las células eucariotas derivadas de organismos multicelulares también pueden ser adecuadas para la expresión de IL-22, subunidades monoméricas o dímeros de IL-22, por ejemplo, pero no limitadas a, células de invertebrados como Drosophila S2 y Spodoptera.Sf9, o células de mamífero como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células de riñón embrionario humano (como células HEK293), células trofoblásticas de testículo murino, células de pulmón humano y células de cáncer de mama murino. Después de que el plásmido de clonación de la subunidad monomérica IL-22 o IL-22 se transforme o transfecte en una célula huésped, las células huésped pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales y puede inducirse la expresión de proteínas, si es necesario. En algunas realizaciones, la expresión de IL-22 o subunidades monoméricas no requiere inducción.

En algunas realizaciones, las subunidades monoméricas expresadas forman dímeros de IL-22. En algunas realizaciones, las subunidades monoméricas requieren inducción adicional, como mediante el suministro de un compuesto de oxidación (como peróxido de hidrógeno o un metal catalítico), luz UV o un reticulante químico (como formaldehído, 1,6-bismaleimidohexano, 1,3- dibromo-2-propanol, sulfuro de bis(2-cloroetilo) o glutaraldehído), para formar dímeros de IL-22.

En algunas realizaciones, la formación de dímeros de IL-22 no requiere inducción. En algunas realizaciones, la célula huésped usada para expresar IL-22, subunidades monoméricas o dímeros de IL-22 es una célula CHO. La IL-22, las subunidades monoméricas o los dímeros de IL-22 pueden purificarse usando cualquier número de técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, la IL-22, las subunidades monoméricas o los dímeros de IL-22 pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, precipitación o ultracentrifugación. En algunas realizaciones, se elimina una etiqueta de afinidad fusionada con el polipéptido de IL-22 o subunidad monomérica de IL-22.

Se han descrito métodos de preparación ejemplares de dímeros de IL-22, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente internacional WO2012028089A1 (N° de Solicitud PCT/CN2011/079124 presentada por Generon (Shanghai) Corporation LTD. (ahora Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd) el 30 de agosto de 2011).

Administración de dímeros de IL-22

Los dímeros de IL-22 descritos en la presente pueden administrarse a un individuo a través de varias vías. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por vía parenteral, intravenosa, oral, intramuscular o subcutánea.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por inyección intravenosa (IVP). En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por infusión intravenosa. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por infusión intravenosa continua.

En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero, como humanos, roedores o primates. En algunas realizaciones, el individuo es humano.

La cantidad eficaz, la dosis adecuada y el programa de dosificación del dímero de IL-22 administrado a un individuo (como un humano) pueden variar dependiendo de la composición particular, el método de administración y el tipo particular de NEC que se esté tratando. La dosis debería ser suficiente para efectuar una respuesta deseable, tal como una respuesta terapéutica o profiláctica contra la NEC. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de la NEC. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para prevenir la aparición y/o recurrencia de la NEC. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. La dosificación adecuada del dímero de IL-22 incluye, por ejemplo, de 0,5 pg/kg a 500 pg/kg, de 1 pg/kg a 200 pg/kg, de 2 pg/kg a 200 pg/kg, de 1 pg/kg a 100 pg /kg, de 5 pg/kg a 80 pg/kg, de 10 pg/kg a 45 pg/kg, y de 30 pg/kg a 40 pg/kg.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra una vez a la semana. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 24 semanas. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 12 meses. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra solo una vez.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa a una dosis de por lo menos cualquiera de 1 pg/kg, 2 pg/kg, 5 pg/kg, 10 pg/kg, 20 pg/kg, 30 pg/kg, 40 pg/kg o 50 pg/kg. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa a una dosis de no más de cualquiera de 100 pg/kg, 50 pg/kg, 40 pg/kg, 30 pg/kg, 20 pg/kg, 10 pg/kg, 5 pg/kg o 1 pg/kg. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra al individuo a razón de 1 pg/kg a 100 pg/kg. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra con una frecuencia de no más de una vez por semana, una vez por mes, una vez cada dos meses o una vez cada seis meses.

Medicamentos

También se proporcionan medicamentos adecuados para cualquiera de los métodos descritos en la presente.

El dímero de IL-22 descrito en la presente puede formularse con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento y/o prevención de la NEC.

La composición farmacéutica puede comprender una cantidad segura y eficaz de dicho dímero de IL-22 y una sal farmacéuticamente aceptable, o un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. "Cantidad segura y eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto o agente suficiente para mejorar sustancialmente la condición del paciente con necesidad de ello sin provocar efectos secundarios graves. La cantidad segura y eficaz se determina en base a las circunstancias específicas, como la edad, el estado y el régimen asociados con un individuo que recibe el tratamiento.

"Excipiente o portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a uno o más materiales de relleno o gelatina sólidos o líquidos compatibles que son adecuados para su uso en humanos con pureza suficiente y toxicidad suficientemente baja. "Compatibilidad" se refiere a la capacidad de cada ingrediente de la composición para mezclarse mutuamente con el compuesto de la presente invención y la capacidad de mezclado mutua entre los ingredientes, sin disminuir sustancialmente la eficacia clínica del compuesto. Algunos de los ejemplos de excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables incluyen celulosa y sus derivados (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa sódica, acetato de celulosa, etc.), gelatina, speckstone, agente lubricante sólido (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio), sulfato de calcio, aceite vegetal (por ejemplo, aceite de guisante, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, etc.), polioles (por ejemplo, propilenglicol, glicerol, manitol, sorbitol, etc.), emulsionante (por ejemplo, Tween®), agente humectante (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), colorante, agente aromatizante, estabilizador, antioxidante, antiséptico, agua libre de pirógenos, etc.

Las vías adecuadas de administración del dímero de IL-22 de la presente solicitud incluyen, pero no se limitan a, administración oral, administración rectal, administración parenteral (intravenosa, intramuscular o subcutánea) y administración local.

Las formas sólidas ejemplares de la composición farmacéutica para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvo y gránulos. En estas formas sólidas, el agente activo se mezcla con por lo menos uno de los excipientes (o portadores) inertes convencionales, como citrato de sodio, fosfato dicálcico o cualquiera de los siguientes ingredientes: (a) agente de relleno o de carga, por ejemplo, almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (b) agente de adhesión, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; (c) humectantes, por ejemplo, glicerol; (d) agente de disgregación, por ejemplo, agar, carbonato de calcio, almidón de patata o almidón de mandioca, ácido algínico, silicato compuesto y carbonato de sodio; (e) agente tampón, por ejemplo, cera de parafina; (f) agente acelerador de la absorción, por ejemplo, compuesto de amina cuaternaria; (g) agente humectante, por ejemplo, cetanol y monoestearato de glicerina; (h) absorbente, por ejemplo bolo alba; y (i). agente lubricante, por ejemplo, speckstone, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicol sólido, lauril sulfato de sodio, o cualquier mezcla de los mismos. Las cápsulas, comprimidos y píldoras también pueden comprender un agente tampón.

Las formas sólidas como comprimidos, píldoras de azúcar, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con materiales de recubrimiento y de núcleo-envoltura, como cubiertas y otros materiales conocidos en la técnica. Estos materiales pueden comprender un agente opacificante, y el compuesto activo o compuesto en dicha composición puede liberarse de manera retardada de manera que la liberación se realice en cierta parte del canal alimentario. Pueden usarse componentes de incrustación como materiales poliméricos y materiales de cera. Si se desea, los compuestos activos pueden mezclarse con uno o más de los excipientes descritos anteriormente para formular una forma de microcápsula.

Las formas líquidas ejemplares de la composición farmacéutica descrita en la presente para administración oral comprenden una emulsión, una solución, una suspensión, un jarabe o una tintura farmacéuticamente aceptables. Aparte de los compuestos activos, las formas líquidas también pueden comprender diluyentes inertes usados convencionalmente en la técnica, como agua u otro solvente, agente solubilizante y emulsionante como etanol, isopropanol, acetato de carbonato, acetato de etilo, propan-2-ol, 1,3- butan-2-ol, dimetilfomamida y aceite, en particular aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceite de embrión de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo o cualquier mezcla de los mismos.

Además de estos diluyentes inertes, la composición también puede comprender aditivos como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, correctores y especias.

Además de los compuestos activos, la suspensión también puede comprender un agente de suspensión, como alcohol etoxilicoisoesteárico, polioxietilensorbitol, sorbitán, celulosa microcristalina, metóxido de aluminio, agar o cualquier mezcla de los mismos.

Las composiciones usadas para la administración parenteral también pueden comprender combinaciones líquidas fisiológicamente aceptables como agua estéril o solución anhidra, solución, suspensión o emulsión de dispersión, etc. Los portadores apropiadamente hidratados o anhidros, agentes de dilución, solvente, o excipiente que comprende agua, etanol, polioles (como propilenglicol, polietilenglicol, glicerina, etc.), y mezclas apropiadas de los mismos, se describen en la Farmacopea China o en las Farmacopeas de otros países. Preferiblemente, las composiciones líquidas también pueden comprender aditivos farmacéuticamente aceptables comúnmente usados, siempre que los aditivos no inhiban las funciones de los dímeros de IL-22. Los aditivos representativos incluyen (pero no se limitan a): tampón, regulador de PH y similares.

Las composiciones usadas para la administración parenteral también pueden comprender polvo esterilizado (por ejemplo, polvo liofilizado) que puede reconstituirse en una solución inyectable o solución de dispersión. Preferiblemente, el polvo liofilizado también puede comprender aditivos farmacéuticamente aceptables usados comúnmente, siempre que los aditivos no inhiban las funciones de los dímeros de IL-22. Los aditivos representativos incluyen (pero no se limitan a): tampón, regulador de PH. Preferiblemente, los solventes usados para disolver el polvo liofilizado incluyen (pero no se limitan a) solución de glucosa, solución de cloruro de sodio.

En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 descrito en la presente puede administrarse por vía intravenosa, por ejemplo, mediante infusión intravenosa o presión intravenosa.

Las formas del dímero de IL-22 de la presente invención usadas para la administración tópica comprenden pomadas, polvos, parches, pulverizadores e inhalantes. En condiciones estériles, los componentes activos pueden mezclarse con un portador fisiológicamente aceptable y cualquier agente antiséptico, tampón o propelente si se desea.

El dímero de IL-22 de la presente invención puede administrarse solo o junto con cualquier otro compuesto o agente farmacéuticamente aceptable.

Las microcápsulas que contienen el dímero de IL-22 de la presente invención pueden usarse como un sistema de liberación sostenida. El sistema de microcápsulas de liberación sostenida de proteína recombinante se ha aplicado con éxito a la hormona de crecimiento humano recombinante (rhGH), el interferón humano recombinante (rhIFN), IL-2 y MNrgp120 (Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799). (1996), Yasuda, Biomed Ther 27:1221-1223 (1993); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; US 5,654,010).

El sistema de liberación sostenida del dímero de IL-22 de la presente solicitud puede prepararse con poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que tiene buena compatibilidad biológica y amplia degradabilidad biológica. El ácido láctico y el ácido glicólico, los productos degradantes de PLGA, pueden depurarse rápidamente en el cuerpo humano. Además, la degradabilidad de ese polímero puede variar de varios meses a varios años dependiendo de su peso molecular y composición (Lewis, "Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), págs. 1-41)).

La dosificación y la concentración de la composición farmacéutica de la presente invención pueden ajustarse de acuerdo con las situaciones de uso reales. Un experto en la técnica debe saber cómo elegir la dosificación y la vía de administración adecuadas de acuerdo con las necesidades prácticas. El principio de ajuste entre diferentes especies, como ratones y humanos, puede verse en Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Pergamon Press, New York 1989, págs. 42-96..

Las siguientes realizaciones ejemplares describen adicionalmente la presente invención. Para las realizaciones en las que no se describen los detalles de los métodos experimentales, tales métodos se llevan a cabo de acuerdo con condiciones convencionales como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o según lo sugerido por los fabricantes.

EJEMPLOS

Se pretende que los ejemplos siguientes sean puramente ilustrativos de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse como limitativos de la invención de ninguna manera. Los siguientes ejemplos y la descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1. Papel de la señalización de IL-22RA1 en el mantenimiento de la barrera intestinal.

IL-22RA1 (receptor alfa 1 de IL-22) es un componente del receptor de IL-22, que se expresa en los tejidos epiteliales. Se generaron ratones knockout para IL-22RA1 intestinales específicos (denominados en la presente ratones IL-22RA1ñIEC) cruzando ratones IL-22RA1fl/fl x villin-cre para investigar los efectos de la señalización de IL-22RA1 sobre la respuesta inmunitaria intestinal.

Como se muestra en la FIG. 4, en comparación con los ratones de tipo salvaje, los ratones deficientes en la señalización intestinal de IL-22RA1 tenían un número significativamente reducido de células caliciformes y células de Paneth en el intestino delgado. Por lo tanto, la señalización de IL-22RA1 regula el número de células secretoras en el intestino delgado.

Las células de Paneth se encuentran en el fondo de las criptas intestinales y producen grandes cantidades de péptidos antimicrobianos, como la lisozima y Reg3g. La FIG. 5 muestra los resultados de un experimento de hibridación in situ con sondas contra ARNm de Reg3g en muestras de intestino de ratones de tipo salvaje y II-22RA1ñIEC En comparación con los ratones de tipo salvaje, los ratones II-22RA1AIEC habían reducido significativamente los niveles de expresión de Reg3g en el intestino.

Sin querer estar limitados por ninguna teoría o hipótesis, la señalización de IL-22RA1 regula el número de células caliciformes y células de Paneth promoviendo el desarrollo de células madre intestinales. Las células secretoras del intestino son efectores clave de la defensa innata de la mucosa que mantienen la integridad de la barrera intestinal. Por lo tanto, la señalización de IL-22RA1 e IL-22 desempeña funciones importantes en el mantenimiento de la barrera intestinal.

Ejemplo 2. El dímero de IL-22 protege a las células epiteliales intestinales contra la inflamación in vitro.

Este ejemplo investiga los efectos protectores in vitro de un dímero de IL-22 ejemplar contra la inflamación de las células epiteliales intestinales (células IEC-6). El dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, cada una de las cuales comprende un dominio de IL-22 y un dominio Fc (también denominado en la presente como "rIL-22"). El dímero de IL-22 de ejemplo consistía en dos subunidades monoméricas, cada una de las cuales comprendía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

Las células IEC-6 se sometieron a los siguientes cuatro grupos de condiciones: (1) Grupo de control: las células IEC-6 se cultivaron en medio y no se trataron con el dímero de IL-22 o lipopolisacárido (LPS); (2) grupo LPS: las células IEC-6 se cultivaron en medio y luego se estimularon con LPS; (3) grupo rIL-22: las células iEC-6 se pretrataron con el dímero de IL-22 y luego se cultivaron en medio; y (4) grupo LPS rIL-22: las células IEC-6 se pretrataron con el dímero de IL-22 y luego se estimularon con LPS. La respuesta inflamatoria de las células IEC-6 en cada grupo se evaluó monitorizando la translocación nuclear de NF-^{k B} usando inmunotinción y microscopía confocal, y midiendo los niveles de expresión de IL-6 (una citoquina proinflamatoria) usando qRT-PCR. Se usó RPLO como gen de control en los experimentos de qRT-PCR.

Como se muestra en la FIG. 6A, la estimulación con LPS de células IEC-6 llevó a un nivel significativo de translocación nuclear de NF-^{k B} (segundo panel desde la izquierda). El pretratamiento de las células IEC-6 con el dímero de IL-22 evitó de manera eficaz la translocación nuclear de NF-^{k B} en respuesta a la estimulación con LPS (tercer panel desde la izquierda).

Como se muestra en la FIG. 6B, la estimulación con LPS de las células IEC-6 llevó a un aumento del nivel de expresión de la citoquina proinflamatoria IL-6 en comparación con el grupo de control (P<0,05). El pretratamiento con el dímero de IL-22 redujo significativamente el nivel de expresión de IL-6 en comparación con el grupo LPS (P<0,05).

Los resultados demuestran que el dímero de IL-22 inhibe la translocación nuclear de NF-^{k B} y la expresión de IL-6 en células epiteliales intestinales in vitro. Como NF-^{k B} e IL-6 son efectores en sentido descendente de la vía de señalización de TLR-4 en la respuesta inflamatoria, el dímero de IL-22 puede proteger a las células epiteliales intestinales de la inflamación inhibiendo la señalización de TLR-4.

Ejemplo 3. El dímero de IL-22 promueve el crecimiento de células caliciformes y la expresión de genes de defensa del huésped en enteroides ex vivo.

Este ejemplo investiga los efectos inmunoprotectores de un dímero de IL-22 ejemplar (es decir, rIL-22) en enteroides de ratón y humanos. Las células madre intestinales se aislaron de las criptas de tejidos del intestino delgado de ratones B6 de tipo salvaje no tratados y de tejidos fetales humanos de 20 semanas, respectivamente. Las células madre intestinales se cultivaron durante 5 días para proporcionar enteroides, que se trataron con el dímero de IL-22 o con medio solo (control) durante 24 horas.

El número de células caliciformes y enterocitos en los enteroides se evaluó mediante inmunohistoquímica y microscopía confocal. Como se muestra en la FIG. 7, las células caliciformes se tiñeron contra Muc2 (rojo), los enterocitos se tiñeron contra E-cadherina (verde) y los núcleos se tiñeron usando DAPI (azul). Los resultados demuestran que el dímero de IL-22 promovió el crecimiento de los enterocitos y la diferenciación de las células madre intestinales en células caliciformes tanto en enteroides humanos como de ratón.

Además, la secuenciación del ARN se realizó en muestras de enteroides murinos del grupo de tratamiento con dímero de IL-22 y del grupo de control. Se compararon los niveles de expresión de los genes de defensa del huésped en los dos grupos. Como se muestra en la FIG. 8, muchos genes de defensa del huésped estaban regulados de manera diferencial en enteroides tratados con el dímero de IL-22 en comparación con los enteroides de control. Por ejemplo, las a-defensinas (como Defa-ps1, Defa22 y Defa29) y otros péptidos antimicrobianos (como Reg3g, Reg3b y Reg3d) fueron reguladas por incremento en los enteroides tratados con dímero de IL-22. Reg3a, Reg4 y Reg1 estaban regulados por disminución en los enteroides tratados con dímero de IL-22.

Los resultados demuestran que el dímero de IL-22 puede promover la diferenciación y el crecimiento de las células caliciformes y regular la expresión de los genes de defensa del huésped en enteroides de ratón y humanos. Las células secretoras del intestino, como las células caliciformes y los péptidos antimicrobianos secretados por las mismas, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la barrera intestinal y en la prevención o el tratamiento de la NEC.

Ejemplo 4. El dímero de IL-22 protege a las células epiteliales intestinales contra la inflamación in vivo.

En este ejemplo, se administraron LPS a ratones de tipo salvaje neonatales (7-10 días de edad) mediante alimentación forzada con fórmula y se trataron con IgG (control) o un dímero de IL-22 ejemplar (es decir, rIL-22) mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana en días postnatales 10-28. Se evaluó la respuesta inflamatoria en el íleon terminal de ratones en el grupo de tratamiento con dímero de IL-22 y el grupo de control mediante la cuantificación de las células secretoras (es decir, células caliciformes y células de Paneth) usando inmunohistoquímica, y midiendo los niveles de expresión de TLR4 usando qRT- PCR. Se usó RPLO como gen de control en los experimentos de qRT-PCR.

Como se muestra en la FIG. 9, en comparación con los ratones tratados con IgG, los ratones tratados con el dímero de IL-22 tenían un número significativamente mayor de células caliciformes (teñidas frente a Muc2) y células Paneth (teñidas frente a lisozima) en el íleon terminal (P<0,05). Por tanto, el tratamiento con el dímero de IL-22 puede aumentar la cantidad de células secretoras en los intestinos de los ratones, lo que es beneficioso para mantener la barrera intestinal y prevenir o tratar la NEC.

Además, en comparación con el grupo de tratamiento con IgG, los ratones de tipo salvaje tratados con el dímero de IL-22 tenían niveles de expresión de TLR4 significativamente más bajos (P = 0,005). Por lo tanto, el tratamiento con el dímero de IL-22 inhibe la señalización de TLR4 in vivo, lo que sugiere que el dímero de IL-22 puede proteger a las células epiteliales del intestino contra enfermedades mediadas por TLR4, como NEC.

Los resultados sugieren que el dímero de IL-22 puede ser eficaz para prevenir la NEC en ratones recién nacidos.

Ejemplo 5. Eficacia in vivo del dímero de IL-22 en el tratamiento de un modelo murino de NEC.

En este ejemplo, se estableció un modelo murino de NEC y se trató con un dímero de IL-22 ejemplar (es decir, rIL-22). La eficacia del dímero de IL-22 se evaluó comparando la gravedad de NEC en el grupo de tratamiento con dímero de IL-22, el grupo de NEC inducido y el grupo de control.

Métodos

Inducción de NEC en ratones neonatales.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Se indujo NEC experimental en ratones de 7 a 10 días de edad como se ha descrito con anterioridad (ver, por ejemplo, Sodhi CP, Neal MD, Siggers R et al., "Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice." Gastroenterology 2012;143:708-18 e1-5; y Afrazi A, Sodhi CP, Good M, et al., "Intracellular heat shock protein-70 negatively regulates TLR4 signaling in the newborn intestinal epithelium." J Immunol 2012;188:4543-57). Brevemente, se administró alimentación forzada con

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un dímero de IL-22 para su uso en un método para prevenir y/o tratar la enterocolitis necrosante (NCE) en un individuo, en donde el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un dímero de IL-22.

2. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la NEC es NEC en etapa I, NEC en etapa II o NEC en etapa III.

3. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el individuo es un bebé prematuro y/o el individuo es un bebé que tiene bajo peso al nacer.

4. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dímero de IL-22 comprende dos subunidades monoméricas, en donde cada subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización, opcionalmente en donde la subunidad monomérica comprende un dominio de IL-22 enlazado a un dominio de dimerización a través de un conector opcional.

5. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el conector tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, opcionalmente en donde el conector comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10 o tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 10.

6. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el dominio de dimerización comprende:

(a) por lo menos dos cisteínas capaces de formar enlaces disulfuro intermoleculares; y/o

(b) por lo menos una porción de un fragmento Fc, opcionalmente en donde el fragmento Fc:

(i) comprende los dominios CH2 y CH3; o

(ii) comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9 o tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 9.

7. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el dominio de IL-22 de cada una de las subunidades monoméricas tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o el dominio de IL-22 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

8. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el dominio de dimerización está en el extremo N-terminal del dominio de IL-22 o en el extremo C-terminal del dominio de IL-22.

9. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en donde cada una de las subunidades monoméricas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 y 6-8.

10. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el dímero de IL-22 se administra:

(a) en una cantidad eficaz de 1 pg/kg a 200 pg/kg, opcionalmente en donde el dímero de IL-22 se administra en una cantidad eficaz de 5 pg/kg a 80 pg/kg, o de 10 pg/kg a 45 pg /kg; y/o

(b) no más de aproximadamente una vez a la semana, opcionalmente en donde el dímero de IL-22 se administra no más de aproximadamente una vez al mes o no más de aproximadamente una vez cada tres meses.

11. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa.

12. El dímero de IL-22 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el individuo es un humano.

13. Una composición farmacéutica que comprende un dímero de IL-22 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de NEC.