PT1748789E - Il-22 para prevenir doenças infecciosas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

IL-22 PARA PREVENIR DOENÇAS INFECCIOSAS A invenção refere-se a biomarcadores de resistência a infecções em humanos e às suas aplicações biológicas, particularmente em diagnóstico, profilaxia e terapêutica.

Refere-se a biomarcadores de resistência a infecções devido a patogénicos em geral, particularmente infecções devidas a vírus e retrovírus, e mais particularmente a infecções com HIV. Várias doenças virais emergiram no final do século vinte, particularmente o Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) . Mais do que duas décadas desde a sua descoberta, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) epidémico é ainda um dos maiores fardos para as questões de saúde, sociais e económicas em todo o mundo. Durante 2002, cerca de 3,1 milhões de mortes foram reportadas, enquanto foram registados cerca de 5 milhões de novos casos de infecção. Mais de 40 milhões de pessoas são infectadas em todo o mundo e existe uma necessidade urgente de encontrar agentes para prevenção da disseminação deste vírus, assim como para melhorar o regime actual de tratamento. Até à data, o repertório genético do hospedeiro, as respostas imunitárias inatas e adquiridas, a mutação ou atenuação virai têm sido invocados para explicar a maior ou menor susceptibilidade individual à infecção. Foi feito um imenso progresso na compreensão do mecanismo de entrada do vírus da imunodeficiência humana nas células alvo. As descobertas 1 ΕΡ1748789Β1 importantes tais como a identificação de co-receptores virais e a estrutura da proteína do envelope virai (Env) ligada ao seu receptor proporcionou uma importante compreensão de como Env medeia a fusão das membranas virai e celular como descrito na Fig. 1. A existência de algumas pessoas de alguma forma "imunes" à infecção, apesar de sujeitos a uma repetida exposição ao HIV assim como a progressão extremamente lenta da doença em alguns indivíduos infectados com HIV, oferece valiosas pistas para elucidar os mecanismos subjacentes à resistência natural ao HIV. De forma notável, nestas revelações, os denominados Expostos Seronegativos, Expostos Não infectados (ESN, EU) e os de Progresso Lento, os de Progresso a Longo Prazo (SP, LTNP) têm respostas imunitárias comuns, e. g. a produção de anticorpos neutralizantes dirigidos contra alvos comuns, que podem desempenhar um papel prospectivo na entrada e/ou disseminação.

Em 1989 uma publicação de Ranki descreveu um fenómeno curioso: resposta de células T especifica para HIV contra HIV, gp 120 nativa e envelope recombinante e proteínas do núcleo podem ser detectadas em parceiros sexuais de homens que se conhecem positivos para HIV negativos para anticorpos e antigénios. Os outros dois relatórios confirmaram que a observação inicial e os autores consideraram a possibilidade de que a exposição a HIV que não resultava em seroconversão e infecção estaria associada com a iniciação exclusiva de linfócitos T auxiliares [2]. As análises realizadas em diferentes conjuntos de indivíduos com risco elevado de infecção com HIV, e incluindo profissionais de cuidados de saúde expostos a HIV de forma parentérica e recém-nascidos 2 ΕΡ1748789Β1 saudáveis de mães infectadas com HIV, revelaram que as células T auxiliares especificas para HIV, mas não os anticorpos, estavam presentes em todos estes indivíduos. Estas observações levaram à hipótese de que a exposição virai que resulta na iniciação exclusiva de células T específicas para HIV podia estar associada à protecção contra a actual infecção com HIV. Esta hipótese foi largamente apoiada por três trabalhadores de sexo comercial em Narobi (o estudo Pumwaani), claramente demonstrou que enquanto a maior parte das mulheres que se iniciaram na prostituição se tornaram infectadas com HIV num ano, uma minoria quantificável, subsequentemente estimada como sendo de cerca de 15% dos indivíduos testados, foi claramente resistente à infecção. 2) Sarah Rowland-Jones mostrou a presença de CTL específicos para HIV em recém-nascidos saudáveis de mães infectadas com HIV. A detecção de linfócitos T CD 8 que segregam iFNã, específicos para HIV, nestes recém-nascidos foi um ponto de viragem na percepção de que a exposição a HIV não associada à seroconversão está associada a uma infecção presente abortiva e que o vírus vivo, em replicação é, de facto, responsável pela estimulação da imunidade específica. De facto, apenas a infecção actual com o vírus pode resultar na apresentação de antigénios virais em associação com moléculas HLA de classe I, e aparecimento de uma resposta imunitária mediada por CD8. (muito mais tarde, o papel protector da imunidade mediada por células neste âmbito foi ainda reforçado pela observação de que a seroconversão tardia que ocorre em profissionais do sexo quenianos resistentes a HIV que interromperam a actividade comercial do sexo durante um período de tempo está relacionada com o decréscimo das respostas de CD8+ específicas para HIV devidas a reduzida exposição antigénica). 3) As experiências em que macacos expostos in 3 ΕΡ1748789Β1 vivo a doses subinfecciosas de SIV, e em que foram detectadas células auxiliares T especificas para SIV, demonstraram protecção contra exposições subsequentes com doses infecciosas do mesmo vírus (estes resultados não foram inequivocamente confirmados por outros investigadores).

Nasceu o campo da investigação da imunidade em correlação com a protecção contra a infecção com HIV. Subsequentemente, os principais relatórios mostram que em indivíduos expostos a HIV mas não infectados: 1) uma base genética particular, epitomizada pela deleção no receptor CCR5, pode estar presente; 2) é aumentada a produção de factores solúveis, incluindo factores celulares antivirais (CAF), quimioquinas beta, e defensinas alfa; 3) IgA específica para HIV segregada, assim como podem ser detectados auxiliares T e CTL em fluidos cervico-vaginais e

ejaculados [19], e 4) a actividade de células NK é particularmente potente [2] . Deste modo, 15 anos após a primeira descrição da detecção de células auxiliares T específicas para HIV em indivíduos seronegativos, a possível resistência à infecção com HIV pode ser sumarizada como estando correlacionada com o aparecimento da imunidade sistémica e mediada por células da mucosa, e IgA confinada na mucosa, possivelmente em circunstâncias genéticas favoráveis e imunidade natural. 4 ΕΡ1748789Β1

Tabela 1. Mecanismos sugeridos como associados com resistência a infecção com HIV.

Mecanismos adquiridos Mecanismos genéticos Imunidade Inata Células auxiliares T Deleção nos co- Actividade de NK específicas para HIV receptores de HIV-1 elevada CTL específicos para HIV Alelos HLA particulares Produção elevada de quimioquinas β IgA da Mucosa específica Produção elevada de para HIV CAF Anticorpos anti CD4 Concentração elevada de defensinas oí Anticorpos anti CCR5 A compreensão de mecanismos de resistência natural contra a infecção com HIV pode ter implicações na identificação de novas estratégias anti-virais e em particular para o desenvolvimento de concepções inovadoras para diagnóstico, terapêutica e vacinas.

Os inventores compararam os estudos dos perfis de proteína (proteoma) e expressão de genoma (transcriptoma) de indivíduos expostos a HIV não infectados (EU) , expostos a HIV e indivíduos infectados (HIV+) e dadores saudáveis (HC) para identificar biomarcadores de EU que podem explicar os mecanismos de resistência à infecção com HIV.

Identificaram uma citoquina chave que parece ser responsável pela indução de proteínas envolvidas na resistência a vírus.

Verificaram também que outra citoquina apresenta um polimorfismo entre os casos estudados que exibe um padrão particular nos EU. Além disso, também outras isoformas parecem estar envolvidas nos processos de resistência a HIV pelo seu efeito nos receptores FPR u FPRLI e a subsequente 5 ΕΡ1748789Β1 fosforilação dos co-receptores de HIV CCR5 ou CXCR4. Então, a combinação destas citoquinas foi considerada como um elemento que participa indirectamente no bloqueio da infecção virai, individualmente e em combinação, estes parecem também participar nos mecanismos de resistência a HIV. A invenção refere-se a IL-22 para utilização na prevenção de doenças por infecção iniciando a resposta imunitária inata.

As proteínas de uma resposta imunitária inata incluindo 11-22 da via Jack/STAT, S0CS3, beta defensinas (2 e 3) e a apolipoproteina amilóide do soro Ac da fase aguda ou A-SAA ou um seu fragmento, citoquina IL-8 e suas isoformas, têm grande valor nas aplicações biológicas atendendo às suas propriedades como biomarcadores de resistência a infecções com HIV. Particularmente, estas têm grande interesse para diagnóstico, terapêutica e profilaxia.

Na utilização acima mencionada uma quantidade eficaz de IL-22 está em associação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da invenção são vantajosamente preparadas para administração pela via oral, intramuscular, intravenosa ou mucosal.

Para administração oral, estas são apresentadas na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, rebuçados, pensos ou spray. 6 ΕΡ1748789Β1

Para administração por injecção, as composições farmacêuticas estão sob a forma de solução para injecção pela via intravenosa, subcutânea ou intramuscular produzida a partir de solução, ou suspensão ou emulsão estéril ou esterilizável.

Para administração por via mucosal, as composições farmacêuticas estão sob a forma de géis.

As doses de administração serão facilmente ajustadas por um especialista na técnica dependendo do estado do doente.

De acordo com ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um método para favorecer a resistência inata do hospedeiro a infecções virais, compreendendo a utilização de IL-22 como citoquina iniciadora de auxilio à resposta imunitária inata a infecções.

Outras características e vantagens da invenção serão dadas nos exemplos que se seguem e com referência às figuras 1 a 10, que representam, respectivamente:

Figura 1 : Diferentes passos da ligação do envelope virai aos receptores celulares,

Figura 2: Perfil SELDI-TOF de proteínas de indivíduos de diferentes conjuntos,

Figura 3: Efeitos inibidores na infecção por HIV-1 da cascata de infecção de EU, 7 ΕΡ1748789Β1

Figura 4: Depleção da proteína de cerca de 8,6 kDa utilizando um Mab anti-A-SAA,

Figuras 5 e 6: RT-PCR comparativa para IL-8 (Figura 5) e IL-22 (Figura 6) de indivíduos de diferentes conjuntos,

Figura 7: Validados de Western de análise SAGE de indivíduos de diferentes conjuntos,

Figura 8: Indução de fosforilação do co-receptor CCR5 de VIH-1 através da ligação à proteína SAA da fase aguda ao receptor FPR,

Figura 9: Infectividade de R5 de HIV-1 de células dendríticas imaturas,

Figura 10: Perfil de SELDI-TOF da preparação de SAA exibindo o fragmento de * 8, .6 kDa.

Materiais e Métodos

Recrutamento de indivíduos expostos não infectados (EU)

Foram incluídos indivíduos expostos a HIV mas não infectados. Em cada um dos casos o ESN foi o parceiro sexual de um doente infectado com HIV; em cada casal foi reportada um longa história de relações sexuais penetrativas sem preservativo (e sem outros factores de risco conhecidos). O critério de inclusão para os EU foi uma história de múltiplos episódios sexuais não protegidos durante pelo menos quatro anos com pelo menos quatro episódios de relação de risco 4 8 ΕΡ1748789Β1 meses antes do período de estudo. Os EUs foram repetidamente seronegativos para HIV por métodos de cultura e carga de vírus de RNA. Os indivíduos infectados com HIV e controlos saudáveis foram também incluídos no conjunto. Os doentes com HIV e HC foram divididos de acordo com o sexo e idade dos EU. Todos os indivíduos EU, HIV+ e HC foram longitudinalmente seguidos durante pelo menos 4 anos (antes do período de estudo) pelo Departamento das Doenças Infecciosas, Santa Maria Annunziata Hospital em Florença. Isto permitiu excluir do conjunto ESN e HC em que as doenças sexualmente transmitidas ou qualquer outra patologia foi reportada nesse período de tempo. Os EU foram caracterizados com base na presença de alelos de CCR5-A32; foi detectada uma deleção heterozigótica em 1 indivíduo. Todos os indivíduos EU, doentes com HIV e não infectados de baixo risco concordaram com a doação de células mononucleares do sangue periférico. Células

Foram realizados estudos comparativos de Proteómica e Transcriptómica em células T de EU e HIV+ que formam casais discordantes tendo frequentes relações sexuais não protegidas ou injecção invasiva de drogas com troca de seringas. As células T de HC foram os controlos destas análises. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC), obtidas a partir de 3 conjuntos: HC, EU e HIV+ foram recolhidas e separadas em Ficoll-Hypaque, foram cultivadas em prazo curto (6 dias) (Yssel, H. e Spits, H, em Current Protocols in Immunology, Capítulo 7.19) depois os linfócitos T (CD4+ e CD8+) foram activados com CD3/CD28 e cultivados em RPMI suplementados com 10% de FCS. Resumidamente, para activar o complexo CD3-TCR, 10 pg/mL de anti-CD3, anticorpo monoclonal 9 ΕΡ1748789Β1 para SPV-T3b (MAb) foi utilizado para revestir placas de 24 poços durante 4 h a 37°C. Subsequentemente, 106 células foram depositadas nestes poços revestidos na presença de meio de cultura (meio de Yssel, irvine scientific, Santa Ana, CA) contendo 1% de soro humano AB+ e 1 pg/mL de MAb anti-CD28 L293. Três tempos de activação de células T foram respectivamente efectuados: 2, 6 e 18 h. As células activadas misturadas de 5 indivíduos por conjunto (possuindo cada um, um número equivalente de células e RNA total, Tabela 2) para os estudos de expressão de genes de células T que foram efectuados utilizando a Serial Analysis Gene Expression (SAGE, Velculescu 1995). Subsequentemente, um conjunto de RNA total de cada indivíduo da mistura foi congelada para utilização posterior para validar individualmente os resultados de SAGE. Um conjunto destas células foi também utilizado para realizar análises de transferência de Power e Western (ver a seguir). As proteínas solúveis presentes no plasma de indivíduos (n=25, Tabela 2) de 3 conjuntos foram analisadas por abordagem de SELDI-TOF Ciphergen™.

As células dendríticas foram derivadas de monócitos de dadores saudáveis. Resumidamente, foi processada uma camada de células brancas para obter monócitos altamente purificados que foram cultivados em meio DMEM suplementado com 10% de FCS na presença de 10 ng/mL de IL-4 e 150 ng de GM-CSF (Becton and Dickinson) durante 7 dias para se obterem bem caracterizados utilizando MAbs apropriados (MAbs anti-sinal DC, Anti-CDla, anti-CD83 e anti-CD86) exibindo também a presença do péptido Formilo do tipo receptor 1 (FPRLl) (um receptor que pertence à família do receptor Péptido Formilo (FPR)) em Células Dendríticas imaturas (iDC) . As células foram mantidas a 37°C numa atmosfera húmida a 5% de CO2. 10 ΕΡ1748789Β1

Anticorpos e Reagentes A il-22 recombinante humana, Anticorpo policlonal anti-CCR5, policlonal anti-iL-22 humana foram adquiridos a R & D Systems (Oxon, UK), proteínas Soro Amilóide A (A-SAA) e IL-8 foram adquiridas a Peprotech (Rocky Hill, NJ), MIP-Ιβ foi obtido de (Françoise Baleux (Pasteur Institute, Paris, França), MAb Anti-lL-8 foi adquirido a Bender, MAbs Anti-CXCR4, Anti-SAAl e 2 (Biosource), Anti-SAA MAb (Calbiochem), Ab policlonal Anti-Stat-1 activo, MAb anti-Statl, Ab policlonal Anti-Stat-3 activo, pAb Anti-Stat-3, anti-active Stat-5 Ab policlonal, MAb Anti-Stat-5 foi adquirido a Becton and Dickinson (Paio Alto, CA) . 0 Ab policlonal anti-SOCS 3 (Santa Cruz laboratories, Santa Cruz, CA).

Análise de Plasma por abordagem de SELDI-TOF de Proteína em Chip

Antes da análise, as amostras de plasma foram centrifugadas a 13 000 rpm durante 15 min, o precipitado foi rejeitado e sobrenadante foi diluído (1:10) em tampão de ligação optimizado (BB: NaCl 0,250 M de Hepes de 50 mM, pH 7,5). As amostras de plasma diluídas foram aplicadas durante 1 h em Protein-chips™ de forte troca iónica previamente saturados (SAX2) por dois banhos BB de 5 min. As proteínas não ligadas foram removidas com lavagem utilizando sucessivamente 3 lavagens de 5 min com o tampão de lavagem (WB: NaCl a 1 M, Hepes a 50 mM, pH 7,5) e uma lavagem final utilizando 5 pPL de água pura bi-destilada. As proteínas capturadas pelo Chip foram subsequentemente secas ao ar à temperatura ambiente (TA) antes da sua cobertura com uma matriz (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinapínico (SPA) em 99,9% 11 ΕΡ1748789Β1 de acetonitrilo e 0,1% de ácido trifluoroacético) para absorver a energia laser. As amostras preparadas em matriz foram secas à TA. Estas amostras receberam então uma media de 100 descargas de laser em tempo real para desabsorver as proteínas capturadas a uma intensidade de laser que variou desde 10 000 até 40 000 descargas (unidades arbitrárias) para produzir um espectro de proteína (proteograma). As proteínas ionizadas e desabsorvidas foram detectadas e as suas massas moleculares assinaladas nos picos de proteograma foram determinadas utilizando análise TOF com o software Protein-Chip Biology System II (PBS II; Ciphergen) e o software Ciphergen Peaks. A proporção massa para carga (m/z) de cada proteína capturada pela superfície do chip foi determinada de acordo com padrões externamente calibrados: Angiotensina I humana (1,2965 quilodaltons, kDa), ACTH humana (2, 9335 kDa), α-endorfina human (3,4650 kDa), insulina bovina (5,7336 kDa), e ubiquitina bovina (8,5648 kDa).

Depleção da proteína de ~ 8,6 kDa do plasma de EU A vinte e cinco microlitros de esferas magnéticas (Dynal) lavadas 3 vezes com 1 mL de PBS foram adicionados 25 pg de MAb anti-A-SAA (SAA-1 & SAA-2) de Clinisciences concentrado a 100 pg/mL e incubados durante 18 h a 4°C em agitação orbital. As esferas revestidas com MAb anti-A-SAA foram subsequentemente lavadas 3 vezes com 1 mL de PBS. Foram então adicionados quinhentos microlitros de plasma de EU e incubados a 37°C durante 3 h sob agitação. Este sobrenadante de plasma foi então reanalisado utilizando o Chip apropriado de Ciphergen. Foram aplicados cinco microlitros de EU pré-incubados com MAb anti-A-SAA 1 & 2 ou não e analisados como previamente indicado por SELDI-Tof (Ciphergen™). 12 ΕΡ1748789Β1

Inibição da infecção com HIV-1 pela proteína recombinante A-SAA

Antes da infecção com hiv-1 as células iDC foram incubadas durante 1 h nas concentrações designadas com a apolipoproteina amilóide do soro A da fase aguda humana (SSA de Peprotec™) que é um agonista de FPRLl. Subsequentemente, as células foram infectadas com HIV-1 ADA ou HXB2 a um MOI de 0,1 durante 2 horas. As células foram extensivamente lavadas e incubadas em meio completo. Os niveis de p24 de HIV-1 foram determinados por ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (Beckman-Coulter, França) 4 dias após infecção.

Análise de SAGE A SAGE foi efectuada essencialmente como delineado no protocolo detalhado de Velculescu obtenível na URL: WWW.sagenet.org com as modificações de Powell e Kenzelmann.

Análise de transferência de Power A análise de imunotransferência de proteínas foi realizada como descrito (www.translab.com/shtml).

Resumidamente, células T estimuladas com CD3/CD28 dos 3

conjuntos foram lisadas pelo tampão de lise (Tris a 10 mM pH 7,4, Na+ ortovanadato a 1 mM, SDS a 1%), sonicadas e clarificadas por centrifugação. As proteínas foram separadas em géis de 5-15% de gradiente de SDS-poliacrilamida para detectar uma vasta gama de tamanhos de proteínas em um gel. Quatrocentos microgramas de proteína foram aplicados em poços longos ao longo da largura total do gel. Isto traduziu-se em cerca de 15 pg de proteína sujeita a electroforese por linha 13 ΕΡ1748789Β1 num gel convencional de 25 poços. Subsequentemente, o gel foi transferido para uma membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) durante a noite. Após transferência, as membranas foram bloqueadas durante for 1 h com 5% de leite. Subsequentemente, a membrana foi inserida num sistema de multi-saida de transferência de Western que isola 45 canais ao longo da membrana. Em cada canal, foram adicionados diferentes misturas complexas de anticorpo e foram deixados hibridar durante 1 h. Após coloração, as membranas foram lavadas e hibridadas durante 30 minutos com secundário de cabra anti-peroxidase de rábano de murganho (HRP). Todos os anticorpos foram monoclonais de murganho. As membranas foram lavadas e desenvolvidas com SuperSignal West Pico (Pierce, Santa Clara, CA).

Análise de RT-PCR O RNA total, isolado de células T activadas foi convertido por transcrição reversa em cDNA. Para cada amostra de RNA total de transcrição reversa a 42°C durante 50 min, foram utilizados os seguintes reagentes: 1 pg de RNA total e 200 Unidades de Superscript II reverse transcriptase (RT, Gibco-BRL); tampão de RT conforme fornecido; 100 mmol/L de ditiotreitol (DTT), 40 units de Rnasin (Promega, Madison, wi, USA); 1,25 mmol/L de cada dNTP; e 500 ng de oligo dTs. O PCR foi realizado como se segue: 2 pL de cDNA; 1,25 mmol/L de cada dNTP, 2,5 unidades de Taq polimerase (Promega); 2,5 mmol/L de MgCl2, 2,5 pL de tampão 10X e 20 pmol de cada par de iniciadores especifico num volume total de 25 pL. foram utilizados os seguintes iniciadores específicos: IL-22: SEQ ID N° 1 com sentido 5' -TGACAAGTCCAACTTCCAGCAG-3' , SEQ ID N°2 antisentido 5'-TCTGGATATGCAGGTCATCACC- 3'; IL-8: SEQ ID N°3 14 ΕΡ1748789Β1 com sentido 5'-AACTTCTCCACAACCCTCTG-3' , SEQ ID N°4 antisentido 5'-TTGGCAGCCTTCCTGATT- 3'; GAPDH: SEQ ID N°5 com sentido 5'- CCA-CCC-ATG-GCA-AAT-TCC-ATGGCA-3' e SEQ ID N°6 antisentido 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' . Após pré-incubação (94°C, 5 min), cada amostra de PCR sofreu 29 ciclos de amplificação com um regime de desnaturação (94°C, 1 min), emparelhamento de iniciadores (56°C, 1 min) e extensão do iniciador (72°C, 1 min) com uma extensão final (72°C, 10 min) .

Análise de transferência de Western

Um milhão de células T activadas com CD3/CD28 (como acima indicado) de cada conjunto (HC, EU, e HIV+) foram lisadas num tampão NP40 a 1%. Para cada grupo, iguais quantidades de proteina foram sujeitas a electroforese sob condições de redução e transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas durante 30 min em TBS (50 mmol/L de NaCl, 20 mmol/L de Tris HC1, pH 7,5) contendo 5% de BSA e 0,1% de Tween 20 e depois incubadas durante a noite a 4°C com um anticorpo primário. As proteínas foram visualizadas utilizando o sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . As transferências foram lavadas em TBS contendo 0,1% de Tween 20 e incubadas com HRP conjugada com anti-coelho de cabra ou anticorpo secundário anti-murganho (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).para reanalisar com outro anticorpo, os filtros foram cortados às tiras como previamente descrito [10] . 15 ΕΡ1748789Β1

Avaliação da fosforilação do co-receptor de Hiv-l

As células Dendríticas Imaturas foram estimuladas com mip-1β ou com a A-SAA de fase aguda (Peprotec™) nas concentrações indicadas (na Fig 7) para os períodos de tempo indicados a 37°C. depois as células foram lisadas após 20 minutos em gelo com uma mistura periódica no tampão de lise (1% de Triton X-100, 20 mM de Tris HC1 pH 8,0, 137 mM de

NaCl, 15% de glicerol, 5 mM de EDTA) contendo inibidores da fosfatase (1 mM de fluoreto de fenilsulfonilo, 5 pg/mL de aprotinina, 5 pg/mL de leupeptina, 1 mM de ortovanadato de sódio, 1 mM de EGTA). Os lisados de células foram pré-clarificados com 30 pL de esferas de proteína A Sepharose lavadas (15 pL de esferas empacotadas) a 4°C durante 1 h e 1 pg de anticorpo policlonal anti-fosfoserina (BD) foram adicionadas a 200 pg de lisados de células. A mistura de reacção foi incubada a 4°C durante a noite. O complexo imunitário foi capturado por adição de 50 pL de esferas de proteína A sepharose (25 pL de esferas empacotadas) lavadas. A mistura de reacção foi incubada a 4°C durante mais 2 horas.

As esferas foram centrifugadas (10 seg a 14 000 rpm), o sobrenadante foi drenado, foram lavadas 3 vezes com 1 X tp IP, depois foram ressuspendidas em 30 pL de tampão de amostra 2 X Laemli e fervidas durante 5 min para eluir o complexo imunitário. Após electroforese em gel pré-encastrado a 10% de SDS-PAGE (Invitrogen), as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. O CCR5 foi visualizado utilizando uma policlonal anti-CCR5 (R & D Systems) e sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). 16 ΕΡ1748789Β1

Quimioquina Humana, Searchlight™, matrizes

Quatro plasmas diferentes de cada conjunto estudado foram analisados seguindo as instruções do fabricante das matrizes de quimioquina Searchlight (Pierce Endogen, Perbio, Boston) para o conteúdo em plasma em 8 quimioquinas.

Resultados

Apesar de serem repetidamente expostos ao vírus da Imunodeficiência Humana de Tipo I (HIV-1) através das vias sexual ou sistémica certos indivíduos permanecem não infectados. Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à resistência a infecção com HIV-1, os inventores realizaram um estudo comparativo em células T do sangue periférico activadas com CD3/CD28 (para melhorar a sinalização celular e expressão dos genes) e plasma (para estudar as suas proteínas solúveis) de conjuntos de indivíduos expostos a hiv-1 não infectados (EU), seus parceiros sexuais infectados com HIV-1 e controlos saudáveis. n. categoria HIV+ parceiro de cada EU Carga virai CD 4 EU HIV+ 1 EU1 HIV+ 20 460 348 2 EU2 HIV+ 21 <400 244 3 EU3 HIV+ 22 400 327 4 EU4 HIV+ 23 9420 328 5 EU5 HIV+ 24 9440 916 6 EU6 HIV+ 18 <50 205 7 EU7 HIV+ 25 750000 16 8 EU8 HIV+ 26 2070 636 9 EU9 HIV+ 27 399 101 17 ΕΡ1748789Β1 10 EU10 HIV+ 28 750000 424 11 EU11 HIV+ 9 <50 673 12 EU12 HIV+ 29 <50 13 EU13 HIV+ 16 <50 472 14 EU14 HIV+ 19 <50 1220 15 EU15 HIV+ 13 <50 321 16 EU16 HIV+ 30 <400 385 17 EU17 HIV+ 31 >750000 49 18 EU18 HIV+ 32 400 339 19 EU19 HIV+ 33 <50 20 EU20 HIV+ 34 400 327 21 EU21 HIV+ 35 350000 166 HC 1 HCl HlVneg 2 HC2 HlVneg 3 HC3 HlVneg 4 HC4 HlVneg 5 HC5 HlVneg 6 HC6 HlVneg 7 HC7 HlVneg 8 HC8 HlVneg 9 HC9 HlVneg 10 HC10 HlVneg 11 HC11 HlVneg 12 HC12 HlVneg 13 HCl 3 HlVneg 14 HCl 4 HlVneg 15 HCl 5 HlVneg 16 HCl 6 HlVneg 17 HCl 7 HlVneg 18 HCl 8 HlVneg 19 HCl 9 HlVneg 20 HC20 HlVneg 21 HC21 HlVneg 22 HC22 HlVneg 18 ΕΡ1748789Β1

Foram efectuadas análises complementares de genómica, proteómica e sinalização de células utilizando Serial Analysis Gene Expression (SAGE), Ionização e Desabsorção Laser Melhorada de Superfície e Espectrofotometria de Tempo de Vôo de Massa (SELDITOF, Ciphergen™) e Power blotting™, respectivamente (ver Material e Secção 6 de Métodos). A compreensão da genética e fisiologia dos indivíduos que não progridem a longo prazo (LTNP) e EU com respeito aos mecanismos anti-virais naturais deve proporcionar a base do tratamento contra a infecção com HIV. Os inventores estudaram depois os mecanismos fisiopatológicos com base na ausência de infecção em indivíduos sujeitos a exposições frequentes a HIV em indivíduos EU. Os primeiros resultados obtidos do elevado número de marcas de genes (HC: 21193 marcas, EU: 22697 marcas, e HIV+: 17 285 marcas) de análises de transcriptoma pelo método de SAGE mostraram que se verificava que os EU sobre-expressavam a IL-22 Thl e S0CS1 e que a Granzyme B era sub-expressa em HIV+ em comparação com os conjuntos EU e HC que exibiram níveis semelhantes (Tabela 3) . Claro que estes resultados foram obtidos sem possuir qualquer ideia "a priori".

SAGE

Expressão ao Nível do Gene GENE HC ESN HIV + IL - 22 1 13 0 SOCS 1 0 3 0 Granzyme B 3, 91 3, 96 0

Transferência de Potência 19 ΕΡ1748789Β1

Expressão ao nível da Proteína PROTEÍNA HC ESN HIV + STAT3 0 5 0

Utilizando em paralelo a análise de Transferência de Power de proteínas de células T misturadas de 3 conjuntos foi detectado o factor STAT3 de resposta de fase aguda. As análises de plasma (utilizando a abordagem de SELDI-TOF) de 25 indivíduos por conjunto mostraram um aumento de expressão de uma proteína solúvel de ~8,6 kDa de PM, (Fig. 2).

Tomando em conta que IL-22 inicia uma cascata (Fig. 3) de resposta imunitária inata que inclui a via Jack/STAT, SOCS 3, beta-defensinas, e a apolipoproteína A amilóide do soro de fase aguda (A-SAA): SAA-1 e SAA2, estes dados foram depois desenvolvidos utilizando diferentes métodos para confirmar e estender o seu significado (ver Secção de Material e Métodos). Sintetizada no fígado e em outros tecidos como epitélios de vasos sanguíneos, a ASAA é encontrada associada a HDL e isenta de HDL no plasma. 0 promotor de A-SAA é altamente responsivo a citoquinas inflamatórias tais como ΙΤίβ, TNFa; IFNy e IL6 que podem ser induzidas por LPS. Além disso, recentemente, foi demonstrado que a citoquina IL-22 Thl é capaz de participar na expressão de A-SAA. Estas observações sugeriram que a A-SAA pode desempenhar um papel como uma molécula de defesa imunitária inata nos locais. A clivagem pós-tradução de A-SAA produz fragmentos C-terminais de aproximadamente 8,5 kDa de PM. Para identificar a proteína de ~8.6 kDa obtida da análise de SELDI-TOF, foi utilizado uma MAb anti-A-SAA específico antes da obtenção do perfil de SELDI-TOF do plasma e como apresentado na Fig. 4 o pico 20 ΕΡ1748789Β1 correspondente a ~8,.6 kDa foi diminuído utilizando este MAJo anti-A-SAA. De forma interessante, é também conhecido que a A-SAA é capaz de induzir a citoquina IL-8, depois foi efectuado um RT-PCR específico para il-8 de 5 indivíduos de cada conjunto para verificar que esta citoquina caracteriza a cascata de EU. A Figura 5 mostra claramente que o PCR evidencia um polimorfismo e específico de IL-8 em EU em comparação com os outros 2 grupos (HIV+ e HC). Um RT-PCR específico para IL-22 foi também realizado (Figura 6) em cada indivíduo que formava as misturas e podia observar-se que apenas os EU sobre-expressavam de modo significativo esta importante citoquina Thl.

Foram efectuados outros controlos e validações, tendo deste modo sido efectuadas as análises de Transferência de Western em proteínas de amostras em mistura. Foi também observado no grupo EU que STATl e STAT3 foram fosforiladas (Figuras 7A e 7B), enquanto STAT5 foi regulada negativamente nos Hiv+ mas verificaram-se níveis de activação iguais ou superiores em ambos os grupos HC e EU (Figura 7C). A expressão da proteína S0CS3 (Figura 7D), um gene responsivo a STAT3, foi regulado negativamente nos EU. Além disso, estes indivíduos EU mostraram sobre-expressar alfa-defensinas. Além disso, foi demonstrado que IL-8 é capaz de dessensibilizar os co-receptores de HIV através da família de receptores FPRs e que Statl é necessária para a inibição mediada pelo factor celular antiviral (CAF) da activação da repetição terminal Longa (LTR) de HIV-1 e replicação de HIV.

Uma vez que os agonistas de FPR e FPRLl, A-SAA solúvel, o péptido WKYMWVm, o péptido quimiotáctico bacteriano fMLF, e provavelmente o seu fragmento de ~8,6 kDa), induz 21 ΕΡ1748789Β1 fosforilação como apresentado nas nossas experiências utilizando A-SAA em transferências de Western especificas (Figura 8) e modulação negativa dos co-receptores CCR5 e CXCR4 de Hiv-l através da activação de fpr. Depois, como reportado [31,38], foi demonstrado que proteína A-SAA inibiu a infecção por HIV-I (Figura 9). A A-SAA adquirida a Peprotec™ utilizada nestes ensaios exibia o fragmento de ~8,6 kDa (Figura 10).

Estes resultados permitiram identificar uma cascata de eventos que favorecem a resistência inata do hospedeiro a infecção com HIV caracterizando os EU. Uma vez que IL-22 é capaz de, via JAK/STAT, induzir as defensinas Beta, A-SAA e que a A-SAA induz a secreção de IL8 da sua expressão, estes resultados apresentam claramente esta cascata. Além disso, a IL-8 e β-Defensina mostraram diminuir a infecção com HIV-I. Em conjunto, os nossos resultados mostram que IL-22 é uma citoquina iniciadora que auxilia a resposta imunitária inata que proporciona mecanismos resistentes a infecção com HIV (Figura 2).

Adicionalmente a análise de SAGE mostrou de forma interessante que a Granzyme B foi regulada negativamente em HIV+ mas mantinha-se nos indivíduos EU e HC. Isto confirma a observação da perda de granzyme verificada em indivíduos tratados com HIV-HAART [2, 3] . Os inventores observaram também na análise de SAGE uma maior produção de IFN-gama em EU do que em HC e HIV+. Esta citoquina é tipicamente um antiviral que foi encontrada em alguns estudos em EU realizados por outros. 22 ΕΡ1748789Β1

Tendo em conta que se verificou que a cascata de eventos induzia elementos vários e principais da imunidade inata, o âmbito da invenção também se estende a outros vírus e retrovírus para além de HIV.

Deve também ser considerado que os EU exibiam quantidades superiores de STATl fosforilada e que de forma importante, este elemento é essencial para a actividade dos "Factores celulares anti-virais" (CAF) segregados pelas células T CD8. Foi também demonstrado que HIV+ parece perder as Granzymes B em comparação com EU e HC. As Granzymes B são produzidas por células T CD8 e NK para matar células infectadas. A produção de Granzymes B CAF dependente de STAT-1 desempenha um papel principal na actividade anti-HIV em pessoas que resistem ao desenvolvimento da SIDA apesar da sua infecção com HIV.

Foi também observado na análise de SAGE uma maior produção de iFN-gama em eu do que em HC e Hiv+. Esta citoquina é tipicamente antiviral.

Estes elementos de cascatas devem estar envolvidos não apenas como elementos da resistência a infecção virai mas também como elementos da resistência à doença induzida.

Lisboa, 28 de Março de 2011 23

Claims (6)

1. ΕΡ1748789Β1 REIVINDICAÇÕES 1. IL-22 para utilização na prevenção de doenças infecciosas por iniciação da resposta imunitária inata.
2. 2. IL-22 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que IL-22 está numa forma de citoquina em associação com um veiculo farmaceuticamente inerte.
3. 3. IL-22 para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os fármacos estão em formulações para aplicação oral ou em mucosa ou por injecção.
4. 4. IL-22 para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que, para aplicação oral, os fármacos são apresentados na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, rebuçados, pensos ou spray.
5. 5. IL-22 para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que para aplicação por injecção, os fármacos estão sob a forma de solução para injecção por via intravenosa, subcutânea, ou intramuscular produzidos a partir de solução, ou suspensão ou emulsão estéril ou esterilizável.
6. 6. IL-22 para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que, para aplicação em mucosa, os fármacos estão sob a forma de géis. Lisboa, 28 de Março de 2011 1