CN111655717A - IL-22 Fc融合蛋白及使用方法 - Google Patents

IL-22 Fc融合蛋白及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及IL‑22Fc融合蛋白、包含其的组合物、制备和/或纯化其的方法、选择IL‑22Fc融合蛋白或其组合物的批次的方法和使用组合物治疗疾病(例如，IBD)的方法。

Description

IL-22 Fc融合蛋白及使用方法
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且按引用整体并入本文中。所述ASCII拷贝，生成于2019年1月24日，命名为50474-180WO2_Sequence_Listing_1.24.19_ST25，并且大小为121,827字节。
发明领域
本发明涉及IL-22 Fc融合蛋白、包含其的组合物(例如，药物组合物)，及其制备、纯化和使用方法。
发明背景
白介素(IL)-22是例如由Th22细胞、NK细胞、淋巴组织诱导(LTi)细胞、树突细胞和Th17细胞产生的细胞因子IL-10家族的成员。IL-22结合到IL-22R1/IL-10R2受体复合物，其在天然细胞(诸如上皮细胞、肝细胞和角化细胞)中并在若干种组织(例如真皮、胰腺、肠和呼吸系统)的屏障上皮组织中表达。
IL-22在黏膜免疫中起着重要作用，介导对于黏附和脱落细菌病原体的早期宿主防御。IL-22促进抗微生物肽和促炎细胞因子从上皮细胞产生并且刺激肠道中结肠上皮细胞的增殖和迁移。在细菌感染后，IL-22敲除小鼠表现出受损的肠道上皮再生、高细菌负荷和增加的死亡率。同样地，用流感病毒感染IL-22敲除小鼠导致严重的体重减轻和受损的气管和支气管上皮细胞再生。因此，IL-22在抑制微生物感染中起着促炎性作用并在炎症反应中在上皮再生中起着抗炎性保护作用。
仍然需要改善的治疗剂和方法，用于治疗炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，以及其他病症，包括微生物感染、急性肾损伤、急性胰腺炎、创伤、心血管病况、代谢综合症、急性内毒素血症、移植物抗宿主病(GVHD)和败血症。仍然需要用于制备和纯化此类治疗剂的改进方法。
发明概述
本发明尤其提供了白介素(IL)-22 Fc融合蛋白、包含其的组合物(例如，药物组合物)，及其制备、纯化和使用方法，例如用于治疗包括IBD、微生物感染、急性肾损伤、急性胰腺炎、创伤、心血管病况、代谢综合症、急性内毒素血症、GVHD和败血症的疾病，以及选择用于释放的包含IL-22 Fc融合蛋白的批次的方法。本文还提供了控制IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量的方法和通过调节IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的唾液酸含量来降低体内清除和/或增加半衰期的方法。
在一个方面中，本发明的特征在于包含白介素22(IL-22)Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的糖基化IL-22多肽，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22多肽是N糖基化的。在一些实施方案中，IL-22多肽在对应于SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143的一个或多个位置被糖基化。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的糖基化IL-22多肽，其中IL-22多肽在对应于SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143的一个或多个位置被糖基化，并且其中：(a)残基Asn21上的百分比N-糖基化位点占有率在70至90的范围内；(b)残基Asn35上的百分比N-糖基化位点占有率在90到100的范围内；(c)残基Asn64上的百分比N-糖基化位点占有率在90到100的范围内；和/或(d)残基Asn143上的百分比N-糖基化位点占有率在25到35的范围内。
在前述任一个方面的一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8或9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。在其他实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
在前述任一个方面的一些实施方案中，唾液酸糖基化包括N-乙酰神经氨酸(NANA)。
在前述任一个方面的一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于1摩尔NGNA的平均N-乙醇酰神经氨酸(NGNA)含量。
在前述任一个方面的一些实施方案中，组合物是液体组合物。
在前述任一个方面的一些实施方案中，(i)IL-22 Fc融合蛋白具有约8,000ng/mL至约19,000ng的最大观察浓度(Cmax)；(ii)IL-22 Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)；和/或(iii)IL-22 Fc融合蛋白具有约40mL/kg/天至约140mL/kg/天的清除率(CL)。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax、AUClast和/或CL。
在前述任一个方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含含有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构；(ii)约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构；(iii)约25％至约40％的N-聚糖具有三触角结构；和/或(iv)约30％至约51％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中：(i)0.1％至2％的N-聚糖具有单触角结构；(ii)10％至25％的N-聚糖具有双触角结构；(iii)25％至40％的N-聚糖具有三触角结构；和/或(iv)30％至51％的N-聚糖具有四触角结构。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含含有零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约9％至约32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分；(ii)约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分；(iii)约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分；(iv)约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分；和/或(v)约12％至约30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中：(i)9％至32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分；(ii)10％至20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分；(iii)8％至25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分；(iv)12％至25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分；和/或(v)12％至30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含含有零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约12％至约30％的N-聚糖包含零个唾液酸部分；(ii)约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分；(iii)约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分；(iv)约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分；和/或(v)约1％至约20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中：(i)12％至35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分；(ii)10％至30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分；(iii)10％至30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分；(iv)10％至30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分；和/或(v)1％至20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，(i)IL-22多肽包含约0％至约10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖；和/或(ii)IL-22多肽包含约30％至约55％含有末端N-乙酰葡糖胺(GlaNAc)部分的N-聚糖。在一些实施方案中，(i)IL-22多肽包含0％至10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖；和/或(ii)IL-22多肽包含30％至55％含有末端GlaNAc部分的N-聚糖。在一些实施方案中，IL-22多肽包含0％至10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中，IL-22多肽包含30％至55％含有末端GlcNAc部分的N-聚糖。
在任何前述方面的一些实施方案中，N-聚糖包含一个、两个、三个或四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，(i)约1％至约20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分；(ii)约1％至约20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分；(iii)约5％至约25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分；和/或(iv)约0％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中：(i)1％至20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分；(ii)1％至20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分；(iii)5％至25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分；和/或(iv)0％至15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，(i)IL-22多肽包含约20％至约45％含有末端半乳糖(Gal)部分的N-聚糖；和/或(ii)N-聚糖包含一个、两个或三个末端Gal部分。在一些实施方案中，(i)IL-22多肽包含20％至45％含有末端Gal部分的N-聚糖；和/或(ii)N-聚糖包含一个、两个或三个末端Gal部分。
在任何前述方面的一些实施方案中：(i)约15％至约30％的N-聚糖包含一个末端Gal部分；(ii)约1％至约15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分；和/或(iii)约0.1％至约6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中：(i)15％至30％的N-聚糖包含一个末端Gal部分；(ii)1％至15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分；和/或(iii)0.1％至6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
在任何前述方面的一些实施方案中：(i)IL-22多肽包含含有半乳糖N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖；(ii)IL-22多肽包含含有岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖；和/或(iii)IL-22多肽包含含有无岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。
在另一个方面中，本发明提供了包含具有表12或13中所示的N-聚糖分布的IL-22Fc融合蛋白的组合物。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约0.5mg/mL至约20mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约0.5mg/mL至约5mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约1mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约8mg/mL至约12mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约10mg/mL。
在任何前述方面的一些实施方案中，从具有至少约500L体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。在任何前述方面的一些实施方案中，从具有约500L至约5,000L体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约1,000L至约3,000L体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约1,500L至约2,500L体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约2,000L至体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。
在任何前述方面的一些实施方案中，Fc区是未糖基化的。在一些实施方案中：(i)按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly或Ala；和/或(ii)按照Fc区的EU索引中的位置299的氨基酸残基是Ala、Gly或Val。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly或Ala。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly。在其他实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Ala。
在任何前述方面的一些实施方案中，Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽是人IL-22多肽。在一些实施方案中，IL-22多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)或由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)组成。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22受体是人IL-22受体。在一些实施方案中，人IL-22受体包含由IL-22R1多肽和IL-10R2多肽组成的杂二聚体。在一些实施方案中，IL-22R1多肽包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列，而IL-10R2多肽包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由两个单链单元组成，所述单元通过两个链间二硫键连接，其中每个单链单元由包含与人免疫球蛋白IgG4的Fc区融合的IL-22的人IL-22融合蛋白组成。
在任何前述方面的一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合6565物是含水和/或无菌的。在一些实施方案中，组合物进一步包含其他治疗剂。在一些实施方案中，组合物进一步包含胶凝剂。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎是中度至重度溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，IBD是克罗恩氏病。
在另一个方面中，本发明的特征在于本文所述的任何组合物，用作药物。
在另一个方面中，本发明的特征在于本文所述的任何组合物用于(i)治疗炎性肠病(IBD)，(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，(vi)治疗代谢综合症，(vii)治疗急性内毒素血症或败血症，或(viii)治疗GVHD。
在另一个方面中，本发明的特征在于本文所述的任何组合物用于制备药物，所述药物用于(i)治疗炎性肠病(IBD)，(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，(vi)治疗代谢综合症，(vii)治疗急性内毒素血症或败血症，或(viii)治疗GVHD。
在另一个方面中，本发明的特征在于抑制需要其的对象的肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于加速或促进需要其的对象中的创伤愈合的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于预防或治疗需要其的对象中的心血管病症的方法，所述病症包括动脉粥样硬化斑块形成的病理，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的代谢综合症的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗急性内毒素血症、败血症或两者的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的GVHD的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物施用于对象。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述组合物通过静脉内、皮下、腹膜内或局部施用。
在任何前述方面的一些实施方案中，给对象共同施用至少一种其他治疗剂。
在另一个方面中，本发明的特征在于制备包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，所述IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽；(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；(c)在适于形成接种训练培养物的条件下在接种培养基中接种种子训练物；和(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，并且其中步骤(d)的持续时间为至少10天，由此制得包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，步骤(d)的持续时间为至少11天，至少12天或至少13天。在一些实施方案中，步骤(d)的持续时间为12天。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：(e)从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。在一些实施方案中，步骤(e)包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：(f)纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，步骤(f)包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，步骤(f)进一步包括一个或多个以下子步骤：(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；(v)将纯化的产品集合超滤；(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒，之后将细胞培养液接触亲和性柱。
在另一个方面中，本发明的特征在于制备包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的方法，所述方法包括：在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包含多个宿主细胞的接种训练培养物至少约10天，其中宿主细胞包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸，IL-22Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，培养的持续时间为至少11天，至少12天，或至少13天。在一些实施方案中，培养的持续时间为12天。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，接着在生产培养基中培养接种训练培养物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在适于形成接种训练培养物的条件下在接种培养基中接种种子训练培养物，接着在生产培养基中培养接种训练培养物。
在任何前述方面的一些实施方案中，宿主细胞是真核宿主细胞。在一些实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白进一步包括一个或多个以下的子步骤：(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；(v)将纯化的产品集合超滤；(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒，之后将细胞培养液接触亲和性柱。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括富集组合物的唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至8摩尔唾液酸范围内的初始平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6、7或8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内。
在任何前述方面的一些实施方案中，亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。在一些实施方案中，蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170000091
树脂。
在任何前述方面的一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含具有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包括CAPTOTM粘附树脂。
在任何前述方面的一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
在任何前述方面的一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8或9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
在另一个方面中，本发明的特征在于通过本文所述的任一种方法产生的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由两个单链单元组成，所述单链单元通过两个链间二硫键连接，其中每个单链单元由包含与人免疫球蛋白IgG4的Fc区融合的IL-22的人IL-22融合蛋白组成。
在另一个方面中，本发明的特征在于选择用于释放的一个包含IL-22 Fc融合蛋白的批次的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一个包含IL-22 Fc融合蛋白的批次；(b)评价该批次中唾液酸的水平；和(c)如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用高性能液相色谱(HPLC)、超高性能液相色谱(UHPLC)、毛细管电泳或比色测定来评估批次中的唾液酸水平。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用HPLC评估唾液酸的水平。
在另一个方面中，本发明的特征在于用于控制包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的唾液酸含量的方法，所述IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，所述方法包括：在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包含多个宿主细胞的接种训练培养物至少10天，其中宿主细胞包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸并表达IL-22 Fc融合蛋白，其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量；和将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内，由此控制组合物的唾液酸含量。在一些实施方案中，所述方法包括将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内。
在另一个方面中，本发明的特征在于用于控制包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的唾液酸含量的方法，所述IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，所述方法包括：在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包含多个宿主细胞的接种训练培养物至少10天，其中宿主细胞包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸并表达IL-22 Fc融合蛋白，其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量；和将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围，由此控制组合物的唾液酸含量。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法包括将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内。
在任何前述方面的一些实施方案中，富集平均唾液酸含量包括从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。在一些实施方案中，收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
在任何前述方面的一些实施方案中，富集组合物的平均唾液酸含量进一步包括纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白进一步包含一个或多个以下的子步骤：(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；(v)将纯化的产品集合超滤；(vi)更换浓缩的产品集合的缓冲液，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒，之后将细胞培养液接触亲和性柱。在一些实施方案中，亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。在一些实施方案中，蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170000111
树脂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含具有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包括CAPTOTM粘附树脂。
在一个方面中，本发明的特征在于包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在某些方面中，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸表示在一摩尔IL-22融合蛋白中包含8至12唾液酸部分。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白具有约40％至约130％的效力。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约120％的效力。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白具有约60％至约110％的效力。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约100％的效力。在一些实施方案中，在受体结合测定或基于细胞的结合测定中评估效力。在一些实施方案中，参照IL-22 Fc融合蛋白具有表12和/或表13中所示的N-聚糖分布。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约11摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的唾液酸含量。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有约9,000ng/mL至约18,000ng/ml的最大观察浓度(Cmax)。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估AUClast。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有约40mL/kg/天至约140mL/kg/天的清除率(CL)。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估CL。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽是N-糖基化的。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含具有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。在一些实施方案中，约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约0.5％至约1.5％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约1％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约12％至约21％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约17％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约25％至约40％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约28％至约35％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约31％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约30％至约51％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约35％至约48％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约42％的N-聚糖具有四触角结构。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含含有零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中，约9％至约32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约21％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12％至约16％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约14％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约16％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约13％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约22％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约19％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12％至约30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约24％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含含有零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约12％至约35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约20％至约30％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约24％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约20％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约21％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约12％至约24％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约17％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约9％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含约0％至约10％包含末端甘露糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中，约1％至约4％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。在一些实施方案中，约2％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含约30％至约55％包含末端N-乙酰葡糖胺(GlaNAc)部分的N-聚糖。在一些实施方案中，约35％至约50％的N-聚糖包含末端GlaNAc部分。在一些实施方案中，约42％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，N-聚糖包含一个、两个、三个或四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约14％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约0％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约4％至约12％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约7％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含约20％至约45％的包含末端半乳糖(Gal)部分的N-聚糖。在一些实施方案中，约25％至约35％的N-聚糖包含末端Gal部分。在一些实施方案中，约32％的N-聚糖包含末端Gal部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，N一聚糖包含一个、两个或三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约15％至约30％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约20％至约25％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约23％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约1％至约15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约2％至约12％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约7％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约0.1％至约6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约1％至约3％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约2％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含含有半乳糖N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖。在一些实施方案中，约1％至约10％的N-聚糖包含LacNAc重复。在一些实施方案中，约3％至约6％的N-聚糖包含LacNAc重复。在一些实施方案中，约5％的N-聚糖包含LacNAc重复。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含含有岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。在一些实施方案中，约60％至约80％的N-聚糖是岩藻糖基化的。在一些实施方案中，约65％至约75％的N-聚糖是岩藻糖基化的。在一些实施方案中，约70％的N-聚糖岩藻糖基化的。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽包含含有无岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。在一些实施方案中，约20％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143上是糖基化的。在一些实施方案中，IL-22多肽在在SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和Asn143上是糖基化的。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约70％至约90％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约75％至约85％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约81％至约84％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约82％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约90％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约95％至约100％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约90％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约95％至约100％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约15％至约45％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约25％至约35％。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约32％至约35％。在一些实施方案中，SEQID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约33％。
在一些实施方案中，IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和Asn143上是糖基化的，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约81％至约84％，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35糖基化占有率为约100％，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约100％和SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约32％至约35％。在一些实施方案中，IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和Asn143上是糖基化的，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为81％至84％，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35糖基化占有率为100％，SEQ IDNO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为100％和SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为32％至35％。
在另一个方面中，本发明的IL-22 Fc融合蛋白具有表12或13中所示的N-聚糖分布。
在任何前述方面的一些实施方案中，Fc区不是糖基化的。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引的位置297的氨基酸残基是甘氨酸(Gly)。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引的位置297的氨基酸残基是丙氨酸(Ala)。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引的位置299的氨基酸残基是Ala、Gly或缬氨酸(Val)。在一些实施方案中，Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3。在一些实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，Fc区不是N-糖基化的。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白是二聚IL-22 Fc融合蛋白。在之前任一个方面的其他实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白是单体IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，IL-22多肽是人IL-22多肽。在一些实施方案中，IL-22多肽包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，接头由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)组成。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22受体是人IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1和/或IL-10R2。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白通过包括以下步骤的方法来产生：在适于IL-22 Fc融合蛋白表达的条件下培养能够表达IL-22 Fc融合蛋白的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞培养物或培养基获得IL-22 Fc融合蛋白的步骤。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约5摩尔NGNA的N-乙醇酰神经氨酸(也称为Neu5Gc或NGNA)含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于1摩尔NGNA的NGNA含量。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白和至少一种药物学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至10摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。在一些实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含胶凝剂。在一些实施方案中，胶凝剂是多糖。在一些实施方案中，胶凝剂是纤维素物质。在一些实施方案中，胶凝剂是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、POE-POP嵌段聚合物、海藻酸盐、透明质酸、聚丙烯酸、羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，药物组合物是用于局部施用。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括施用本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎是中度至重度溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，IBD是克罗恩氏病。
在另一个方面中，本发明的特征在于在需要其的对象中抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，上皮细胞是肠上皮细胞。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。
在另一个方面中，本发明的特征在于加速或促进需要其的对象中的创伤愈合的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，创伤是慢性创伤或受感染的创伤。在一些实施方案中，对象患有糖尿病。在一些实施方案中，糖尿病对象患有II型糖尿病。在一些实施方案中，创伤是糖尿病足溃烂。在一些实施方案中，施用IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物直至创伤完全闭合。
在另一个方面中，本发明的特征在于预防或治疗需要其的对象中的心血管病症的方法，所述病症包括动脉粥样硬化斑块形成的病理，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，心血管疾病是冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病。在一些实施方案中，所述方法进一步包括减缓动脉粥样硬化斑块形成的进程或预防动脉粥样硬化的体征。在一些实施方案中，动脉粥样硬化的体征包括斑块积聚和/或血管炎症。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的代谢综合症的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，所述方法进一步包括降低与代谢综合症相关的一种或多种风险因素，包括腹部肥胖、高血糖、血脂异常和高血压。在一些实施方案中，所述方法进一步包括降低对象中的细菌脂多糖水平。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的急性内毒素血症、败血症或两者的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，对象需要改变HDL/LDL脂质谱。
在另一个方面中，本发明的特征在于治疗需要其的对象中的GVHD的方法，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物所述方法包括将本文所述的任何IL-22Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物施用于对象。
在再一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的组合物或本文所述的任何药物组合物，用作药物。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的组合物或本文所述的药物组合物用于(i)治疗炎性肠病(IBD)，(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，(vi)治疗代谢综合症，(vii)治疗急性内毒素血症或败血症，或(viii)治疗GVHD。
在再另一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的组合物或本文所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于(i)治疗炎性肠病(IBD)，(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，(vi)治疗代谢综合症，(vii)治疗急性内毒素血症或败血症，或(viii)治疗GVHD。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，将IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物静脉内、皮下、腹膜内或局部施用。在一些实施方案中，将IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物静脉内施用。在一些实施方案中，将IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物皮下施用。
在任何前述方面的一些实施方案中，给对象共同施用至少一种其他治疗剂。
在任何前述方面的一些实施方案中，对象是人类。
在另一个方面中，本发明的特征在于制备本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含编码本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞；(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；(c)将种子训练物接种于接种培养基中并在适于形成接种训练培养物的条件下培养；和(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得IL-22 Fc融合蛋白。
在另一个方面中，本发明的特征在于制备IL-22 Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，所述IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽；(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；(c)将种子训练物接种于接种培养基中并在适于形成接种训练培养物的条件下培养；和(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
在任何前述方面的一些实施方案中，宿主细胞是冷冻宿主细胞，并且步骤(a)进一步包括在种子训练培养基中融化冷冻的宿主细胞。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤d)之前将接种训练物传代约1至约10次。在一些实施方案中，接种训练物在步骤d)之前传代约2至约6次。在一些实施方案中，接种训练物在步骤d)之前传代约5次。
在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基包含能够针对宿主细胞进行选择的选择剂。在一些实施方案中，选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺、甲氨蝶呤或抗生素。在一些实施方案中，选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺。在一些实施方案中，选择剂是抗生素。在一些实施方案中，抗生素选自杀稻瘟菌素、遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、霉酚酸或zeocin。
在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基、接种培养基和/或生产培养基包含消泡剂。在一些实施方案中，消泡剂是西甲硅油乳剂、消泡剂204、消泡剂A、消泡剂B、消泡剂C、消泡剂Y-30或消泡剂SE-15。在一些实施方案中，消泡剂是西甲硅油乳剂。
在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基、接种培养物和/或生产培养基包括缓冲剂、细胞保护剂、多糖和/或重量摩尔渗透压浓度调节剂。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(b)在约25℃至约40℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(b)在约35℃至约39℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(b)在约37℃的温度下进行。
在任何前述方面的一些实施方案中，在旋转器、旋转管、摇瓶、一次性使用的生物反应器(例如WAVE BIOREACTORTM或生物反应器(例如
Figure BDA0002603336170000212
15生物反应器))或种子训练生物反应器中进行步骤(b)。在一些实施方案中，在种子训练旋转器或摇瓶中进行步骤(b)。在其他实施方案中，在一次性使用的生物反应器(例如WAVE BIOREACTORTM或
Figure BDA0002603336170000213
生物反应器(例如
Figure BDA0002603336170000214
15生物反应器或
Figure BDA0002603336170000215
250生物反应器))中进行步骤(b)。在一些实施方案中，步骤(b)具有每个世代约1天至约12天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有每个世代约2天至约7天的持续时间。在一些实施方案中，在种子训练生物反应器中进行步骤(b)。
在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基的pH为约6至约8。在一些实施方案中，种子训练培养基的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，种子训练培养基的pH为约7.15。
在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基的溶解氧为约15％至约50％。在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基的溶解氧为约20％至约40％。在任何前述方面的一些实施方案中，种子训练培养基的溶解氧为约30％。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(b)具有约1天至约10天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约5天的持续时间。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(c)在约25℃至约40℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约35℃至约39℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约37℃的温度下进行。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(c)在一个或多个生物反应器中进行。在一些实施方案中，步骤(c)在三个或四个生物反应器中进行。
在任何前述方面的一些实施方案中，接种培养基的pH为约6至约8。在一些实施方案中，接种培养基的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，接种培养基的pH为约7.1。
在任何前述方面的一些实施方案中，接种培养基的溶解氧为约15％至约50％。在一些实施方案中，接种培养基的溶解氧为约20％至约40％。在一些实施方案中，接种培养基的溶解氧为约30％。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(c)具有约1天至约5天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约3天的持续时间。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(d)包括从初始温度到转变后温度的温度转变。在一些实施方案中，初始温度为约25℃至约40℃。在一些实施方案中，初始温度为约35℃至约39℃。在一些实施方案中，初始温度为约37℃。在一些实施方案中，转变后温度为约25℃至约40℃。在一些实施方案中，转变后温度为约30℃至约35℃。在一些实施方案中，转变后温度为约33℃。在一些实施方案中，温度转变在约12h至约120h的时间段中进行。在一些实施方案中，温度转变在约48h至约96h的时间段中进行。在一些实施方案中，温度转变在约72h的时间段中进行。
在任何前述方面的一些实施方案中，生产培养基的pH为约6至约8。在一些实施方案中，生产培养基的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，生产培养基的pH为约7.0。在一些实施方案中，步骤(d)在生产生物反应器中进行。在一些实施方案中，生产培养基的溶解氧为约15％至约50％。在一些实施方案中，生产培养基的溶解氧为约20％至约40％。在一些实施方案中，生产培养基的溶解氧为约30％。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(d)具有约5天至约25天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约7天至约16天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约8天至约16天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约12天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)进一步包括通过营养物质补料将营养物质加入生产培养基中。
在任何前述方面的一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，CHO细胞是适应悬浮的CHO细胞。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(e)从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。在一些实施方案中，步骤(e)包括冷却生产培养物。在一些实施方案中，其中步骤(e)包括将生产培养物冷却至约2℃至约8℃。在一些实施方案中，其中步骤(e)包括通过离心从生产培养基除去宿主细胞以形成细胞培养液。在一些实施方案中，步骤(e)进一步包括过滤细胞培养液。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(f)纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，步骤(f)包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，步骤(f)进一步包括以下子步骤：(iv)将纯化的产品结合浓缩，以形成浓缩的产品集合。在一些实施方案中，步骤(f)进一步包括以下子步骤：(v)将纯化的产品集合超滤。在一些实施方案中，超滤包括用10kDa复合再生纤维素超滤膜过滤纯化的产品集合。在一些实施方案中，步骤(f)进一步包括以下子步骤：(vi)更换浓缩产品集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合。在一些实施方案中，将浓缩产品集合的缓冲液交换为包含终浓度为0.01M磷酸钠，pH7.2的渗滤缓冲液。在一些实施方案中，步骤(f)进一步包括以下子步骤：(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步在将细胞培养液接触亲和性柱之前通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒。在一些实施方案中，子步骤(i)包括通过将去污剂加入亲和性集合中来灭活病毒。在一些实施方案中，去污剂是
Figure BDA0002603336170000231
X-100或
Figure BDA0002603336170000232
CG110。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.01％至约2％(v/v)。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.1％至约1％(v/v)。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.3％至约0.5％(v/v)。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.5％。在一些实施方案中，病毒灭活在约12至约25℃下进行。在一些实施方案中，灭活病毒具有超过约0.5h的持续时间。
在另一个方面中，本发明的特征在于纯化IL-22 Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)提供包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液并任选灭活细胞培养液中的病毒；(b)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，并用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(c)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(d)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。
在任何前述方面的一些实施方案中，亲和性色谱支持物包含蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。在一些实施方案中，蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170000241
树脂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含终浓度0.4M的磷酸钾，pH7.0。
在任何前述方面的一些实施方案中，第一洗脱缓冲液包含终浓度0.3M的盐酸L-精氨酸，0.013M的磷酸钠，pH3.8。
在任何前述方面的一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含具有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含CAPTOTM粘附树脂。在一些实施方案中，第一平衡缓冲液包含终浓度0.04M的醋酸钠，pH5.8。在一些实施方案中，第二洗脱缓冲液是梯度洗脱缓冲液。在一些实施方案中，梯度洗脱缓冲液包含0.04M醋酸钠，pH5.8作为梯度洗脱缓冲液的缓冲液A，以及0.04M醋酸钠，0.3M硫酸钠pH5.8作为梯度的缓冲液B，其中梯度从10％的缓冲液B开始。在一些实施方案中，第二平衡缓冲液包含终浓度0.025M的MOPS，0.3M的硫酸钠，pH7.0。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于治疗需要其的对象中的IBD的方法中。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩氏病。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎(UC)。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎是中度至重度的溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，IBD是克罗恩氏病。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于需要其的对象中抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法中。在一些实施方案中，上皮细胞是肠上皮细胞。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于治疗需要其的对象中的急性肾损伤或急性胰腺炎的方法中。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于加速或促进需要其的对象中的创伤愈合的方法中。在一些实施方案中，创伤是慢性创伤或受感染的创伤。在一些实施方案中，患者患有糖尿病。在一些实施方案中，糖尿病对象患有II型糖尿病。在一些实施方案中，创伤是糖尿病足溃烂。在一些实施方案中，施用IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物直至创伤完全闭合。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于预防或治疗需要其的对象中的心血管病症的方法中，所述病症包括动脉粥样硬化斑块形成的病理。在一些实施方案中，心血管疾病是冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病。在一些实施方案中，所述方法包括减缓动脉粥样硬化斑块形成的进程或预防动脉粥样硬化的体征。在一些实施方案中，动脉粥样硬化的体征包括斑块积聚和/或血管炎症。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于治疗需要其的对象中的代谢综合症的方法中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括降低与代谢综合症相关的一种或多种风险因素，包括腹部肥胖、高血糖、血脂异常和高血压。在一些实施方案中，所述方法进一步包括降低对象中的细菌脂多糖水平。
在另一个方面中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白或本文所述的任何药物组合物可以用于治疗需要其的对象中的急性内毒素血症或败血症或两者的方法中。
在任何前述方面的一些实施方案中，对象需要改变HDL/LDL脂质谱。
在任何前述方面的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物通过静脉内、皮下、腹膜内或局部施用。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物通过静脉内施用。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物通过皮下施用。
在任何前述方面的一些实施方案中，给对象共同施用至少一种其他治疗剂。在任何前述方面的一些实施方案中，对象是人类。
除非上下文另外明确指出，否则可以将每个实施方案进行组合。除非上下文清楚地另外指出，否则每个实施方案可以应用于本发明的每个方面。
通过以下对某些优选实施方案的更详细描述和权利要求，本发明的特定实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1A是显示示例性二聚IL-22 Fc融合蛋白的示意性设计构造的示意图，该二聚IL-22 Fc融合蛋白具有两个人白介素-22(IL-22)多肽，每个多肽与人免疫球蛋白G4(IgG4)Fc区融合。两个Fc区通过两个链间二硫键连接。还描绘了在每个IL-22多肽上存在四个N-聚糖。
图1B是IL-22 Fc融合蛋白的人白介素22(IL-22)细胞因子区域的带注释的氨基酸序列。IL-22受体结合区以粗体显示。Asn21，Asn35，Asn64和Asn143的糖基化位点显示为N。
图1C是IL-22 Fc融合蛋白的人免疫球蛋白G4(IgG4)Fc区的带注释的氨基酸序列。用G表示N81G的Fc突变，以去除N-聚糖，从而将Fc效应子功能的可能性降至最低。
图2A是显示完整的，去糖基化的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次的质谱图，证实了完整分子的预测分子量。85,265Da和85,393Da处的物质分别是具有一个C-末端赖氨酸残基和两个C-末端赖氨酸残基的IL-22 Fc融合蛋白。
图2B是显示还原的，去糖基化的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次的质谱图，证实了还原分子的预测分子量。42,706Da处的物质是具有一个C-末端赖氨酸残基的IL-22 Fc融合蛋白。
图3A-3B是一系列色谱图，显示了胰蛋白酶消化的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次在0至50分钟(3A)和50-110分钟(3B)之间的色谱图的展开图。
图3C-3D是一系列色谱图，显示了胰蛋白酶消化的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3在0至50分钟(3C)和50-110分钟(3D)之间的色谱图比较的展开图，验证了一级结构并证明了肽模式批次与批次间的一致性。
图4A-4B是一系列色谱图，显示了IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分布的全尺寸图(4A)和展开图(4B)，提供了有关IL-22 Fc融合蛋白分子大小异质性的定量信息。主峰顶点观察到的差异归因于糖基化。
图5A-5B是一系列色谱图，显示了非还原的，荧光标记的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3的毛细管电泳十二烷基硫酸钠无凝胶筛分(CE-SDS-NGS)分析的全尺寸图(5A)和展开图(5B)，证明了存在一个具有一致峰型和校正峰面积百分比(CPA)的主峰。主峰形状的差异归因于糖基化。
图5C-5D是一系列色谱图，显示了还原的，荧光标记的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3的CE-SDS-NGS分析的全尺寸图(5C)和展开图(5D)，表明了存在一个具有一致峰型和校正峰面积百分比(CPA)的主峰。主峰形状的差异归因于糖基化。IRS＝不完全还原的物质。
图6A-6B显示了IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3的还原样品(6A)和非还原样品(6B)的
Figure BDA0002603336170000261
Ruby染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺钠凝胶电泳(SDS-PAGE)，证明了所有批次间的一致条带模式。泳道1：精确加未染色的蛋白质标准品(Biorad)，泳道2：8ng牛血清白蛋白(BSA)，泳道3：2ng BSA，泳道4：IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次，泳道5：IL-22 Fc融合蛋白临床批次1，泳道6：IL-22 Fc融合蛋白临床批次2，泳道7：IL-22 Fc融合蛋白临床批次3。
图7A-7B是一系列色谱图，显示了天然IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次和临床批次1、2和3的成像毛细管等电聚焦(ICIEF)的全尺寸图(7A)和展开图(7B)。
图7C-7D是一系列色谱图，显示了除去C-末端赖氨酸后羧肽酶B(CpB)处理的IL-22Fc融合蛋白参照标准批次和临床批次1、2和3异质性的ICIEF的全尺寸图(7C)和展开图(7D)。曲线的pI的微小差异与仪器有关，并且对峰面积百分比没有影响。
图7E是显示天然的和CpB处理的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次的ICIEF谱的色谱图。
图8A-8B是一系列色谱图，显示了通过2-氨基苯甲酸亲水性相互作用液相色谱-超高性能液相色谱(2-AAhILIC-UHPLC)的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3从0-40分钟(8A)和40-75分钟(8B)的相对N-聚糖分布。
图8C-8D是一系列图，显示了通过2-AAhILIC-UHPLC的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次和临床批次1、2和3(8C)以及参照标准批次和临床批次2、3、4、5和6的相对N-聚糖分布(8D)，以峰面积百分比(％)表示。
图9是显示通过Lys-C肽图谱和LC-MS的在位点Asn21的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次和临床批次1、2和3的相对N-聚糖分布，以峰面积百分比(％)表示。
图10是IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3的圆二色性(CD)光谱，显示了批次之间的高级结构特征没有可辨别的差异。
图11是使用人结肠癌细胞系Colo 205进行的基于细胞的IL-22 Fc融合蛋白结合效力测定的示意性概图，该细胞系内源性地表达IL-22受体并稳定地表达STAT3荧光素酶报道基因。
图12A是证明了与基于细胞的IL-22 Fc融合蛋白结合效力测定相比，在体外测定中的唾液酸含量与效力之间的关系的图。
图12B是比较了用唾液酸酶脱唾液酸化之前和之后IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次2、4、5和6的效力的图。对于所有脱唾液酸化的样品和参照标准批次，误差条表示n＝2的％差异。对于释放值的效力，误差条为n＝3的标准偏差。星号(*)表示效力的估算，结果超出验证的测定范围。
图13是用PNGase F酶去糖基化后检查IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次2、4、5和6的效力的系列图。将过程控制暴露于与样品相同的孵育，但没有添加PNGaseF。
图14是比较单次静脉内(IV)施用后小鼠中IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸变体的血清IL-22Fc融合蛋白浓度随时间变化的图。
图15是显示在单次IV施用指示的IL-22 Fc融合蛋白唾液酸变体后，小鼠中唾液酸水平对IL-22 Fc融合蛋白的体外效力及其暴露的影响的相反作用的图。
图16A是显示在小鼠中单次IV施用后对IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸变体的REG3β应答的影响的图，表示为随着时间的血清REG3β浓度(ng/mL)。
图16B是显示在小鼠中单次IV施用后IL-22 Fc融合蛋白暴露与对IL-22 Fc融合蛋白唾液酸变体的血清REG3β应答之间的关系的图，呈现为REG3β AUC(天×ng/mL)相对IL-22Fc融合蛋白AUC(天×ng/mL)。
图17是细胞培养过程流程图，显示了用于IL-22 Fc融合蛋白生产的过程中控制、过程阶段和培养基。
图18是纯化过程流程图，显示了用于纯化IL-22 Fc融合蛋白的过程阶段和过程中控制。
图19显示了来自不同哺乳动物物种的成熟IL-22的氨基酸序列比对：人(GenBank登录号No.Q9GZX6，SEQ ID NO：4，黑猩猩(GenBank登录号No.XP_003313906，SEQ ID NO：48)，猩猩(GenBank登录号No.XP_002823544，SEQ ID NO：49)，小鼠(GenBank登录号No.Q9JJY9，SEQ ID NO：50)和狗(GenBank登录号No.XP_538274，SEQ ID NO：51)。
图20是显示细胞培养过程中唾液酸水平变化的图。每张线图显示了不同的生产运行。使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定唾液酸水平。每摩尔IL-22 Fc蛋白的唾液酸水平(在y轴上显示)随着细胞培养持续时间(在x轴上显示)的增加而降低。
发明实施方案的详述
I.定义
除非另外限定，否则本文所用的全部本领域术语、符号和其他科学术语意在具有本发明所属的领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清晰和/或为了便利参考，本文中定义具有通常理解含义的术语，并且本文中纳入这类定义不应当必然地解释为代表相对于本领域通常所理解而言巨大的差异。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的惯常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数称谓。例如，对“一种分离的肽”的提及意指一种或多种分离的肽。
遍及本说明书，词汇“包含”或其变异形式如“包括了”或“包含有”应理解为表示纳入所陈述的整数或整数群，但不排除任何其它整数或整数群。
如本文所用，术语“IL-22 Fc融合蛋白”或“IL-22融合蛋白”或“IL-22Ig融合蛋白”指其中IL-22蛋白或多肽直接或间接与IgG Fc区连接的融合蛋白。在一些实施方案中，IL-22蛋白或多肽是糖基化的。在特定的实施方案中，IL-22蛋白或多肽是唾液酸化的。在某些优选的实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与人IgG Fc区连接的人IL-22蛋白或多肽。在某些优选的实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含两个人白介素-22(IL-22)多肽，每个多肽与人免疫球蛋白G4(IgG4)Fc区融合，其中两个Fc区通过两个链间二硫键连接。在某些实施方案中，人IL-22蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。然而，可以理解，本发明还构思了不影响IL-22或IL-22Fc融合蛋白的功能和/或活性的IL-22或Fc的微小序列变异如插入、缺失、置换、尤其保守性氨基酸置换。本发明的IL-22 Fc融合蛋白可以与IL-22受体结合，这可以导致IL-22受体下游信号传导。在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白能够与IL-22受体结合，和/或能够导致IL-22受体下游信号传导。可以通过本领域已知的方法测定IL-22 Fc融合蛋白功能和/或活性，所述方法包括而不限于ELISA、配体-受体结合测定法和Stat3萤光素酶测定法。在某些实施方案中，本发明提供与IL-22受体结合的IL-22 Fc融合蛋白，其中所述结合作用可以导致IL-22受体下游信号传导，所述IL-22 Fc融合蛋白包含与选自SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中Fc区没有糖基化。在某些具体实施方案中，IL-22融合蛋白的Fc区没有效应子活性(例如，不与FcγIIIR结合)或显示比完整(例如，野生型)IgG抗体实质更低的效应子活性。在某些其他实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的Fc区不触发细胞毒性，如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)。除非另外说明，“IL-22融合蛋白”、“IL-22 Fc融合物”、“IL-22Ig融合蛋白”、“IL-22 Fc融合蛋白”或“IL-22 Fc”在本申请期间自始至终可互换使用。
除非另外说明，否则如本文所用，术语“IL-22”或“IL-22多肽”或“IL-22蛋白”广义地指来自任何哺乳动物来源的任何天然IL-22，所述哺乳动物来源包括灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖“全长”、未加工的IL-22以及因细胞中加工而产生的任何形式的IL-22。例如，本发明涵盖含有N端前导序列的全长IL-22和成熟形式的IL-22。前导序列(或信号肽)可以是内源IL-22前导序列或另一种哺乳动物分泌型蛋白的外源前导序列。在某些实施方案中，前导序列可以来自真核或原核分泌型蛋白。本术语还涵盖天然存在的IL-22变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人IL-22的氨基酸序列在SEQ ID NO：4(成熟形式，无信号肽)中显示。在某些实施方案中，带内源前导序列的全长IL-22蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：71中提供；而在其他实施方案中，带外源前导序列的成熟IL-22蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中提供。本发明还构思了不影响IL-22的功能和/或活性(例如，与IL-22受体结合)的IL-22微小序列变异、尤其保守性氨基酸置换。图19显示来自几种示例性哺乳动物物种的成熟IL-22的氨基酸序列比对结果。星号表示各物种间高度保守的氨基酸残基，这些残基对IL-22的功能和/或活性可能重要。因此，在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含IL-22多肽，所述IL-22多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22蛋白与SEQ ID NO：71具有95％或更大的序列同一性、具有96％或更大的序列同一性，具有97％或更大的序列同一性；与SEQ ID NO：71具有98％或更大的序列同一性；或与SEQ IDNO：71具有99％或更大的序列同一性。本文所述的IL-22多肽可以从多种来源分离，如从人组织或从另一个来源分离，或通过重组或合成方法制备。
术语“IL-22受体”或“IL-22R”指由IL-22R1和IL-10R2或其天然存在的等位变体组成的异二聚体。参见例如Ouyang等人，2011，Annu.Rev.Immunol.29：159-63。IL-10R2由许多细胞类型普遍表达，并且IL-22R1仅在固有细胞如上皮细胞、肝细胞和角质形成细胞中表达。IL-22R1也称作IL-22Ra1或IL-22Rα 1。IL-22R1可以与其他多肽配对以形成其他IL-10家族成员(例如IL-20或IL-24)的异二聚受体。参见例如，Ouyang等人，2011，上文。示例性IL-22R1多肽的全长氨基酸序列示于SEQ ID NO：81。IL-22R1的这一全长序列包括在最终功能分子中被切割的N-末端信号序列(氨基酸1-15)(其示例性氨基酸序列显示于SEQ ID NO：82中)。示例性IL10R2多肽的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO：83中。IL10R2的这一全长序列包括在最终功能分子中被切割的N-末端信号序列(氨基酸1-19)(其示例性氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84中)。
“天然序列IL-22多肽”或“天然序列IL-22R多肽”指包含与衍生于自然界的相应IL-22或IL-22R多肽相同的氨基酸序列的多肽。这种天然序列IL-22或IL-22R多肽可以从自然界分离或可以通过重组或合成手段产生。这些术语特别涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定IL-22或IL-22R多肽(例如，缺少其相关信号肽的IL-22)、该多肽的天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和天然存在的等位变体。在本发明的多种实施方案中，本文中公开的天然序列IL-22或IL-22R多肽是成熟或全长的天然序列多肽。示例性全长天然人IL-22在SEQ ID NO：70(DNA)和SEQ ID NO：71(蛋白质)中显示。尽管IL-22多肽和IL-22R多肽序列显示始于本文中命名为氨基酸位置1的甲硫氨酸残基，但是可构思并可能的是，可以使用位于氨基酸位置1上游或下游的其他甲硫氨酸残基作为IL-22多肽或IL-22R多肽的起始氨基酸残基。
“IL-22变体”、“IL-22R变体”、“IL-22变体多肽”、或“IL-22R变体多肽”意指如上文定义的与全长天然序列IL-22或IL-22R多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的有活性的IL-22或IL-22R多肽。通常，IL-22或IL-22R多肽变体将与全长或成熟的天然序列IL-22或IL-22R多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性、备选地至少约81％氨基酸序列同一性、备选地至少约82％氨基酸序列同一性、备选地至少约83％氨基酸序列同一性、备选地至少约84％氨基酸序列同一性、备选地至少约85％氨基酸序列同一性、备选地至少约86％氨基酸序列同一性、备选地至少约87％氨基酸序列同一性、备选地至少约88％氨基酸序列同一性、备选地至少约89％氨基酸序列同一性、备选地至少约90％氨基酸序列同一性、备选地至少约91％氨基酸序列同一性、备选地至少约92％氨基酸序列同一性、备选地至少约93％氨基酸序列同一性、备选地至少约94％氨基酸序列同一性、备选地至少约95％氨基酸序列同一性、备选地至少约96％氨基酸序列同一性、备选地至少约97％氨基酸序列同一性、备选地至少约98％氨基酸序列同一性和备选地至少约99％氨基酸序列同一性。
术语“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”指免疫球蛋白重链的C端非抗原结合区，其含有至少一部分恒定区。该术语包括天然Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。除非本文中另外说明，否则IgG或Fc区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述的用于抗体的EU编号体系，也称作EU索引。
在某些实施方案中，Fc区指包含铰链区(始于Cys226)、IgG CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白IgG重链恒定区。如本文所用，术语“铰链区”或“铰链序列”指位于接头和CH2结构域之间的氨基酸序列。在某些实施方案中，铰链区包含氨基酸序列CPPCP(SEQ IDNO：31)。在某些实施方案中，IL-22 IgG4 Fc融合蛋白的铰链区包含CPPCP序列(SEQ ID NO：31)，天然IgG1铰链区中存在的序列，以促进二聚化。在某些其他实施方案中，Fc区始于铰链区并且延伸到IgG重链的C末端。在某些具体实施方案中，Fc区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。在某些具体实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。在某些其他的具体实施方案中，Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。
在某些实施方案中，IgG CH2结构域始于Ala231。在某些其他实施方案中，CH3结构域始于Gly341。可以理解，人IgG的C端Lys残基可以任选地不存在。还应当理解，本发明的范围内构思了Fc区的保守性氨基酸置换而不影响Fc的所需结构和/或稳定性。
在某些实施方案中，IL-22经接头与Fc区连接。在某些具体实施方案中，接头是将IL-22的C末端与如本文所述的Fc区连接的肽。在某些实施方案中，天然IgG序列存在于接头和/或铰链区中以使免疫原性风险最小化和/或避免免疫原性风险。在其他实施方案中，可以将微小序列变异引入天然序列以协助制造。包含显示高活性(如例如，通过萤光素酶测定法测量)的外源接头或铰链序列的IL-22 Fc融合构建体也处于本发明的范围内。在某些实施方案中，接头包含长8-20个氨基酸、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、11-16、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，接头包含氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO：32)。在某些具体实施方案中，接头不包含序列Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：45)、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：46)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：47)。
在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽。术语“与连接”或“与融合”指在两个部分之间形成的共价键，例如，肽键。
如本文所用的术语“糖基化”和“糖基化的”是指存在与生物分子(例如蛋白质或脂质)连接的碳水化合物(例如寡糖或多糖，也称为“聚糖”)。在特定实施方案中，糖基化是指存在与蛋白质(例如，IL-22 Fc融合蛋白)或目的蛋白的一部分(例如，IL-22 Fc融合蛋白的多肽部分)连接的聚糖(例如，N-聚糖)。N-连接的糖基化是指碳水化合物部分连接天冬酰胺残基的侧链。三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于碳水化合物部分酶促连接天冬酰胺侧链的识别序列。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以参与O-连接的糖基化。对于糖基化的综述，参见，例如，Varki等，Essentials of Glycobiology，第3版，Cold SpringharborLaboratory Press，2015-2017。
本文可互换使用的术语“无糖基化的”和“未糖基化的”是指未糖基化(例如，未N-糖基化的)蛋白质或目的蛋白的一部分(例如，IL-22 Fc融合蛋白的Fc区)。可以理解，在一些实施方案中，目的蛋白(例如，IL-22 Fc融合蛋白)的一部分是糖基化的(例如，IL-22 Fc融合蛋白的IL-22多肽部分)，而目的蛋白的另一部分是未糖基化的(例如，IL-22 Fc融合蛋白的Fc区)。
在一些实施方案中，本文提供了其中Fc区或CH2结构域是未糖基化的IL-22 Fc融合蛋白。在某些实施方案中，CH2结构域中的N-糖基化位点被突变，以防止糖基化。例如，可以通过突变Fc区的CH2结构域中按照EU索引的位置297的氨基酸残基(例如，N297)(也称为残基N81，参见，例如，图1C)来制得具有无糖基化Fc区的IL-22 Fc融合蛋白。在某些实施方案中，可以通过改变糖基化共有位点，即，位置297的Asn，接着任何氨基酸残基(在人IgG情况中，是Ser)和Thr，来消除Fc区的CH2结构域中的糖基化。可以通过氨基酸插入、缺失和/或取代来改变糖基化位点。例如，可以在Asn和Ser之间或在Ser和Thr之间插入一个或多个氨基酸残基，以改变初始糖基化位点，其中插入没有使得N-糖基化位点再生。在某些特定实施方案中，人IgGFc的CH2结构域内按照EU索引的位置297的氨基酸残基(例如，Fc中的N-糖基化的位点)被突变，以消除糖基化位点。在某些特定实施方案中，按照EU索引的位置297的氨基酸残基(例如，N297)变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu。在一些特定实施方案中，按照EU索引的位置297的氨基酸残基(例如，N297)变成Gly或Ala。在其他特定实施方案中，按照EU索引的位置297的氨基酸残基(例如，N297)变成Gly。在某些其他实施方案中，按照EU索引的位置299的氨基酸残基可以被另一个氨基酸例如，Ala、Val或Gly取代。在某些特定实施方案中，导致无糖基化Fc的突变没有影响IL-22 Fc融合蛋白的结构和/或稳定性。
在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含其中CH2结构域中按照EU索引的位置297的氨基酸残基被突变的Fc区。在某些实施方案中，按照EU索引的位置297的氨基酸残基变成Gly或Ala，优选变成Gly。在某些其他实施方案中，按照EU索引的位置297的氨基酸残基被缺失。在某些实施方案中，包含按照EU索引的位置297的氨基酸残基具有氨基酸取代的Fc的IL-22 Fc融合蛋白是无糖基化的或未糖基化的。
在其他实施方案中，可以通过酶促，例如，通过去糖基化，除去连接按照EU索引的位置297(例如，N297)的野生型氨基酸残基的N-聚糖。合适的糖分解酶包括但不限于，肽-N-糖苷酶(PNGase)。
本文使用的术语“糖基化占有率”是指蛋白质在特定糖基化位点(例如，共有糖基化位点的Asn残基)被糖基化的概率或在蛋白质群中在特定糖基化位点被糖基化的蛋白质百分比。例如，IL-22多肽可以在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143上被糖基化。在再一个具体实例中，(a)残基Asn21的N-糖基化位点百分比占有率可以在70至90的范围内；(b)残基Asn35的百分比N-糖基化位点占有率可以在90至100的范围内；(c)在残基Asn64的百分比N-糖基化位点占有率可以在90至100的范围内；和/或(d)残基Asn143的百分比N-糖基化位点的占有率可以在25至35的范围内。
术语“唾液酸化”和“唾液酸化的”是指在蛋白质或目的蛋白的一部分上存在唾液酸，特别是作为连接至蛋白质的聚糖(例如，N-聚糖)链的组分。唾液酸(在本文中也称为“唾液酸部分”)通常是指神经氨酸的N-或O-取代的衍生物。N-乙酰神经氨酸(5-乙酰胺基-2-酮-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖醛酸；也称为NANA或Neu5Ac)是哺乳动物中最常见的唾液酸。其他示例性唾液酸包括但不限于2-酮-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖醛酸(也称为Kdn)、N-乙醇酰神经氨酸(也称为Neu5Gc或NGNA)、神经氨酸(也称为Neu)和2-脱氧-2，3-二脱氢-Neu5Ac(也称为Neu2en5Ac)。游离唾液酸(Sia)可用于激活后聚糖合成至核苷酸供体CMP-Sia上。Sia从CMP-Sias转移到真核细胞的高尔基系统中新合成的糖缀合物(例如糖蛋白)上是由连接特异性唾液酸转移酶(ST)家族催化的。唾液酸通常是聚糖(例如，N-聚糖)分支的终止残基。在一些实施方案中，唾液酸可占据聚糖内的内部位置，最常见的是一个唾液酸残基连接另一个时。对于唾液酸化和唾液酸的综述，参见，例如，Varki等的第15章，Essentials of Glycobiology，第3版，Cold Springharbor Laboratory Press，2015-2017。
术语“唾液酸含量”是指糖基化蛋白(例如，IL-22 Fc融合蛋白)或目的蛋白的一部分的唾液酸化的水平或含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约4至约16摩尔(例如，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15或约16摩尔)的唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8、9、10、11或12摩尔唾液酸的唾液酸含量。
关于根据含有根据本发明的IL-22 Fc融合蛋白的组合物(例如，药物组合物或批次)的术语“平均唾液酸含量”是指组合物中每摩尔IL-22 Fc融合蛋白中唾液酸的总摩尔数。因此，例如，这样的组合物可以含有杂合的IL-22 Fc融合蛋白集合，其组合物内含有具有不同唾液酸化水平(例如在每摩尔IL-22 Fc融合蛋白0-25摩尔唾液酸范围内)各IL-22Fc融合蛋白。除非另外指出，否则本文所述的针对唾液酸含量的所有值，包括平均唾液酸含量，是指二聚IL-22 Fc融合蛋白。
如本文使用的术语“批次”是指运行一次生产过程的产品，包括，例如，IL-22 Fc融合蛋白或其组合物。例如，本文所述的方法可以用于生产多批次的IL-22 Fc融合蛋白或其组合物。可以根据本文所述的方法，例如，通过评估批次的平均唾液酸含量，选择批次用于释放(即，用于分配或销售)。
术语“无岩藻糖基化”、“无岩藻糖基化的”、“去岩藻糖基化”或“去岩藻糖基化的”是指N-聚糖(例如，连接蛋白质(例如，IL-22多肽)或蛋白质的一部分(例如，Fc的CH2结构域)的N-聚糖)不存在或去除了核心岩藻糖。
术语“二聚体IL-22 Fc融合蛋白”指其中每个单体包含IL-22 Fc融合蛋白的二聚体。术语“单体IL-22 Fc融合蛋白”指这样的二聚体，其中一个单体包含IL-22 Fc融合蛋白(IL-22 Fc臂)，而另一个单体包含无IL-22多肽的Fc区(Fc臂)。因此，二聚体IL-22 Fc融合蛋白在IL-22R结合方面是双价的，而单体IL-22 Fc融合蛋白在IL-22R结合方面是单价的。可以通过本领域已知的方法协助单体IL-22 Fc融合蛋白的异二聚化，所述方法包括而不限于借助结入孔(knob-imo-hole)技术的异二聚化。结入孔技术的结构和装配方法可以在，例如US 5,821,333、US 7,642,228、US 2011/0287009和PCT/US 2012/059810中找到，所述文献因而通过引用的方式以其整体并入。通过以下方式形成这项技术：在一个Fc的CH3结构域中通过将小氨基酸残基替换为一个大氨基酸残基而引入“结”(或突出部分)，并且在另一个Fc的CH3结构域中通过将一个或多个大氨基酸残基替换为更小的氨基酸残基而引入“孔”(或空孔)。在某些实施方案中，IL-22 Fc融合物臂包含结，并且仅有Fc臂包含孔。
用于形成结的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成结的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺，天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH3结构域中用于形成结的示例性氨基酸置换包括而不限于T366W、T366Y或F405W置换。
用于形成孔的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个实施方案中，用于形成孔的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。CH3结构域中用于产生孔的示例性氨基酸置换包括而不限于T366S、L368A、F405A、Y407A、Y407T和Y407V置换。在某些实施方案中，结包含T366W置换，并且孔包含T366S/L368A/Y407V置换。在某些具体实施方案中，单体IL-22Fc融合蛋白的Fc区包含IgG1 Fc区。在某些具体实施方案中，单体IL-22IgG1 Fc融合物包含IL-22 Fc结臂和Fc孔臂。在某些实施方案中，IL-22 Fc结臂包含T366W置换(SEQ IDNO：61)，并且Fc孔臂包含T366S、L368A和Y407V(SEQ ID NO：62)。在某些其他实施方案中，两个臂的Fc区还包含N297G或N297A突变。在某些实施方案中，单体IL-22 Fc融合蛋白在大肠杆菌细胞中表达。可以理解，本申请还构思并涵盖了本领域已知的促进异二聚化的Fc区的其他修饰。
术语“创伤”指损伤，特别是其中皮肤或另一个外表面被撕裂、刺穿、切割或否则破坏的损伤。
术语“溃疡”是皮肤或粘膜的损伤位点，经常以形成脓、组织死亡为特征并是经常伴发炎症反应。
如本文互换所用的术语“肠”或“消化道”广义地涵盖小肠和大肠。
术语“加速创伤愈合”或“创伤愈合加速”指愈合速率的增加，例如，直至完整创伤闭合发生的时间减少或直至创伤面积减少百分比％发生的时间减少。
“糖尿病性创伤”是与糖尿病相关的创伤。
“糖尿病性溃疡”是与糖尿病相关的溃疡。
“慢性创伤”指不痊愈的创伤。参见，例如，Lazarus等人，Definitions andguidelines for assessment of wounds and evaluation of healing，Arch.Dermatol.130：489-93(1994)。慢性创伤例如包括但不限于动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压迫溃疡或褥疮、静脉溃疡等。急性创伤可以发展成慢性创伤。急性创伤包括但不限于例如由热损伤(例如，烧伤)、创伤、手术、切除大范围皮肤癌、深部真菌性感染和细菌性感染，血管炎、硬皮病、天疱疮、中毒性表皮坏死松解等引起的创伤。因此，在某些实施方案中，慢性创伤是感染的创伤。“正常创伤”指经历正常创伤愈合修复的创伤。“亲和力”指分子(例如，配体或抗体)的单一结合位点与其结合伙伴(例如，受体或抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，IL-22Fc融合蛋白和IL-22受体)之间1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
如本文针对IL-22 Fc融合蛋白所用，术语“效力”是指IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22R(例如，IL-22-R1a，或其一部分，例如，胞外结构域)和/或激活下游IL-22R信号传导(例如STAT3信号传导)的能力。在一些实施方案中，例如，如实施例2中所述，在受体结合测定或基于细胞的结合测定中评估效力。在一些实施方案中，例如，如实施例2中所述，使用体内测定法评估效力。在一些实施方案中，将效力与参照IL-22 Fc融合蛋白(例如具有表12和/或表13中所示的N-聚糖分布的IL-22 Fc融合蛋白)进行比较。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不是完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab'-SH、F(ab′)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”或“效应子活性”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白不显示出任何效应子功能或任何可检测的效应子功能。在某些其他实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白显示出实质降低的效应子功能，例如，降低约50％、60％、70％、80％或90％的效应子功能。
活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”或“治疗有效量”，指以必要的剂量和时间段有效实现所需治疗性或预防性结果的剂量。
例如，在心血管疾病或病况的情况下，治疗有效量的IL-22Fc融合蛋白可以减少动脉粥样硬化斑块形成的程度；减小动脉粥样硬化斑块的尺寸)；抑制(即，某种程度地减慢并且优选地制止)动脉粥样硬化斑块；抑制(即，某种程度地减慢并且优选地制止)血栓形成或动脉粥样硬化斑块破裂；和/或某种程度地缓解一种或多种与该疾病或病况相关的症状。
“减少或抑制”意指引起总体减少优选地20％或更多、更优选地50％或更多、并且最优选地75％、85％、90％、95％或更多的能力。减少或抑制可以指正在治疗的病症的症状、动脉粥样硬化斑块的存在或大小或动脉粥样硬化斑块数目。
“次优量”指比通常用于某种治疗的治疗剂最佳量更少的量。当两种治疗剂同时或依次给予对象时，与单独给予每种治疗剂时的治疗相比，每种治疗剂可以按次优量给予。例如，在某些实施方案中，对有需要IBD治疗的对象施用次优量的包含本发明的IL-22 Fc融合蛋白和地塞米松的药物组合物。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用来指具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。转化的细胞包括瞬时或稳定转化的细胞。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。在某些实施方案中，宿主细胞用外源核酸瞬时转染。在某些实施方案中，宿主细胞用外源核酸稳定转染。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体或抗体的片段。
“个体”、“对象”或“患者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体、对象或患者是人。
“分离的”IL-22Fc融合蛋白是这样的融合蛋白，所述融合蛋白已经从重组产生该融合蛋白的宿主细胞的环境分离。在一些实施方案中，将IL-22Fc融合蛋白纯化至大于80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)法所确定。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“编码IL-22 Fc融合蛋白的分离的核酸”指编码IL-22 Fc融合蛋白的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或独立载体中的这类核酸分子、瞬时或稳定转染到宿主细胞中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列必需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷化信号和增强子。
当一种核酸与另一个核酸序列处于功能性关系时，该核酸是“有效连接的”。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA与编码多肽的DNA有效连接若前者表达为参与所述多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列有效连接若它影响该序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列有效连接若该结合位点如此安置从而促进翻译。通常，“有效连接的”意指连接的DNA序列是连续的，并且，在分泌性前导序列情况下，是连续的并处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。连接通过在便利的限制性位点处连接而完成。如此类位点不存在，则根据常规实践使用合成性寡核苷酸衔接头或接头。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，例外在于例如含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能的变体抗体，这类变体通常以微量存在。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括而不限于，天然序列人IgG1 Fc区(非A同种型和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰、优选地一个或多个氨基酸置换而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如约1个至约10个氨基酸置换，和优选地约1个至约5个氨基酸置换。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并最优选地与之具有至少约90％同源性，更优选地与之具有至少约95％同源性。在某些实施方案中，变体Fc区未糖基化。
本文中可互换使用的“病症”、“疾病”或“病况”是将从本文所述的组合物(例如，药物组合物)，例如包括IL-22 Fc融合蛋白的组合物(例如，药物组合物)治疗中受益的任何病况。这包括慢性和急性病症或病况，包括那些使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。在一些实施方案中，所述病症为IL-22相关的病症。示例性病症包括但不限于IBD(例如，UC或克罗恩氏病)、微生物感染、急性肾损伤、急性胰腺炎、创伤、心血管病况、代谢综合症、急性内毒素血症和败血症。
本文互换使用的术语“炎性肠病症”、“炎性肠病”和“IBD”在本文中以最广含义使用并且包括其发病机制涉及肠(包括小肠和结肠)中复发性炎症的全部疾病和病理状况。IBD包括例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD不限于UC和CD。疾病的表现包括但不限于肠中炎症和上皮完整性下降。
术语“心血管疾病”或“心血管病症”在本文中以最广含义使用并且包括其发病机制涉及血管异常，诸如，例如，动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高的全部疾病和病理状况。本术语额外地包括从抑制动脉粥样硬化斑块形成获益的疾病和病理状况。心血管疾病包括而不限于冠状动脉动脉粥样硬化、冠脉微血管疾病、中风、颈动脉病、外周动脉病、局部缺血、冠状动脉病(CAD)、急性冠状动脉综合征(ACS)、冠状动脉心脏病(CHD)、与CAD和CHD相关的病况、脑血管病、外周血管病、动脉瘤、血管炎、静脉血栓形成、糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏疾病、在局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、和心肺旁路术。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病。
术语“心血管病况”在本文中以最广含义使用并且包括其病理学涉及动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高的全部心血管病和疾病。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病和病况。本术语特别地包括从抑制动脉粥样硬化斑块形成获益的疾病和病理状况。心血管病包括而不限于冠状动脉动脉粥样硬化、冠脉微血管疾病、中风、颈动脉病、外周动脉病、局部缺血、冠状动脉病(CAD)、冠状动脉心脏病(CHD)、与CAD和CHD相关的病况、脑血管病和与脑血管病相关的病况、外周血管疾病和与外周血管疾病相关的病况、动脉瘤、血管炎、静脉血栓形成、糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏疾病、在局部缺血和再灌注后的远端组织损伤和心肺旁路术。如本文所用的“与脑血管病相关的病况”包括例如短暂性脑缺血发作(TIA)和中风。如本文所用的“与外周血管疾病相关的病况”例如包括跛行。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病和病况。
动脉粥样硬化斑块形成可以因针对代谢性内毒素血症的先天免疫反应而出现，所述先天免疫反应以源自消化道微生物群和消化道粘膜屏障的功能完整性丧失的全身性脂多糖(LPS)的升高的水平为特征。针对内毒素血症的先天免疫反应导致造成斑块形成的低等级慢性炎症。
术语“代谢综合征”在本文中以最广含义使用。代谢综合征包括在成年对象中共同出现几种代谢风险因子，包括以下五种性状中的至少三种：可以例如是男性中腰围大于或等于90cm和女性中腰围大于或等于80cm的腹部肥胖；可以例如是大于或等于150mg/dL的血清甘油三酯升高或用于甘油三酯升高的药物治疗；可以例如是男性中低于40mg/dL和女性中低于50mg/dL的血清HDL胆固醇水平降低或用于低HDL胆固醇的药物治疗；可以例如是收缩血压大于130mmHg和舒张压大于85mmHg的高血压或用于高血压的药物治疗；和可以例如是大于或等于100mg/dL的空腹血糖升高、用于葡萄糖升高的药物治疗或先前诊断的2型糖尿病。
对于超过16岁的儿童，可以使用以上成年标准。对于10-16岁之间的儿童，代谢综合征包括在对象中共同出现几种代谢风险因子，包括以下五种性状中的至少三种：可以例如是腰围大于第90百分位数的腹部肥胖；可以例如是大于或等于110mg/dL、大于第95百分位数的血清甘油三酯升高或用于甘油三酯升高的药物治疗；可以例如是低于40mg/dL、小于第5百分位数的血清HDL胆固醇水平降低或用于低HDL胆固醇的药物治疗；可以例如是收缩血压大于130mmHg和舒张压大于85mmHg、大于第90百分位数的高血压或用于高血压的药物治疗；和可以例如是大于或等于100mg/dL的空腹血糖升高、糖耐受受损、用于葡萄糖升高的药物治疗或先前诊断的2型糖尿病。
通常而言，在代谢综合征中共同出现的风险因子包括肥胖(如腹部的肥胖)、高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗和/或高血压。全部这些风险因子均促进动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病或二者的形成。代谢综合征还可以以慢性脂肪组织炎症为特征。
代谢综合征可以视作促炎、凝血前状态，并且可能与升高水平的一种或多种C-反应蛋白、IL-6，LPS和纤维蛋白溶酶原激活物抑制物1相关；这类标志物可以与后续形成动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病或这二者的风险增加相关。
代谢综合征可以与几种肥胖相关病症相关，所述肥胖相关病症包括以下一种或多种：脂肪肝疾病伴脂肪变性、纤维化和肝硬化，肝细胞性和肝内胆管癌、慢性肾脏疾病、多囊性卵巢综合征、睡眠障碍性呼吸(包括阻塞性睡眠呼吸暂停)和高尿酸血症及痛风。
术语“胰岛素相关的病症”涵盖以糖耐受受损为特征的疾病或病况。在一个实施方案中，胰岛素相关的病症是包括而不限于以下的糖尿病：I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)、II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)糖尿病、妊娠糖尿病和将由刺激胰岛素分泌的活性剂受益的任何其他病症。在另一个实施方案中，胰岛素相关的病症以胰岛素抵抗为特征。
术语“败血病”以其最广意义使用并且可以涵盖由严重感染造成的全身性炎症状态。败血病可以由免疫系统对严重感染的反应造成，最常见地对血、尿道、肺、皮肤或其他组织中细菌、还对真菌、病毒和寄生虫的反应造成。
术语“急性内毒素血症”以其最广意义使用并且可以涵盖血浆细菌脂多糖(LPS)升高的病况。急性内毒素血症转而可能导致败血病。全身循环中增加的LPS将诱导低等级慢性炎症，这激活内源保护性宿主反应以升高血浆脂质，所述血浆脂质在慢性病况中促成膳食引起的肥胖、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化及最终CVD事件。
术语“移植抗宿主病(GVHD)”是指同种异体干细胞移植的并发症。在GVHD中，供体造血干细胞将移植受者识别为异物，并攻击患者的组织和器官，这可能损害组织或器官的功能或导致其衰竭。如本文所用，GVHD包括例如急性GVHD或慢性GVHD。此外，非限制性实例包括肠GVHD。
如本文所用，“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。理想的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病况态，以及缓解或预后改善。
例如，就IBD而言，“治疗”可以指形成IBD的可能性降低、形成IBD的速率降低和疾病严重程度降低。作为另一个例子，就动脉粥样硬化斑块形成而言，“治疗”可以指形成动脉粥样硬化斑块沉积物的可能性降低、形成沉积物的速率降低、现有沉积物的数量和尺寸减小或斑块稳定性改善。需要治疗的那些对象包括已经患有病症的那些以及其中待预防该病症的那些。理想的治疗效果包括，但不限于防止疾病的出现或复发、缓和症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、预防疾病、降低病情进展速率、缓解或缓和疾病状态，以及造成缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的IL-22 Fc融合蛋白用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
在某些实施方案中，“有需求的对象”在预防或治疗心血管病的语境下指以下对象：经诊断患有心血管疾病或心血管病况(CVD)或代谢综合征或显示与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的对象、过去已经诊断患有CVD或代谢综合征或显示与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的对象、或已经被认定在未来因遗传性或环境因素而处于形成CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的风险的对象。因此，在某些实施方案中，有需求的对象可以是正在显示CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况的对象或这样的对象，所述对象已经在过去显示CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况或已经被认定在未来处于形成CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况的风险。
在治疗心血管疾病或病况中，治疗药可以直接改变免疫反应的组分的反应的幅度，或使得疾病更易受其他治疗药(例如，抗生素、抗真菌药、抗炎要、化疗药等)治疗影响。在治疗动脉病中，治疗可能例如阻止或减缓疾病进展。因此，治疗动脉病特别地包括阻止、抑制或减慢病况的形成或该病况从一个阶段向另一个更晚期阶段进展，或进展成更严重的相关病况。
疾病或病况的“病理学”包括损害对象福祉的全部现象。在心血管疾病或病况情况下，这包括而不限于动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高。
“缓和”、“缓和的”或其等同物指治疗性疗法以及预防性或防止性措施，其中目的在于改善、防止、减缓(减轻)、减少或抑制疾病或病况，例如，动脉粥样硬化斑块形成。需要治疗的那些对象括已经患有该疾病或病况的那些以及倾向于患有该疾病或病况的那些或其中待预防该疾病或病况的那些。
“长期”施用指以与急性模式相反，以连续模式施用所述药物，从而将初始治疗作用维持延长的时间段。
“间歇”施用是在不中断的情况下不以连续方式进行、而在本质上为循环性的治疗。
术语“包装说明书”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
将相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
下文是如何相对于命名为“IL-22”的氨基酸序列计算命名为“对比蛋白”或“参照蛋白”的氨基酸序列的氨基酸序列同一性％的实例，其中“IL-22”表示IL-22目的多肽的氨基酸序列，“对比蛋白”表示正在与“IL-22”目的多肽比较的多肽的氨基酸序列，并且“X”、“Y”和“Z”各自表示不同氨基酸残基。
IL-22 XXXXXXXXXXXXXXX(长度＝15个氨基酸)
参照蛋白XXXXXYYYYYYY(长度＝12个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(两条多肽序列之间的相同匹配的氨基酸残基数)除以(IL-22多肽的氨基酸残基的总数)＝5除以15＝33.3％
IL-22 XXXXXXXXXX(长度＝10个氨基酸)
参照蛋白XXXXXYYYYYYZZYZ(长度＝15个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(两条多肽序列之间的相同匹配的氨基酸残基数)除以(IL-22多肽的氨基酸残基的总数)＝5除以10＝50％
术语“激动剂”以最广意义使用并且包括部分或完全模拟IL-22多肽的生物活性的任何分子。还由“激动剂”涵盖的是刺激编码该多肽的mRNA转录或翻译的分子。
合适的激动剂分子例如包括激动剂抗体或抗体片段；天然多肽；天然多肽的片段或氨基酸序列变体；肽；反义寡核苷酸；有机小分子；和编码多肽激动剂或抗体的核酸。对“激动剂”的提及涵盖单一激动剂或两种或更多种不同激动剂的组合。
术语“IL-22激动剂”以最广意义使用并且包括模拟天然序列IL-22多肽的定性生物活性(如上文限定)的任何分子。IL-22激动剂特别地包括IL-22-Fc或IL-22Ig多肽(免疫黏附素)，还包括模拟至少一种IL-22生物活性的小分子。优选地，生物活性是对IL-22受体的结合、与IL-22BP相互作用、促进先天免疫反应途径，或在心血管疾病或病况情况下，影响动脉粥样硬化斑块形成，尤其抑制动脉粥样硬化斑块形成。可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适成像方法，评估对斑块形成的抑制作用。
IL-22R1与其他蛋白质配对以形成异二聚体作为针对某些IL-10家族成员的受体。参见Quyang等人，2011，上文。因此，在某些实施方案中，IL-22激动剂可以包括IL-22受体激动剂，包括与IL-22R1结合并触发其下游信号传导的细胞因子(或其融合蛋白或激动剂)。在某些实施方案中，IL-22激动剂包括IL-22R1激动剂，包括而不限于抗-IL-22R1激动剂抗体；IL-20激动剂，包括而不限于IL-20多肽或IL-20Fc融合蛋白；和IL-24激动剂，包括而不限于IL-24多肽或IL-24融合蛋白。在某些其他实施方案中，IL-22R1激动剂包括IL-19激动剂，包括而不限于IL-19多肽或IL-19Fc融合蛋白；和IL-26激动剂，包括而不限于IL-26多肽或IL-26Fc融合蛋白。本文提供了IL-19的示例性序列(GenBank登录号AAG16755.1，SEQ ID NO：77)、IL-20的示例性序列(GenBank登录号AAH69311.1，SEQ ID NO：78)、IL-24的示例性序列(GenBank登录号AAH09681.1，SEQ ID NO：79)和IL-26的示例性序列(GenBank登录号NP_060872.1，SEQ ID NO：80)。在某些实施方案中，IL-19多肽包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在某些其他实施方案中，IL-20多肽包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在另外的其他实施方案中，IL-24多肽包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在某些其他实施方案中，IL-26多肽包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。
“小分子”在本文中定义为具有低于约600道尔顿、优选地低于约1000道尔顿的分子量。
如本文所用“激动剂抗体”是部分或完全模拟IL-22多肽的生物活性的抗体。
术语“药物制剂”或“药物组合物”指这样的制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的对象不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稀释剂、稳定剂或防腐剂。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
在本申请范围内，除非另外声明，否则所用的技术可以在几种熟知参考文献的任一者中找到，如：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)、PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等人，1990.Academic Press，San Diego，CA)及Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)。
如果适宜，除非另外指出，否则通常根据制造商限定的方案和/或参数，实施涉及使用市售试剂盒和试剂的方法。在因此本发明的方法和用途之前，应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体和试剂，它们当然可以变动。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。
Ⅱ.组合物和方法
本发明提供了IL-22 Fc融合蛋白，其组合物(例如，药物组合物)及其用途，例如，用于治疗IL-22相关的疾病，如IBD(例如，溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病)、心血管病症、代谢综合症、GVHD和用于加速创伤愈合(例如，糖尿病创伤愈合)。本文还提供了制备和纯化IL-22 Fc融合蛋白的方法。本发明至少部分是基于以下发现：IL-22 Fc融合蛋白的IL-22多肽部分是唾液酸化的，并且唾液酸化含量与本文提供的IL-22 Fc融合蛋白的效力和药代动力学特异性都有关。这个发现部分地是与鉴定受制造过程影响的以及影响分子的活性和PK/PD特性的分子的某些特性有关。例如，目前发现了如本文所述的具有总体上低糖基化的包含IL-22 Fc的组合物(包括但不限于例如每摩尔IL-22 Fc融合蛋白小于约8摩尔的平均唾液酸含量的IL-22 Fc融合蛋白及其组合物具有不期望的体内快速清除，并且此外，那些组合物(包括，但不限于，例如具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约12摩尔唾液酸的IL-22 Fc融合蛋白及其组合物)的高糖基化具有不希望的对IL-22受体的结合特性。因此，在某些方面中，如本文所述的，针对所识别问题的解决方案是针对IL-22 Fc融合蛋白及其组合物确定平均唾液酸含量的范围，其均具有合适的清除率以及合适的结合活性。更特别地，目前发现期望的范围是小于完全唾液酸化的范围，否则该完全唾液酸化范围通常是本领域技术人员将选择的范围，例如为了易于制造。在一个具体的实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白及其组合物的平均唾液酸含量的特别优选范围是每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸。
A.IL-22 Fc融合蛋白和组合物
本发明提供了IL-22 Fc融合蛋白及其组合物。通常，IL-22 Fc融合蛋白包括通过接头与Fc区连接的IL-22多肽。在一些实施方案中，IL-22多肽是糖基化的(例如，N-糖基化的)。在特定的实施方案中，IL-22多肽是唾液酸化的。在一些实施方案中，Fc区不是糖基化的，并且因此，也不是唾液酸化的。
在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约3摩尔唾液酸。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白超过约4摩尔唾液酸。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白超过约5摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白超过约6摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约7摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约8摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约9摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约10摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约11摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约12摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约13摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约14摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约15摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约16摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白超过约17摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约18摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约19摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白超过约20摩尔唾液酸。
在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约20摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约19摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约18摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约17摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约16摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约15摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约14摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约13摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白低于约12摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约11摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约10摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约9摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约8摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约7摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约6摩尔唾液酸。在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约5摩尔唾液酸。
例如，在一个方面中，本发明提供了包括通过接头连接Fc区的IL-22多肽的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约4至约20摩尔(例如，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15摩尔，约16摩尔，约17摩尔，约18摩尔，约19摩尔，或约20摩尔)唾液酸的唾液酸含量。
在另一个方面中，本发明提供了包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约20％至约180％的效力(例如，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约100％，约110％，约120％，约130％，约140％，约150％，约160％，约170％或约180％)。在一些实施方案中，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约40％至约130％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔至约12摩尔(例如，约8，约9，约10，约11或约12摩尔)唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约120％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔至约12摩尔(例如，约8，约9，约10，约11或约12摩尔)唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约60％至约110％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔至约12摩尔(例如，约8，约9，约10，约11或约12摩尔)唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约10％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约40％至约130％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约60％至约110％的效力。在一些实施方案中，例如，相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约10％的效力。在一些实施方案中，如本文所述的(例如，实施例2)，在受体结合测定或基于细胞的结合测定中评估效力。在一些实施方案中，参照IL-22 Fc融合蛋白具有表12和/或表13中所示的N-聚糖分布。
例如，在任何前述方面的一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22Fc融合蛋白约5至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约10摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约9摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约8摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约7摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5至约6摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约10摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约9摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约8摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约7摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22Fc融合蛋白约7至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约10摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约9摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7至约8摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22Fc融合蛋白约9至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9至约10摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约10至约11摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约11至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约11至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约11至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22Fc融合蛋白约11至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约11至约12摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约12至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约12至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约12至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约12至约13摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约13至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约13至约15摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约13至约14摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约14至约16摩尔唾液酸，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约14至约15摩尔唾液酸，或每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约15至约16摩尔唾液酸。
在一些实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔(例如，约8，约9，约10，约11或约12摩尔)。例如，在特定实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸。在其他特定实施方案中，唾液酸含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸。
唾液酸可以是本领域已知的任何合适的唾液酸或其任何合适的组合。例如，在一些实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)、Kdn、NGNA、Neu、Neu2en5Ac，或其组合。在一些实施方案中，主要的唾液酸是NANA。在一些实施方案中，基本上全部的唾液酸是NANA。
之前任一个IL-22 Fc融合蛋白可以具有约6,000ng/mL至约25,000ng的最大观察浓度(Cmax)，例如，约6,000ng/mL，约7,000ng/mL，约8,000ng/mL，约9,000ng/mL，约10,000ng/mL，约11,000ng/mL，约12,000ng/mL，约13,000ng/mL，约14,000ng/mL，约15,000ng/mL，约16,000ng/mL，约17,000ng/mL，约18,000ng/mL，约19,000ng/mL，约20,000ng/mL，约21,000ng/mL，约22,000ng/mL，约23,000ng/mL，约24,000ng/mL，或约25,000ng/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有约9,000ng/mL至约18,000ng的Cmax，例如，约9,000ng/mL，约10,000ng/mL，约11,000ng/mL，12,000ng/mL，约13,000ng/mL，约14,000ng/mL，约15,000ng/mL，约16,000ng/mL，约17,000ng/mL，或约18,000ng/mL。在一些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白具有约8,000ng/mL至约19,000ng的Cmax。在一些实施方案中，将约1,000μg/kgIL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax，或是等价的人Cmax值。
之前任一个IL-22 Fc融合蛋白可以具有约2,000天·ng/mL至约42,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)，例如，约2,000天·ng/mL，约4,000天·ng/mL，约6,000天·ng/mL，约7,000天·ng/mL，约7,500天·ng/mL，约8,000天·ng/mL，约8,500天·ng/mL，约9,000天·ng/mL，约9,500天·ng/mL，约10,000天·ng/mL，约12,000天·ng/mL，约16,000天·ng/mL，约20,000天·ng/mL，约24,000天·ng/mL，约30,000天·ng/mL，约36,000天·ng/mL，或约42,000天·ng/mL。例如，在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的AUClast。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg的IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax，或是等价的人Cmax值。
之前任一个IL-22 Fc融合蛋白可以具有约25mL/kg/天至约400mL/kg/的清除率(CL)，例如，约25mL/kg/天，约50mL/kg/天，约75mL/kg/天，约100mL/kg/天，约125mL/kg/天，约150mL/kg/天，约175mL/kg/天，约200mL/kg/天，约225mL/kg/天，约250mL/kg/天，约275mL/kg/天，约300mL/kg/天，约325mL/kg/天，约350mL/kg/天，约375mL/kg/天，或约400mL/kg/天。在一些实施方案中，CL为约40mL/kg/天至约140mL/kg/天。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg的IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估CL，或是等价的人CL值。
在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约5摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约4摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约3摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约2摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约1摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22Fc融合蛋白低于约0.5摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约0.2摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约0.1摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约0.05摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约0.01摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约0.001摩尔NGNA。在一些实施方案中，NGNA含量为每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约0.001摩尔至约5摩尔NGNA，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约0.001摩尔至约1摩尔NGNA，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约0.1摩尔至约1摩尔NGNA，或每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约0.5摩尔至约1摩尔NGNA。
在之前任一个方面中，IL-22多肽可以是N-糖基化的。之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以包含具有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。
例如，在一些实施方案中，约0.01％至约5％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构在一些实施方案中，约0.5％至约1.5％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约0.6％至约1.5％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约0.3％至约1.7％的N-聚糖具有单触角结构。在一些实施方案中，约1％的N-聚糖具有单触角结构。
例如，在一些实施方案中，约0.5％至约40％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约13.1％至约20.4％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约10.6％至约22.8％的N-聚糖具有双触角结构。在一些实施方案中，约17％的N-聚糖具有双触角结构。
例如，在一些实施方案中，约10％至约50％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，或约50％)的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约20％至约40％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约25％至约35％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约28.2％至约33.5％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约26.5％至约35.3％的N-聚糖具有三触角结构。在一些实施方案中，约31％的N-聚糖具有三触角结构。
例如，在一些实施方案中，约20％至约60％(例如，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，或约60％)的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约30％至约50％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约35％至约45％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约35.9％至约47％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约26.5％至约35.3％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中，约42％的N-聚糖具有四触角结构。
之前任一个IL-22 Fc融合蛋白可以包含含有零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。
例如，在一些实施方案中，约5％至约40％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约13.7％至约27.5％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约9.1％至约32.1％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。在一些实施方案中，约21％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。
在另一个实例中，在一些实施方案中，约1％至约35％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，或约35％)的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12％至约16％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12.3％至约15.6％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约11.2％至约16.7％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。在一些实施方案中，约14％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。
在再另一个实例中，在一些实施方案中，约1％至约35％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，或约35％)的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约5％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约16％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10.9％至约15.7％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约9.3％至约17.4％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。在一些实施方案中，约13％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。
在再一个实例中，在一些实施方案中，约5％至约40％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约16.4％至约20.6％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约22％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。在一些实施方案中，约19％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。
在另一个实例中，在一些实施方案中，约5％至约45％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，或约45％)的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约20.8％至约26.4％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约18.9％至约28.3％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中，约24％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以包含含有零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分的N-聚糖。
例如，在一些实施方案中，约10％至约50％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，或约50％)的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15％至约35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约20％至约30％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约17.3％至约30％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约13.1％至约34.3％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。在一些实施方案中，约24％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。
在另一个实例中，在一些实施方案中，约5％至约45％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，或约45％)的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约17.6％至约22.3％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约16％至约23.9％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。在一些实施方案中，约20％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。
在再另一个实例中，在一些实施方案中，约5％至约45％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，或约45％)的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约17.5％至约23.7％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约15.5％至约25.8％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。在一些实施方案中，约21％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。
在另一个实例中，在一些实施方案中，约5％至约40％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约12％至约24％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约14.2％至约19.1％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约12.5％至约20.7％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。在一些实施方案中，约17％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。
例如，在一些实施方案中，约1％至约30％(约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，或约30％)的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约6.4％至约12％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约4.5％至约13.9％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中，约9％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括约0％至约20％(例如，约0％，约0.1，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，或约20％)的包括末端甘露糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中，约0.1％至约5％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。在一些实施方案中，约1％至约4％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。在一些实施方案中，约1.6％至约2.9％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。在一些实施方案中，约1.2％至约3.3％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。例如，在一些实施方案中，约2％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括约10％至约70％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，或约70％)的包括末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分的N-聚糖。例如，在一些实施方案中，约30％至约50％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约35％至约45％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约35.1％至约49.2％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约30.4％至约53.8％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约42％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约1％至约35％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，或约35％)的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约8.4％至约12.5％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约7％至约13.8％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约1％至约35％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，或约35％)的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约1％至约20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约15％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约8.1％至约12.5％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约6.7％至约14％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约1％至约40％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，或约40％)的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约5％至约25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10％至约20％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约10.1％至约18.6％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约7.2％至约21.5％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约14％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约0.1％至约25％(例如，约0.1％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，或约25％)的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约1％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约4％至约24％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约2.3％至约11.8％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约0.1％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，约7％的N-聚糖包含四个末端GlCNAc部分。
在之前任一个IL-22 Fc融合蛋白可以包括约10％至约70％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，或约70％)的包括末端半乳糖部分的N-聚糖。例如，在一些实施方案中，约20％至约50％的N-聚糖包括末端Gal部分。在一些实施方案中，约25％至约35％的N-聚糖包括末端Gal部分。在一些实施方案中，约26.1％至约38.3％的N-聚糖包括末端Gal部分。在一些实施方案中，约22.1％至约42.3％的N-聚糖包括末端Gal部分。在一些实施方案中，约32％的N-聚糖包括末端Gal部分。
之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以包括一个、两个或三个末端Gal部分。
例如，在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约5％至约50％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，或约50％)的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约19.8％至约27.1％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约17.4％至约29.5％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。在一些实施方案中，约23％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约0％至约25％(例如，约0％，约0.1％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，或约25％)的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约1％至约15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约2％至约12％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约4.6％至约9.2％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约3％至约10.8％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。在一些实施方案中，约7％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，约0％至约15％(例如，约0％，约0.1％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，或约15％)的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约0.1％至约10％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约1％至约5％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约1.1％至约2.6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约0.7％至约3％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。在一些实施方案中，约2％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括包含半乳糖N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖。在一些实施方案中，约0％至约20％(例如，约0％，约0.1％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，或约16％，约17％，约18％，约19％，或约20％)的N-聚糖包括LacNAc重复。例如，在一些实施方案中，约1％至约10％的N-聚糖包括LacNAc重复。在一些实施方案中，约2％至约8％的N-聚糖包括LacNAc重复。在一些实施方案中，约3.7％至约5.2％的N-聚糖包括LacNAc重复。在一些实施方案中，约3.2％至约5.7％的N-聚糖包括LacNAc重复。在一些实施方案中，约5％的N-聚糖包括LacNAc重复。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括包含岩藻糖化的N-聚糖的N-聚糖。在一些实施方案中，约50％至约100％(例如，约50％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，约70％，约70％，约71％，约72％，约73％，约74％，约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或约100％)的N-聚糖是岩藻糖化的。例如，在一些实施方案中，约60％至约80％的N-聚糖是岩藻糖化的。在一些实施方案中，约65％至约75％的N-聚糖是岩藻糖化的。在一些实施方案中，约65.1％至约75％的N-聚糖是岩藻糖化的。在一些实施方案中，约61.7％至约78.3％的N-聚糖是岩藻糖化的。在一些实施方案中，约70％的N-聚糖是岩藻糖化的。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括包含无岩藻糖化的N-聚糖的N-聚糖。在一些实施方案中，约5％至约50％(例如，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，或约50％)的N-聚糖是无岩藻糖化的。例如，在一些实施方案中，约10％至约30％的N-聚糖是无岩藻糖化的。在一些实施方案中，约15％至约25％的N-聚糖是无岩藻糖化的。在一些实施方案中，约16.4％至约23.7％的N-聚糖是无岩藻糖化的。在一些实施方案中，约14％至约16.1％的N-聚糖是无岩藻糖化的。在一些实施方案中，约20％的N-聚糖是无岩藻糖化的。
之前任何IL-22多肽可以在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143上是糖基化的。在一些实施方案中，IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和Asn143上是糖基化的。
例如，在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率可以为约50％至约100％(例如，约50％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，约70％，约70％，约71％，约72％，约73％，约74％，约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或约100％)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约70％至约90％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约75％至约85％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约82％。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率可以为约60％至约100％(例如，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，约70％，约70％，约71％，约72％，约73％，约74％，约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或约100％)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约90％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约95％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约100％。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率可以为约60％至约100％(例如，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，约70％，约70％，约71％，约72％，约73％，约74％，约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或约100％)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约90％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约95％至约100％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约100％。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白中，在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率可以为约1％至约60％(例如，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，预热56％，约57％，约58％，约59％，或约60％)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约15％至约45％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约25％至约35％。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约33％。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，Fc区不是糖基化的。在一些实施方案中，Fc区按照EU索引的位置297的氨基酸残基是Gly。在一些实施方案中，Fc区按照EU索引的位置297的氨基酸残基是Ala。在一些实施方案中，Fc区按照EU索引的位置299的氨基酸残基是Ala、Gly或Val。在一些实施方案中，Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
在之前任何IL-22 Fc融合蛋白的一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与选自SEO ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，Fc区不是N-糖基化的。
之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以是二聚IL-22 Fc融合蛋白。在其他实施方案中，之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以是单体IL-22 Fc融合蛋白。
之前任何IL-22 Fc融合蛋白可以包括人IL-22多肽。在一些实施方案中，SEQ IDNO：4的氨基酸序列。
任何合适的接头可以用于本文所述的IL-22 Fc融合蛋白中。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，接头由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)组成。
在一些实施方案中，本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22受体是人IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1和/或IL-10R2。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1。
在一些实施方案中，之前任何IL-22 Fc融合蛋白通过包括以下步骤的方法来产生：在适于IL-22 Fc融合蛋白表达的条件下培养能够表达IL-22 Fc融合蛋白的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞培养物或细胞培养基获得IL-22 Fc融合蛋白的步骤。
本文所述的(例如，以上所述的)任何IL-22 Fc融合蛋白可以包括在组合物(例如，药物组合物)中。例如，以上关于IL-22 Fc融合蛋白所述的任何值可以是针对IL-22 Fc蛋白的组合物的平均值。
例如，本文提供了包括白介素(IL)-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白包括通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，IL-22多肽是N-糖基化的。
在另一个实例中，本文提供了包括IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白包括通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143上是糖基化的，和其中：(a)残基Asn21的百分比N-糖基化位点占有率在70至90范围内；(b)残基Asn35的百分比N-糖基化位点占有率在90至100范围内；(c)残基Asn64的百分比N-糖基化位点占有率在90至100范围内；和/或(d)残基Asn143的百分比N-糖基化位点占有率在25至35范围内。
任何组合物可以具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8或9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
在本文所述的任何组合物中，唾液酸可以是N-乙酰神经氨酸(NANA)。
任何组合物可以具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于1摩尔NGNA的平均NGNA含量。
在一些实施方案中：(i)IL-22 Fc融合蛋白可以具有约8,000ng/mL至约19,000ng的最大观察浓度(Cmax)；(ii)IL-22 Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)；和/或(iii)IL-22 Fc融合蛋白可以具有约40mL/kg/天至约140mL/kg/天的清除率(CL)。在一些实施方案中，将约1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax、AUClast和/或CL。
在任何组合物中，IL-22多肽可以包括具有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构；(ii)约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构；(iii)约25％至约40％的N-聚糖具有三触角结构；和/或(iv)约30％至约51％的N-聚糖具有四触角结构。在一些实施方案中：(i)0.1％至2％的N-聚糖具有单触角结构；(ii)10％至25％的N-聚糖具有双触角结构；(iii)25％至40％的N-聚糖具有三触角结构；和/或(iv)30％至51％的N-聚糖具有四触角结构。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白可以包括包含零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约9％至约32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分；(ii)约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分；(iii)约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分；(iv)约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分；和/或(v)约12％至约30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。在一些实施方案中：(i)9％至32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分；(ii)10％至20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分；(iii)8％至25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分；(iv)12％至25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分；和/或(v)12％至30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白可以包含含有零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分的N-聚糖。在一些实施方案中：(i)约12％至约35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分；(ii)约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分；(iii)约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分；(iv)约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分；和/或(v)约1％至约20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。在一些实施方案中：(i)12％至35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分；(ii)10％至30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分；(iii)10％至30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分；(iv)10％至30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分；和/或(v)1％至20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
在任何组合物中，(i)IL-22多肽可以包括约0％至约10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖；和/或(ii)IL-22多肽包含约30％至约55％含有末端N-乙酰葡糖胺(GlaNAc)部分的N-聚糖。在一些实施方案中，(i)IL-22多肽包括0％至10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖；和/或(ii)IL-22多肽包括约30％至约55％含有末端GlaNAc部分的N-聚糖。在一些实施方案中，IL-22多肽包括0％至10％含有末端甘露糖部分的N-聚糖。在一些实施方案中，IL-22多肽包括30％至55％含有末端GlcNAc部分的N-聚糖。
在任何组合物中，N-聚糖包含一个、两个、三个或四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中，(i)约1％至约20％的N-聚糖包括一个末端GlcNAc部分；(ii)约1％至约20％的N-聚糖包括两个末端GlcNAc部分；(iii)约5％至约25％的N-聚糖包括三个末端GlcNAc部分；和/或(iv)约0％至约15％的N-聚糖包括四个末端GlcNAc部分。在一些实施方案中：(i)1％至20％的N-聚糖包括一个末端GlcNAc部分；(ii)1％至20％的N-聚糖包括两个末端GlcNAc部分；(iii)5％至25％的N-聚糖包括三个末端GlcNAc部分；和/或(iv)0％至15％的N-聚糖包括四个末端GlcNAc部分。
在任何组合物中，(i)IL-22多肽包括约20％至约45％具有末端半乳糖(Gal)部分的N-聚糖；和/或(ii)N-聚糖包括一个、两个或三个末端Gal部分。在一些实施方案中，(i)IL-22多肽包括20％至45％具有末端Gal部分的N-聚糖；和/或(ii)N-聚糖包括一个、二个或三个末端Gal部分。
在任何组合物中：(i)约15％至约30％的N-聚糖可以包括一个末端Gal部分；(ii)约1％至约15％的N-聚糖可以包括两个末端Gal部分；和/或(iii)约0.1％至约6％的N-聚糖可以包括三个末端Gal部分。在一些实施方案中：(i)15％至30％的N-聚糖包括一个末端Gal部分；(ii)1％至15％的N-聚糖包括两个末端Gal部分；和/或(iii)0.1％至6％的N-聚糖包括三个末端Gal部分。
在任何组合物中：(i)IL-22多肽可以包含含有半乳糖N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖；(ii)IL-22多肽可以包含含有岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖；和/或(iii)IL-22多肽可以包含含有无岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白的Fc区可以是未糖基化的。在一些实施方案中：(i)按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly或Ala；和/或(ii)按照Fc区的EU索引中的位置299的氨基酸残基是Ala、Gly或Val。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly或Ala。在一些实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Gly。在其他实施方案中，按照Fc区的EU索引中的位置297的氨基酸残基是Ala。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白的Fc区包括IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白可以包括与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白可以包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQID NO：16的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。
在任何组合物中，IL-22多肽可以是人IL-22多肽。在一些实施方案中，IL-22多肽包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白的接头可以包括氨基酸序列RVESKYGPP(SEQID NO：44)或由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)组成。
在任何组合物中，IL-22 Fc融合蛋白可以结合IL-22受体。在一些实施方案中，IL-22受体是人IL-22受体。
可以使用任何合适浓度的IL-22 Fc融合蛋白。例如，在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度可以为约0.5mg/mL至约20mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约0.5mg/mL至约5mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约1mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约8mg/mL至约12mg/mL。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白的浓度为约10mg/mL。
可以从具有至少约500L体积的生产培养物产生本文所述的IL-22 Fc融合蛋白。在任何前述方面的一些实施方案中，从具有约500L至约5,000L体积的生产培养物产生IL-22Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约1,000L至约3,000L体积的生产培养物产生IL-22Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约1,500L至约2,500L体积的生产培养物产生IL-22Fc融合蛋白。在一些实施方案中，从具有约2,000L至体积的生产培养物产生IL-22 Fc融合蛋白。
任何组合物可以是药物组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包括其他治疗剂。在一些实施方案中，组合物进一步包括胶凝剂。
1.示例性IL-22多肽
任何合适的IL-22多肽可以包括在本文提供的IL-22 Fc融合蛋白中。例如，在本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白中，IL-22多肽可以包括包含含有SEQ ID NO：71的氨基酸序列(具有内源性IL-22前导序列的人IL-22)的多肽，或包括与SEQ ID NO：71具有至少80％序列同一性(例如，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，IL-22多肽包括包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列(没有前导序列的人IL-22)或包含与SEQ ID NO：4具有至少80％(例如，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22多肽包括包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
可以通过本领域普通技术人员已知的方法实现天然IL-22分子连同其核酸和多肽序列的制备。例如，可以通过培养用含有IL-22核酸的载体转化或转染的细胞，产生IL-22多肽。当然，构思了本领域熟知的替代性方法可以用来制备IL-22。例如，可以通过使用固相技术直接进行肽合成，产生IL-22序列或其部分(参见，例如，Stewart等人，1969，Solid-PhasePeptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，Calif.(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，1963，85：2149-2154)。可以使用手工技术或通过自动化法，进行体外蛋白质合成。可以例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City，Calif.)，使用制造商的说明，完成自动合成。可以单独化学合成IL-22的多个部分并利用化学或酶促方法将其合并，以产生全长IL-22。
可以通过引入被变成编码天然序列IL-22多肽的DNA的适宜核苷酸或通过合成所需的IL-22多肽，制备IL-22变体。本领域技术人员将理解，氨基酸变化可以改变IL-22的翻译后处理，如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特征。
例如，使用例如在美国专利号5,364,934中所述的用于保守突变和非保守突变的任何技术和指南，可以在本文所述的天然序列IL-22多肽中产生变异。变异可以是置换、缺失或插入一个或多个编码天然序列或变体IL-22的密码子，所述置换、缺失或插入导致与相应的天然序列或变体IL-22相比其氨基酸序列的变化。任选地，变异是通过在天然序列IL-22多肽的一个或多个结构域中将至少一种氨基酸置换为任何其他氨基酸。可以通过比较IL-22的序列与已知同源蛋白质分子的序列并最小化在高度同源性区域内所做的氨基酸序列变化的数目，找到确定可以插入、置换或缺失哪个氨基酸残基而并未不利影响所需活性中的指导原则。氨基酸置换可以是将一个氨基酸替换为具有相似结构的和/或化学特性的另一种氨基酸结果，如将亮氨酸替换为丝氨酸，即，保守性氨基酸替换。插入或缺失可以任选地处于1至5个氨基酸的范围内。可以通过在序列中系统地产生氨基酸插入、缺失或置换并例如在以下实施例中描述的体外测定法中检验所得变体的活性，确定允许的变异。
在具体的实施方案中，表A中优选置换的标题下显示感兴趣的保守性置换。如果此类置换导致生物活性改变，则引入表A中名为“示例性置换”或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更明显改变，并且筛选产物。
本发明范围内包括的IL-22多肽的另一类型的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。出于本发明的目的，“改变天然糖基化模式”意指删除一个或多个存在于天然序列IL-22中的糖部分，和/或添加一种或多种在天然序列IL-22中不存在的糖基化位点，和/或改变附着于糖基化位点的糖残基的比率和/或组成。
多肽的糖基化一般是N联接的或O联接的。可以通过改变氨基酸序列，完成向IL-22多肽添加糖基化位点。可以例如通过向天然序列IL-22添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由前述残基置换(对N-联接的糖基化位点而言)，或添加用于O联接的糖基化的识别序列，作出改变。可以任选通过以下方式改变IL-22氨基酸序列：在DNA水平的变化，特别地通过在预选择的碱基处突变编码IL-22多肽的DNA，从而生成将翻译成所需氨基酸的密码子。
在IL-22多肽上增加糖部分数目的另一种手段是通过糖苷与多肽的化学偶联或酶促偶联。本领域中描述了这类方法，例如，在WO 87/05330中和在Aplin等人，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中描述。
可以按化学或酶促方式或通过突变性置换密码子，实现IL-22多肽上存在的糖部分的移除，其中所述密码子编码充当糖基化的靶的氨基酸残基。化学去糖基化技术是本领域已知的并且例如由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)并由Edge等人，Anal.Biochem.，118：131(1981)描述。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现多肽上糖部分的酶促切除，如Thotakura等人，Meth.Enzymol.，138：350(1987)。
可以使用本领域已知的方法如寡核苷酸介导的(位点定向)诱变、丙氨酸扫描法和PCR诱变产生变异。可以在克隆的DNA上实施位点定向诱变(Carter等人，1986，Nucl.AcidsRes，13：4331；Zoller等人，1987，Nucl.Acids Res.，10：6487)，盒诱变(Wells等人，1985，Gene，34：315)、限制性选择诱变(Wells等人，1986，Philos.Trans.R.Soc.London A，317：415)或其他已知技术以产生IL-22变体DNA。
本文还提供IL-22多肽的片段。这类片段可以在N末端或C末端截短，或可以缺少内部的残基，例如，与全长天然蛋白比较时。某些片段缺少对本发明IL-22多肽的所需生物活性而言并非必需的氨基酸残基。因此，在某些实施方案中，IL-22多肽的片段是有生物活性的。在某些实施方案中，全长IL-22的片段缺少N端信号肽序列。
本发明的范围内包括对天然序列和变体IL-22多肽的共价修饰。一种类型的共价修饰包括所靶向的IL-22的氨基酸残基与能够与选择的IL-22多肽侧链或N端残基或C端残基反应的有机衍生剂反应。用双官能试剂衍生化可用于例如将IL-22交联至水不溶性支持物基质或表面，例如，用于纯化抗IL-22抗体的方法。常使用的交联剂例如包括1，1-双(二唑乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯、同双官能酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3，3′-二硫代双(珀酰亚胺丙酸酯)、双官能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和活性剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯。
其他修饰包括谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺化成为相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基、脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，1983，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86i页)、N末端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
另一类型的IL-22共价修饰包括将IL-22多肽连接至多种非蛋白质聚合物的之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，例如按美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式连接。天然序列和变体IL-22也可以按形成包含与另一个异源多肽或氨基酸序列融合的IL-22(包括IL-22片段)的嵌合分子的方式修饰。
在一个实施方案中，这种嵌合分子包含IL-22与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供抗标签抗体可以选择性与之结合的表位。表位标签通常置于IL-22多肽的氨基端或羧基端。可以使用针对标签多肽的抗体，检测到IL-22多肽的这类加表位标签形式的存在。也提供表位标签使得能够利用抗标签抗体或另一个类型的与该表位标签结合的亲和基质，通过亲和纯化法轻易纯化IL-22多肽。多种标签多肽及其相应的抗体是本领域熟知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；fluHA标签多肽和其抗体12CA5(Field等人，1988，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165)；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、和9E10抗体(Evan等人，1985，Mol.Cell.Biol.，5：3610-3616)；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人，1990，Protein Engineering，3(6)：547-553)。其他标签多肽包括Flag-肽(Hopp等人，1988，BioTechnology，6：1204-1210)；KT3表位肽(Martin等人.，1992，Science，255：192-194)；微管蛋白表位肽(Skinner等人，1991，J.Biol.Chem.，266：15163-15166)；和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397)。
在另一个实施方案中，嵌合分子可以包含IL-22多肽或其片段与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于双价形式的嵌合分子，这种融合物可以是IgG分子的Fc区。这些融合多肽是抗体样分子，这些抗体样分子将异源蛋白(“黏附蛋白”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合，并经常叫做免疫黏附素。在结构上，免疫黏附素包含IL-22或其变体的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物。免疫黏附素分子的黏附蛋白部分一般是至少包含受体或配体结合位点的连续氨基酸序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白显示改性的效应子活性。
IL-22多肽或其片段可以例如与免疫球蛋白重链恒定区序列融合以产生IL-22-Ig融合蛋白(例如，IL-22 Fc融合蛋白)。IL-22多肽可以是人或鼠IL-22。免疫球蛋白重链恒定区序列可以是人或鼠免疫球蛋白重链恒定区序列。
2.示例性IL-22 Fc融合蛋白
在某些实施方案中，本文描述的任何IL-22Fc融合蛋白与IL-22受体结合并且诱导IL-22受体活性或信号传导和/或是IL-22受体活性的激动剂。
在另一个方面，本文提供的IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的多肽。在其他实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含了具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，并相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的IL-22 Fc融合蛋白保留与IL-22受体结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：8、10、12、14、16、24或26中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在IL22外部的区域内(即，在Fc中)。。在一些实施方案中，取代、插入或缺失可以在IL-22 Fc融合蛋白的接头、铰链、CH2结构域、CH3结构中。在某些具体实施方案中，Fc的C末端Lys残基缺失。在某些其他实施方案中，Fc的C末端Gly残基和Lys残基同时缺失。
在一些实施方案中，接头与DKTHT(SEQ ID NO：32)，EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：33)，VEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：34)，KVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：35)，KKVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：36)，DKKVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：37)，VDKKVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：38)，KVDKKVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：39)，EPKSSDKTHT(SEQ ID NO：40)，GGGDKTHT(SEQ ID NO：41)，ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：42)，SKYGPP(SEQ ID NO：43)，RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)，GGGSTHT(SEQ ID NO：63)，DKKVEPKSSDKTHT(SEQ ID NO：64)，KVDKKVEPKSSDKTHT(SEQ IDNO：65)，或KKVEPKSSDKTHT(SEQ ID NO：66)具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。参见，例如，美国专利No.9,815,880的表2，将其全部按引用并入本文中。
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的IL-22 Fc融合蛋白变体。表A中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表A中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更实质的变化。可以将氨基酸置换引入IL-22 Fc融合蛋白中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的IL-22受体结合作用、免疫原性降低或改善的IL-22受体信号传导。
表A
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val：Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的蛋白质残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该蛋白质与其结合伙伴的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，蛋白质复合物(例如，细胞因子-受体复合物)的晶体结构可以用来确定蛋白质和其结合伙伴之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间范围的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。
本文提供了编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，核酸编码包含SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26的氨基酸序列的IL-22 Fc融合蛋白，优选SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16，更优选SEQ ID NO：8。在某些其他实施方案中，核酸包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的多核苷酸序列。在某些特定实施方案中，核酸包括SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11的多核苷酸序列，优选SEQ ID NO：7。在某些实施方案中，分离的核酸包括与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：23或SEQ ID NO：25的多核苷酸序列为至少80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，分离的核酸包括与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的多核苷酸序列为至少80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的多核苷酸序列，其中分离的核酸能够编码能够结合IL-22R和/或引发IL-22R活性的IL-22 Fc融合蛋白，并且其中IL-22 Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，，分离的核酸包括与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23或SEQID NO：25的多核苷酸序列为至少80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的多核苷酸序列，其中分离的核酸能够编码包括SEQ ID NO：8、10、12或14的氨基酸序列的IL-22 Fc融合蛋白。在相关方面中，本发明提供了包含上述核酸的载体，和包含所述载体的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在某些特定实施方案中，宿主细胞是原核细胞，包括但不限于，大肠杆菌细胞。在某些其他实施方案中，宿主细胞是真核细胞，包括但不限于，CHO细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包括包含编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的IL-22 Fc融合蛋白的核酸的载体。
a)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的IL-22 Fc融合蛋白以升高或降低融合蛋白的Fc部分糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对蛋白质添加或删除糖基化位点。
在融合蛋白包含Fc区的情况下，可以改变附着于其的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状寡糖，所述寡糖通常借助N联接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。例如见，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双天线状寡糖结构的“茎部”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰的抗体或抗体Fc区中的寡糖以产生具有某些改善特性的Fc变体。
通过以下方式确定附着于Fc区的CH2结构域的岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的附着于Asn297或N297的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处糖链内部岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的约上游或下游±3个氨基酸，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1；和WO2004/056312 A1，特别地在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
还可以为抗体变体提供双分寡糖，例如，其中附着于抗体Fc区的双天线状寡糖由GlcNAc平分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US2005/0123546中描述。也提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中描述。
b)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的Fc融合蛋白的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的Fc变体，这使所述Fc变体成为下述应用的理想候选物，其中包含Fc区的抗体或融合蛋白的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体或Fc缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch等人，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(见，例如，Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性测定法(见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和
Figure BDA0002603336170000771
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95：652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体或Fc不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg等人，Blood 101：1045-1052(2003)；和Cragg等人，Blood 103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(见，例如，Petkova等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括置换了Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或削弱的与FcR结合的某些抗体或Fc变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白包含这样的Fc变体，所述Fc变体具有一个或多个减少ADCC的氨基酸置换，例如，在Fc区的位置297处移除N-糖基化位点并仍保留FcRn结合活性的置换(EU残基编号)。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致削弱的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
在US 2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了具有增加的半寿期和改善的与新生Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子也参见Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
c.)半胱氨酸改造的变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸改造的Fc融合蛋白，其中将抗体Fc区的一个或多个残基置换为半胱氨酸残基。在具体的实施方案中，置换的残基出现在Fc的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在Fc的可及位点处并且可以用来使Fc缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。例如，可以将重链Fc区的S400(EU编号)置换为半胱氨酸。参见例如，美国专利号7,521,541。
B.制备和/或纯化IL-22 Fc融合蛋白的方法
可以通过任何合适的方法，例如，培养用含有编码IL-22 Fc融合蛋白、片段或其变体的核酸的载体转化或转染的细胞，来制备本文提供的IL-22 Fc融合蛋白。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。可以使用任何合适的宿主细胞，例如，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)、大肠杆菌或酵母。进一步提供了用于生产本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的方法，并且通常涉及在适于所需IL-22 Fc融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，并从细胞培养物收集和任选纯化所需的IL-22 Fc融合蛋白。本文还提供了选择包括IL-22 Fc融合蛋白的批次的方法。
例如，本文提供了制备本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白的方法，其包括一个、两个、三个或全部四个以下步骤：(a)提供包含编码本文所述的任何IL-22 Fc融合蛋白(例如，包括通过接头连接Fc区的IL-22多肽的IL-22 Fc融合蛋白)的核酸的宿主细胞；(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；(c)将种子训练培养物接种至接种培养基中并在适于形成接种训练培养物的条件下培养；和/或(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练培养物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，IL-22多肽是糖基化的。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约16摩尔唾液酸(例如，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15或约16摩尔唾液酸)的唾液酸含量。
在之前任何方法中，宿主细胞可以是冷冻的宿主细胞，并且步骤(a)进一步包括在种子训练培养基中融化冷冻的宿主细胞。宿主细胞可以在任何合适的温度下冷冻，例如，约0℃，约-10℃，约-20℃，约-30℃，约-40℃，约-50℃，约-60℃，约-70℃，约-80℃，约-90℃，约-100℃，或更低。冷冻的宿主细胞可以融化任何合适的时间量并且在任何合适的温度下融化。在其他实施方案中，滚动种子训练物可以用于IL-22 Fc融合蛋白的生产。在这个实例中，种子训练物连续生长(直至特定的细胞年龄)，以接种接种训练物，而不是使用冷冻的宿主细胞。
在之前任何方法的一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物具有约1L至约100L的体积，例如，约1L，约2L，约3L，约4L，约5L，约10L，约15L，约20L，约25L，约30L，约35L，约40L，约45L，约50L，约55L，约60L，约70L，约75L，约80L，约85L，约90L，约95L，或约100L。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物具有约5L至约50L的体积。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物具有约10L至约40L的体积。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物具有约15L至约25L的体积。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物具有约20L的体积。
接种训练培养基或接种训练培养物可以具有任何合适的体积。在之前任何方法的一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约10L至约4,000L的体积，例如，约10L，约15L，约20L，约25L，约30L，约35L，约40L，约45L，约50L，约55L，约60L，约70L，约75L，约80L，约85L，约90L，约95L，约100L，约105L，约110L，约115L，约120L，约125L，约130L，约135L，约140L，约145L，约150L，约155L，约160L，约165L，约170L，约175L，约180L，约185L，约190L，约195L，约200L，约300L，约400L，约500L，约600L，约700L，约800L，约900L，约1000L，约1,500L，约2,000L，约2,500L，约3,000L，约3,500L，或约4,000L。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约50L至约100L的体积。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约75L至约90L的体积。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约80L的体积。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约300L至约500L的体积(例如，约300L，约320L，约340L，约360L，约380L，约400L，约420L，约440L，约460L，约480L，或约500L)。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约350L至约450L的体积。在一些实施方案中，接种训练培养基或接种训练培养物具有约400L的体积。
生产培养基或生产培养物可以具有任何合适的体积。在之前任何方法的一些实施方案中，生产培养基或生产培养物具有约100L至约30,000L的体积，例如，约100L，约200L，约300L，约400L，约500L，约600L，约700L，约800L，约900L，约1000L，约1,500L，约2,000L，约2,500L，约3,000L，约3,500L，约4,000L，约4,500L，约5,000L，约5,500L，约6,000L，约6,500L，约7,000L，约7,500L，约8,000L，约8,500L，约9,000L，约9,500L，约10,000L，约12,000L，约15,000L，约20,000L，约25,000L，或约30,000L。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物具有约500L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物具有约1,000L至约3,000L的体积。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物具有约1,500L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物具有约2000L的体积。
在之前任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(d)前将接种训练培养物传代约1至约20次，例如，约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15，约16，约17，约18，约19，或约20次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约1至约10次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约2至约6次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约2至约3次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约5次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约2次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约3次。在一些实施方案中，在步骤(d)之前将接种训练培养物传代约4次。
在之前任何方法的一些实施方案中，种子训练培养基、接种训练培养基和/或生产培养基包括能够选择宿主细胞的选择剂。在一些实施方案中，种子训练培养基包括选择剂。可以使用任何合适的选择剂。在一些实施方案中，选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺、甲氨蝶呤或抗生素(例如杀稻瘟菌素、遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、麦考酚酸或zeocin)。在特定实施方案中，选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺。
在之前任何方法中，种子训练培养基、接种培养基和/或生产培养基可以包括消泡剂。可以使用任何合适的消泡剂。在一些实施方案中，消泡剂是西甲硅油乳剂，消泡剂204，消泡剂A，消泡剂B，消泡剂C，消泡剂Y-30或消泡剂SE-15。在一些实施方案中，消泡剂是西甲硅油乳剂。在一些实施方案中，消泡剂的浓度为约10％至约50％，例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，或约50％(例如，w/v)。在一些实施方案中，消泡剂的浓度为约30％(w/v)。在一些实施方案中，使用30％西甲硅油来制备1％至10％消泡剂溶液，按照需要将其加入培养物(例如，种子训练培养物、接种培养物和/或生产培养物)中，以最小化泡沫。
在之前任何方法中，种子训练培养基、接种培养基和/或生产培养基可以包括缓冲剂、细胞保护剂、多糖和/或重量摩尔渗透压浓度调节剂。
在之前任何方法中，可以在任何合适的温度下进行步骤(b)，例如，约20℃至约45℃的温度，例如，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃，约27℃，约28℃，约29℃，约30℃，约31℃，约32℃，约33℃，约34℃，约35℃，约36℃，约37℃，约38℃，约39℃，约40℃，约41℃，约42℃，约43℃，约44℃，或约45℃。在一些实施方案中，步骤(b)在约25℃至约40℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(b)在约35℃至约39℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(b)在约36℃至约38℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(b)在约37℃的温度下进行。
在之前任何方法中，步骤(b)可以在任何合适的培养容器中进行，例如，旋转器、摇瓶或种子训练生物反应器(例如，不锈钢生物反应器或一次性使用的生物反应器(例如，WAVE BIOREACTORTM或
Figure BDA0002603336170000811
生物反应器(例如，
Figure BDA0002603336170000812
15或
Figure BDA0002603336170000813
250生物反应器))。在一些实施方案中，步骤(b)在速度训练旋转器或摇瓶中进行。在其他实施方案中，步骤(b)在一次性使用的生物反应器(例如，WAVE BIOREACTORTM或
Figure BDA0002603336170000814
生物反应器(例如，
Figure BDA0002603336170000815
15或
Figure BDA0002603336170000816
250生物反应器))中进行。在其他实施方案中，步骤(b)在速度训练生物反应器中进行。
在之前任何方法中，步骤(b)每次传代可以具有约1天至约20天，例如，每次传代约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约15天，约16天，约17天，约18天，约19天，或约20天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约1天至约12天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约2天至约7天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约2天至约6天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约2天至约5天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约2天至约4天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)每次传代具有约2天至约3天的持续时间。
在之前任何方法中，种子训练培养基或种子训练培养物可以具有合适的pH。例如，在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的pH为约5至约9，例如，约5，约5.5，约6，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.15，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约8.0，约8.5，或约9。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的pH为约7.0至约7.5，例如，约7.0，约7.05，约7.1，约7.15，约7.2，约7.25，约7.3，约7.35，约7.4，约7.45，或约7.5。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的pH为约7.15。在一些实施方案中，种子训练培养物的pH为约7.15。
在之前任何方法中，种子训练培养基或种子训练培养物可以具有任何合适的溶解氧(例如，溶解氧百分比，其中100％表示培养基是饱和的)，例如，约10％至约60％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，或约60％)。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的溶解氧为约15％至约50％。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的溶解氧为约20％至约40％。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的溶解氧为约25％至约35％。在一些实施方案中，种子训练培养基或种子训练培养物的溶解氧为约30％。在一些实施方案中，种子训练培养物的溶解氧为约30％。
在之前任何方法中，步骤(b)可以具有任何合适的持续时间，例如，约6小时至约20天，例如，约6h，约7h，约8h，约9h，约10h，约11h，约12h，约13h，约14h，约15h，约16h，约18h，约19h，约20h，约21h，约22h，约23h，约1天，约1.5天，约2天，约2.5天，约3天，约3.5天，约4天，约4.5天，约5天，约5.5天，约6天，约6.5天，约7天，约7.5天，约8天，约8.5天，约9天，约9.5天，约10天，约10.5天，约11天，约11.5天，约12天，约12.5天，约13天，约13.5天，约14天，约14.5天，约15天，约15.5天，约16天，约16.5天，约17天，约17.5天，约18天，约18.5天，约19天，约19.5天，或约20天。在一些实施方案中，步骤(b)具有约1天至约10天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约8天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约7天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约6天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约5天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约4天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(b)具有约2天至约3天的持续时间。
在之前任何方法中，步骤(c)可以在任何合适的温度下进行，例如，约20℃至约45℃的温度，例如，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃，约27℃，约28℃，约29℃，约30℃，约31℃，约32℃，约33℃，约34℃，约35℃，约36℃，约37℃，约38℃，约39℃，约40℃，约41℃，约42℃，约43℃，约44℃，或约45℃。在一些实施方案中，步骤(c)在约25℃至约40℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约35℃至约39℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约36℃至约38℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约37℃的温度下进行。
在之前任何方法中，步骤(c)可以在一个或多个生物反应器中进行，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或更多个生物反应器(例如，不锈钢生物反应器或一次性使用的生物反应器(例如，WAVE BIOREACTORTM))。在一些实施方案中，步骤(c)在3个生物反应器或4个生物反应器中进行。在一些实施方案中，步骤(c)在3个生物反应器中进行。
在之前任何方法中，接种培养基或接种培养物可以具有任何合适的pH。例如，在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的pH为约5至约9，例如，约5，约5.5，约6，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.15，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约8.0，约8.5，或约9。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的pH为约7.0至约7.5，例如，约7.0，约7.05，约7.1，约7.15，约7.2，约7.25，约7.3，约7.35，约7.4，约7.45，或约7.5。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的pH为约7.1。在一些实施方案中，接种培养物的pH为约7.1。
在之前任何方法中，接种培养基或接种培养物可以具有任何合适的溶解氧，例如，约10％至约60％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，或约60％)。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的溶解氧为约15％至约50％。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的溶解氧为约20％至约40％。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的溶解氧为约25％至约35％。在一些实施方案中，接种培养基或接种培养物的溶解氧为约30％。在一些实施方案中，接种培养物的溶解氧为约30％。
在之前任何方法中，步骤(c)可以具有任何合适的持续时间，例如，约6小时至约20天，例如，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约13小时，约14小时，约15小时，约16小时，约18小时，约19小时，约20小时，约21小时，约22小时，约23小时，约1天，约1.5天，约2天，约2.5天，约3天，约3.5天，约4天，约4.5天，约5天，约5.5天，约6天，约6.5天，约7天，约7.5天，约8天，约8.5天，约9天，约9.5天，约10天，约10.5天，约11天，约11.5天，约12天，约12.5天，约13天，约13.5天，约14天，约14.5天，约15天，约15.5天，约16天，约16.5天，约17天，约17.5天，约18天，约18.5天，约19天，约19.5天，或约20天。在一些实施方案中，步骤(c)具有约1天至约10天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约8天。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约7天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约6天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约5天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约4天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约2天至约3天的持续时间。
在之前任何方法中，步骤(d)可以包括从初始温度到转变后温度的温度转变。在一些实施方案中，初始温度为约20℃至约45℃，例如，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃，约27℃，约28℃，约29℃，约30℃，约31℃，约32℃，约33℃，约34℃，约35℃，约36℃，约37℃，约38℃，约39℃，约40℃，约41℃，约42℃，约43℃，约44℃，或约45℃。在一些实施方案中，初始温度为约25℃至约40℃。在一些实施方案中，初始温度为约35℃至约39℃。在一些实施方案中，初始温度为约36℃至约38℃。在一些实施方案中，初始温度为约37℃。
在之前任何方法中，转变后温度可以低于或高于初始温度。在一些实施方案中，转变后为约20℃至约45℃，例如，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃，约27℃，约28℃，约29℃，约30℃，约31℃，约32℃，约33℃，约34℃，约35℃，约36℃，约37℃，约38℃，约39℃，约40℃，约41℃，约42℃，约43℃，约44℃，或约45℃。在一些实施方案中，转变后为约25℃至约35℃。在一些实施方案中，转变后为约30℃至约35℃。在一些实施方案中，转变后为约32℃至约34℃。在一些实施方案中，转变后为约33℃。
在之前任何方法中，温度转变可以在约1h至约140h的时间内进行，例如，约1h，约2h，约3h，约4h，约5h，约6h，约7h，约8h，约9h，约10h，约11h，约12h，约13h，约14h，约15h，约16h，约18h，约19h，约20h，约21h，约22h，约23h，约24h，约25h，约30h，约35h，约40h，约45h，约50h，约55h，约56h，约57h，约58h，约59h，约60h，约61h，约62h，约63h，约64h，约65h，约66h，约67h，约68h，约69h，约70h，约71h，约72h，约73，约74h，约75h，约76h，约77h，约78h，约79h，约80h，约85h，约90h，约95h，约100h，约105h，约110h，约115h，约120h，约125h，约130h，约135h，或约140h。例如，在一些实施方案中，温度转变在约12h至约120h的时间段内进行。在一些实施方案中，温度转变在约24h至约96h的时间段内进行。在一些实施方案中，温度转变在约48h至约96h的时间段内进行。在一些实施方案中，温度转变在约60h至约80h的时间段内进行。在一些实施方案中，温度转变在约72h的时间段内进行。
在之前任何方法中，生产培养基或生产培养物可以具有任何合适的pH。例如，在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的pH为约5至约9，例如，约5，约5.5，约6，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.15，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约8.0，约8.5，或约9。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的pH为约6.5至约7.5。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的pH为约7.0至约7.5，例如，约7.0，约7.05，约7.1，约7.15，约7.2，约7.25，约7.3，约7.35，约7.4，约7.45，或约7.5。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的pH为约7.0。在一些实施方案中，生产培养物的pH为约7.0。
在之前任何方法中，步骤(d)可以在任何合适的培养容器中进行，例如，生产生物反应器(例如，不锈钢生物反应器或一次性使用的生物反应器(例如，WAVE BIOREACTORTM))。
在之前任何方法中，生产培养基或生产培养物可以具有任何合适的溶解氧，例如，约10％至约60％(例如，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，或约60％)。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的溶解氧为约15％至约50％。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的溶解氧为约20％至约40％。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的溶解氧为约25％至约35％。在一些实施方案中，生产培养基或生产培养物的溶解氧为约30％。在一些实施方案中，生产培养物的溶解氧为约30％。
在之前任何方法中，步骤(d)可以持续任何合适的时间段，例如，约6小时至约30天，例如，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约13小时，约14小时，约15小时，约16小时，约18小时，约19小时，约20小时，约21小时，约22小时，约23小时，约1天，约1.5天，约2天，约2.5天，约3天，约3.5天，约4天，约4.5天，约5天，约5.5天，约6天，约6.5天，约7天，约7.5天，约8天，约8.5天，约9天，约9.5天，约10天，约10.5天，约11天，约11.5天，约12天，约12.5天，约13天，约13.5天，约14天，约14.5天，约15天，约15.5天，约16天，约16.5天，约17天，约17.5天，约18天，约18.5天，约19天，约19.5天，约20天，约20.5天，约21天，约21.5天，约22天，约22.5天，约23天，约23.5天，约24天，约24.5天，约25天，约25.5天，约26天，约26.5天，约27天，约27.5天，约28天，约28.5天，约29天，约29.5天，或约30天。在一些实施方案中，步骤(c)具有约1天至约10天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约2天至约25天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约5天至约25天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约7天至约14天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约8天至约16天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(c)具有约10天至约14天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约11天至约13天的持续时间。在一些实施方案中，步骤(d)具有约12天的持续时间。
在另一个方面中，本文提供了制备包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽；(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；(c)在适于形成接种训练培养物的条件下在接种培养基中接种种子训练物；和(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，并且其中步骤(d)的持续时间为至少10天，由此制得包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，步骤(d)的持续时间为至少11天，至少12天或至少13天。在一些实施方案中，步骤(d)的持续时间为12天。
在之前任何方法中，步骤(d)可以进一步包括通过营养物质补料将营养物质加入生产培养基或生产培养物中。
在之前任何方法中，可以使用任何合适的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞，如适应悬浮的CHO细胞)。其他合适的宿主细胞是本领域已知的并且以下有描述，例如，昆虫细胞或植物细胞。
之前任何方法可以进一步包括以下步骤：(e)从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。在一些实施方案中，步骤(e)包括冷却生产培养物(例如，冷却至约1℃至约10℃(例如，约1℃，约2℃，约3℃，约4℃，约5℃，约6℃，约8℃，约9℃，或约10℃)，例如，2℃至约8℃)。在一些实施方案中，步骤(e)包括通过离心从生产培养基移除宿主细胞，以形成细胞培养液。在一些实施方案中，步骤(e)进一步包括过滤细胞培养液。
之前任一个方法可以进一步包括以下步骤：(f)纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，步骤(f)包括一个、两个、三个或全部四个的以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。
在另一个方面中，本发明提供了纯化IL-Fc融合蛋白的方法，其包括一个、两个、三个或全部四个的以下步骤：(a)提供包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液并任选灭活细胞培养液中的病毒；(b)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，并用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(c)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(d)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，IL-22多肽是糖基化的。在一些实施方案中，IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6至约16摩尔唾液酸(例如，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15，或约16摩尔唾液酸)的唾液酸含量。
之前任何方法可以包括浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合。之前任何方法可以包括将纯化的产品集合超滤。在之前任何方法的一些实施方案中，超滤包括用再生纤维素超滤膜(例如，10kDa复合再生纤维素超滤膜)过滤纯化的产品集合。之前任何方法可以包括更换浓缩的产品集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合。在一些实施方案中，将浓缩的产品集合的缓冲液更换为包含终浓度为0.01M磷酸钠，pH7.2的渗滤缓冲液。之前任何方法可以包括用配制缓冲液调节UFDF，以形成调节过的包含IL-22Fc融合蛋白的UFDF集合。
之前任一个方法可以包括一个或多个病毒灭活步骤。例如，在之前任何方法的一些实施方案中，灭活病毒包括将去污剂加入细胞培养液、亲和性集合、阴离子交换集合和/或纯化的产品集合中。在一些实施方案中，灭活病毒包括将去污剂加入细胞培养液中。例如，在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括灭活病毒，将细胞培养液接触亲和性柱之前将去污剂加入细胞培养液中。在一些实施方案中，灭活病毒包括将去污剂加入亲和性集合中。在一些实施方案中，子步骤(i)包括通过将去污剂加入亲和性集合中来灭活病毒。
任何合适的去污剂可以用于灭活病毒，例如，
Figure BDA0002603336170000881
X-100或
Figure BDA0002603336170000882
GG110。在一些实施方案中，细胞培养液中的去污剂的终浓度为约0.001％至约5％(例如，v/v)，约0.001％，约0.01％，约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约1.1％，约1.2％，约1.3％，约1.4％，约1.5％，约2％，约3％，约4％，或约5％。在一些实施方案中，细胞培养液中的去污剂的终浓度为约0.01％至约2％。在一些实施方案中，细胞培养液中的去污剂的终浓度为约0.1％至约1％。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.3％至约0.5％。在一些实施方案中，去污剂的终浓度为约0.5％。病毒灭活可以在任何合适的温度下进行，例如，约4℃至约40℃，例如，约4℃，约5℃，约6℃，约7℃，约8℃，约9℃，约10℃，约11℃，约12℃，约13℃，约14℃，约15℃，约16℃，约17℃，约18℃，about 19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃，约27℃，约28℃，约29℃，约30℃，约31℃，约32℃，约33℃，约34℃，约35℃，约36℃，约37℃，约38℃，约39℃，或约40℃。在一些实施方案中，病毒灭活在约2012℃至约25℃下进行。在一些实施方案中，病毒灭活具有超过约0.25h，例如，超过约0.25h，约0.5h，约1h，约1.5h，约2h，约2.5h，约3h，约3.5h，约4h，约4.5h，约5h，约5.5h，约6h，或更长时间的持续时间。在一些实施方案中，病毒灭活具有超过约0.5h的持续时间，例如，约5h至48h，约5h至约24h，或任何其他合适的持续时间。
在另一个实例中，本发明提供了一种制备包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的方法，其包括在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包括多个宿主细胞的接种训练培养物，其中宿主细胞包括编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸，IL-22 Fc融合蛋白包括通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，并且其中培养的持续时间是至少10天，由此制得包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。在一些实施方案中，培养的持续时间是至少11天，至少12天或至少13天。在一些实施方案中，培养的持续时间是12天。
在之前任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在生产培养基中培养接种训练培养物前在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在生产培养基中培养接种训练培养物之前在适于形成接种训练培养物的条件下在接种培养基中接种种子训练培养物。
可以使用任何合适的宿主细胞。在任何方法中，宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞。在一些实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养物除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
任何方法可以进一步包括纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白进一步包括一个或多个以下子步骤：(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；(v)将纯化的产品集合超滤；(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括将细胞培养液接触亲和性柱之前，通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒。在另一个实例中，本发明提供了一种控制包含IL-22 Fc融合蛋白的组合物的唾液酸含量的方法，所述IL-22 Fc融合蛋白包括通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，所述方法包括：在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包括多个宿主细胞的接种训练培养物至少10天，其中宿主细胞包括编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸并表达IL-22 Fc融合蛋白，其中组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量；并将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围，由此控制组合物的唾液酸含量。在一些实施方案中，所述方法包括将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。
本文所述的任何方法可以包括富集组合物的唾液酸含量。可以使用任何合适的方法来进行富集，例如，通过纯化本文所述的IL-22 Fc融合蛋白。例如，在一些实施方案中，富集平均唾液酸含量包括从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。在一些实施方案中，收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。富集组合物的平均唾液酸含量可以包括纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白包括以下子步骤：(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。在一些实施方案中，纯化IL-22 Fc融合蛋白进一步包括一个或多个以下子步骤：(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；(v)将纯化的产品集合超滤；(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。在一些实施方案中，子步骤(i)进一步包括将细胞培养液接触亲和性柱之前，通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒。在一些实施方案中，亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。在一些实施方案中，蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170000911
树脂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包括具有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包括CAPTOTM粘附树脂。
在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约1至约8摩尔(例如，约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7，或约8摩尔)范围内的初始平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6，约7或约8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量。在一些实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量。在其他实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白7摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量。在其他实施方案中，组合物具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。
例如，在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22Fc融合蛋白约1至约8摩尔唾液酸范围内(例如，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7摩尔，或约8摩尔唾液酸)的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约4摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括平均唾液酸含量从将每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的范围。
在其他实例中，在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白1至8摩尔唾液酸范围内(例如，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白1，2，3，4，5，6，7或8摩尔唾液酸)的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22Fc融合蛋白3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白4摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白5摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白7摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的范围。
在其他实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约1至约8摩尔唾液酸(例如，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7摩尔，或约8摩尔唾液酸)的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。例如，在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约4摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约5摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约6摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约7摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸的范围。
再在其他实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白1至8摩尔唾液酸(例如，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白1，2，3，4，5，6，7或8摩尔唾液酸)的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。例如，在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白3摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白4摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白5摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白6摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22 Fc融合蛋白7摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将平均唾液酸含量从每摩尔IL-22Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的初始平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的范围。
在之前任何方法的一些实施方案中，亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。在之前任何方法的一些实施方案中，亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂。在一些实施方案中，蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170000931
树脂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含终浓度0.4M的磷酸钾，pH7.0。在一些实施方案中，第一洗脱缓冲液包含终浓度0.3M的盐酸L-精氨酸，0.013M的磷酸钠，pH3.8。
在之前任何方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含具有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。在一些实施方案中，阴离子交换色谱支持物包含CAPTOTM粘附树脂。在一些实施方案中，第一平衡缓冲液包含终浓度0.04M的醋酸钠，pH5.8。
在之前任何方法的一些实施方案中，第二平衡缓冲液是梯度缓冲液。在一些实施方案中，梯度缓冲液包含0.04M醋酸钠，pH5.8至0.04M醋酸钠，0.3M硫酸钠，pH5.8。
在之前任何方法的一些实施方案中，第二平衡缓冲液包含终浓度0.025M的MOPS，0.3M的硫酸钠，pH7.0。
本发明还提供了选择用于释放的一个包含IL-22 Fc融合蛋白的批次的方法，所述方法包括一个、两个或全部三个的以下步骤：(a)提供一个包含IL-22 Fc融合蛋白的批次；(b)评价该批次中唾液酸的水平；和(c)如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用高性能液相色谱(HPLC，包括反相HPLC(RP-HPLC))、超高性能液相色谱(UHPLC)、毛细管电泳或比色测定来评估批次中的唾液酸水平。在一些实施方案中，步骤(b)包括使用HPLC(例如，RP-HPLC)。
本文所述的任何方法可以用于控制IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的唾液酸含量的方法中。本文所述的任一个方法可以通过调节IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的唾液酸含量用于降低IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的体内清除率/提高IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的半衰期的方法中。
将宿主细胞用产生IL-22多肽的本文所述表达载体或克隆载体转染或转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。培养条件，如培养基、温度、pH等，可以由技术人员在无需过多实验的情况下选择。通常，可以在Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler，编著(IRL Press，1991)和上文Sambrook等人中找到用于最大化动物细胞培养物生产率的原理、操作方案和实用技术。
转染方法是普通技术人员已知的，例如，借助CaPO4和电穿孔或脂质转染(例如使用
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)转染。取决于所用的宿主细胞，使用适于这类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理法，如Sambrook等人，上文中所述，或电穿孔法通常用于含有牢固细胞壁屏障的原核生物或其他细胞。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染法用于转化某些植物细胞，如Shaw等人，Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所描述。对于没有这类细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和vander Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。已经在美国专利号4,399,216中描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。向酵母中转化一般根据Van Solingen等人，J.Bact，130：946(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法实施。但是，也可以使用向细胞引入DNA的其他方法，如通过核微量注射、电穿孔、细菌原生质体与完好细胞融合、或聚阳离子(例如，聚凝胺、聚鸟氨酸)引入。关于转化哺乳动物细胞的多种技术，参见Keown等人，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等人，Nature，336：348-352(1988)。
重组表达的本发明多肽可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收。以下程序是合适纯化程序的示例：在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶或在阳离子交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；移除污染物如IgG的蛋白A琼脂糖凝胶柱；和结合加表位标签形式的本发明多肽的金属螯合柱。可以使用多种蛋白质纯化方法并且这类方法是本领域已知的并例如在Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中描述。选择的纯化步骤将例如取决于所用生产方法和产生的具体多肽的性质。
本领域熟知的替代性方法可以用来制备本发明的多肽。例如，可以使用固相技术(参见，例如，Stewart等人，1969，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，SanFrancisco，CA；Merrifield，J.1963，Am.Chem.Soc.，85：2149-2154)，通过直接肽合成法产生编码多肽或其部分的序列。可以使用手工技术或通过自动化法，进行体外蛋白质合成。可以例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City，CA)，使用制造商的说明，完成自动合成。本发明多肽或其部分的多个部分可以分别化学合成并使用化学或酶促方法合并以产生全长多肽或其部分。
在其他实施方案中，本发明提供嵌合分子，其包含与异源多肽或氨基酸序列融合的本文所述的任何多肽。这类嵌合分子的例子包括但不限于与表位标签序列或免疫球蛋白Fc区融合的本文所述的任何多肽。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞包括原核生物细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌属(Enterobacter)如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是可公开获得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATC C31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码IL-22的载体的合适克隆宿主或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。
用于表达糖基化-IL-22的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9，以及植物细胞。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更具体的例子包括SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞(经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980)))；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；和小鼠乳腺瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。认为对适宜宿主细胞的选择处于本领域能力范围内。
可以将编码IL-22的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入复制型载体中用于克隆(扩增DNA)或用于表达。多种载体是可公开获得的。载体可以例如处于质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体形式。可以通过多种方法，将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术，将DNA插入适宜限制性核酸内切酶位点中。载体组件通常包括但不限于，一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些组件中一个或多个组件的合适载体的构建利用了技术人员已知的标准连接技术。
IL-22多肽可以不仅直接重组地产生，还作为与异源多肽的融合多肽重组地产生，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽N末端具有特定切割位点的其他多肽，以及作为IL-22 Fc融合蛋白重组地产生。通常，信号序列可以是载体的组件，或它可以是插入载体的IL-22 DNA的部分。信号序列可以是例如选择自碱性磷酸酶前导序列、青霉素酶前导序列、1pp、或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以例如是酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)”-因子前导序列，后者在美国专利号5,010,182中描述)、或酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP 362,179)，或在1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达时，哺乳动物信号序列可以用来指导蛋白质分泌，如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌性前导序列。
表达载体和克隆载体均含有能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。这类序列对多种细菌、酵母和病毒而言是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌、2：质粒复制起点适用于酵母，并且多个病毒复制起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体将一般含有选择基因，又称作选择标记物。常见的选择基因编码这样的蛋白质，这些蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)补充营养缺陷，或(c)供应从复合培养基不可获得的关键养分，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
用于哺乳动物细胞的合适选择标记的例子是能够确定有能力摄取IL-22核酸的细胞的一种选择标记，如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适宜宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，如Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)所描述那样制备和增殖。用于酵母中的合适选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因[参见，例如，Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene，7：141(1979)；Tschemper等人，Gene，10：157(1980)]。trp1基因为缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株(例如，ATCC No.10231或PEP4-1)提供选择标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
表达载体和克隆载体通常含有与IL-22核酸序列有效连接的启动子以指导mRNA合成。由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。随原核宿主一起使用的适合启动子包括正交-内酰胺酶和乳糖启动子系统[参见，例如，Chang等人，Nature，275：615(1978)；Goeddel等人，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[参见，例如，Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子如tac启动子[参见，例如，deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。用于细菌系统中的启动子还将含有与编码IL-22的DNA有效连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
随酵母宿主一起使用的合适启动子序列的例子包括以下酶的启动子：3-磷酸甘油酸激酶[参见，例如，Hitzeman等人，J.Biol.Chem，255：2073(1980)]或其他糖酵解酶[参见，例如，Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978)]，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
作为具有额外优点即转录受生长条件控制的诱导型启动子的其他酵母启动子是下述的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步在EP 73,657中描述。
哺乳动物宿主细胞中来自载体的IL-22转录受例如下述启动子控制，所述启动子从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒病毒(1989年7月5公开的UK 2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的基因组获得、从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得，并从热休克启动子获得，条件是这类启动子与宿主细胞系统相容。
可以通过将增强子序列插入载体，增加高等真核生物转录编码IL-22多肽的DNA。增强子是作用于启动子以增加其转录的顺式作用DNA元件，通常约10至约300bp。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。一般，然而，将采用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在IL-22编码序列的位置5′或3′被剪接进入载体，但优选地位于启动子5′的位点。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体也将含有为终止转录和为稳定mRNA必需的序列。这类序列常从真核DNA或者病毒DNA或cDNA的5′非翻译区和偶尔从其3′非翻译区可获得。这些区域含有转录为编码IL-22的mRNA的非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
另外，适于在重组脊椎动物细胞培养物中合成IL-22的其他方法、载体和宿主细胞在Gething等人，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等人，Nature，281：40-46(1979)；EP117,060；和EP 117,058中描述。
可以在样品中直接测量基因扩增和/或表达，例如，基于本文提供的序列，使用适当标记的探针，通过常规DNA印迹法、定量mRNA转录的RNA印迹法[参见例如，Thomas，ProcNatl Acad Sci USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交测量。可选地，可以使用这样的抗体，所述抗体可以识别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。抗体转而可以被标记并且可以实施这样的测定法，其中双链体与表面结合，从而当双链体在表面上形成时，可以检测到结合于双链体的抗体的存在。
可选地，可以通过免疫学方法如细胞切片或组织切片的免疫组织化学染色法和细胞培养物或体液测定法测量基因表达以直接定量基因产物的表达。用于免疫组织化学染色和/或样品流体测定法的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。便利地，可以针对天然序列IL-22多肽或针对基于本文所提供DNA序列的合成肽或针对与IL-22DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列，制备抗体。
IL-22的形式可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收。如果是膜结合型，可以使用合适的去垢剂溶液(例如TRITON-X100)或通过酶促切割，从膜释放它。可以通过多种物理或化学手段、如冻融循环、超声处理、机械破裂或细胞溶解剂，破坏在表达IL-22时使用的细胞。
可能需要从重组细胞蛋白或多肽中纯化IL-22。以下程序是合适的纯化程序的示例：通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶或在阳离子交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；移除污染物如IgG的蛋白A琼脂糖凝胶柱；和结合加表位标签形式的IL-22多肽的金属螯合柱。可以使用多种蛋白质纯化方法并且这类方法是本领域已知的并例如在Deutscher，Methods inEnzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中描述。选择的纯化步骤将例如取决于所用生产方法和产生的具体IL-22的性质。上述的一般方法也可以适用于IL-2Fc融合蛋白的制备。
类似地，可以使用重组方法和组合物产生IL-22 Fc融合蛋白，例如，如MolecularCloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等人1990.Academic Press，San Diego，CA)中所述。在一个实施方案中，提供编码本文所述的IL-22 Fc融合蛋白的分离核酸。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含包含核酸的载体(例如，已经用该载体转化)，所述核酸编码包含IL-22 Fc融合蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中，该载体是表达载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供产生IL-22Fc融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适于表达Fc融合蛋白的条件下培养如上文提供的包含编码IL-22 Fc融合蛋的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述Fc融合蛋白。
为了重组产生IL-22 Fc融合蛋白，将编码(例如，如本文所述的)Fc融合蛋白的核酸分离并插入用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一种或多种载体中。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码融合蛋白的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。在某些实施方案中，当制备IL-22 Fc融合蛋白时，编码IL-22的多肽或其片段的核酸可以与编码免疫球蛋白恒定结构域序列的核酸在恒定结构域上的指定位置处连接，以在IL-22的C端处产生Fc融合物；然而N端融合物也是可能的。
作为构建IL-22 Fc融合蛋白的例子，通过限制性酶在编码IL-22的DNA的3’末端或靠近其3’末端并且在编码成熟多肽N末端处或其附近(其中构思使用不同前导序列)或在IL-22全长蛋白的N末端编码区处或临近于该区域(其中使用天然信号)切割编码IL-22的DNA。随后将这个DNA片段轻易地插入中编码免疫球蛋白轻链或重链恒定区的DNA并且，如果需要，通过缺失诱变调整。优选地，当融合蛋白意在用于人类的体内治疗时，这是人免疫球蛋白。
在一些实施方案中，将IL-22-免疫球蛋白嵌合体作为单体、异多聚体或同源多聚体，或作为二聚体或四聚体装配。通常，这些装配的免疫球蛋白将具有如以下简图所代表的已知单元结构。基本的四链结构单元是其中IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM通常作为由二硫键聚拢在一起的基本四链单元的五聚物存在。IgA球蛋白，和偶尔IgG球蛋白也可以在血清中以多聚体形式存在。在多聚体的情况下，每个四链单元可以是相同或不同的。还参见Capon等人，美国专利号5,116,964，所述专利通过引用方式完整并入本文。
编码免疫球蛋白轻链恒定区或重链恒定区的DNA是已知的或从cDNA文库轻易可获得或被合成。参见例如，Adams等人，Biochemistry 19：2711-2719(1980)；Gough等人，Biochemistry 19：2702-2710(1980)；Dolby等人；P.N.A.S.USA，77：6027-6031(1980)；Rice等人P.N.A.S USA79：7862-7865(1982)；Falkner等人；Nature 298：286-288(1982)；和Morrison等人；Ann.Rev.Immunol.2：239-256(1984)。本文提供编码具有内源前导序列的人IL-22的DNA序列(SEQ ID NO：70)。已知或从cDNA文库轻易可获得的编码其他所需结合伙伴的DNA序列适于实施本发明。
将编码本发明IL-22 Fc融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中用于表达。如果需要多聚体，则将宿主细胞用编码将构成多聚体的每条链的DNA转化，最佳地选择宿主细胞以能够按所需方式装配多聚体的链。如果宿主细胞在转染之前就产生免疫球蛋白，则仅需要用与轻链或与重链融合的结合伙伴转染以产生异种抗体。具有一个或多个携带结合配偶体结构域的臂和一个或多个携带陪伴可变区的臂的前述免疫球蛋白产生针对结合伙伴配体和针对抗原或治疗性部分的双特异性。随上述的重组方法使用多重共转化的细胞以产生具有多种特异性的多肽如上文讨论的异四聚体免疫球蛋白。
尽管在本发明的免疫黏附素中不要求免疫球蛋白轻链的存在，但是免疫球蛋白轻链可能存在，或与IL-22-免疫球蛋白重链融合多肽共价缔合。在这种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA一般与编码IL-22-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。分泌时，杂合重链和轻链将共价地缔合以提供包含二硫键连接的两个免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于制备这类结构物的方法物例如在1989年3月28日授权的美国专利号4,816,567中公开。用于克隆或表达编码靶蛋白的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，可以在细菌中产生IL-22Fc融合蛋白，尤其当糖基化和Fc效应子功能是不需要的或有害时。对于在细菌中表达多肽，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达后，可以将Fc融合蛋白从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。如实施例部分中所例举，其他纯化方法包括而不限于使用蛋白A柱纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
表达糖基化蛋白质的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定法
通过本领域已知的多种测定法可以就其物理/化学性质和/或生物活性鉴定，筛选，或表征本文提供的IL-22 Fc融合蛋白。
1.结合测定法和其他测定法
在一个方面，就其受体结合活性测试本发明的IL-22 Fc融合蛋白，例如通过已知的方法诸如ELISA、western印迹分析、通过Scatchard的细胞表面结合、表面等离子体共振。在另一方面，可以使用竞争测定法以鉴定与IL-22 Fc融合蛋白竞争结合IL-22受体的抗体。在其他方面，本发明的IL-22 Fc融合蛋白可以用于检测生物样品中存在的IL-22受体或IL-22结合蛋白(可溶受体)的存在或量。在其他方面，本发明的IL-22 Fc融合蛋白可以用于检测生物样品中存在的IL-22受体的存在或量。在某些实施方式中，生物样品首先用非特异性同种型对照抗体封闭以饱和样品中的任何Fc受体。
2.活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定IL-22 Fc融合蛋白的生物活性的测定法。IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白的生物活性可以包括，例如，结合IL-22受体，刺激IL-22信号传递，和诱导STAT3、RegIII和/或PancrePAP表达。在一些实施方案中，所述测定是如实施例2中所述的效力测定(例如，受体结合测定、基于细胞的效力测定或体内测定)。在一些实施方案中，将效力与参照IL-22 Fc融合蛋白进行比较，例如，具有表12和/或表13中所示的N-聚糖分布的IL-22 Fc融合蛋白。此外，在心血管疾病或病况的情况下，生物活性可以包括影响动脉粥样硬化斑块的形成、特别地抑制动脉粥样硬化斑块形成的形成。可以通过本领域普通技术人员已知的任何适当的成像方法评价斑块形成的抑制。
D.缀合物
本发明也提供了缀合物，其包含与一种或多种用于检测、制剂、半寿期延长、减轻免疫原性或组织穿透的活性剂缀合的本文描述的IL-22 Fc融合蛋白。示例性缀合包括而不限于PEG化和附着至放射性同位素。
在另一个实施方式中，缀合物包含缀合至放射性原子的如本文描述的IL-22 Fc融合蛋白以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32，pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如再次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
E.药物制剂
将以符合良好医学实践的方式配制、给药，和施用本文的组合物(例如，包括IL-22Fc融合蛋白的药物组合物)。在本文上下文中考虑的因素包括受治疗的特别病症、受治疗的特别哺乳动物、个体对象的临床病况、病症的起因、活性剂的递送位点、施用方法、施药的时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。在一个实施方式中，组合物可以用于增加易受或诊断患有疾病或病况疾病的人类对象的存活持续时间。存活的持续时间定义为从第一次施药到死亡的时间。
通过以下方式使用本领域中已知的标准方法制备冻干制剂或水溶液剂形式的药物制剂：将具有所需纯度的活性成分与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington′sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980)和Remington′s PharmaceuticalSciences第20版，编者A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa)。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(
Figure BDA0002603336170001041
Baxter International，Inc.)。在US专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖如软骨素酶组合。
任选地，制剂含有可药用的盐，优选地氯化钠，并且更优选地为约生理浓度。
任选地，本发明的制剂可以含有可药用的防腐剂。在一些实施方式中防腐剂浓度范围从0.1至2.0％，通常为v/v。适当的防腐剂包括药物领域内已知的那些。苯甲醇、苯酚、m-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苯扎氯铵和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以包括浓度为0.005至0.02％的可药用的表面活性剂。
本文的制剂还可以含有正在治疗的特别适应征所需要的多于一种活性化合物，特别地是具有并非不利地彼此影响的互补活性的那些。此类分子以有效用于预期的目的的量适当地组合存在。
在美国专利号6,267,958中描述了示例性冻干制剂。水性制剂包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以含有正在治疗的特定适应征所需要的多于一种活性成分，优选地是具有并未不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供类固醇、TNF拮抗剂或其他抗炎性治疗剂。这种活性成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
活性成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有IL-22 Fc融合蛋白的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯))、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L谷氨酸γ乙基酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够在多于100天中释放分子，某些水凝胶以较短的时间释放蛋白质。当囊封的抗体在体中长时间保持时，其可能由于在37℃暴露于湿度而变性或聚集，导致损失生物活性和免疫原性的可能改变。取决于涉及的机制，可以设计合理的策略用于稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换的分子间S-S键形成，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制湿度含量、使用适当的添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定化。
可以配制用于局部施用的药物组合物，例如，以局部凝胶的形式。参见例如，US 4,717,717、US 5,130,298、US 5,427,778、US 5,457,093、US 5,705,485、US 6,331,309和WO2006/138,468。在某些实施方式中，可以在存在纤维素衍生物的条件下配制组合物。在某些其他实施方式中，可以在施用前用充足的缓冲剂或稀释剂从冻干的制剂重构局部制剂。在某些实施方式中，配制IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白用于对具有上皮创伤愈合缺陷的对象局部施用。在某些特别的实施方式中，上皮创伤愈合发生在皮肤中。在某些其他特别的实施方式中，对象是具有创伤愈合缺陷的人。在某些其他实施方式中，包含本发明的IL-22Fc融合蛋白的局部制剂可用于改善内部或外部手术切口后的创伤愈合。
在本发明的一个实施方式中，用于加速、促进或改善创伤愈合的IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白在局部凝胶的制剂中，例如，在预填充的注射器或容器中，或备选地，本发明的化合物可以在马上对患者局部施用前与凝胶基质混合。在某些实施方式中，也同时或顺序地局部施用额外的治疗剂。也可以任选地使用施用的其他途径，例如通过任何适当的方式施用，包括但不限于，肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔，和鼻内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内，或皮下施用。
通常对于创伤愈合，配制IL-22 Fc融合蛋白用于位点特异性递送。当局部应用时，IL-22Fc融合蛋白适当地与其他成分组合，例如载体和/或佐剂。此类其他成分的性质没有限制，除了它们必须是可药用的并且对于其预期的施用是有效的，并且不能降低组合物的活性成分的活性之外。适当的载体的实例包括油膏、乳脂、凝胶、喷雾或悬液，具有或没有纯化的胶原。组合物还可以灌输到无菌敷料、皮肤药贴、石膏和绷带中，任选地为液体或半液体形式。也可以使用经氧化的再生的纤维素/胶原基质，例如，PROMOGRAN Matrix WoundDressing或PROMOGRAN PRISMA MATRIX.。
为了获得凝胶制剂，在液体组合物中配制的IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白可以与有效量的水溶性多糖或合成的聚合物混合以形成凝胶(例如，胶凝剂)诸如聚乙二醇以形成待局部应用的适当粘度的制剂。可使用的多糖或胶凝剂包括，例如，纤维素衍生物诸如醚化的纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素，和烷基羟烷基纤维素，例如，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和羟丙基纤维素；羧甲基纤维素钠；POE-POP嵌段聚合物：多种级别的泊咯沙姆(poloxamer)USP；透明质酸；聚丙烯酸诸如卡波姆(carbopol)940；淀粉和分级的淀粉；琼脂；海藻酸和海藻酸盐；阿拉伯树胶；普鲁兰糖(pullullan)；琼脂糖；卡拉胶；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖；和合成的生物聚合物；以及胶诸如黄原胶；瓜尔胶；刺槐豆胶；阿拉伯树胶；黄芪胶；和刺梧桐胶；和其衍生物、组合物和混合物。在本发明的一个实施方式中，本文的胶凝剂是这样的胶凝剂，其例如对于生物系统是惰性的、非毒性的、易于制备、和/或并非太稀或太粘，并且将不使得其中保有的IL-22多肽或IL-22 Fc融合物不稳定。
在本发明的某些实施方式中，多糖是醚化的纤维素衍生物，在另一实施方式中是良好定义的、纯化的，和在USP中列出的，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，诸如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，和羟丙基甲基纤维素(全部称为纤维素剂)。在一些实施方式中，多糖是羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。
可用于凝胶作用的聚乙二醇通常是低和高分子量聚乙二醇的混合物以获得适当的粘度。例如，当以适当比例混合以获得糊剂时，分子量400-600的聚乙二醇与分子量1500的聚乙二醇的混合物将有效用于此目的。
应用于多糖和聚乙二醇的术语“水可溶”意为包括胶体溶液和分散剂。一般而言，纤维素衍生物的溶解性由醚基团的取代程度确定，并且本文可用的稳定性衍生物应当在纤维素链中具有充分量的此类醚基团每脱水葡萄糖单元以使得衍生物水可溶。至少0.35个醚基团每脱水葡萄糖单元的醚取代的程度一般是足够的。额外地，纤维素衍生物可以为碱金属盐的形式，例如，Li、Na、K、或Cs盐。
在某些实施方式中，在凝胶中使用甲基纤维素，例如，其包含约1-5％，或约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的凝胶并且IL-22 Fc融合蛋白以约50-2000μg、100-2000μg，或100-1000μg每ml凝胶的量存在。在某些实施方式中，局部施用的创伤愈合的IL-22 Fc融合蛋白的有效量可以为25μg至约500μg、约50μg至约300μg、约100μg至约250μg、约50μg至约250μg、约50μg至约150μg、约75μg、约100μg、约125μg、约150μg、约175μg、约200μg、约225μg、约250μg、约300μg，或约350μg，每cm2创伤面积。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如用通过无菌滤膜过滤轻易地实现无菌。
本发明提供了基于IL-22Fc融合蛋白的治疗剂的剂量。例如，取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的多肽是对对象施用的初始候选剂量，无论，例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。典型的每日剂量可能范围为从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。对于在若干天中或更长的重复施用，取决于病况，持续治疗直到疾病症状的理想的抑制发生。然而，其他剂量方案是可用的。通过常规技术和测定法容易地监测此疗法的进展。
对于疾病的预防或治疗，本发明的多肽的适当剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，多肽的类型，疾病的严重性和进程，多肽是否是出于预防性或治疗性目的施用的，先前的疗法，对象的临床史和对多肽的响应，和主治医师的裁量。在一个时间或在一系列的治疗中将多肽适当地施用于对象。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)的多肽可以是对对象施用的初始候选剂量，无论，例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。一种典型的每日剂量可能范围为从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。对于在若干天中或更长的重复施用，取决于病况，持续治疗直到疾病症状的理想的抑制发生。多肽的一种示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围内。因此，可以对对象施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、或20mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。在某些实施方式中，可以对对象施用约0.5mg/kg、1.0mg.kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、或20mg/kg(或其组合)。此类剂量可以间歇地施用，例如，每周、每两周、每三周(例如，使得对象接受从约2至约20次，例如约6次剂量的多肽)。可以施用初始较高的负载剂量，随后为一次或多次较低剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始负载剂量，随后为约2mg/kg的抗体的每周维持剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测此疗法的进展。
通常通过静脉注射施用本发明的化合物用于预防或治疗心血管疾病或病况、代谢综合征、急性内毒素血症或败血病、GVHD、或糖尿病。
也可以使用其他施用方法，包括但不限于，局部、肠胃外、静脉内、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、眼睛、眼内、玻璃体内、病灶内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、口腔，或吸入施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内，或皮下施用。此外，根据已知的方法，本文描述的化合物施用于人类对象，诸如作为推注或通过在一段时间中连续输注静脉施用。
F.治疗方法和组合物
本文提供的任何IL-22 Fc融合蛋白和其组合物(例如药物组合物)可以用于治疗方法中。
a)炎性肠病
在一个方面，提供了作为药物使用的IL-22 Fc融合蛋白。在其他方面，提供了用于治疗IBD，包括UC和CD的IL-22 Fc融合蛋白。在某些实施方式中，提供了用于治疗具有UC或CD的个体的方法中的IL-22 Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22Fc融合蛋白。在一个这种实施方式中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在其他实施方式中，本发明提供用于增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的IL-22 Fc融合蛋白。在某些特别的实施方式中，上皮细胞组织是肠上皮细胞组织。在某些实施方式中，本发明提供用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22 Fc融合蛋白以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。还在其他实施方式中，本发明提供用于治疗糖尿病、特别是II型糖尿病、糖尿病创伤愈合、代谢综合征和动脉粥样硬化的IL-22 Fc融合蛋白。在某些实施方式中，本发明提供用于在个体中治疗糖尿病、特别是II型糖尿病、糖尿病创伤愈合、代谢综合征和动脉粥样硬化的方法的IL-22 Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22 Fc融合蛋白。参见国际专利申请公开号WO2014/145016，其通过引用以其整体并入本文。根据以上实施方式中任一个的“个体”或“对象”或“患者”优选是人。
在其他方面，本发明提供IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白在制造或制备药物中的用途。在一个实施方式中，该药物用于治疗IBD和创伤愈合。在其他实施方式中，该药物用于治疗IBD和创伤愈合的方法中，所述方法包括向患有IBD的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方式中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在其他实施方式中，药物用于抑制肠上皮细胞中的炎性反应。在其他实施方式中，药物用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。根据以上实施方式中任一个的“个体”可以是人。
在其他方面，本发明提供了用于治疗IBD，包括UC和CD的方法。在一个实施方式中，方法包括向具有IBD的个体施用有效量的IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白。在一个这种实施方式中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方式中任一个的“个体”可以是人。
在其他方面，本发明提供了用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法。在一个实施方式中，方法包括向个体施用有效量的IL-22多肽或IL-22 Fc融合蛋白以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。在一个实施方式中，“个体”是人。
b)其他治疗适应征
本发明提供了用于心血管疾病和病况、代谢综合征、急性内毒素血症和败血病、移植物-抗-宿主病(GVHD)、和糖尿病的基于IL-22Fc融合蛋白的治疗剂。对于预防，治疗或降低给定疾病或病况的严重性，本发明的化合物的适当剂量将取决于如上所定义的待治疗的疾病或病况的类型，疾病或病况的严重性和进程，活性剂是否出于预防性或治疗性目的施用，先前的疗法，对象的临床史和对化合物的反应，和主治医师的裁量。在一个时间或在一系列的治疗中将化合物适当地施用于对象。优选地，理想的是先于在人中测试前，首先在体外，并然后在有用的动物模型中，测定本发明的剂量响应曲线和药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了用于治疗心血管疾病或病症、代谢综合征、急性内毒素血症和败血病、GVHD、和胰岛素相关的病症的方法。在一个实施方式中，方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的IL-22 Fc融合蛋白。在另一方面，本发明提供了延迟或减缓心血管疾病或病症、代谢综合征、GVHD、和胰岛素相关的病症的进展的方法。在一个实施方式中，方法包括对诊断有疾病、病况、或病症的对象施用有效量的IL-22 Fc融合蛋白。在另一方面，本发明提供了用于预防心血管疾病或病症、GVHD、和胰岛素相关的病症的标志的方法。在一个实施方式中，方法包括对处于疾病、病况、或病症的风险的对象施用有效量的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白有效针对疾病、病况、或病症的标志的发展。在一个方面，本发明提供了用于GVHD的治疗方法。在另一个方面中，本发明提供了用于延迟或减缓GVHD进程的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将有效量的IL-22 Fc融合蛋白给药于诊断为患有所述疾病、病况或病症的对象。
心血管疾病和病况
在一个方面，IL-22 Fc融合蛋白提供了针对对象中的心血管疾病或病况的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的治疗性的、预防性的或预防的作用。在一个实施方式中，疾病或病况是动脉粥样硬化。在一个实施方式中，标志包括动脉粥样硬化斑块形成和/或血管炎症。在另一个实施方式中，对象处于心血管疾病的风险。一般地，处于风险的对象先前已经患有如本文所述的心血管疾病或病况，或将具有心血管疾病或病况的遗传素质。
可以通过评价心血管疾病中通常使用的多种评估来测量心血管疾病和病况的治疗的功效。例如，可以评估心血管健康。心血管健康可以通过，但不限于，例如血液测试(例如，总胆固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、C-反应性蛋白、纤维蛋白原、高半胱氨酸、空腹胰岛素、铁蛋白、脂蛋白、和LPS)、血压、听诊、心电图、心脏压力测试、心脏成像(例如，冠脉插管术、超声心动图、血管内超声、正电子发射断层扫描、计算机断层扫描血管造影术，和磁共振成象)评价。
代谢综合征
在一个方面，IL-22 Fc融合蛋白提供了针对对象中的代谢综合征(或代谢病症或疾病)的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的治疗性，预防性的或预防的作用。在一个或多个实施方式中，对象处于代谢综合征的风险。
可以通过评价代谢综合征中通常使用的多种评估来测量代谢综合征的治疗的功效。例如，可以测量肥胖。作为另外的实例，可以测量高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗、慢性脂肪组织炎症，和/或高血压。可以测量C-反应性蛋白、IL-6、LPS、和纤溶酶原激活物抑制剂1中的一种或多种的水平的降低。这些测量可以通过本领域公知的任何方法进行。
胰岛素相关病症
对于胰岛素相关病症，术语“治疗”指病症的治疗性治疗和预防的或预防性的措施，其中目的是预防或减慢(减轻)靶向的病理病况或病症。需要治疗的那些包括已经具有胰岛素相关病症的那些以及倾向于具有此类病症的那些或待在其中预防病症的那些。
在一个方面，IL-22 Fc融合蛋白提供了针对对象中的胰岛素相关病症的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的预防性的或预防的作用。在一个实施方式中，病症是I型糖尿病、II型糖尿病、或妊娠糖尿病。在一个实施方式中，病理学或病理性标志包括以下中的一种或多种：胰腺(例如胰岛细胞)生产极少或不生产胰岛素、胰岛素抗性、和高血糖。在另一个实施方式中，对象处于胰岛素相关病症的风险。一般地，处于风险的对象具有胰岛素相关病症的遗传素质的风险，已经暴露于引发胰岛细胞的自身免疫破坏的病毒(例如，Epstein-Barr病毒、柯萨基病毒、腮腺炎病毒或巨细胞病毒)，是肥胖、糖尿病前期的(pre-diabetic)(高于正常血糖水平)，或具有妊娠糖尿病。
可以通过评价此类病症中通常使用的多种评估来测量胰岛素相关病症的治疗的功效。例如，可以使用以下中的一种或多种评价I型和II型糖尿病：糖化血红蛋白测试(A1C)，常规血糖测试，和空腹血糖测试。也可以通过测试血液中的自身抗体和/或尿中的酮类评价I型糖尿病。也可以通过测试口腔葡萄糖耐受评价II型糖尿病。
急性内毒素血症和败血病
在一个方面，IL-22 Fc融合蛋白提供了针对对象中的急性内毒素血症、败血病，或二者的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的治疗性，预防性的或预防的作用。在一个或多个实施方式中，对象处于急性内毒素血症、败血病，或二者的风险。
可以通过评价急性内毒素血症、败血病，或二者中通常使用的多种评估来测量急性内毒素血症、败血病，或二者的治疗的功效。例如，可以测量LPS或炎性标志物的水平的降低。可以通过本领域中公知的任何方法进行这些测量。
创伤愈合
有多种方式测量创伤愈合。通常取得图像以计算线性尺寸、周长和面积。NIH具有免费的程序，Image J，其允许从图像测量创伤面积。可以基于外周朝向中心的迁移从初始愈合速率外推最终愈合预后。这是使用多种数学等式完成的，其中最通常的是修改的Gilman等式。除了目视检查以外，创伤愈合测量也可以通过光谱方法或MRI辅助。参见，Dargaville等人，Biosensors Bioelectronics，2013，41：30-42，Tan等人，2007，BritishJ.Radiol.80：939-48。如果愈合缓慢/不足，可以取得创伤边缘的生物活检样品以排除或决定感染和恶性。在某些实施方式中，创伤愈合的加速或改善可以通过比较IL-22处理的和对照创伤中的创伤闭合来评价。在某些实施方式中，创伤愈合的加速或改善是快于或优于对照至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在某些方面，本发明提供了促进/加速/改善在创伤中具有或不具有活动性感染、微生物污染或建群的创伤的愈合的方法。IL-22 Fc融合蛋白可以用于治疗感染的创伤或促进/加速/改善感染的创伤愈合。在某些实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白可以用于治疗创伤、或促进/加速/改善创伤愈合，在感染存在的条件下。在一些实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白可用于治疗创伤或促进/加速/改善感染的创伤愈合，在存在具有感染风险的微生物污染或建群的条件下。在其他实施方式中，需要创伤愈合治疗的患者可以是糖尿病患者。因此，在一些实施方式中，创伤是糖尿病创伤，例如糖尿病足部溃疡。在一些其他实施方式中，创伤是感染的糖尿病创伤，例如感染的糖尿病足部溃疡。
本发明的IL-22 Fc融合蛋白可以单独使用或与疗法中的其他活性剂组合使用。例如，本发明的IL-22 Fc融合蛋白可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。在某些实施方式中，额外的治疗剂是降低炎性反应的免疫抑制剂，包括但不限于氨甲喋呤、TNF抑制剂、TNF拮抗剂、美沙拉嗪、类固醇、地塞米松，咪唑硫嘌呤，及其组合。降低炎性反应的适当的额外的治疗剂包括但不限于5-氨基水杨酸(5-ASA)，巯嘌呤(也称为6-巯嘌呤或6-MP)或其组合。在某些实施方式中，IL-22 Fc融合物可以与降低炎性反应的一种或多种额外的治疗剂(例如，5-ASA、6-MP、或TNF拮抗剂)共同施用用于治疗IBD。在某些其他实施方式中，IL22 Fc融合物可以与整联蛋白拮抗剂诸如etrolizumab共同施用用于治疗IBD。在一个实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白与IL-22激动剂组合使用。
为了加速慢性创伤愈合，诸如为了治疗糖尿病足溃疡，可以组合施用IL-22 Fc融合蛋白与一种或多种额外的创伤愈合剂。适当的额外的创伤愈合剂包括但不限于生长因子(例如，EGF、FGF、IGF、PDGF、TGF和VEGF)、神经生长因子(NGF)、血管生成因子(例如，HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8、促血管生成素1和2、Tie-2、整联蛋白α5、基质金属蛋白酶类、一氧化氮、和COX-2)、血小板衍化生长因子(PDGF)家族的成员(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C，和PDGF-D)、胰岛素生长因子(IGF)家族的成员(例如，IGF-I和IGF-II)、转化生长因子(TGF)家族的成员(例如，TGF-α和TGF-β)和合成代谢氧(真空疗法)。在某些实施方式中，IL-22 Fc融合物可以与如本文所述的一种或多种额外的创伤愈合剂和/或适于局部施用的一种或多种抗菌剂或抗生素共同施用。参见WO2006/138468，其通过引用以其整体并入。在此类实施方式中，抗生素可以是硫抗生素包括但不限于磺胺嘧啶银盐，例如，silvadeen。共同施用的一种或多种额外活性剂可以与IL-22融合蛋白共同施用，备选地或与之顺序施用。
在其他示例性实施方式中，如果目标是预防或治疗心血管疾病或病况或代谢综合征，IL-22 Fc融合蛋白的施用可以与以下的施用组合或用其补充：降胆固醇剂诸如他汀类(例如，洛伐他丁、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀，和辛伐他汀)、胆汁酸结合树脂(考来替泊、考来烯胺蔗糖、和考来维纶)、依泽替米贝、或依泽替米贝-辛伐他汀组合；抗血小板剂诸如环氧合酶抑制剂(例如阿司匹林)、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(例如氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、和噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑)、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂(例如阿昔单抗、埃替非巴肽、和替罗非班)、腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫)、凝血恶烷抑制剂(例如凝血恶烷合酶抑制剂、凝血恶烷受体拮抗剂、和terutroban)；β阻断剂诸如阿普洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、杜仲(eucommia bark)、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、塞利洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、奈比洛尔、布他沙明、ICI-118,551、和SR 59230A；血管生成素转化酶(ACE)抑制剂诸如卡托普利、佐芬普利、含有二羧酸盐的活性剂(例如依那普利、雷米普利、喹那普利、哌林多普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、和佐芬普利)，含有磷酸盐的活性剂(例如福辛普利)、casokinins、lactokinins、乳三肽(例如由益生素瑞士乳杆菌生产的或源自酪蛋白的Val-Pro-Pro，和Ile-Pro-Pro)；钙通道抑制剂诸如二氢吡啶(例如，氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、和普拉地平)、苯基烷胺(例如，维拉帕米)、苯并噻氮卓类(例如，地尔硫卓)、米贝拉地尔、苄普地尔、氟司必林、和芬地林；利尿剂诸如高效能髓袢利尿剂(例如，呋塞米、依他尼酸、托拉塞米和布美他尼)、噻嗪化物(例如，氢氯噻嗪酸)，碳酸酐酶抑制剂(例如，乙酰唑胺和醋甲唑胺)、保钾利尿剂(例如，醛固酮拮抗剂：螺内酯，和上皮细胞钠通道阻断剂：阿米洛利和氨苯蝶啶)、和保钙利尿剂，和任意上述的可药用的盐、酸或衍生物。
对于胰岛素相关病症或代谢综合征，IL-22 Fc融合蛋白的施用可以与多种治疗剂的施用组合或用其补充。在I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)的情况中，本文所述的IL-22 Fc融合蛋白可以与常规胰岛素替代疗法(包括快速作用和长时作用胰岛素)、免疫抑制治疗、胰岛移植和干细胞疗法中的一种或多种组合。在一个实施方式中，常规胰岛素替换疗法包括，但不限于，常规胰岛素(例如，HUMULIN
Figure BDA0002603336170001151
，NOVOLIN
Figure BDA0002603336170001152
)，低精蛋白锌胰岛素(例如，HUMULIN
Figure BDA0002603336170001153
，NOVOLIN
Figure BDA0002603336170001154
)、赖脯胰岛素(例如，
Figure BDA0002603336170001155
)、门冬胰岛素(例如，
Figure BDA0002603336170001156
)，甘精胰岛素(例如，
Figure BDA0002603336170001157
)和地特胰岛素(例如，
Figure BDA0002603336170001158
)。在其他实施方式中，胰岛素替换疗法还包括普兰林(
Figure BDA0002603336170001159
)。
在II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)或代谢综合征的情况中，本文所述的IL-22Fc融合蛋白可以与一种或多种胰岛素替换疗法(如以上所讨论的)、降低肝脏的葡萄糖生产的活性剂、刺激胰腺生产和释放胰岛素的活性剂、阻断碳水化合物的酶促分解或增加胰岛素敏感性的活性剂组合。在一个实施方式中，降低葡萄糖生产的活性剂是二甲双胍(例如，
Figure BDA00026033361700011510
和
Figure BDA00026033361700011511
)。在另一个实施方式中，刺激胰腺生产和释放胰岛素的活性剂是格列吡嗪(例如，
Figure BDA00026033361700011512
和GLUCOTROL
Figure BDA00026033361700011513
)、格列本脲(例如，
Figure BDA00026033361700011514
和
Figure BDA00026033361700011515
)或格列美脲(例如，
Figure BDA00026033361700011516
)。在一个其他实施方式中，阻断碳水化合物的酶促分解或增加胰岛素敏感性的活性剂是吡格列酮(例如，Actos)。在另一个实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白可以与二甲双胍的以下替代之一组合：西他列汀(例如，
Figure BDA00026033361700011517
)、沙格列汀(例如，
Figure BDA00026033361700011518
)、瑞格列奈(例如，
Figure BDA00026033361700011519
)和那格列奈(例如，
Figure BDA00026033361700011520
)、艾塞那肽(例如，
Figure BDA00026033361700011521
)和利拉鲁肽(例如，
Figure BDA00026033361700011522
)。在另一个实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白可以与口服低血糖剂，例如，磺酰脲类组合。
在妊娠糖尿病或代谢综合征的情况下，本文所述的IL-22 Fc融合蛋白可以与口服血糖控制药物组合。在一个实施方案中，药物是格列本脲。
GVHD
在一个方面中，IL-22 Fc融合蛋白提供了对抗GVHD的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理标记(包括症状和体征两者)的发展的预防效果，或对抗进程的治疗效果。例如，所述方法提供了治疗GVHD的方法，其包括将有效量的本文所述的IL-22 Fc融合蛋白或其组合物(包括药物组合物)施用于有需要的对象。如本文所述的IL-22 Fc融合蛋白或其组合物的施用可以减轻GVHD的一个或多个症状，包括疼痛、皮疹、皮肤变厚、黄皮肤或眼睛、口腔干燥或溃疡、味觉异常、眼睛干涩、感染或体重减轻。IL-22 Fc融合蛋白或其组合物可以组合其他GVHD疗法来施用，其他GVHD疗法包括例如免疫抑制剂(例如，环孢菌素、麦考酚酸莫酯(MMF)或他克莫司)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司或依维莫司)、化疗剂(例如，伊马替尼、喷司他丁、甲氨蝶呤或沙利度胺)、TNF拮抗剂(例如，依那西普)、类固醇(例如，泼尼松龙、甲基泼尼松龙、局部类固醇或类固醇滴眼液)、光疗(例如，体外光采血疗法)、羟氯喹、抗纤维化剂(例如，卤夫酮)、单克隆抗体(例如阿仑珠单抗、英夫利昔单抗或利妥昔单抗)，或其组合。
组合疗法可以提供“协同作用”和证明是“协同的”，即当活性成分一起使用时所达到的效果比单独使用化合物获得的效果的总和大。当活性成分：(1)以组合的、单位剂量制剂同时共同配制和施用或递送时；(2)作为单独的制剂交替或平行递送时；或(3)通过一些其他方案时，可以实现协同作用。当以交替疗法递送时，当顺序施用或递送化合物时，例如通过单独的注射器中的不同的注射，可以实现协同作用。一般地，在交替疗法过程中，顺序地，即连续地施用每种活性成分的有效剂量，然而在组合疗法中，共同施用两种或多种活性成分的有效剂量。
上文所示的这类组合疗法涵盖组合的施用(其中在相同或单独的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和单独施用，在这种情况下，本发明IL-22 Fc融合蛋白的施用可以在额外的一种或多种治疗剂的施用之前、同时和/或之后进行。在一个实施方式中，IL-22 Fc融合蛋白的施用和额外的治疗剂的施用在彼此的约一个月内，或在约1、2或3周内、或在约1、2、3、4、5、6天内发生。
本发明的IL-22 Fc融合蛋白(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内、局部和鼻内，以及，如果局部治疗需要，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药时间表，包括但不限于单次或在多个时间点中多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的IL-22 Fc融合蛋白将以符合良好医学规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特别的病症、正在治疗的特别的哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、递送活性剂的部位、施用方法、施用时间安排和医疗执业者已知的其他因素。IL-22 Fc融合蛋白不需要，但任选地与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种活性剂一起配制。这类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的融合蛋白的量、疾病或疗法类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明IL-22 Fc融合蛋白的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、Fc区的类型、疾病的严重性和过程，融合蛋白是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对IL-22 Fc融合蛋白的反应，以及主治医师的决定。将IL-22 Fc融合蛋白适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)或约0.1μg/kg至1.5mg/kg(例如，0.01mg/kg-1mg/kg)的IL-22 Fc融合蛋白可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量范围可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病况，治疗通常将持续直至所需的疾病症状抑制出现。IL-22 Fc融合蛋白的一个示例性剂量将处于从约0.05mg/kg至约10mg/kg范围。某些其他剂量包括从约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.02mg/kg至约10mg/kg，和约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围。因此，可以向患者施用约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。对于局部创伤愈合，可以对患者施用约0.001mg/cm2-约10mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约5mg/cm2创伤面积、约0.01mg/cm2-约1mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积、约0.01mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约0.2mg/cm2创伤面积、或约0.1mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积(或其任意组合)中的一种或多种剂量。在某些实施方式中，可以对患者施用约0.01mg/cm2、0.02mg/cm2、0.03mg/cm2、0.04mg/cm2、0.05mg/cm2、0.06mg/cm2、0.07mg/cm2、0.08mg/cm2、0.09mg/cm2、0.1mg/cm2、0.15mg/cm2、0.2mg/cm2、0.25mg/cm2、0.3mg/cm2、0.4mg/cm2、或0.5mg/cm2创伤面积中的一种或多种剂量。这类剂量可以间断地施用，例如，每周或每3周(例如，从而，患者接受从约2个至约20个，或例如约6个剂量的IL-22 Fc融合蛋白)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的缀合物替代IL-22 Fc融合蛋白或除IL-22 Fc融合蛋白之外还使用本发明的缀合物来实施。
G.制造品
在本发明的另一个方面，提供制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文提供的IL-22 Fc融合蛋白。标签或包装说明书提示组合物用于治疗选择的病况。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的IL-22 Fc融合蛋白；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性活性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病况的包装说明书。备选或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代IL-22 Fc融合蛋白或除IL-22 Fc融合蛋白之外，前述任一制造品可以包括本发明的缀合物。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解，考虑到以上提供的一般描述，可以实践多种其他实施方案，并且实施例并非意在限制权利要求的范围。
实施例1：IL-22 Fc融合蛋白的结构和分子表征
示例性IL-22 Fc融合蛋白的初级结构
本发明的示例性IL-22 Fc融合蛋白由通过两个链间二硫键连接的两个单链单元组成。每条单链由人白介素-22(IL-22)融合蛋白组成，所述融合蛋白由与人免疫球蛋白G4(IgG4)的Fc区融合的细胞因子IL-22组成。
Fc区提高了细胞因子的药代动力学特征。融合蛋白的Fc区掺入了N81G突变(从细胞因子和Fc的完整融合多肽的N-末端编号时，这对应于N227G突变，并且关于根据EU索引的Fc区的编号，对应于N297G突变)，这除去了糖基化，使得Fc效应子功能的可能最小化。另外，进行了通过将Ser替换为Pro而产生的修饰铰链区，如通过位点定向突变在CPPCP(SEQ IDNO：31)的氨基酸序列中的粗体和下划线的Pro残基中所示的，以增加分子的稳定性。IL-22Fc融合蛋白由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生，并且预测分子量约为85,131Da(完整的，仅肽链，Fc上没有C-末端赖氨酸残基)。不含碳水化合物的IL-22细胞因子的计算分子量为16,749.4Da(半胱氨酸残基处于还原形式)。没有C-末端赖氨酸残基的IgG4 Fc的计算分子量为25,844.3Da(半胱氨酸残基处于还原形式)。IL-22 Fc融合蛋白的结构如图1A所示。IL-22Fc融合蛋白的IL22细胞因子和IgG4 Fc区氨基酸序列分别如图1B和图1C所示。
表征测试方法
研究了IL-22 Fc融合蛋白的结构和分子特性，重点是以下理化特性：一级结构、大小和电荷异质性、等电点、消光系数、N-聚糖分布和唾液酸含量、高级结构和生物活性。表1列出了用于表征的测试方法，并在本文中进行了描述。
对IL-22 Fc融合蛋白参考标准批次和临床批次1、2和3进行了表征研究。所有批次均在10mM磷酸钠，240mM蔗糖，5mM蛋氨酸和0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 7.1中配制，最终标称浓度为10mg/mL IL-22 Fc融合蛋白。
表1：表征测试方法
Figure BDA0002603336170001201
缩写：2-AA HILIC-UHPLC＝2-氨基苯甲酸亲水相互作用液相色谱-超高效液相色谱；
CE-SDS-NGS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠，非凝胶筛分；CPA＝校正峰面积；HMW＝高分子量；HPLC＝高效液相色谱；ICIEF＝成像毛细管等电聚焦；RP＝反相；SE＝尺寸排阻
理化性质
质谱
用PNGase F去糖基化后，并用三(2羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)去糖基化和还原二硫键后，在完整状态下，通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析了IL-22 Fc融合蛋白样品。为了直接在线MS分析，通过反相高效液相色谱(RP HPLC)对样品进行脱盐后进行了ESI MS分析。
使用非还原的、去糖基化的IL-22 Fc融合蛋白的分析来获得完整IL-22 Fc融合蛋白的主要物质的质量(图2A)，同时使用还原的、去糖基化的IL-22 Fc融合蛋白的分析来获得单链分子的质量(图2B)。观察到的IL-22 Fc融合蛋白的质量对应于从氨基酸序列推导出的预测质量(表2)。针对完整分子获得的主要质量对应于没有羧基末端赖氨酸残基且没有N连接的聚糖的IL-22 Fc融合蛋白的预测质量。
MS分析证实了分子质量与从IL-22 Fc融合蛋白的氨基酸序列推导出的预测质量一致。
表2：去糖基化的、完整的和还原的IL-22 Fc融合蛋白的电喷雾电离-质谱
Figure BDA0002603336170001211
a观察到的质量不包括C-末端赖氨酸
b平均质量
胰蛋白酶肽图
通过高分辨率液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)分析的肽图分析用于验证预测的一级结构并证明肽模式的批次与批次间的一致性。此外，检测了翻译后修饰以及重组蛋白的加工或储存引起的氨基酸侧链的化学修饰。
为了产生IL-22 Fc融合蛋白肽图，在用盐酸胍使蛋白经历变性条件，用二硫苏糖醇还原，并用碘乙酸使半胱氨酸羧甲基化后，用胰蛋白酶消化该蛋白。通过与具有MS-MS能力的质谱仪偶联的RP-HPLC分离得到的肽，并在214nm处监测肽的洗脱。通过LC-MS分析分离的消化混合物确定胰蛋白酶解肽的质量。
肽分配是基于观察到的完整肽的质量(图3A和图3B)。与N连接的碳水化合物相关的胰蛋白酶肽呈现为分组峰。在表3和表4中为参照标准批次提供了肽的序列及其预测的和观察到的质量。所有观察到的肽与从具有IL-22 Fc融合蛋白的序列的蛋白质的胰蛋白酶消化预期的肽一致，包括常见的翻译后修饰。没有观察到序列变体。
表3：来自IL-22 Fc融合蛋白的人IL-22细胞因子的胰蛋白酶肽
Figure BDA0002603336170001221
表3：来自IL-22 Fc融合蛋白的人IL-22细胞因子的胰蛋白酶肽(续)
Figure BDA0002603336170001231
缩写：ND＝未检测到。
a肽由三部分代码标识，其中第一个字母表示用于消化样品的酶(T表示胰蛋白酶)，中间的数字表示从氨基末端开始的片段编号，而最后一个字母表示肽的来源(C表示细胞因子)。
b对于峰分配参见图3A和图3B。
c观察到的和预测的值表示单同位素质量。
d半胱氨酸残基是羧甲基化的半胱氨酸。
e非特异性切割或错过的切割。
f肽T19C上的精氨酸(R146)是Fc的一部分。
表4：来自IL-22 Fc融合蛋白的人免疫球蛋白G4(IgG4)Fc的胰蛋白酶肽
Figure BDA0002603336170001241
表4：来自IL-22 Fc融合蛋白的人免疫球蛋白G4(IgG4)Fc的胰蛋白酶肽(续)
Figure BDA0002603336170001251
缩写：ND＝未检测到。
a肽由三部分代码标识，其中第一个字母表示用于消化样品的酶(T表示胰蛋白酶)，中间的数字表示从氨基末端开始的片段编号，而最后一个字母表示肽的来源(F表示细胞因子)。
b对于峰分配参见图3A和图3B。
c观察到的和预测的值表示单同位素质量。
d半胱氨酸残基是羧甲基化的半胱氨酸。
e非特异性切割或错过的切割。
将肽图与IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次和全部临床批次进行比较(图3C和图3D)。参照标准批次和全部临床批次的肽图关于肽模式是一致的，证明了制造过程在批次与批次之间的一致性。
SE-HPLC
作为批次释放测试的一部分，进行了尺寸排阻高性能液相色谱(SE-HPLC)。针对临床批次和参照标准批次的定量释放数据并排显示于表5中。
表5：通过SE-HPLC的IL-22 Fc融合蛋白的分子大小分布(峰面积％)
Figure BDA0002603336170001252
备注：对于色谱，参见图4A和图4B。
缩写：SE-HPLC＝尺寸排阻高性能液相色谱。
IL-22 Fc融合蛋白作为主峰洗脱，具有约16分钟的停留时间。IL-22 Fc融合蛋白批次的SE-HPLC谱的完整图和展开图证明了临床批次关于峰型和主峰含量是一致的(图4A和图4B)。此外，作为扩展表征的一部分，分析性超离心(AUC)被用作正交尺寸异质性方法。分析一系列不同水平的聚集物的应力样品时，AUC的数据与SE HPLC充分相关。
CE-SDS-NGS
作为批量释放测试的一部分，在非还原条件下进行了毛细管电泳十二烷基硫酸钠-非凝胶筛分(CE-SDS-NGS)。定量释放数据并排显示于表6中。作为扩展表征，在还原条件下(在二硫苏糖醇存在下)进行了CE-SDS-NGS。作为扩展表征测试的一部分，评估了其他物质(表7)。
表6：通过CE-SDS-NGS的非还原IL-22 Fc融合蛋白的分子大小分布(％CPA)
Figure BDA0002603336170001261
备注：对于CE-SDS-NGS非还原电泳图和峰鉴定，参见图5A和图5B。
缩写：CE-SDS-NGS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠-非凝胶筛分。
表7：通过CE-SDS-NGS的还原IL-22 Fc融合蛋白的分子大小分布(％CPA)
Figure BDA0002603336170001262
备注：对于CE-SDS-NGS非还原电泳图和峰鉴定，参见图5C和图5D。
缩写：CE-SDS-NGS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠-非凝胶筛分；
IRS＝不完全还原的物质。
未还原的IL-22 Fc融合蛋白作为突出峰迁移，其余的次要峰代表具有明显较低或较高分子量的物质(图5A(完整图)和图5B(展开图))。未还原样品的CE-SDS-NGS分离的变体的相对分布提供于表6中。IL-22Fc融合蛋白批次的CE-SDS-NGS剖析显示出一致的峰型和校正峰面积百分比(CPA)。此外，这种方法能够检测蛋白质二硫键的还原，如果存在时。
从还原的IL-22 Fc融合蛋白的CE-SDS-NGS分析的电泳图显示出存在一个主峰，对应于单链分子(图5C和图5D)。还原形式的相对分布在表7中列出。IL-22Fc融合蛋白批次的CE-SDS-NGS谱显示出一致的峰型和校正的CPA百分比。
SDS-PAGE分析
将使用
Figure BDA0002603336170001271
Ruby染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于评估IL-22 Fc融合蛋白批次的纯度。尽管这种方法不是定量的，但可用于检测少量蛋白质杂质。通过SDS-PAGE分析了还原(图6A)和未还原(图6B)的IL-22 Fc融合蛋白样品。在SDS-PAGE样品缓冲液存在下，通过加热使样品变性。将未还原的样品在碘乙酰胺的存在下加热到60℃，持续5分钟，而还原的样品在加入还原剂(DTT)的情况下，加热到60℃，持续10分钟。所有样品均以5μg上样。将制备的样品、分子量标准品和灵敏度标准品(每泳道2和8ng牛血清白蛋白)在4％-20％的聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离。然后通过
Figure BDA0002603336170001272
Ruby染色将蛋白质组分可视化。
针对还原(图6A，泳道4-7)和未还原(图6B，泳道4-7)样品中的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次和IL-22 Fc融合蛋白临床批次观察到了一致的条带模式。
对于还原的样品(图6A，泳道4-7)，一个主要条带以大约50kDa的表观质量迁移，这与IL-22 Fc融合蛋白的单链一致。在还原的样品中观察到的条带模式也与在还原的IL-22Fc融合蛋白的CE-SDS-NGS分析中观察到的迁移模式一致(图5C和图5D)。切下凝胶中的所有条带，用胰蛋白酶消化，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行分析。胰蛋白酶图质量分析的结果表明凝胶中的所有条带均与产物相关。
对于未还原的样品(图6B，泳道4-7)，完整的IL-22 Fc融合蛋白是主要条带，并以约125kDa的表观质量迁移。在未还原的样品中观察到的条带模式也与在未还原的IL-22 Fc融合蛋白的CE-SDS-NGS分析中观察到的迁移模式一致(图5A和图5B)。切下凝胶中的所有条带，用胰蛋白酶消化，并通过MALDI-TOF MS分析。胰蛋白酶图质量分析的结果表明凝胶中的所有条带均与产物相关。
ICIEF
成像毛细管等电聚焦(ICIEF)提供了一种定量评估蛋白质电荷异质性的方法。在有和没有CpB处理的情况下分析了IL-22 Fc融合蛋白批次。CpB是一种除去C-末端赖氨酸残基的酶。认为C-末端赖氨酸残基的异质性是细胞培养操作过程中内源性CHO碱性羧肽酶进行蛋白水解的结果。通过除去C-末端赖氨酸残基赋予的电荷异质性，可以更彻底地评估蛋白质中存在的剩余电荷变体。
作为批次释放测试的一部分，进行了CpB和唾液酸酶处理后的ICIEF。定量释放数据并排显示于表8中。此外，作为扩展表征，进行了未进行CpB处理的ICIEF(具有C-末端赖氨酸异质性的天然IL-22 Fc融合蛋白)。
未经CpB处理的天然IL-22 Fc融合蛋白的ICIEF分析结果概括于表8中，并显示在图7A(完整图)和图7B(展开图)中，表明批次具有由于C-末端赖氨酸电荷异质性引起的可变电荷变体分布。概括于表9中并显示于图7C(完整图)和图7D(展开图)中的来自CpB处理的IL-22 Fc融合蛋白分析的结果证明了电荷变体分布的批次与批次间的一致性。比较使用和未用CpB处理所获得的结果，表明了碱性变体主要是由于赖氨酸异质性引起的(图7E)。
表8：
通过天然IL-22 Fc融合蛋白的ICIEF的电荷变体的分布(峰面积％)
Figure BDA0002603336170001281
缩写：ICIEF＝成像毛细管等电聚焦
表9：
通过CpB处理的IL-22 Fc融合蛋白的电荷变体的分布(峰面积％)
Figure BDA0002603336170001282
缩写：ICIEF＝成像毛细管等电聚焦
等电点
pI是蛋白质没有净电荷的pH值。用唾液酸酶处理后，通过ICIEF确定天然IL-22 Fc融合蛋白的pI。通过这个分析，确定主要成分的pI为6.5。在ICIEF电荷异质性方法中观察到的主峰的pI可能与这个值略有不同，因为电荷异质性方法使用了窄范围两性电解质，其会产生通过两个包含pI标记校准的pH梯度。
消光系数测定
通过将蛋白水解切割和未折叠的IL-22 Fc融合蛋白的光谱与由氨基酸序列计算的光谱进行比较，可以确定IL-22 Fc融合蛋白溶液的蛋白质浓度。这个计算是基于各个氨基酸的已知吸光度值(Bewley等，Analytical Biochemistry 123：55-65，1982)。使用这个方法，测定了IL-22Fc融合蛋白在280nm处的消光系数为0.98mL mg-1cm-1。这个消光系数用于紫外可见分光光度扫描分析中，以计算用于所有测试批次的IL-22 Fc融合蛋白浓度。
N-糖基化位点占有率
IL-22 Fc融合蛋白在分子的两个细胞因子结构域的每个中含有四个N-糖基化位点(Asn21、Asn35、Asn64和Asn143)。通过IL-22 Fc融合蛋白的酶促去糖基化，接着Lys-C肽作图和LC-MS分析，确定了IL-22 Fc融合蛋白的N-糖基化位点占有率。为了产生IL-22 Fc融合蛋白肽图谱，将蛋白质接受使用盐酸胍的变性条件、用二硫苏糖醇还原以及用碘乙酸将半胱氨酸羧甲基化后，用内蛋白酶Lys-C消化蛋白质。使用PNGase F酶从蛋白质切割出N-聚糖。通过连接质谱仪的UHPLC分离所得到的肽。
根据去糖基化肽的提取离子色谱图的积分峰面积除以去糖基化肽和天然肽的总峰面积计算出百分比位点占有率。(PNGase F将天冬酰胺转化为天冬氨酸，导致去糖基化肽的质量偏移1Da。)在计算提取离子色谱图时，考虑了肽最丰富的电荷状态。
Asn21、Asn35、Asn64和Asn143的百分比N-糖基化位点占有率显示于表10中。位点占有率显示出在参照标准批次与临床批次1、2和3的四个N-糖基化位点之间是一致的。
表10：通过Lys-C肽作图和LC-MS的IL-22 Fc融合蛋白的百分比N-糖基化位点占有率
Figure BDA0002603336170001291
对临床批次4、5和6进行了Asn21、Asn35、Asn64和Asn143的百分比N-糖基化位点占有率的其他表征。所有六个临床批次均显示出一致的位点占有率(表11)。
表11：通过Lys-C肽作图和LC-MS的IL-22 Fc融合蛋白临床批次1-6的百分比N-糖基化位点占有率
Figure BDA0002603336170001301
通过2-AA HILIC-UHPLC的N-连接聚糖分析
IL-22 Fc融合蛋白含有每个单链分子四个N-糖基化位点，全部位于分子细胞因子结构域中的Asn21、Asn35、Asn64和Asn143。显示出位点占有率在参照标准批次以及临床批次1、2、3、4、5和6的四个N-糖基化位点之间是一致的。
通过使用荧光检测的HILIC-UHPLC定量评估IL-22 Fc融合蛋白的N-连接聚糖的相对分布。对于这种方法，使用PNGase F酶在变性条件下从蛋白质切割出N-聚糖。用荧光标记2-AA衍化释放的聚糖，并通过结合荧光检测的HILIC-UHPLC分离并检测。
在IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次1、2和3中观察到的聚糖的色谱图显示于图8A和图8B中。IL-22 Fc融合蛋白批次的相对N-连接聚糖分布提供于表12中并显示于图8C中。图8D提供了IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次以及临床批次2、3、4、5和6的相对N-连接聚糖分布。根据属性将N-连接聚糖分组(图8A和图8B)。证明了IL-22 Fc融合蛋白临床批次的糖基化模式和糖基化属性的一致性。所有六个临床批次显示出作为百分比(％)峰面积表示的相似分布(表13)。来自这些扩展表征分析的结果证明了IL-22 Fc融合蛋白批次具有一致的聚糖特征。
此外，作为扩展表征的一部分还进行了半乳糖-α-1，3-半乳糖的分析。通过高效阴离子交换色谱脉冲电流检测(HPAEC-PAD)定量评估了半乳糖-α-1，3-半乳糖。使用这种方法，在参照标准批次和临床批次中没有检测到半乳糖-α-1，3-半乳糖。
表12：通过2-AA HILIC-UHPLC的IL-22 Fc融合蛋白的相对N-聚糖分布(峰面积％)
Figure BDA0002603336170001311
表12：通过2-AA HILIC-UHPLC的IL-22 Fc融合蛋白的相对N-聚糖分布(峰面积％)(续)
Figure BDA0002603336170001321
表12：通过2-AA HILIC-UHPLC的IL-22 Fc融合蛋白的相对N-聚糖分布(峰面积％)(续)
Figure BDA0002603336170001331
备注：对于色谱图，参见图8A和图8B。
缩写：2-AA HILIC-UHPLC＝2-氨基苯酸亲水性相互作用液相色谱-超高效液相色谱；Hex＝己糖；HexNAc＝N-乙酰基氨基己糖；NeuAc＝N-乙酰基神经氨酸；NeuGc＝N-乙醇酰基神经氨酸；Man＝甘露糖；GlcNAc＝N-乙酰基葡糖胺。
a聚糖组成分配是基于使用GlycoMod预测工具(http://web.expasy.org/glycomod)的完整聚糖的实验质量，其假定了由(Man)3(GlcNAc)2组成的标准N-连接戊糖核的存在。
b含有lactosaminic(半乳糖-N-乙酰基葡糖胺)重复。
c含有三个NeuAc残基和一个NeuGc残基。
Figure BDA0002603336170001341
Figure BDA0002603336170001351
位点特异性N-糖基化
IL-22 Fc融合蛋白的细胞因子结构域中的Asn21 N-糖基化位点位于与IL-22受体相互作用的界面处或附近(Jones等，Structure 16：1333-44，2008；Logsdon等，JMol.Biol.342(2)：503-14，2004)。
通过Lys-C肽作图和LC-MS分析测定了位点Asn21处的N-连接聚糖的相对分布。为了产生IL-22 Fc融合蛋白肽图谱，将蛋白质接受使用盐酸胍的变性条件、用二硫苏糖醇还原以及用碘乙酸将半胱氨酸羧甲基化后，用内蛋白酶Lys-C消化蛋白质。通过连接质谱仪的UHPLC分离所得到的肽。
通过LC-MS方法的Lys-C肽作图提供了关于给定的N-糖基化位点处N-连接聚糖的鉴定和相对丰度的信息。由于IL-22 Fc融合蛋白中许多糖肽的电离效率的潜在差异，使用相对定量来比较批次之间的糖肽丰度。针对Asn21的相对N-连接聚糖分布显示于图9中。根据选择主要糖基化属性，将N-连接的聚糖分组。证明了对于IL-22 Fc融合蛋白临床批次，Asn21处的糖基化模式和糖基化属性的一致性。
针对NANA含量的唾液酸分析
使用唾液酸RP-HPLC方法来测定N-乙酰基神经氨酸(NANA)含量并作为批次释放测试的一部分来进行。针对临床批次和参照标准批次的定量释放数据并排显示于表4中。来自唾液酸分析的结果证明了批次在IL-22 Fc融合蛋白释放规格内具有一致的NANA含量(8-12摩尔NANA/摩尔IL-22 Fc融合蛋白)。此外，作为扩展表征的一部分，进行了针对N-乙醇酰神经氨酸(NGNA)的分析。NGNA的含量在参照标准批次和临床批次之间保持一致的低(表14)。
表14：通过RP HPLC的IL-22 Fc融合蛋白的N-乙酰基神经氨酸和N-乙醇酰神经氨酸含量
Figure BDA0002603336170001361
缩写：NANA＝N-乙酰基神经氨酸；NGNA＝N-乙醇酰神经氨酸；
RP-HPLC＝反相高效液相色谱。
结构表征
二硫键属于蛋白质的高级结构。从共有序列，推断出每条单链四个总的链间二硫键，细胞因子中两个(Cys7-Cys99和Cys56-Cys145)，Fc中两个(Cys45-Cys105和Cys151-Cys209)。在完整分子中，每条单链的两个半胱氨酸残基预期参与链间二硫键。这些键在Fc中，并且可以从共有序列推断出来，两条单链之间两个二硫键(Cys10-Cys10和Cys13-Cys13)。
蛋白质的高级结构由氨基酸序列和翻译后修饰决定。因此，确定蛋白质的一级结构是表征其结构性质的基础。可以使用提供直接评估分子共价结构和功能特性的方法，以及对分子表面特性的细微变化敏感且定量的方法。圆二色性(CD)光谱用作扩展表征的一部分，以寻找IL-22 Fc融合蛋白中是否存在更高级结构元素。二级结构特征包括α螺旋和β折叠，出现在CD光谱的远离紫外线(UV)区域(190-250nm)中。这些条带是由于与蛋白质的其余部分相比，肽键沿蛋白质主链的相对取向引起的。此外，CD光谱的临近紫外线区域(250-340nm)提供了有关可能涉及疏水性、三级结构接触的芳香族残基(例如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的手性取向变化的信息。参照标准批次和临床批次的光谱彼此相似，这表明通过CD分析，IL-22 Fc融合蛋白的高级结构没有可辨别的差异(图10)。
实施例2：IL-22 Fc融合蛋白效力和唾液酸化的作用
体外研究
IL-22 Fc融合蛋白效力测定测量了IL-22 Fc融合蛋白与IL 22 RA1 ECD结合的能力。在测定中，将不同浓度的IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次、对照和样品添加到涂有IL22 RA1 ECD的96孔平板中。用山羊抗人IgG辣根过氧化物酶(HRP)抗体和四甲基联苯胺底物溶液检测结合的IL-22 Fc融合蛋白。将以光密度(OD)单位表示的结果相对于IL-22 Fc融合蛋白浓度作图，并使用平行曲线程序计算相对于参照样品批次的IL-22 Fc融合蛋白样品的测量效力。
来自效力测量的结果证明了批次具有一致的效力，满足可接受标准(40％-130％相对效力)，并且适用于打算的用途(表15)。
表15：IL-22 Fc融合蛋白效力
Figure BDA0002603336170001381
已知唾液酸化的存在和水平对糖蛋白(如IL 22)的相互作用有影响(Marchal等，Biol Chem 382：151-9，2001)。为了研究唾液酸对IL 22 Fc融合蛋白与IL 22受体之间的相互作用的影响，产生了来自不同研发批次的具有不同唾液酸水平(0.7，4.6，8.1，12.0或15.4mol唾液酸/mol IL-22 Fc融合蛋白)(测定定量极限为3mol/mol)的IL 22 Fc融合蛋白样品，并在结合测定和基于细胞的报道基因测定中进行了测试。基于细胞的测定是报告基因测定，其测量IL-22 Fc融合蛋白激活工程化稳定的内源性地表达IL-22受体的colo2005细胞中的荧光素酶表达的能力。在工程化稳定的colo205细胞报告基因细胞系中，信号转导子和转录激活因子3(STAT3)与报告基因的启动子中的其DNA响应元件的结合诱导萤火虫萤光素酶表达。在该测定中，将表达colo205报告基因的细胞与制备的IL-22 Fc融合蛋白参照标准、测定对照和测试样品的稀释液在96孔测定平板中一起孵育。定时孵育后，将萤光素酶试剂添加到测定平板的孔中，并使用发光板读数器测量报告基因的活性。在测定平板的每个孔中发射的光量与IL-22 Fc融合蛋白参照标准、测定对照和测试样品诱导的萤光素酶量成正比。将表示为发光单位(LUM)的结果相对于IL-22 Fc融合蛋白浓度作图，并且使用平行线分析来估计IL-22 Fc融合蛋白样品相对于参照标准的活性。这个测定的示意图示于图11中。为了产生具有不同唾液酸水平的材料，对细胞培养和纯化过程进行了改进。
在基于细胞的测定中测量活性时，维持唾液酸含量和结合的关系(图12A)。关系线不是平行的，但显示出相同的趋势。
使用结合测定和基于细胞的测定在效力检查前用唾液酸酶处理低水平唾液酸和高唾液酸变体表明，效力不仅仅由唾液酸决定，而且还受到基础聚糖的影响(表16)。用0.01U/mg的唾液酸酶A孵育变体，处理去除唾液酸酶A并配置。将唾液酸(SA)变体15(mol/mol)材料渗析，以产生SA变体0高材料。将SA变体4材料渗析，以产生SA变体0低材料。与SA水平0低材料相比，SA变体0高材料含有更多四触角聚糖(即，更多分支，因此命名为“高”)，更多半乳糖基化的聚糖，和较少的末端含GlaNac聚糖。换句话说，与SA变体0低材料相比，SA变体0高材料含有更完整的聚糖结构。具有更多分支和半乳糖基化的SA变体0高材料允许添加更多的唾液酸，其可以只添加至半乳糖残基。认为提高的分支和半乳糖基化(可用的半乳糖残基)程度涉及获得15和更高的唾液酸水平。
表16：IL-22 Fc融合蛋白唾液酸变体的效力
Figure BDA0002603336170001391
％差异：测定之间的差异(n＝2)
*效力的估计值
为了进一步研究唾液酸含量和结合之间的关系，用唾液酸酶处理几个临床批次，以除去唾液酸。在结合测定中分析了去唾液酸化的样品。来自临床批次(2、4、5和6)和参照标准批次的去唾液酸化的材料没有集中于均一的效力值，表明其他产品质量属性归因于效力差异(图12B)。可以影响IL-22 Fc融合蛋白与IL-22 RA1结合的聚糖属性，而不是总唾液酸含量，包括半乳糖基化和唾液酸化的分支(触角性)和水平。与临床批次相比参照标准批次提高的效力归因于更多的末端甘露糖和末端GlcNAc、较少的分支、较少的半乳糖基化和较少的唾液酸化，由此表明与针对临床批次观察到的那些相比较少的完整聚糖结构。证明了所有临床批次的糖基化模式和糖基化属性的一致性。
为了研究基础聚糖结构对结合活性的作用，用PNGase F酶处理相同的临床批次，以除去全部N-聚糖并在效力测定中进行分析。从通过与样品相同处理(除了PNGase F添加)的参照标准批次制备的过程控制样品的效力不同于参照标准批次的效力。此外，观察到了与参照标准批次相比过程控制的分子大小异质性的差异。与参照标准批次相比，过程控制含有更多高分子量(HMW)形式和较少低分子量(LMW)形式，如通过尺寸排阻超高性能液相色谱(SE-UHPLC)测量的。针对过程控制的SE-UHPLC色谱图证明了峰形状和停留时间的变化，表示孵育和纯化处理后聚糖组成的变化。
所有去糖基化的样品，包括参照标准批次，具有集中于超过测定验证范围的水平的结合水平。所有去糖基化样品的EC50(参见图13)是相似的，表明基础聚糖，超越唾液酸，也有助于结合活性。过程控制的效力转移可能是由于聚糖组成的差异引起的，如通过SE-UHPLC峰中的变化所示的。以上的结果表明效力测定对影响IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1的能力的产品质量属性是敏感的。
体内研究
在小鼠中评价了IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量对药代动力学(PK)和血清REG3βPD响应的影响。将九十六只株系CD1的雌性小鼠分配至六组中的一组(n＝16只小鼠/组)。通过尾静脉，组1中的动物给予单次推注剂量的载体对照，而组2-6中的动物给予单次1,000μg/kg(1mg/kg)IV推注剂量的具有0.7，4.6，8.1，12.0或15.4mol唾液酸/mol IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸水平的IL-22 Fc融合蛋白。在给药后长达21天的不同时间点，收集血清样品(n＝4/时间点)，并分析IL-22 Fc融合蛋白浓度和血清REG3β浓度。使用非区隔稀疏分析，将来自个体动物的血清浓度-时间数据用于估计PK参数。
平均±SD(标准偏差)血清IL-22 Fc融合蛋白浓度-时间特征呈现于图14中，并且组平均PK参数估计值提供于表17中。
表17：在CD1小鼠中静脉内施用1,000μg/kg IL-22 Fc融合蛋白变体后的非区隔药代参数估计值
Figure BDA0002603336170001411
缩写：AUClast＝时间0至最后测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积；CL＝清除率；Cmax＝最大观察到的浓度；IL＝白介素；mol＝摩尔；PK＝药代动力学；SA＝唾液酸；T1/2，λz＝末端消除半衰期；Vss＝稳态分布体积。
1,000μg/kg单次IV推注剂量的具有0.7，4.6，8.1，12.0或15.4mol/mol唾液酸水平的IL-22 Fc融合蛋白施用于CD1小鼠后，平均清除率(CL)估计值分别为945，399，132，42.6和25.1mL/kg/天；最大观察到的血清浓度(Cmax)分别为3,100，6,850，10,300，15,800和23,200ng/mL；和稳态分布体积(Vss)估计值分别为2,430，797，301，107和71.2mL/kg。末端半衰期估计值在具有不同唾液酸水平的材料中是相似的，并且范围在1.93至2.66天之间。整体上，随着唾液酸水平的提高，IL-22 Fc融合蛋白暴露提高了，Vss提高了，而CL降低了(图15)，很可能是通过暴露的半乳糖残基被去唾液酸糖蛋白(ASGP)受体识别的肝脏吸收介导的(Stefanich等，J Pharmacol Exp Ther 327：308-15，2008)。
REG3α是由肠上皮细胞和胰腺腺泡细胞产生的抗微生物肽，并且是表示IL-22R靶衔接的相关PD生物标志物。REG3β是人和食蟹猴REG3α的小鼠直系同源物。平均±SD血清REG3β浓度-时间特征呈现于图16A中。CD1小鼠中单次IV推注剂量1,000μg/kg后观察到了随着IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸水平递增，REG3β的血清水平的单调增加。随着不同唾液酸水平的IL-22 Fc融合蛋白曲线下面积(AUC)的变化和相应的血清REG3β AUC变化之间的关系显示于图16B中。结合的PK/PD数据显示出IL-22 Fc融合蛋白暴露和血清REG3β应答随着IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸水平的递增而增加。这表明了在CD1小鼠中1,000μg/kg IV剂量下，随着唾液酸含量递增的IL-22 Fc融合蛋白暴露的增加导致了体内血清REG3β PD应答的增加，尽管随着唾液酸含量增加体外效力是降低的。
这些研究证明了结合效力测定对唾液酸含量是敏感的，其方式与初步基于细胞的测定相一致。
鉴于小鼠PK/PD研究中唾液酸含量和PD应答之间观察到的正相关，在唾液酸含量和效力之间观察到的负相关没有导致体内药理作用的降低。尽管效力随着唾液酸递增而降低，但体内清除率和分布体积也降低了，导致较高的暴露(在Cmax和AUC两者中)。结合的PK/PD数据显示出由于唾液酸含量差异引起的IL-22 Fc融合蛋白暴露中的变化是体内血清REG3β PD应答中观察到的变化的主要驱动力，尽管唾液酸含量对体外效力的作用相反。
实施例3：IL-22 Fc融合蛋白的化学性质、制造过程和过程控制
批次和规模限定
使用适应悬浮的CHO细胞系在生物反应器中制造IL-22 Fc融合蛋白。细胞的来源是Master细胞库(MCB)，并将MCB的融化物用于作为几个生产运行的来源。从每个细胞培养生产运行产生单批次的收获细胞培养液(HCCF)。通过纯化和最终调节来加工一个或多个批次的HCCF，以产生单批次的IL-22 Fc融合蛋白。所有制造都是依据cGMP的。以表8中所列的规模进行使用本文所述的方法的生产。
表18：细胞培养过程的制造规模
Figure BDA0002603336170001421
细胞培养和收集
用于生产IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养过程由四个阶段组成：种子训练、接种训练、生产和收获。图17的流程图说明了所述阶段、过程中控制(IPC)以及细胞培养和收集过程的相关信息。以表18中所示的规模进行使用这个部分所述过程的生产。过程参数列于表19中。
细胞培养过程的描述
细胞培养基
细胞培养阶段使用不同类型的培养基，其全部都是化学限定的培养基。在种子训练阶段中使用含有甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的选择培养基，而非选择培养基用于接种和生产阶段中。在生产阶段还使用了非选择营养物质补料培养基。生产细胞培养物过程中使用的基础培养基是化学限定的培养基，选择其来最小化与使用动物源原料相关的关于不定物质的潜在风险。培养基含有氨基酸、维生素、微量元素和缓冲剂组分。
所有细胞培养基是无血清的、化学限定的，并且包括细胞保护剂、多糖和重量摩尔渗透压浓度调节剂。在过程中使用了一种含有动物源组分的原料：按照需要添加30％西甲硅油，以控制起泡。
种子训练
为了启动种子训练，从液氮存储物中取出来自无血清IL-22 Fc融合蛋白MCB的一安瓿或几安瓿细胞，融化，并用于接种旋转器、摇瓶或种子训练生物反应器。
将细胞在融化后亚培养并随后在选择种子训练培养基中传代。用于种子训练的培养条件提供于表19中。将来自种子训练培养的细胞用于接种第一接种训练生物反应器。
在其他实例中，可以使用滚动种子训练来产生IL-22 Fc融合蛋白。在这个实例中，种子训练物连续生长(直至特定细胞年龄)，以接种接种训练物。
接种训练
为了提供用于IL-22 Fc融合蛋白生产培养物的接种物，通过在较大尺寸的一个或多个生物反应器中的非选择培养基中亚培养来扩增种子训练细胞团块。种子训练和生产阶段之间的亚培养被称为接种训练(N-2，和N-1培养物)。通过对非选择培养基中的IL-22 Fc融合蛋白表达稳定性的后续研究，限定了接种训练中的最大传代数，目前限于四或更低。用于接种训练的培养条件提供于表19中。
生产阶段
IL-22 Fc融合蛋白的生产阶段在生物反应器中使用非选择培养基来进行。为了接种生产培养物，将来自接种训练最后阶段的细胞(称为N-1培养物)转移至含有生产培养基的生产生物反应器中。为了维持细胞生活力和生产力，在培养过程中将营养物质补料加入生产生物反应器中。生产过程还使用了温度偏移，以延长培养物生活力和增强生产力。生产培养条件概括于表19中。
在生产培养物收获之前，取样并分析，以证实关于微生物和病毒的产品安全性。
过程控制
监控细胞培养物性能指示(例如，细胞密度、生活力和滴定度)和过程参数(培养pH、温度和溶解氧)。监测和控制的过程参数显示于表19中。表20中提供了过程中控制测试的操作和排除限制。通过添加CO2气体(酸)和/或Na2CO3、NaOH或按照需要的其他合适的碱来调节生物反应器培养物的pH。在生物反应器培养物中补充消泡剂(西甲硅油乳剂)，以最小化泡沫形成。使用前，将所有培养基溶液通过灭菌级膜滤器(孔径大小为0.1μm)过滤。使用前，将所有用于pH和溶解氧控制的气体通过灭菌级膜滤器(孔径为0.22μm)过滤。表20中提供了针对过程中控制测试的操作和排除限制。制造过程设计为使用补料分批培养过程进行操作。IL-22 Fc融合蛋白的加工过程中没有中间体。
表19：每个细胞培养过程阶段的过程参数目标
Figure BDA0002603336170001441
a将通过研发来确定可接受范围，以确保IL-22 Fc融合蛋白一致地满足产品释放规格。
b通过直接充入空气和/或氧气和/或富氧空气将溶解氧维持在设定点。
表20：使用限制的过程中控制
Figure BDA0002603336170001451
CFU＝集落形成单位；DNAF＝DNA结合荧光染料(fluorochrome)；NA＝不适用；
PCR＝聚合酶链式反应；UFDF＝超滤和渗滤。
a当前的临床批次已按说明的排除限制生产。对于以后的批次，说明了接受标准。如果超过了接受标准，则批次被排除。
过程相关杂质
作为过程中控制测试的一部分，在IL-22 Fc融合蛋白中常规地监测包括宿主细胞DNA、残余蛋白A和宿主细胞蛋白(HCP)的过程相关杂质。
本节介绍了在IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中对甲硫氨酸亚砜亚胺(也称为MSX)，消泡剂(西甲硅油乳剂)和Kolliphor P 188(又称为泊洛沙姆188)等杂质的去除能力的评估，通过证明杂质在该过程中被显著稀释至可接受的低水平(MSX)，或者在纯化过程中被显著降低至可接受的低水平(西甲硅油和泊洛沙姆188)。
为了选择压力，将MSX以50μM的水平加入种子训练培养物中。没有将MSX添加至接种训练或生产生物反应器中；因此，基于最大体积和最低预期的滴定度1.5g/L，生产培养基中的最大MSX浓度为每mg IL-22 Fc融合蛋白81μg/L或54ng MSX。假设纯化过程中没有清除MSX时，则可能残留的MSX的最大量为针对I期临床研究的每建议最大剂量(42mg)2.3μgMSX。但是，预期色谱、超滤和渗滤(UFDF)步骤将进一步降低小分子(如MSX)的水平。
亲和性集合中的第一色谱步骤后，通过核磁共振(NMR)测量了IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中与过程相关的杂质，如西甲硅油和泊洛沙姆188。亲和性集合中，西甲硅油和泊洛沙姆188低于测定的定量极限(LOQ)(10μg/mL)(参见表21)。
表21：亲和性集合中的过程相关杂质水平
Figure BDA0002603336170001461
残余溶剂
在IL-22 Fc融合蛋白生产中没有使用1类或2类溶剂。在IL-22 Fc融合蛋白纯化中使用了低浓度的冰醋酸。根据The International Council for Harmonisation ofTechnical Requirements for Pharmaceuticals(ICH)残留溶剂指南(Q3C)，冰醋酸毒性低并且对于人健康是低风险的。
收获
在生产培养结束时，从细胞分离出细胞培养液。为了收获，将培养物在生产生物反应器中冷却。随后使用盘堆栈分离器通过离心除去细胞并随后使用一次性使用的深度和微生物截留滤器过滤。
mAb或与mAb相关格式可能会导致二硫键还原发生。迄今为止，对于IL-22Fc融合蛋白尚未观察到该现象。但是，作为预防措施，在研发IL-22 Fc融合蛋白期间已实施了几种缓解策略。如下所述从收集的细胞培养液纯化IL-22 Fc融合蛋白。
纯化和修饰反应
用于纯化和最终调节IL-22 Fc融合蛋白的过程步骤和IPC显示于图18中。
纯化过程步骤中使用的缓冲剂的组成提供于表22、表23、表24、表25和表26中。
表22：IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中使用的去污剂病毒灭活溶液的组成
Figure BDA0002603336170001471
表23：IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中使用的亲和性色谱缓冲剂的组成
Figure BDA0002603336170001472
表24：IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中使用的多峰阴离子交换色谱缓冲剂的组成
Figure BDA0002603336170001473
表25：IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中使用的疏水性-相互作用色谱缓冲剂的组成
Figure BDA0002603336170001474
表26：IL-22 Fc融合蛋白纯化过程中使用的超滤和渗析缓冲剂的组成
Figure BDA0002603336170001475
通过添加去污剂的病毒灭活
添加去污剂Triton X-100的10％储液，以产生收集的细胞培养液(HCCF)，获得0.5％Triton X-100的终浓度。将HCCF在20℃-24℃下保持≥1小时，以灭活潜在的病毒颗粒。
亲和性色谱
亲和性色谱步骤是使用MABSELECT
Figure BDA0002603336170001481
树脂的结合-和-逐步洗脱过程。细胞分离和Triton添加后，将HCCF施加于平衡柱上。通过洗涤柱除去蛋白质和非蛋白质杂质。使用低pH洗脱缓冲剂从柱回收产物。亲和性合并从体积开始，并基于280nm处的吸光度终止。这个色谱步骤除去了残余杂质，如DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、病毒和小分子。
多峰阴离子交换色谱
多峰阴离子交换步骤是使用CAPTOTM粘附树脂的结合-和-逐步洗脱过程。用平衡缓冲剂平衡多峰阴离子交换柱后，将电导率-和pH-调节过的亲和性集合加载于柱上。IL-22Fc融合蛋白结合树脂后，用平衡缓冲剂洗涤柱。使用递增的盐梯度，用洗脱缓冲剂从柱洗脱IL-22 Fc融合蛋白。基于280nm处的吸光度开始和终止多峰阴离子交换合并。这个色谱步骤除去了残余杂质，如DNA、宿主细胞蛋白质、病毒和高分子量形式(HMWF)。
通过小病毒截留过滤的病毒去除
将来自之前步骤的产物集合通过一次性使用的正常流小分子截留滤器(
Figure BDA0002603336170001482
Pro Magnus)来过滤。使用前后对滤器进行完整性测试。
疏水性相互作用色谱
使用苯基SEPHAROSETM FF树脂以流通方式进行疏水性-相互作用步骤。用平衡缓冲剂平衡疏水性-相互作用柱后，将来自之前步骤的电导率和pH-调节过的产物集合加载至柱上。IL-22 Fc融合蛋白流过柱，随后用平衡缓冲剂洗涤。基于280nm处的吸光度开始和终止疏水性-相互作用合并。这个色谱步骤除去了残余的杂质，如宿主细胞蛋白质、病毒和HMWF。
超滤和渗滤
使用10kDa复合再生的纤维素超滤膜，通过超滤，将产物集合浓缩至大约20g/L。随后将浓缩的集合渗滤(交换的缓冲剂)至渗滤缓冲剂中。
调节
用渗滤缓冲剂稀释超滤和渗滤(UFDF)集合，并在0.010M磷酸钠，0.24M蔗糖，0.005M甲硫氨酸，0.02％聚山梨酸酯20，pH7.1中调节至10.0±1.0g/L IL-22 Fc融合蛋白的终浓度。
IL-22 Fc融合蛋白的最终过滤、充填和储存
将调节过的UFDF集合通过0.22μm膜过滤，以产生在≤-20℃下储存的IL-22Fc融合蛋白。
合并相同步骤过程中集合
含产物的过程中集合可以在过程步骤之间储存在2℃-8℃，并可以合并用于进一步加工。对于所得到的释放可接受的IL-22 Fc融合蛋白，合并的单独集合必须各自单独地满足过程中限制。合并集合以解决质量问题是不可接受的。
重新过滤
重新过滤是一种主动措施，仅可用于防止过程中集合的损害。在极少数情况下，当过程中集合由于例如以下操作事件而处于风险中时，可能需要在过程中进行重新过滤：
a.)对免除了过滤步骤的先前过滤步骤进行不可接受的使用后滤器完整性测试。
b.)可能潜在损害储存容器完整性的设备问题(例如，阀门故障或排气过滤器安装不当)。
c.)超过清洁或蒸煮设备的有效保留时间。
不允许进行重新过滤以去除微生物污染或解决任何其他产品质量问题。
再加工
IL-22 Fc融合蛋白批次的再加工可在有限的情况下进行，如可以明确识别的设备故障。实例包括：
a.)不完整的柱床
b.)有缺陷的梯度泵
c.)对先前的过滤步骤进行的不可接受的使用后过滤器完整性测试，导致重复了过程说明中所述的过滤步骤(例如，深度过滤，纳滤[小型病毒截留滤器]或最终的IL-22 Fc融合蛋白过滤)。
通过重复这个部分中所述的一个或多个制造步骤进行了再加工。必须满足再加工步骤的所有相关IPC限制。
必须检查批次的质量，并证明不受再加工的影响。因此，必须满足所有IPC限制和释放规格。如果适用，评估再加工材料的扩展表征和稳定性，以排除质量影响。
充填和储存
将调节过的UFDF集合过滤至一次性使用的生物加工袋中，以产生IL-22 Fc融合蛋白，其储存在2℃-8℃，用于进一步加工，或冷冻，用于在≤-20℃下长期储存。IL-22 Fc融合蛋白可以储存在制造现场或根据运输程序在受控温度条件下转运至其他赞助商站点/合同制造组织站点，用于长期储存或用于IL-22 Fc融合蛋白药物组合物制造。
规格
用于IL-22 Fc融合蛋白的释放规格和可接受标准列于表27中。
表27：IL-22 Fc融合蛋白释放规格
Figure BDA0002603336170001511
实施例4：IL-22 Fc融合蛋白参照标准
这个实施例提供了关于使用参照标准批次No.1作为IL-22 Fc融合蛋白参照标准的数据。这个批次用于所有需要IL-22 Fc融合蛋白参照标准的释放和稳定性测定中。
在过程中样品测试，以及IL-22 Fc融合蛋白和IL-22 Fc融合蛋白药物组合物释放和稳定性测试中定性、定量和半定量使用参照标准，以验证一致的产品质量。适用时，参照标准还用于系统适合性。
使用合适的释放测试分析了每个参照标准批次，以证明适宜用作用于IL-22Fc融合蛋白的参照标准的可接受的组成、纯度和强度。
参照标准批次测试的结果在表28中提供，并基于释放参照批次时所采用的释放测试程序。参照标准批次1的效力分配为100％。相对于先前的参照，定量后续的参照标准批次，并分配新的活性(即新的相对效力值)。
表28：IL-22 Fc融合蛋白参照标准批次释放测试结果
Figure BDA0002603336170001521
CE-SDS-NGS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠无胶筛分；cIEF＝毛细管等电点聚焦；PA＝校正的峰面积；ELSD＝蒸发光散射检测仪；HMW＝高分子量；MALDI-TOF-PMF＝基质辅助激光解吸/电离飞行时间肽质量指纹打印；SE-HPLC＝大小尺寸高效液相色谱；UV光谱扫描＝紫外-可见光分光光度扫描。
实施例5：随着细胞培养持续时间的唾液酸水平的改变
评估了细胞培养持续时间对IL-22 Fc融合蛋白唾液酸水平的影响。如本文所述的产生了IL-22Fc融合蛋白(参见，例如，实施例3)。使用RP-HPLC在生产生物反应器中的培养过程中的多个时间点评估唾液酸水平。每摩尔二聚IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸水平随细胞培养持续时间的增加而降低(图20)。这些结果表明，对于10天的细胞培养持续时间，唾液酸含量为约8mol/mol，而在细胞培养12天之后，唾液酸含量为约6mol/mol。通过本文所述的纯化方法(参见例如实施例3)，例如使用亲和性色谱树脂，如MABSELECT
Figure BDA0002603336170001531
树脂，和多峰阴离子交换色谱，例如使用CAPTOTM粘附树脂，进一步富集唾液酸含量。因此，在生产生物反应器中使用10天的细胞培养持续时间用于生产阶段生产的IL-22 Fc融合蛋白的大约8mol/mol唾液酸含量通过本文所述的纯化可以富集至8至12mol/mol唾液酸(例如，8至9mol/mol唾液酸)。类似地，在生产生物反应器中使用12天的细胞培养持续时间用于生产阶段生产的IL-22 Fc融合蛋白的大约6mol/mol唾液酸含量通过如本文所述的纯化也可以富集至8至12mol/mol唾液酸(例如，8至9mol/mol唾液酸)。
这些数据证明了细胞培养持续时间，例如，在生产生物反应器中的培养持续时间，可以用作加工杠杆来调节如本文所述产生的IL-22 Fc融合蛋白的唾液酸含量。细胞培养持续时间可以结合本文所述的纯化过程使用，以富集具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸(例如，每摩尔IL-22 Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸)的平均唾液酸含量的IL-22 Fc融合蛋白组合物。
其他实施方案
可以根据任何以下编号的实施方案来限定本文所述技术的一些实施方案。
1.一种白介素(IL)-22 Fc融合蛋白，其包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
2.一种IL-22 Fc融合蛋白，其包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，所述IL-22 Fc融合蛋白具有约40％至约130％的效力，任选其中参照IL-22 Fc融合蛋白具有表12和/或表13中所示的N-聚糖分布。
3.实施方案2的IL-22 Fc融合蛋白，其中相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，所述IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约120％的效力。
4.实施方案2或3的IL-22 Fc融合蛋白，其中相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，所述IL-22 Fc融合蛋白具有约60％至约110％的效力。
5.实施方案2-4任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中相对于具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量的参照IL-22 Fc融合蛋白，所述IL-22 Fc融合蛋白具有约80％至约100％的效力。
6.实施方案2-5任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中在受体结合测定或基于细胞的结合测定中评估效力。
7.实施方案2-6任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
8.实施方案1或7的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约11摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
9.实施方案1或8的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
10.实施方案1，8或9的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
11.实施方案1或8-10任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。
12.实施方案1或8-10任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。
13.实施方案1或8-11任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。
14.实施方案1-13任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有约8,000ng/mL至约19,000ng/mL的最大观察浓度(Cmax)。
15.实施方案14的方法，其中将约1,000μg/kg的IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax。
16.实施方案1-15任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)。
17.实施方案16的方法，其中将约1,000μg/kg的IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估AUClast。
18.实施方案1-17任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有约40mL/kg/天至约140mL/kg/天的清除率(GL)。
19.实施方案18的IL-22 Fc融合蛋白，其中将约1,000μg/kg的IL-22 Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估CL。
20.实施方案1-19任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白是N糖基化的。
21.实施方案20的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含含有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。
22.实施方案21的IL-22 Fc融合蛋白，其中约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构。
23.实施方案22的IL-22 Fc融合蛋白，其中约0.5％至约1.5％的N-聚糖具有单触角结构。
24.实施方案23的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％的N-聚糖具有单触角结构。
25.实施方案21-24任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构。
26.实施方案25的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至约21％的N-聚糖具有双触角结构。
27.实施方案26的IL-22 Fc融合蛋白，其中约17％的N-聚糖具有双触角结构。
28.实施方案21-27任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约25％至约40％的N-聚糖具有三触角结构。
29.实施方案28的IL-22 Fc融合蛋白，其中约28％至约35％的N-聚糖具有三触角结构。
30.实施方案29的IL-22 Fc融合蛋白，其中约31％的N-聚糖具有三触角结构。
31.实施方案21-30任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约30％至约51％的N-聚糖具有四触角结构。
32.实施方案31的IL-22 Fc融合蛋白，其中约35％至约48％的N-聚糖具有四触角结构。
33.实施方案32的IL-22 Fc融合蛋白，其中约42％的N-聚糖具有四触角结构。
34.实施方案20-33任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包括包含零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。
35.实施方案34的IL-22 Fc融合蛋白，其中约9％至约32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。
36.实施方案35的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约25％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。
37.实施方案36的IL-22 Fc融合蛋白，其中约21％的N-聚糖包含零个半乳糖部分。
38.实施方案34-37任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。
39.实施方案38的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至约16％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。
40.实施方案39的IL-22 Fc融合蛋白，其中约14％的N-聚糖包含一个半乳糖部分。
41.实施方案34-40任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。
42.实施方案41的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约16％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。
43.实施方案42的IL-22 Fc融合蛋白，其中约13％的N-聚糖包含两个半乳糖部分。
44.实施方案34-43任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。
45.实施方案44的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约22％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。
46.实施方案45的IL-22 Fc融合蛋白，其中约19％的N-聚糖包含三个半乳糖部分。
47.实施方案34-46任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
48.实施方案47的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约25％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
49.实施方案48的IL-22 Fc融合蛋白，其中约24％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
50.实施方案20-49任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包括包含零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分的N-聚糖。
51.实施方案50的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至约35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。
52.实施方案51的IL-22 Fc融合蛋白，其中约20％至约30％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。
53.实施方案52的IL-22 Fc融合蛋白，其中约24％的N-聚糖包含零个唾液酸部分。
54.实施方案50-53任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。
55.实施方案54的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约25％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。
56.实施方案55的IL-22 Fc融合蛋白，其中约20％的N-聚糖包含一个唾液酸部分。
57.实施方案50-56任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。
58.实施方案57的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约25％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。
59.实施方案58的IL-22 Fc融合蛋白，其中约21％的N-聚糖包含两个唾液酸部分。
60.实施方案50-59任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。
61.实施方案60的IL-22 Fc融合蛋白，其中约12％至约24％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。
62.实施方案61的IL-22 Fc融合蛋白，其中约17％的N-聚糖包含三个唾液酸部分。
63.实施方案50-62任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约20％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
64.实施方案63的IL-22 Fc融合蛋白，其中约5％至约15％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
65.实施方案64的IL-22 Fc融合蛋白，其中约9％的N-聚糖包含四个唾液酸部分。
66.实施方案20-65任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含约0％至约10％的包含末端甘露糖部分的N-聚糖。
67.实施方案66的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约4％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。
68.实施方案67的IL-22 Fc融合蛋白，其中约2％的N-聚糖包含末端甘露糖部分。
69.实施方案20-68任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含约30％至约55％的包含末端N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)部分的N-聚糖。
70.实施方案69的IL-22 Fc融合蛋白，其中约35％至约50％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。
71.实施方案70的IL-22 Fc融合蛋白，其中约42％的N-聚糖包含末端GlcNAc部分。
72.实施方案69-71任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中N-聚糖包含一个、两个、三个或四个末端GlcNAc部分。
73.实施方案72的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。
74.实施方案73的IL-22 Fc融合蛋白，其中约5％至约15％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。
75.实施方案74的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分。
76.实施方案72-75任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。
77.实施方案76的IL-22 Fc融合蛋白，其中约5％至约15％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。
78.实施方案77的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分。
79.实施方案72-78任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约5％至约25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。
80.实施方案79的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约20％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。
81.实施方案80的IL-22 Fc融合蛋白，其中约14％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分。
82.实施方案72-81任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约0％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
83.实施方案82的IL-22 Fc融合蛋白，其中约4％至约12％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
84.实施方案83的IL-22 Fc融合蛋白，其中约7％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
85.实施方案20-84任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含约20％至约45％N-聚糖，其包含末端半乳糖(Gal)部分。
86.实施方案85的IL-22 Fc融合蛋白，其中约25％至约35％的N-聚糖包含末端Gal部分。
87.实施方案86的IL-22 Fc融合蛋白，其中约32％的N-聚糖包含末端Gal部分。
88.实施方案85-87任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中N-聚糖包含一个、两个或三个末端Gal部分。
89.实施方案88的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约30％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。
90.实施方案89的IL-22 Fc融合蛋白，其中约20％至约25％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。
91.实施方案90的IL-22 Fc融合蛋白，其中约23％的N-聚糖包含一个末端Gal部分。
92.实施方案88-91任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。
93.实施方案92的IL-22 Fc融合蛋白，其中约2％至约12％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。
94.实施方案93的IL-22 Fc融合蛋白，其中约7％的N-聚糖包含两个末端Gal部分。
95.实施方案88-94任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中约0.1％至约6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
96.实施方案95的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约3％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
97.实施方案96的IL-22 Fc融合蛋白，其中约2％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
98.实施方案20-97任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包括包含半乳糖N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖。
99.实施方案98的IL-22 Fc融合蛋白，其中约1％至约10％的N-聚糖包含LacNAc重复。
100.实施方案99的IL-22 Fc融合蛋白，其中约3％至约6％的N-聚糖包含LacNAc重复。
101.实施方案100的IL-22 Fc融合蛋白，其中约5％的N-聚糖包含LacNAc重复。
102.实施方案20-101任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包括包含岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。
103.实施方案102的IL-22 Fc融合蛋白，其中约60％至约80％的N-聚糖是岩藻糖基化的。
104.实施方案103的IL-22 Fc融合蛋白，其中约65％至约75％的N-聚糖是岩藻糖基化的。
105.实施方案104的IL-22 Fc融合蛋白，其中约70％的N-聚糖是岩藻糖基化的。
106.实施方案20-105任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包括包含无岩藻糖基化N-聚糖的N-聚糖。
107.实施方案106的IL-22 Fc融合蛋白，其中约10％至约30％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。
108.实施方案107的IL-22 Fc融合蛋白，其中约15％至约25％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。
109.实施方案108的IL-22 Fc融合蛋白，其中约20％的N-聚糖是无岩藻糖基化的。
110.实施方案1-109任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143上是糖基化的。
111.实施方案110的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽在在SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21、Asn35、Asn64和Asn143上是糖基化的。
112.实施方案110或111的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约70％至约90％。
113.实施方案112的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约75％至约85％。
114.实施方案113的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn21上的糖基化占有率为约82％。
115.实施方案111-114任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约90％至约100％。
116.实施方案115的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约95％至约100％。
117.实施方案116的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn35上的糖基化占有率为约100％。
118.实施方案111-117任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约90％至约100％。
119.实施方案118的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约95％至约100％。
120.实施方案119的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn64上的糖基化占有率为约100％。
121.实施方案111-120任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约15％至约45％。
122.实施方案121的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约25％至约35％。
123.实施方案122的IL-22 Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO：4的氨基酸残基Asn143上的糖基化占有率为约33％。
124.实施方案1-123任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中Fc区是未糖基化的。
125.实施方案124的IL-22 Fc融合蛋白，其中按照Fc区的EU索引的位置297的氨基酸残基为Glv。
126.实施方案124的IL-22 Fc融合蛋白，其中按照Fc区的EU索引的位置297的氨基酸残基为Ala。
127.实施方案124-126任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中按照Fc区的EU索引的位置299的氨基酸残基为Ala、Gly或Val。
128.实施方案1-127任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
129.实施方案128的IL-22 Fc融合蛋白，其中Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
130.实施方案1-129任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
131.实施方案130的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。
132.实施方案131的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
133.实施方案132的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
134.实施方案133的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
135.实施方案1-134任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
136.实施方案135的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
137.实施方案136的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成。
138.实施方案135的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
139.实施方案138IL-22的Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。
140.实施方案135的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
141.实施方案140的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。
142.实施方案124-141的IL-22 Fc融合蛋白，其中Fc区是未糖基化的。
143.实施方案1-142任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白是二聚IL-22 Fc融合蛋白。
144.实施方案1-142任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白是单体IL-22 Fc融合蛋白。
145.实施方案1-144任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽是人IL-22多肽。
146.实施方案145的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
147.实施方案1-146任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO：44)。
148.实施方案147的IL-22 Fc融合蛋白，其中接头由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQID NO：44)组成。
149.实施方案1-148任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22受体。
150.实施方案149的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22受体是人IL-22受体。
151.实施方案149或150的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1和/或IL-10R2。
152.实施方案151的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白结合IL-22RA1。
153.实施方案1-152任一个的IL-22 Fc融合蛋白，通过包括以下步骤的方法来产生：在适于IL-22 Fc融合蛋白表达的条件下培养能够表达IL-22 Fc融合蛋白的宿主细胞。
154.实施方案153的IL-22 Fc融合蛋白，其中所述方法进一步包括从细胞培养物或培养基获得IL-22 Fc融合蛋白的步骤。
155.实施方案153或154的IL-22 Fc融合蛋白，其中宿主细胞是CHO细胞。
156.实施方案1-155任一个的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白低于约5摩尔NGNA的NGNA含量。
157.实施方案156的IL-22 Fc融合蛋白，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白低于约1摩尔NGNA的NGNA含量。
158.一种药物组合物，其包含实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体。
159.实施方案158的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
160.实施方案158或159的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
161.实施方案158-160任一个的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
162.实施方案158-161任一个的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。
163.实施方案158-162任一个的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。
164.实施方案158-163任一个的药物组合物，其中唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。
165.实施方案158-164任一个的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
166.实施方案165的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
167.实施方案165的药物组合物，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
168.实施方案158-167任一个的药物组合物，进一步包含其他治疗剂。
169.实施方案158-168任一个的药物组合物，进一步包含胶凝剂。
170.实施方案169的药物组合物，其中胶凝剂是多糖。
171.实施方案169或170的药物组合物，其中胶凝剂是纤维素物质。
172.实施方案169-171任一个的药物组合物，其中胶凝剂是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、POE-POP嵌段聚合物、海藻酸盐、透明质酸、聚丙烯酸、羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。
173.实施方案172的药物组合物，其中胶凝剂是羟丙基甲基纤维素。
174.实施方案173的药物组合物，其中药物组合物是用于局部施用。
175.一种治疗需要其的对象中的炎性肠病(IBD)的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
176.实施方案175的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
177.实施方案176的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
178.实施方案177的方法，其中溃疡性结肠炎是中度至重度溃疡性结肠炎。
179.实施方案176的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
180.一种抑制需要其的对象的肠道中的微生物感染、在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞、增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
181.实施方案180的方法，其中上皮细胞是肠道上皮细胞。
182.一种治疗需要其的对象的急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
183.一种加速或促进需要其的对象中的创伤愈合的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-174任一个的药物组合物施用于对象。
184.实施方案183的方法，其中创伤是慢性创伤或受感染的创伤。
185.实施方案183或184的方法，其中对象是糖尿病的。
186.实施方案185的方法，其中糖尿病对象患有II型糖尿病。
187.实施方案183-186任一个的方法，其中创伤是糖尿病足溃烂。
188.实施方案183-187任一个的方法，其中施用IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物直至创伤完全闭合。
189.一种用于预防或治疗需要其的对象中的心血管病况的方法，所述病况包括动脉粥样硬化斑块形成的病理，所述方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
190.实施方案189的方法，其中心血管疾病是冠状动脉疾病、冠状微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病。
191.实施方案189或190的方法，进一步包括减缓动脉粥样硬化斑块形成的进程或预防脉粥样硬化的体征。
192.实施方案191的方法，其中动脉粥样硬化的体征包括斑块积聚和/或血管炎症。
193.一种用于治疗需要其的对象的代谢综合症的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
194.实施方案193的方法，进一步包括降低与代谢综合症相关的一种或多种风险因素，包括腹部肥胖、高血糖、血脂异常和高血压中的一种或多种。
195.实施方案193或194的方法，进一步包括降低对象中的细菌脂多糖的水平。
196.一种在需要其的对象中治疗急性内毒素血症、败血症或两者的方法，该方法包括将实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白或实施方案158-168任一个的药物组合物施用于对象。
197.实施方案193-196任一个的方法，其中对象需要改变HDL/LDL脂质谱。
198.实施方案175-197任一个的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
199.实施方案198的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约10摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
200.实施方案198或199任一个的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8至约9摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
201.实施方案198-200任一个的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约8摩尔唾液酸的唾液酸含量。
202.实施方案198-200任一个的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白约9摩尔唾液酸的唾液酸含量。
203.实施方案198-202任一个的方法，其中唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。
204.实施方案175-203任一个的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
205.实施方案204的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
206.实施方案204的方法，其中IL-22 Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
207.实施方案175-206任一个的方法，其中静脉内、皮下、腹膜内或局部施用IL-22Fc融合蛋白或药物组合物。
208.实施方案207的方法，其中静脉内施用IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物。
209.实施方案207的方法，其中皮下施用IL-22 Fc融合蛋白或药物组合物。
210.实施方案175-209任一个的方法，其中给对象共同施用至少一种其他治疗剂。
211.实施方案175-210任一个的方法，其中对象是人。
212.一种制备实施方案1-57任一个的IL-22 Fc融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码实施方案1-157任一个的IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞；
(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；
(c)将种子训练物接种于接种培养基中并在适于形成接种训练培养物的条件下培养；和
(d)在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得IL-22 Fc融合蛋白。
213.一种制备IL-22 Fc融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码IL-22 Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，所述IL-22 Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽；
(b)在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养宿主细胞；
(c)在适于形成接种训练培养物的条件下将种子训练物接种于接种培养基中；和
(d)在适于形成生产培养物的条件时间下在生产培养基中培养接种训练物，其中生产培养物的宿主细胞表达IL-22 Fc融合蛋白，由此制得IL-22 Fc融合蛋白，
其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。
214.实施方案212或213的方法，其中宿主细胞是冷冻宿主细胞，并且步骤(a)进一步包括在种子训练培养基中融化冷冻的宿主细胞。
215.实施方案212-214任一个的方法，其中该方法进一步包括在步骤(d)之前将接种训练物传代约1至约10次。
216.实施方案215的方法，其中在步骤(d)之前将接种训练物传代约2至约6次。
217.实施方案216的方法，其中在步骤(d)之前将接种训练物传代约2次。
218.实施方案212-217任一个的方法，其中种子训练培养基包含能够选择宿主细胞的选择剂。
219.实施方案218的方法，其中选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺、甲氨蝶呤或抗生素。
220.实施方案219的方法，其中选择剂是甲硫氨酸亚砜亚胺。
221.实施方案219的方法，其中选择剂是抗生素。
222.实施方案221的方法，其中抗生素选自杀稻瘟菌素、遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、霉酚酸或zeocin。
223.实施方案212-222任一个的方法，其中种子训练培养基、接种培养基和/或生产培养基包含消泡剂。
224.实施方案223的方法，其中消泡剂是西甲硅油乳剂、消泡剂204、消泡剂A、消泡剂B、消泡剂C、消泡剂Y-30或消泡剂SE-15。
225.实施方案224的方法，其中消泡剂是西甲硅油乳剂。
226.实施方案212-225任一个的方法，其中种子训练培养基、接种培养基和/或生产培养基包括缓冲剂、细胞保护剂、多糖和/或重量摩尔渗透压浓度调节剂。
227.实施方案212-225任一个的方法，其中步骤(b)在约25℃至约40℃的温度下进行。
228.实施方案227的方法，其中步骤(b)在约35℃至约39℃的温度下进行。
229.实施方案228的方法，其中步骤(b)在约37℃的温度下进行。
230.实施方案212-229任一个的方法，其中步骤(b)在旋转器、旋转管、摇瓶或种子训练生物反应器中进行。
231.实施方案230的方法，其中步骤(b)在种子训练旋转器、一次性使用的生物反应器(例如，WAVE BIOREACTORTM或
Figure BDA0002603336170001701
生物反应器(例如，
Figure BDA0002603336170001702
15生物反应器))，或摇瓶中进行。
232.实施方案231的方法，其中步骤(b)具有每个传代约1天至约12天的持续时间。
233.实施方案232的方法，其中步骤(b)具有每个传代约2天至约7天的持续时间。
234.实施方案230的方法，其中步骤(b)在种子训练生物反应器中进行。
235.实施方案234的方法，其中种子训练培养物的pH为约6至约8。
236.实施方案235的方法，其中种子训练培养物的pH为约6.5至约7.5。
237.实施方案236的方法，其中种子训练培养物的pH为约7.15。
238.实施方案234-237任一个的方法，其中种子训练培养物的溶解氧为约15％至约50％。
239.实施方案238的方法，其中种子训练培养物的溶解氧为约20％至约40％。
240.实施方案239的方法，其中种子训练培养物的溶解氧为约30％。
241.实施方案234-240任一个的方法，其中步骤(b)具有约1天至约10天的持续时间。
242.实施方案214的方法，其中步骤(b)具有约2天至约5天的持续时间。
243.实施方案212-242任一个的方法，其中步骤(c)在约25℃至约40℃的温度下进行。
244.实施方案243的方法，其中步骤(c)在约35℃至约39℃的温度下进行。
245.实施方案244的方法，其中步骤(c)在约37℃的温度下进行。
246.实施方案212-245任一个的方法，其中步骤(c)在一个或多个生物反应器中进行。
247.实施方案246的方法，其中步骤(c)在三个或四个生物反应器中进行。
248.实施方案246或247的方法，其中接种培养物的pH为约6至约8。
249.实施方案248的方法，其中接种培养物的pH为约6.5至约7.5。
250.实施方案249的方法，其中接种培养物的pH为约7.1。
251.实施方案246-250任一个的方法，其中接种培养物的溶解氧为约15％至约50％。
252.实施方案251的方法，其中接种培养物的溶解氧为约20％至约40％。
253.实施方案252的方法，其中接种培养物的溶解氧为约30％。
254.实施方案246-253任一个的方法，其中步骤(c)具有约1天至约5天的持续时间。
255.实施方案254的方法，其中步骤(c)具有约2天至约3天的持续时间。
256.实施方案212-255任一个的方法，其中步骤(d)包括从初始温度到转变后温度的温度转变。
257.实施方案256的方法，其中初始温度为约25℃至约40℃。
258.实施方案257的方法，其中初始温度为约35℃至约39℃。
259.实施方案258的方法，其中初始温度为约37℃。
260.实施方案256-259任一个的方法，其中转变后温度为约25℃至约40℃。
261.实施方案260的方法，其中转变后温度为约30℃至约35℃。
262.实施方案261的方法，其中转变后温度为约33℃。
263.实施方案256-262任一个的方法，其中温度转变在约12h至约120h的时间段中发生。
264.实施方案263的方法，其中温度转变在约48h至约96h的时间段中发生。
265.实施方案264的方法，其中温度转变在约72h的时间段中发生。
266.实施方案212-265任一个的方法，其中生产培养物的pH为约6至约8。
267.实施方案266的方法，其中生产培养物的pH为约6.5至约7.5。
268.实施方案267的方法，其中生产培养物的pH为约7.0。
269.实施方案212-268任一个的方法，其中步骤(d)在生产生物反应器中进行。
270.实施方案269的方法，其中生产培养物的溶解氧为约15％至约50％。
271.实施方案270的方法，其中生产培养物的溶解氧为约20％至约40％。
272.实施方案271的方法，其中生产培养物的溶解氧为约30％。
273.实施方案269-272任一个的方法，其中步骤(d)具有约5天至约25天的持续时间。
274.实施方案273的方法，其中步骤(d)具有约7天至约16天的持续时间。
275.实施方案274的方法，其中步骤(d)具有约12天的持续时间。
276.实施方案212-275任一个的方法，其中步骤(d)进一步包括通过营养物质补料将营养物质添加至生产培养物中。
277.实施方案212-276任一个的方法，其中宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
278.实施方案277的方法，其中宿主细胞是真核细胞。
279.实施方案278的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
280.实施方案279的方法，其中哺乳动物细胞是指中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
281.实施方案280的方法，其中CHO细胞是适应悬浮的CHO细胞。
282.实施方案212-281任一个的方法，进一步包括以下步骤：
(e)从生产培养物收获包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液。
283.实施方案282的方法，其中步骤(e)包括冷却生产培养物。
284.实施方案283的方法，其中步骤(e)包括将生产培养物冷却至约2℃至约8℃。
285.实施方案282-284任一个的方法，其中步骤(e)包括通过离心从生产培养基除去宿主细胞以形成细胞培养液。
286.实施方案285的方法，其中步骤(e)进一步包括过滤细胞培养液。
287.实施方案282-286任一个的方法，进一步包括以下步骤：
(f)纯化细胞培养液中的IL-22 Fc融合蛋白。
288.实施方案287的方法，其中步骤(f)包括以下子步骤：
(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；
(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和
(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。
289.实施方案288的方法，其中步骤(f)进一步包括以下子步骤：
(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合。
290.实施方案289的方法，其中步骤(f)进一步包括以下子步骤：
(v)将纯化的产品集合超滤。
291.实施方案290的方法，其中超滤包括用10kDa复合再生纤维素超滤膜过滤纯化的产品集合。
292.实施方案289-291任一个的方法，其中步骤(f)进一步包括以下子步骤：
(vi)交换浓缩产品集合的缓冲液，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合。
293.实施方案292的方法，其中浓缩产品集合的缓冲液交换为包含终浓度为0.01M磷酸钠，pH7.2的渗滤缓冲液。
294.实施方案292或293的方法，其中步骤(f)进一步包括以下子步骤：
(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22 Fc融合蛋白的UFDF集合。
295.实施方案288-294任一个的方法，其中子步骤(i)进一步包括在将细胞培养液接触亲和性柱之前通过将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒。
296.实施方案288-294任一个的方法，其中子步骤(i)包括通过将去污剂加入亲和性集合中来灭活病毒。
297.实施方案295或296的方法，其中去污剂是
Figure BDA0002603336170001741
X-100或
Figure BDA0002603336170001742
CG110。
298.实施方案295-297的方法，其中去污剂的终浓度为约0.01％至约2％(v/v)。
299.实施方案298的方法，其中去污剂的终浓度为约0.1％至约1％(v/v)。
300.实施方案299的方法，其中去污剂的终浓度为约0.3％至约0.5％(v/v)。
301.实施方案300的方法，其中去污剂的终浓度为约0.5％。
302.实施方案295-301任一个的方法，其中病毒灭活在约12℃至约25℃下进行。
303.实施方案288-302任一个的方法，其中灭活病毒具有超过约0.5h的持续时间。
304.实施方案288-303任一个的方法，其中亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂，或IL-22受体树脂。
305.实施方案304的方法，其中蛋白A树脂是MABSELECT
Figure BDA0002603336170001743
树脂。
306.实施方案288-305任一个的方法，其中洗涤缓冲液包含终浓度为0.4M的磷酸钾，pH7.0。
307.实施方案288-306任一个的方法，其中第一洗脱缓冲液包含终浓度0.3M盐酸L-精氨酸，0.013M磷酸钠，pH3.8。
308.实施方案288-307任一个的方法，其中阴离子交换色谱支持物包含含有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。
309.实施方案308的方法，其中阴离子交换色谱支持物包括CAPTOTM粘附树脂。
310.实施方案288-309任一个的方法，其中第一平衡缓冲液包含终浓度0.04M的醋酸钠，pH5.8。
311.实施方案288-310任一个的方法，其中第二洗脱缓冲液是梯度洗脱缓冲液。
312.实施方案311的方法，其中梯度洗脱缓冲液包含0.04M醋酸钠，pH5.8作为梯度洗脱缓冲液的缓冲液A；和0.04M醋酸钠、0.3M硫酸钠，pH5.8作为梯度的缓冲液B，其中梯度从10％的缓冲液B开始。
313.实施方案288-312任一个的方法，其中第二平衡缓冲液包含终浓度0.025M的MOPS，0.3M硫酸钠，pH7.0。
314.一种纯化IL-22 Fc融合蛋白的方法，该方法包括：
(a)提供包含IL-22 Fc融合蛋白的细胞培养液并任选灭活细胞培养液中的病毒；
(b)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，并用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；
(c)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22 Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和
(d)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22 Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。
315.实施方案314的方法，其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中IL-22 Fc融合蛋白具有每摩尔IL-22 Fc融合蛋白约8至约12摩尔唾液酸的唾液酸含量。
该说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式详细地描述了前述发明，但是这些描述和示例不应解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本文中，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确地并单独地指出通过引用并入。在发生冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。
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Claims (103)

1.一种包含白介素-22(IL-22)Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，和其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔范围内的平均唾液酸含量。
2.权利要求1的组合物，其中IL-22多肽是N-糖基化的。
3.权利要求1或2的组合物，其中IL-22多肽在对应于SEQ ID NO:4的Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143的氨基酸残基的一个或多个位置上是糖基化的。
4.一种包含IL-22Fc融合蛋白的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，其中IL-22多肽在对应于SEQ ID NO:4的Asn21、Asn35、Asn64和/或Asn143的氨基酸残基的一个或多个位置上是糖基化的，和其中：
(a)残基Asn21上的百分比N-糖基化位点占有率在70至90的范围内；
(b)残基Asn35上的百分比N-糖基化位点占有率在90至100的范围内；
(c)残基Asn64上的百分比N-糖基化位点占有率在90至100的范围内；和/或
(d)残基Asn143上的百分比N-糖基化位点占有率在25至35的范围内。
5.权利要求1-3任一项的组合物，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至9摩尔范围内的平均唾液酸含量。
6.权利要求4的组合物，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8或9摩尔的平均唾液酸含量。
7.权利要求1-5任一项的组合物，其中唾液酸糖基化包含N-乙酰神经氨酸(NANA)。
8.权利要求1-5任一项的组合物，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白低于1摩尔NGNA的平均N乙醇酰神经氨酸(NGNA)含量。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中组合物是液体组合物。
10.权利要求1-9任一项的组合物，其中：
(i)IL-22Fc融合蛋白具有约8,000ng/mL至约19,000ng的最大观察浓度(Cmax)；和/或
(ii)IL-22Fc融合蛋白具有约7,000天·ng/mL至约25,000天·ng/mL的从时间0至最后可测量时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUClast)；
和/或
(iii)约40mL/kg/天至约140mL/kg/天的清除率(CL)。
11.权利要求10的组合物，其中将约1,000μg/kg IL-22Fc融合蛋白静脉内施用于CD1小鼠后评估Cmax、AUClast和/或CL。
12.权利要求2-11任一项的组合物，其中IL-22多肽包含含有单触角、双触角、三触角和/或四触角结构的N-聚糖。
13.权利要求12的组合物，其中：
(i)约0.1％至约2％的N-聚糖具有单触角结构；
(ii)约10％至约25％的N-聚糖具有双触角结构；
(iii)约25％至约40％的N-聚糖具有三触角结构；和/或
(iv)约30％至约51％的N-聚糖具有四触角结构。
14.权利要求2-13任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包括包含零个、一个、两个、三个或四个半乳糖部分的N-聚糖。
15.权利要求14的组合物，其中：
(i)约9％至约32％的N-聚糖包含零个半乳糖部分；
(ii)约10％至约20％的N-聚糖包含一个半乳糖部分；
(iii)约8％至约25％的N-聚糖包含两个半乳糖部分；
(iv)约12％至约25％的N-聚糖包含三个半乳糖部分；和/或
(v)约12％至约30％的N-聚糖包含四个半乳糖部分。
16.权利要求2-15任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包括包含零个、一个、两个、三个或四个唾液酸部分的N-聚糖。
17.权利要求16的组合物，其中：
(i)约12％至约35％的N-聚糖包含零个唾液酸部分；
(ii)约10％至约30％的N-聚糖包含一个唾液酸部分；
(iii)约10％至约30％的N-聚糖包含两个唾液酸部分；
(iv)约10％至约30％的N-聚糖包含三个唾液酸部分；和/或
(v)约1％至约20％的N0聚糖包含四个唾液酸部分。
18.权利要求2-17任一项的组合物，其中(i)IL-22多肽包括约0％至约10％的包含末端甘露糖部分的N-聚糖；和/或(ii)IL-22多肽包括约30％至约55％的包含末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分的N-聚糖。
19.权利要求18的组合物，其中N-聚糖包含一个、三个、四个或四个末端GlcNAc部分。
20.权利要求19的组合物，其中：
(i)约1％至约20％的N-聚糖包含一个末端GlcNAc部分；
(ii)约1％至约20％的N-聚糖包含两个末端GlcNAc部分；
(iii)约5％至约25％的N-聚糖包含三个末端GlcNAc部分；和/或
(iv)约0％至约15％的N-聚糖包含四个末端GlcNAc部分。
21.权利要求2-20任一项的组合物，其中(i)IL-22多肽包括约20％至约45％的包含末端半乳糖(Gal)部分的N-聚糖；和/或(ii)N-聚糖包含一个、两个或三个末端Gal部分。
22.权利要求21的组合物，其中：
(i)约15％至约30％的N-聚糖包含一个末端Gla部分；
(ii)约1％至约15％的N-聚糖包含两个末端Gal部分；和/或
(iii)约0.1％至约6％的N-聚糖包含三个末端Gal部分。
23.权利要求2-22任一项的组合物，其中：(i)IL-22多肽包括包含N-乙酰葡糖胺(LacNAc)重复的N-聚糖；(ii)IL-22多肽包括包含岩藻糖基化的N-聚糖的N-聚糖；和/或(iii)IL-22多肽包括包含无岩藻糖基化的N-聚糖的N-聚糖。
24.权利要求1-23任一项的组合物，其中Fc区是未糖基化的。
25.权利要求24的组合物，其中：(i)按照Fc区的EU索引的位置297的氨基酸残基为Gly或Ala；和/或(ii)按照Fc区的EU索引的位置299的氨基酸残基为Ala、Gly或Val。
26.权利要求1-25任一项的组合物，其中Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
27.权利要求26的组合物，其中Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
28.权利要求1-27任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
29.权利要求1-28任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成。
30.权利要求1-29任一项的组合物，其中IL-22多肽是人IL-22多肽。
31.权利要求30的组合物，其中IL-22多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
32.权利要求1-31任一项的组合物，其中接头包括氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO:44)或由氨基酸序列RVESKYGPP(SEQ ID NO:44)组成。
33.权利要求1-32任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白结合IL-22受体。
34.权利要求33的组合物，其中IL-22受体是人IL-22受体。
35.权利要求34的组合物，其中人IL-22受体包含由IL-22R1多肽和IL-10R2多肽组成的杂二聚体。
36.权利要求35的组合物，其中IL-22R1多肽包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，而IL-10R2多肽包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
37.权利要求1-36任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白由两个链间二硫键连接的两个单链单元组成，其中每个单链单元由包含与人免疫球蛋白IgG4的Fc区融合的IL-22的人IL-22融合蛋白组成。
38.权利要求1-37任一项的组合物，其中组合物是药物组合物。
39.权利要求38的组合物，其中组合物是含水的和/或无菌的。
40.权利要求38或39的组合物，进一步包含其他治疗剂。
41.权利要求38-40任一项的组合物，进一步包括胶凝剂。
42.一种治疗需要其的对象中的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
43.权利要求42的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
44.权利要求43的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
45.权利要求44的方法，其中溃疡性结肠炎是中度至重度的溃疡性结肠炎。
46.权利要求43的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
47.一种包含权利要求1至41任一项的白介素(IL)-22Fc融合蛋白的组合物，用作药物。
48.一种包含权利要求1至41任一项的白介素(IL)-22Fc融合蛋白的组合物，用于
(i)治疗炎性肠病(IBD)；
(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，
(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，
(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，
(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，
(vi)治疗代谢综合症，或
(vii)治疗急性内毒素血症或败血症。
49.一种包含权利要求1至41任一项的白介素(IL)-22Fc融合蛋白的组合物的用途，用于制备用于以下情况中的药物
(i)治疗炎性肠病(IBD)；
(ii)抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，
(iii)治疗急性肾损伤或急性胰腺炎，
(iv)加速或促进需要其的对象中的创伤愈合，
(v)预防或治疗心血管疾病，如冠状动脉疾病、冠状动脉微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病或慢性肾病，
(vi)治疗代谢综合症，或
(vii)治疗急性内毒素血症或败血症。
50.一种在需要其的对象中抑制肠道中的微生物感染，在微生物感染期间在肠道中保留杯状细胞，增强肠道中的上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
51.一种治疗需要其的对象中的急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
52.一种加速或促进需要其的对象中的创伤愈合的方法，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
53.一种用于预防或治疗需要其的对象中的心血管病症的方法，所述病症包括动脉粥样硬化斑块形成的病理，，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
54.一种用于治疗需要其的对象中的代谢综合症的方法，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
55.一种治疗需要其的对象中的急性内毒素血症、败血症或两者的方法，所述方法包括将权利要求1-41任一项的组合物施用于对象。
56.权利要求42-55任一项的方法、组合物或用途，其中静脉内、皮下、腹膜内或局部施用组合物。
57.权利要求42-56任一项的方法、组合物或用途，其中给对象共同施用至少一种其他治疗剂。
58.一种制备包含IL-22Fc融合蛋白的组合物的方法，所述方法包括：
在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包含多个宿主细胞的接种训练培养物至少约10天，其中宿主细胞包含编码IL-22Fc融合蛋白的核酸，IL-22Fc融合蛋白包含通过接头连接Fc区的IL-22多肽，其中宿主细胞表达IL-22Fc融合蛋白，由此制得包含IL-22Fc融合蛋白的组合物，
其中IL-22多肽是糖基化的，并且其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量。
59.权利要求58的方法，其中培养持续至少11天、至少12天或至少13天。
60.权利要求58或59的方法，其中培养持续12天。
61.权利要求58-60任一项的方法，进一步包括在适于形成种子训练培养物的条件下在种子训练培养基中培养包含编码IL-22Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，接着在生产培养基中培养接种训练培养物。
62.权利要求61的方法，进一步包括在适于形成接种训练培养物的条件下在接种培养基中接种种子训练培养物，接着在生产培养基中培养接种训练培养物。
63.权利要求58-62任一项的方法，其中宿主细胞是真核宿主细胞。
64.权利要求63的方法，其中真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
65.权利要求64的方法，其中哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
66.权利要求58-65任一项的方法，进一步包括：
从生产培养物收获包含IL-22Fc融合蛋白的细胞培养液。
67.权利要求66的方法，其中收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
68.权利要求58-67任一项的方法，进一步包括：
纯化细胞培养液中的IL-22Fc融合蛋白。
69.权利要求68的方法，其中纯化IL-22Fc融合蛋白包括以下子步骤：
(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；
(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和
(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。
70.权利要求69的方法，其中纯化IL-22Fc融合蛋白进一步包括一个或多个以下的子步骤：
(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；
(v)将纯化的产品集合超滤；
(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或
(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22Fc融合蛋白的UFDF集合。
71.权利要求69或70的方法，其中子步骤(i)进一步包括在将细胞培养液接触亲和性柱之前通过将去污剂加入细胞培养液来灭活病毒。
72.权利要求58-71任一项的方法，其中所述方法进一步包括富集组合物的唾液酸含量。
73.权利要求72的方法，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白6至8摩尔唾液酸范围内的初始平均唾液酸含量。
74.权利要求72的方法，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白6、7或8摩尔的初始平均唾液酸含量。
75.权利要求72-74任一项的方法，其中所述方法包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围。
76.权利要求62-75任一项的方法，其中所述方法进一步包括将平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围。
77.权利要求70-76任一项的方法，其中亲和性色谱支持物包含蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。
78.权利要求77的方法，其中蛋白A树脂是MABSELECT
Figure FDA0002603336160000081
树脂。
79.权利要求70-78任一项的方法，其中阴离子交换色谱支持物包含含有多峰功能树脂的强阴离子交换剂。
80.权利要求79的方法，其中阴离子交换色谱支持物包含CAPTOTM粘附树脂。
81.权利要求58-80任一项的方法，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
82.权利要求58-81任一项的方法，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8或9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量。
83.权利要求58-82任一项的方法，其中IL-22Fc融合蛋白由通过两个链间二硫键连接的两个单链单元组成，其中每个单链单元由包含与人免疫球蛋白IgG4的Fc区融合的IL-222的人IL-22融合蛋白组成。
84.一种通过权利要求58-83任一项的方法产生的组合物。
85.权利要求84的组合物，其中组合物是药物组合物。
86.一种选择包含IL-22Fc融合蛋白的批次用于释放的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一个包含IL-22Fc融合蛋白的批次；
(b)评价该批次中唾液酸的水平；和
(c)如果该批次具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。
87.权利要求86的方法，其中步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。
88.权利要求86或87的方法，其中步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白8摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。
89.权利要求86或87的方法，其中步骤(c)包括如果该批次具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白9摩尔唾液酸的平均唾液酸含量，则选择该批次用于释放。
90.权利要求86-89任一项的方法，其中步骤(b)包括使用高性能液相色谱(HPLC)、超高性能液相色谱(UHPLC)、毛细管电泳，或比色测定，以评估该批次中的唾液酸水平。
91.权利要求90的方法，其中步骤(b)包括使用HPLC评估唾液酸水平。
92.一种用于控制包含IL-22Fc融合蛋白的组合物的唾液酸含量的方法，所述IL-22Fc融合蛋白包含通过接头连接抗体Fc区的糖基化IL-22多肽，所述方法包括：
在适于形成生产培养物的条件下在生产培养基中培养包含多个宿主细胞的接种训练培养物至少约10天，其中宿主细胞包含编码IL-22Fc融合蛋白的核酸并表达IL-22Fc融合蛋白，其中组合物具有每摩尔IL-22Fc融合蛋白6至12摩尔唾液酸范围内的平均唾液酸含量；和
将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至12摩尔唾液酸范围的平均唾液酸含量，由此控制组合物的唾液酸含量。
93.权利要求92的方法，其中所述方法包括将组合物的平均唾液酸含量富集至每摩尔IL-22Fc融合蛋白8至9摩尔唾液酸范围。
94.权利要求92或93的方法，其中富集平均唾液酸含量包括从生产培养物收获包含IL-22Fc融合蛋白的细胞培养液。
95.权利要求94的方法，其中收获细胞培养液包括：(i)冷却生产培养物；(ii)通过离心从生产培养基除去宿主细胞，以形成细胞培养液；和/或(iii)过滤细胞培养液。
96.权利要求94或95的方法，其中富集组合物的平均唾液酸含量包括纯化细胞培养液中的IL-22Fc融合蛋白。
97.权利要求96的方法，其中纯化IL-22Fc融合蛋白包括以下子步骤：
(i)将细胞培养液接触亲和性色谱支持物，任选用洗涤缓冲液洗涤亲和性色谱支持物，用第一洗脱缓冲液从亲和性色谱支持物洗脱IL-22Fc融合蛋白，以形成亲和性集合，和任选灭活亲和性集合中的病毒；
(ii)将亲和性集合接触阴离子交换色谱支持物，任选用第一平衡缓冲液洗涤阴离子交换色谱支持物，用第二洗脱缓冲液从阴离子交换色谱支持物洗脱IL-22Fc融合蛋白，以形成阴离子交换集合，和任选过滤阴离子交换集合，以除去病毒；和
(iii)将阴离子交换集合接触疏水性-相互作用色谱支持物并收集流过物，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的纯化产品集合，和任选用第二平衡缓冲液洗涤疏水性-相互作用色谱支持物，收集流过物，并将其加入纯化的产品集合中。
98.权利要求97的方法，其中纯化IL-22Fc融合蛋白包括一个或多个以下的子步骤：
(iv)浓缩纯化的产品集合，以形成浓缩的产品集合；
(v)将纯化的产品集合超滤；
(vi)更换浓缩的产物集合的缓冲液，以形成包含IL-22Fc融合蛋白的超滤和渗滤(UFDF)集合；和/或
(vii)用配制缓冲液调节UFDF集合，以形成调节过的包含IL-22Fc融合蛋白的UFDF集合。
99.权利要求97或98的方法，其中子步骤(i)进一步包括在将细胞培养液接触亲和性柱之前将去污剂加入细胞培养液中来灭活病毒。
100.权利要求97-99任一项的方法，其中亲和性色谱支持物包括蛋白A树脂、蛋白G树脂或IL-22受体树脂。
101.权利要求100的方法，其中蛋白A树脂是MABSELECT
Figure FDA0002603336160000101
树脂。
102.权利要求97-101任一项的方法，其中阴离子交换色谱支持物包含含有多峰功能树脂的强饮料交换剂。
103.权利要求102的方法，其中阴离子交换色谱支持物包括CAPTOTM粘附树脂。
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