ES2906615T3 - Tratamiento derivado de citocinas con síndrome de fuga vascular reducido - Google Patents

Tratamiento derivado de citocinas con síndrome de fuga vascular reducido Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica que comprende un conjugado para su uso en el tratamiento de un cáncer, una infección o un trastorno de inmunodeficiencia en un ser humano, en la que el conjugado se administra en una cantidad eficaz para inducir una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o mayor que la obtenida con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2), en la que dicho conjugado comprende: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma que tienen al menos el 10% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225 y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92,5% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo que tienen al menos el 10% de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleucina 15 humana y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; opcionalmente asociado con un portador farmacéuticamente aceptable, en la que la cantidad eficaz de dicho conjugado es de entre 2 y 200 pmol/kg, preferiblemente entre 8 y 200 pmol/kg y todavía preferiblemente entre 20 y 80 pmol/kg.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento derivado de citocinas con síndrome de fuga vascular reducido
Esta solicitud de patente internacional reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea EP 13002066.2 presentada el 19 de abril de 2013.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una nueva composición farmacéutica y a un método asociado para tratar un cáncer y/o una infección en un sujeto.
Antecedentes
En las últimas décadas se han desarrollado inmunoterapias para superar la incapacidad del sistema inmunitario para proteger eficazmente contra el establecimiento de tumores o microbios o rechazar tumores o microbios establecidos.
Entre las inmunoterapias, las basadas en citocinas son de interés particular. Estas moléculas, que son moléculas solubles, regulan la inmunidad humoral y/o celular. Entre ellas, IL-2, IL-7, IL-12 e IL-15 son de interés más particular puesto que inducen la supervivencia y/o proliferación de células NK; por tanto, son interesantes como adyuvantes para tratar una infección o un cáncer.
Como ejemplo, se ha mostrado que la rIL-2 humana da como resultado la remisión tumoral en el 25-30% de los pacientes con melanoma o carcinoma renal metastásicos. Al igual que la terapia intermitente con IL-2, también se usa en pacientes infectados por VIH en combinación con terapia antirretroviral altamente activa y restablece niveles protectores sostenidos de linfocitos T CD4+.
No obstante, el uso de tales citocinas está restringido debido a su toxicidad dependiente de la dosis, que se manifiesta particularmente como síndrome de fuga vascular (VLS), que se caracteriza por un aumento de la permeabilidad vascular y una disminución de la perfusión microcirculatoria, lo que conduce a edema intersticial e insuficiencia multiorgánica en el plazo de 2-24 h de la administración de IL-2.
El análisis del mecanismo de VLS inducido por citocinas ha demostrado la implicación de células NK inducidas por citocinas en algunas fases del VLS (ASSIER et al., Cytokines, vol. 32(6), págs.: 280-6, 2005). También se ha establecido la implicación de células T en VLS puesto que el VLS se acentúa por el agotamiento de células Treg (KOTTKE et al., Mol. Ther., vol. 16(7), págs.: 1217-26, 2008). Finalmente, en la actualidad, el uso de citocinas se limita a una inducción de proliferación de células NK máxima, para no inducir VLS inaceptable o letal.
El documento EP 2 511 294 se refiere a composiciones que pueden fomentar tanto la respuesta inmunitaria innata como la respuesta inmunitaria adaptativa en un sujeto basándose en el uso conjunto de ApoA, interleucina 15 y el dominio sushi de la cadena alfa del receptor de IL15, así como al uso de estas composiciones para la estimulación de la respuesta inmunitaria en un paciente y a métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplásicas.
El documento WO 2012/175222 se refiere a una inmunocitocina que comprende (a) un conjugado y (b) un anticuerpo o un fragmento del mismo unido directa o indirectamente por covalencia a dicho conjugado, en la que dicho conjugado comprende (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 o derivados de la misma y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15R^ o derivados del mismo; y a usos de la misma.
El documento US 2009/238791 se refiere a la estimulación de la ruta de señalización de IL-15Rbeta/gamma, para inducir y/o estimular de ese modo la activación y/o proliferación de células positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como células NK y/o T. Los compuestos apropiados incluyen compuestos que comprenden al menos una entidad de unión a IL-15Rbeta/gamma, unida directa o indirectamente por covalencia a al menos un polipéptido que contiene el dominio sushi de la región extracelular de un IL-15Ralfa.
Bessard et al. investigan la alta actividad tumoral de RLI, una proteína de fusión de interleucina 15-receptor alfa de interleucina 15, en melanoma y cáncer colorrectal metastásicos (Mol Cancer Ther. Septiembre de 2009; 8(9): 2736-45).
Debido a este requisito y a la seguridad problemática, en la actualidad, el uso de una dosis alta de citocinas se limita en realidad a infecciones crónicas y a cáncer metastásico avanzado.
Sumario de la invención
Ahora, los inventores han establecido sorprendentemente que su molécula (RLI), que comprende la secuencia de aminoácidos de hIL-15, muestra una seguridad muy diferente en comparación con la de iL-15 o IL-2 , siendo la seguridad de RLI mucho más favorable. Finalmente, sus resultados establecieron que RLI puede usarse en una ventana terapéutica que no es concebible ni para IL-2 ni para IL-15.
Esta seguridad permite el uso de una dosis alta de RLI para tratar enfermedades asociadas con un mal pronóstico y la dosis más baja de RLI para tratar enfermedades asociadas con un pronóstico correcto o bueno. La presente invención se define por las reivindicaciones. La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado para su uso en el tratamiento de un cáncer, una infección o un trastorno de inmunodeficiencia en un ser humano, en la que el conjugado se administra en una cantidad eficaz para inducir una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o mayor que la obtenida con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2), en la que dicho conjugado comprende:
a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma que tienen al menos el 10% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225 y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92,5% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y
b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo que tienen al menos el 10% de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleucina 15 humana y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92% con una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; opcionalmente asociado con un portador farmacéuticamente aceptable, en la que la cantidad eficaz de dicho conjugado es de entre 2 y 200 pmol/kg, preferiblemente entre 8 y 200 pmol/kg y todavía preferiblemente entre 20 y 80 pmol/kg.
Preferiblemente, el conjugado también se administra en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8 mayor que la obtenida con HDIL-2.
En otra realización preferida, dicho conjugado se administra al sujeto en una cantidad que induce una proliferación de células Treg (FoxP3+CD4+CD25alt°) que es menor que la obtenida con HDIL-2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado que va a administrarse a un sujeto que padece un cáncer, una infección o un trastorno inmunodeficiente, comprendiendo dicho método las etapas de:
i) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dicho sujeto con cantidades crecientes del conjugado definido anteriormente en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC;
ii) poner en contacto otras PBMC de dicho sujeto con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2) en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC; y
iv) seleccionar una cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado, induciendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz una proliferación de células NK de dichas PBMC que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2. Todavía preferiblemente, dicha cantidad de conjugado induce una razón de porcentaje de células NK y/o de células T CD8 proliferantes con respecto al de células Treg que es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el efecto de la dosis in vitro de RLI sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas en comparación con IL-2 e IL-15.
La figura 2 muestra el efecto in vitro de RLI sobre una subpoblación de Treg humanas en comparación con IL-2 e IL-15.
La figura 3 resume el protocolo de inyección de Mus musculus.
La figura 4 representa la proporción de células NK, células T CD8+, células T Foxp3+ CD4+ y células T Foxp3‘ CD4+ proliferantes en ratones en los que se inyecta PBS, IL-2, IL-15 o RLI.
La figura 5 representa la razón de células NK proliferantes con respecto a células T Foxp3+ (Treg) en ratones en los que se inyecta PBS, IL-2, IL-15 o RLI.
La figura 6 representa el porcentaje de células productoras de IFN y entre células NK, células T CD8+ y células T CD4+ y la citotoxicidad de células NK contra la línea celular YAC-1 para los ratones en los que se inyecta PBS, IL-2, IL-15 o RLI.
La figura 7 muestra los números de células totales de células de donante, células T CD8+ MP y células NK en ratones en los que se inyectan células de donante y PBS, IL-2, IL-15 o RLI.
La figura 8 representa el VLS en ratones en los que se inyectan células de donante y PBS, IL-2, IL-15 o RLI. La figura 9 representa la evolución del volumen tumoral dependiendo del régimen de citocinas.
La figura 10 representa la evolución observada y modelada de la concentración de RLI en sangre de macaco dependiendo de la dosis inyectada en función del tiempo.
La figura 11 representa el VLS frente a la proliferación de células NK y CD8 inducida en ratones en los que se inyecta PBS, IL-2, IL-15 y RLI.
La figura 12 muestra el efecto de proliferación in vitro en los días 3, 4, 5, 6 y 7 sobre células NK y sobre células T CD8 a partir de PBMC de donantes sanos de dosis equimolares de RLI, IL-2 e IL-15 en comparación con PBS. La figura 13 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre la expansión de células NK.
La figura 14 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre VLS en pulmón e hígado.
La figura 15 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre VLS en pulmón.
La figura 16 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre la expansión de células NK.
La figura 17 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre la expansión de células Treg.
La figura 18 representa el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre la razón de porcentaje de células Treg frente a NK.
La figura 19 representa la eficacia farmacológica frente a la toxicidad para RLI.
Descripción detallada
Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino o un primate, y lo más preferiblemente un ser humano.
El término “conjugado” se usa en su significado general en la técnica y se refiere a un complejo covalente o no covalente, preferiblemente a un complejo covalente y lo más preferiblemente a una proteína de fusión.
El término “interleucina 2” se usa en su significado general en la técnica (para las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos, véanse los números de registro NM_000586.3 y NP_000577.2, respectivamente).
La expresión “dosis alta de interleucina 2” o “HDIL-2” la conoce bien un experto. Una dosis alta de IL-2 (600.000— 720.000 UI/kg por vía i.v. cada 8 h) es el régimen más comúnmente usado en los Estados Unidos. Como ejemplo, la dosificación aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de carcinoma de células renales o melanoma metastásicos (cáncer con mediana de pronóstico de menos de 6 meses) es de 600.000 UI/kg administrada mediante un bolo i.v. a lo largo de 15 minutos cada 8 horas durante un máximo de 14 dosis. Tras 9 días de reposo, se repite el régimen, si lo tolera el paciente. Se han investigado regímenes subcutáneos de dosis baja de IL-2 (1-30 millones de UI/m 2/d) porque pueden reducir la toxicidad pero comprometen la eficacia (FYFE, FiSh ER y rOs ENBERG et al., J. Clin. Oncol., vol. 13, págs.: 688-696, 1995). La potencia biológica de PROLEUKIN® se determina mediante un bioensayo de proliferación de linfocitos y se expresa en unidades internacionales tal como establece la 1a norma internacional de la Organización Mundial de la Salud para la interleucina 2 (humana). La relación entre la potencia y la masa proteica es la siguiente: 18 millones de unidades internacionales de PROLEUKIN = 1,1 mg de proteína.
Debe observarse que las autoridades legales (por ejemplo, FDA, EMA, etc.) toleran muchos más efectos secundarios para los tratamientos de enfermedades mortales (por ejemplo, carcinoma de células renales o melanoma metastásicos) que aumentan la supervivencia del paciente en ausencia de tratamientos alternativos.
El término “interleucina 15” se usa en su significado general en la técnica y se refiere a una citocina con similitud estructural a IL-2 (GRABSTEIN et al., Science, vol. 264(5161), págs.: 965-968, 1994). Esta citocina también se conoce como IL-15, IL15 o MGC9721. Esta citocina e IL-2 comparten muchas actividades biológicas y se halló que se unían a subunidades comunes del receptor de hematopoyetina. Por tanto, pueden competir por el mismo receptor, regulando de manera negativa cada una la actividad de la otra. Se ha establecido que IL-15 regula la activación y proliferación de células T y linfocitos citolíticos naturales, y se muestra que el número de células de memoria CD8+ está controlado por un equilibrio entre esta citocina e IL2. La actividad de IL-15 puede medirse determinando su inducción de proliferación en la línea celular kit225 (HORI et al., Blood, vol. 70(4), págs.: 1069­ 72, 1987), tal como se divulga en los ejemplos.
Dicha IL-15 o derivados de la misma tienen al menos el 10% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225, preferiblemente al menos el 25% y más preferiblemente al menos el 50%.
Dicha interleucina 15 es una interleucina 15 de mamífero, preferiblemente una interleucina 15 de primate y más preferiblemente una interleucina 15 humana.
La interleucina 15 de mamífero puede identificarla de manera sencilla el experto. Como ejemplo, pueden citarse la interleucina 15 de Sus scrofa (número de registro ABF82250), de Rattus norvegicus (número de registro NP_037261), de Mus musculus (número de registro NP_032383), de Bos taurus (número de registro NP_776515), de Oryctolagus cuniculus (número de registro NP_001075685), de Ovies aries (número de registro NP_001009734), de Felis catus (número de registro NP_001009207), de Macaca fascicularis (número de registro BAA19149), de Homo sapiens (número de registro NP_000576), de Macaca mulatta (número de registro NP_001038196), de Cavia porcellus (número de registro NP_001166300) o de Chlorocebus sabaeus (número de registro ACI289).
Tal como se usa en el presente documento, el término “interleucina 15 de mamífero” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 1.
La interleucina 15 de primate puede identificarla de manera sencilla el experto. Como ejemplo, pueden citarse la interleucina 15 de Sus scrofa (número de registro ABF82250), de Oryctolagus cuniculus (número de registro NP_001075685), de Macaca fascicularis (número de registro BAA19149), de Homo sapiens (número de registro NP_000576), de Macaca mulatta (número de registro NP_001038196) o de Chlorocebus sabaeus (número de registro ACI289).
Tal como se usa en el presente documento, el término “interleucina 15 de primate” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 2.
La interleucina 15 humana puede identificarla de manera sencilla el experto y se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivados de interleucina 15” se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92,5% (es decir, correspondiente a aproximadamente 10 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, preferiblemente de al menos el 96% (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos) y más preferiblemente de al menos el 98,5% (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos), o de al menos el 99% (es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Tales derivados puede identificarlos de manera sencilla el experto en vista de su conocimiento personal y de las enseñanzas de la presente solicitud de patente. Como ejemplo de tales derivados, pueden citarse los descritos en la solicitud de patente internacional PCT WO 2009/135031. También se entenderá que los aminoácidos naturales pueden reemplazarse por aminoácidos químicamente modificados. Normalmente, tales aminoácidos químicamente modificados aumentan la semivida del polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento, “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de aminoácidos significa el porcentaje de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que van a compararse, obtenido con la mejor alineación de dichas secuencias, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando las diferencias entre estas dos secuencias dispersadas de manera aleatoria a lo largo de las secuencias de aminoácidos. Tal como se usa en el presente documento, “mejor alineación” o “alineación óptima” significa la alineación para la cual el porcentaje de identidad determinado (véase a continuación) es el más alto. La comparación de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realiza habitualmente comparando estas secuencias que previamente se han alineado según la mejor alineación; esta comparación se realiza en segmentos de comparación con el fin de identificar y comparar las regiones locales de similitud. La mejor alineación de secuencias para llevar a cabo la comparación puede realizarse, además de manualmente, usando el algoritmo de homología local desarrollado por SMITH y Wa TERMAN (Ad. App. Math., vol. 2, págs.: 482, 1981), usando el algoritmo de homología global desarrollado por NEEDLEMAN y WUNSCH (J. Mol. Biol., vol. 48, págs.: 443, 1970), usando el método de similitudes desarrollado por PEARSON y LIPMAN (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
85, págs.: 2444, 1988), usando un software informático que use tales algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EE.UU.), usando los algoritmos de alineación múltiple MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, págs.: 1792, 2004). Para conseguir la mejor alineación local, puede usarse preferiblemente el software BLAST con la matriz BLOSUM 62. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima, pudiendo englobar las secuencias de aminoácidos adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia con el fin de conseguir la alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre estas dos secuencias y dividiendo este número entre el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado obtenido por 100 para conseguir el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Preferiblemente, los derivados de interleucina 15 son agonistas o superagonistas de IL-15. Un experto en la técnica puede identificar de manera sencilla un agonista o superagonista de IL-15. Como ejemplo de agonista o superagonista de IL-15, pueden citarse los dados a conocer en la solicitud de patente internacional WO 2005/085282 o en ZHU et al. (J. Immunol., vol. 183(6), págs.: 3598-607, 2009).
Todavía preferiblemente, dicho agonista o superagonista de IL-15 se selecciona del grupo que comprende/que consiste en L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y y N72P (en referencia a la secuencia de IL-15 humana, SEQ ID NO: 3).
Tal como se usa en el presente documento, el término “el dominio sushi de IL-15Ra” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un dominio que comienza en el primer residuo de cisteína (C1) después del péptido señal de IL-15Ra y que termina en el cuarto residuo de cisteína (C4) después de dicho péptido señal. Dicho dominio sushi correspondiente a una porción de la región extracelular de IL-15Ra es necesario para su unión a IL-15 (WEI et al., J. Immunol., vol. 167(1), págs.: 277-282, 2001).
Dicho dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo tiene al menos el 10% de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleucina 15 humana, preferiblemente al menos el 25% y más preferiblemente al menos el 50%. Dicha actividad de unión puede determinarse de manera sencilla mediante el método dado a conocer en WEI et al. (anteriormente mencionado, 2001).
Dicho dominio sushi de IL-15Ra es el dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero, preferiblemente el dominio sushi de un IL-15Ra de primate y más preferiblemente el dominio sushi de IL-15Ra humano.
El dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero puede identificarlo de manera sencilla el experto. Como ejemplo, puede citarse el dominio sushi de un IL-15Ra de Rattus norvegicus (número de registro XP_002728555), de Mus musculus (número de registro EDL08026), de Bos taurus (número de registro XP_002692113), de Oryctolagus cuniculus (número de registro XP_002723298), de Macaca fascicularis (número de registro ACI42785), de Macaca nemestrina (número de registro ACI42783), de Homo sapiens (número de registro CAI41081), de Macaca mulatta (número de registro NP_001166315), de Pongo abelii (número de registro XP_002820541), de Cercocebus torquatus (número de registro ACI42784), de Callithrix jacchus (número de registro XP_002750073) o de Cavia porcellus (número de registro NP_001166314).
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 4.
Preferiblemente, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de un IL-15Ra de mamífero se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 5.
El dominio sushi de un IL-15Ra de primate puede identificarlo de manera sencilla el experto. Como ejemplo, pueden citarse los dominios sushi de IL-15Ra de Oryctolagus cuniculus, de Macaca fascicularis, de Macaca nemestrina, de Homo sapiens, de Macaca mulatta, de Pongo abelii, de Cercocebus torquatus o de Callithrix jacchus.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio sushi de un IL-15Ra de primate” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 6.
Preferiblemente, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de un IL-15Ra de primate se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 7.
El dominio sushi de IL-15Ra humano puede identificarlo de manera sencilla el experto y se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
Preferiblemente, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra humano se refiere a SEQ ID NO: 9.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivados del dominio sushi de IL-15Ra ” se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92% (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, preferiblemente de al menos el 96% (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos) y más preferiblemente de al menos el 98% (es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Tales derivados comprenden los cuatro residuos de cisteína del dominio sushi de IL-15Ra y puede identificarlos de manera sencilla el experto en vista de su conocimiento general y de las enseñanzas de la presente solicitud de patente. También se entenderá que los aminoácidos naturales pueden reemplazarse por aminoácidos químicamente modificados. Normalmente, tales aminoácidos químicamente modificados permiten aumentar la semivida del polipéptido.
Según una realización preferida, el conjugado comprende (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de IL-15Ra o derivados del mismo.
El dominio bisagra de IL-15Ra se define como la secuencia de aminoácidos que comienza en el primer residuo de aminoácido después del dominio sushi y que termina en el último residuo de aminoácido antes del primer posible sitio de glicosilación. En IL-15Ra humano, la secuencia de aminoácidos de la región bisagra consiste en los catorce aminoácidos que están ubicados después del dominio sushi de este IL-15Ralfa, en una posición C-terminal con respecto a dicho dominio sushi, es decir, dicha región bisagra de IL-15Ralfa comienza en el primer aminoácido después de dicho residuo de cisteína (C4) y termina en el decimocuarto aminoácido (contando en la orientación convencional “desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal”).
Dichos dominios sushi y bisagra de IL-15Ra son los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de mamífero, preferiblemente los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de primate y más preferiblemente los dominios sushi y bisagra de IL-15Ra humano.
La secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de mamífero puede identificarla de manera sencilla el experto. Tal como se usa en el presente documento, el término “dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de mamífero” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 10.
La secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de primate puede identificarla de manera sencilla el experto. Tal como se usa en el presente documento, el término “dominios sushi y bisagra de un IL-15Ra de primate” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 11.
La secuencia de aminoácidos de los dominios sushi y bisagra de IL-15Ra humano puede identificarla de manera sencilla el experto. Tal como se usa en el presente documento, el término “dominios sushi y bisagra de IL-15Ra humano” se refiere a la secuencia de consenso SEQ ID NO: 12.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivados de los dominios sushi y bisagra de IL-15Ra ” se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 93% (es decir, correspondiente a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, preferiblemente de al menos el 97% (es decir, correspondiente a aproximadamente 2 sustituciones de aminoácidos) y más preferiblemente de al menos el 98% (es decir, correspondiente a aproximadamente 1 sustitución de aminoácidos). Tales derivados comprenden los cuatro residuos de cisteína del dominio sushi de L-15Ra y puede identificarlos de manera sencilla el experto en vista de su conocimiento general y de las enseñanzas de la presente solicitud de patente. También se entenderá que los aminoácidos naturales pueden reemplazarse por aminoácidos químicamente modificados. Normalmente, tales aminoácidos químicamente modificados permiten aumentar la semivida del polipéptido.
Ambos polipéptidos a) y b) del conjugado pueden estar unidos de manera no covalente tal como en el complejo dado a conocer en la patente US 8.124.084 B2 y en la solicitud de patente internacional WO 2012/040323. Dicho conjugado o complejo puede obtenerse de manera sencilla proporcionando una cantidad adecuada del polipéptido a), proporcionando una cantidad adecuada del polipéptido b), mezclando ambos polipéptidos en condiciones iónicas y de pH adecuadas durante una duración suficiente para permitir la formación del complejo (es decir, el conjugado) y opcionalmente concentrando o purificando dicho complejo. Los polipéptidos del complejo (es decir, el conjugado) pueden formarse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos según métodos convencionales; expresando cada polipéptido por separado en una célula o en un extracto celular, después aislando y purificando el polipéptido. Opcionalmente, el complejo polipeptídico terapéutico de la invención puede formarse expresando ambos polipéptidos i) y ii) en la misma célula o extracto celular, después aislando y purificando los complejos, por ejemplo, usando técnicas cromatográficas, tales como cromatografía de afinidad, con anticuerpos contra la porción de linfocina, contra la porción de receptor de linfocina o contra el complejo.
Ambos polipéptidos a) y b) del conjugado también pueden unirse de manera covalente usando agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales o en una proteína de fusión.
El experto conoce bien los agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, así como sus métodos de uso, e incluyen, como ejemplos, (2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2 ,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-flúor activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
El término “proteína de fusión” se refiere a una proteína creada a través de la unión de dos o más genes que originalmente codificaban para proteínas independientes. También se conocen como proteína quimérica. La traducción de este gen de fusión da como resultado un único polipéptido con propiedades funcionales que se derivan de cada una de las proteínas originales. Las proteínas de fusión recombinantes se crean de manera artificial mediante tecnología de ADN recombinante para su uso en investigación biológica o en productos terapéuticos. Una proteína de fusión recombinante es una proteína creada a través de ingeniería genética de un gen de fusión. Esto implica normalmente retirar el codón de terminación de una secuencia de ADNc que codifica para la primera proteína, después unir la secuencia de ADNc de la segunda proteína en marco a través de PCR de extensión por solapamiento o ligación. A continuación, una célula expresará esa secuencia de ADN como proteína única. La proteína puede modificarse por ingeniería para incluir la secuencia completa de ambas proteínas originales, o sólo una porción de cualquiera de las mismas.
En una realización preferida, el conjugado es una proteína de fusión.
La secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma puede estar en una posición C-terminal o N-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 o derivados de la misma está en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo. La secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma y la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo pueden estar separadas por una secuencia de aminoácidos de “ligador”. Dicha secuencia de aminoácidos de “ligador” puede tener una longitud suficiente para garantizar que la proteína de fusión forma estructuras secundarias y terciarias apropiadas.
La longitud de la secuencia de aminoácidos de ligador puede variar sin afectar significativamente a la actividad biológica de la proteína de fusión. Normalmente, la secuencia de aminoácidos de ligador comprende al menos uno pero menos de 30 aminoácidos, por ejemplo, un ligador de 5-30 aminoácidos, preferiblemente de 10­ 30 aminoácidos, más preferiblemente de 15-30 aminoácidos, todavía más preferiblemente de 15­ 25 aminoácidos, lo más preferiblemente de 18-22 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de ligador preferidas son aquellas que permiten que el conjugado adopte una conformación apropiada (es decir, una conformación que permite una actividad de transducción de señales apropiada a través de la ruta de señalización de IL-15Rbeta/gamma).
Las secuencias de aminoácidos de ligador más adecuadas (1) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no mostrarán propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interaccionar con los dominios funcionales de las proteínas de fusión y (3) tendrá un carácter cargado o hidrófobo mínimo que podría fomentar la interacción con los dominios de proteína funcionales.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de ligador comprende aminoácidos casi neutros seleccionados del grupo que comprende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) y Gln (Q), lo más preferiblemente del grupo que comprende Gly (G), Asn (N) y Ser (S).
En las patentes estadounidenses n.os 5.073.627 y 5.108.910 se describen ejemplos de secuencias de ligador. Los ligadores flexibles ilustrativos que son más particularmente adecuados para la presente invención incluyen aquellos codificados por las secuencias SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID NO: 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) o SEQ ID NO: 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ) y SEQ ID NO: 16 (SGGSGGGGSGGGSGGGGS).
En una realización todavía preferida, el conjugado corresponde a una proteína de fusión con la secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a composiciones y entidades moleculares que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen reacciones alérgicas o indeseables similares, tales como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, tal como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa que puede estar aprobado por una agencia regulatoria del gobierno federal o estatal o indicado en la farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
El término “portador” se refiere a un disolvente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Tales portadores farmacéuticos puede ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares.
La vía de administración de la combinación de la invención es preferiblemente parenteral; tal como se usa en el presente documento, el término “parenteral” incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Por tanto, la composición farmacéutica contiene vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación destinada a inyectarse. Estos pueden ser, en particular, soluciones salinas estériles isotónicas (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de disoluciones inyectables. En “Remington's Pharmaceutical Sciences” de E.W. Martin se describen portadores farmacéuticos adecuados.
De estas, la administración intravenosa es la más preferida.
El conjugado puede solubilizarse en un tampón o agua o incorporarse en emulsiones, microemulsiones, hidrogeles (por ejemplo, hidrogeles a base de copolímeros de tribloque de PLGA-PEG-PLGA), en microesferas, en nanoesferas, en micropartículas, en nanopartículas (por ejemplo, micropartículas de poli(ácido láctico-coglicólico) (por ejemplo, poli(ácido láctico) (PLA); poli(lactida-co-ácido glicólico) (PLGA); microesferas, nanoesferas, micropartículas o nanopartículas de poliglutamato), en liposomas u otras formulaciones galénicas. En todos los casos, la formulación debe ser estéril y fluida en la medida en que tenga una inyectabilidad aceptable. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
El conjugado puede formularse en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
El portador también puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Los conjugados de la invención también pueden modificarse, por ejemplo, mediante pegilación, para aumentar su biodisponibilidad.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio.
La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso de agentes que retardan la absorción en las composiciones, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina, polioles, formulaciones covalentes y no covalentes de que potencian la semivida.
Existen numerosas causas de inestabilidad o degradación de péptidos, incluyendo la hidrólisis y la desnaturalización. La interacción hidrófoba puede provocar la aglutinación de moléculas entre sí (es decir, la agregación). Pueden añadirse estabilizadores para reducir o prevenir tales problemas.
Los estabilizadores incluyen ciclodextrina y derivados de la misma (véase la patente estadounidense n.° 5.730.969). También pueden añadirse conservantes adecuados tales como sacarosa, manitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina para estabilizar la formulación final. Puede añadirse a la formulación un estabilizador seleccionado de tensioactivos iónicos y no iónicos, D-glucosa, D-galactosa, D-xilosa, ácido D-galacturónico, trehalosa, dextranos, hidroxietilalmidones y mezclas de los mismos. La adición de sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar un péptido. El péptido también puede estabilizarse poniéndolo en contacto con un sacárido seleccionado del grupo que consiste en dextrano, ácido condroitin-sulfúrico, almidón, glicógeno, dextrina y sal de ácido algínico. Otros azúcares que pueden añadirse incluyen monosacáridos, disacáridos, alcoholes de azúcar y mezclas de los mismos (por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un péptido y son miscibles en agua o solubles en agua. Polioles adecuados pueden ser alcoholes polihidroxilados, monosacáridos y disacáridos incluyendo manitol, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, trimetilglicol, vinilpirrolidona, glucosa, fructosa, arabinosa, manosa, maltosa, sacarosa y polímeros de los mismos. Diversos excipientes también pueden estabilizar los péptidos, incluyendo albúmina sérica, aminoácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensioactivos, metales, polioles, agentes reductores, agentes quelantes de metales, polivinilpirrolidona, gelatina hidrolizada y sulfato de amonio.
En el contexto de la invención, el término “tratar”, tal como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir la evolución de o prevenir el trastorno o estado al que se aplica tal término, o uno o más síntomas de tal trastorno o estado.
El término “tratamiento del cáncer”, tal como se usa en el presente documento, significa la inhibición del crecimiento de células cancerosas. Preferiblemente, tal tratamiento también conduce a la remisión del crecimiento tumoral, es decir, la reducción del tamaño de un tumor medible. Lo más preferiblemente, tal tratamiento conduce a una remisión completa del tumor.
El término “tratamiento de una infección”, tal como se usa en el presente documento, significa la inhibición de la replicación/proliferación de microbios.
El término “tratamiento de un trastorno de inmunodeficiencia”, tal como se usa en el presente documento, significa la inducción de células NK y/o células T.
Una “cantidad eficaz” del conjugado es una cantidad que es suficiente para inducir la remisión del crecimiento tumoral o de la replicación de microbios. Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros, en particular, en función del modo de administración usado, de la patología relevante o, alternativamente, de la duración deseada del tratamiento. Naturalmente, la forma de la composición farmacéutica, la vía de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente del estado que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del sujeto, etc. No se pretende que los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación limiten la invención y representan intervalos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosis preferida puede ajustarse al sujeto individual, tal como entiende y puede determinar un experto en la técnica sin experimentación excesiva.
Dada la importantísima seguridad del conjugado de la invención, puede contemplarse su administración para el tratamiento de un cáncer, una infección y un trastorno de inmunodeficiencia con una importantísima ventana terapéutica, lejos de la restringida ventana terapéutica de IL-2 y también de la ventana terapéutica prevista para IL-15.
Esta seguridad permite prever el uso de 1) una dosis muy alta de RLI para tratar una enfermedad crónica con un mal pronóstico (por ejemplo, adenocarcinoma renal o melanoma metastásicos) y 2) una dosis baja de RLI para tratar una enfermedad con un buen pronóstico.
La cantidad administrada también induce una proliferación de células T CD8 que es mayor que la obtenida con HDIL-2.
Como ilustración, una cantidad eficaz del al menos un conjugado es mayor de 40 fmol/kg o 0,2 pmol/kg (1 ng/kg o 5 ng/kg), preferiblemente mayor de 1 pmol/kg o 2 pmol/kg (25 ng/kg o 50 ng/kg) y todavía preferiblemente mayor de 4 pmol/kg (100 ng/kg), 20 pmol/kg (500 ng/kg) o incluso mayor de 40 pmol/kg (1 mcg/kg). Son viables otras dosificaciones, puesto que pueden influir el peso molecular y la actividad del conjugado de las mismas. Al experto en la técnica se le atribuye fácilmente la determinación de una dosificación adecuada que se encuentre dentro de los intervalos o, si es necesario, fuera de los intervalos.
Como otra ilustración, una cantidad eficaz del al menos un conjugado corresponde a una concentración en sangre mayor de 4 fmol/ml (0,1 ng/ml), preferiblemente mayor de 40 u 80 fmol/ml (1 ó 2 ng/ml) y todavía preferiblemente mayor de 0,160 pmol/ml (4 ng/ml).
Ventajosamente, la cantidad administrada del al menos un conjugado es menor de 2,4 nmol/kg (60 mcg/kg), preferiblemente menor de 2 nmol/kg (50 mcg/kg) o 1,2 nmol/kg (30 mcg/kg) y todavía preferiblemente menor de 1.0 nmol/kg (25 mcg/kg) o incluso menor de 200 pmol/kg (5 mcg/kg).
Todavía ventajosamente, la cantidad administrada del al menos un conjugado corresponde a una concentración en sangre de menos de 0,12 nmol/ml (3.000 ng/ml), preferiblemente menos de 80 ó 40 pmol/ml (2.000 ó 1.000 ng/ml) y todavía preferiblemente menos de 20 pmol/ml (500 ng/ml) o incluso menos de 12 pmol/ml (300 ng/ml).
La cantidad administrada también induce una proliferación de células T CD8 que es mayor que la obtenida con HDIL-2.
En una primera realización preferida, el conjugado se usa para tratar a un sujeto que padece una enfermedad asociada con un mal pronóstico.
Tal como se usa en el presente documento, una enfermedad asociada con un mal pronóstico es una enfermedad en la que la mediana de pronóstico es menor de 2 años, preferiblemente menor de 1 año y todavía preferiblemente menor de 6 meses.
Tal como se usa en el presente documento, una enfermedad asociada con un mal pronóstico es un cáncer avanzado (grado IV del TNM) o uno metastásico.
En dicha realización, el conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células Nk ) que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2.
En dicha realización, el conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8+ que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Como ilustración, una cantidad eficaz del al menos un conjugado está comprendida entre 24 y 2.400 pmol/kg (entre 0,6 y 60 mcg/kg), preferiblemente entre 28 y 800 pmol/kg (entre 0,7 y 20 mcg/kg) y todavía preferiblemente entre 32 y 400 pmol/kg (entre 0,8 y 10 mcg/kg).
Como otra ilustración, el conjugado se administra en una cantidad correspondiente a una concentración en sangre comprendida entre 0,4 pmol/ml y 0,12 nmol/ml (entre 10 ng/ml y 3.000 ng/ml), preferiblemente entre 0,48 pmol/ml y 40 pmol/ml (entre 12 ng/ml y 1.000 ng/ml) y todavía preferiblemente entre 0,6 y 20 pmol/ml (entre 15 y 500 ng/ml).
En una segunda realización preferida, dicho conjugado se usa para tratar a un sujeto que tiene un buen pronóstico.
Tal como se usa en el presente documento, una enfermedad asociada con un buen pronóstico es una enfermedad en la que la mediana de pronóstico es de más de 3 años, preferiblemente más de 4 años y todavía preferiblemente más de 5 años.
Tal como se usa en el presente documento, una enfermedad asociada con un buen pronóstico es un cáncer no metastásico, preferiblemente un cáncer de grado I, II o III del TNM, o una infección.
En dicha realización, el conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o como máximo el 50 o el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 20% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 10% mayor que la obtenida con HDIL-2.
En dicha realización, el conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8+ que es la misma o como máximo el 200% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 150% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 100% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Como ilustración, una cantidad eficaz del al menos un conjugado está comprendida entre 2 y 200 pmol/kg (entre 50 y 5.000 ng/kg), preferiblemente entre 8 y 200 pmol/kg (entre 200 y 5.000 ng/kg) y todavía preferiblemente entre 20 y 80 pmol/kg (entre 500 y 2.000 ng/kg).
Como otra ilustración, el conjugado se administra en una cantidad correspondiente a una concentración en sangre comprendida entre 40 fmol/ml y 12 pmol/ml (entre 1 ng/ml y 300 ng/ml), preferiblemente entre 80 fmol/ml y 12 pmol/ml (entre 2 ng/ml y 300 ng/ml) y todavía preferiblemente entre 0,16 y 4 pmol/ml (entre 4 y 100 ng/ml).
Todavía sorprendentemente, los inventores establecieron que dicha inducción de células NK del derivado de IL-15 se obtiene con una inducción de células T reguladoras inferior a la obtenida con HDIL-2.
En una tercera realización preferida, dicho conjugado se administra al sujeto en una cantidad que induce una proliferación de células Treg (FoxP3+CD4+CD25alt°) que es menor que la obtenida con HDIL-2.
Ventajosamente, el conjugado se administra al sujeto en una cantidad que induce una proliferación de células Treg que es al menos el 5% menor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 10 o el 20% menor; y todavía preferiblemente al menos el 50% menor que la obtenida con HDIL-2.
Por consiguiente, la inducción de células NK y CD8 obtenida con el derivado de IL-15 es mucho más eficaz que la inducida por HDIL-2 debido a la inducción de células T reguladoras más pequeña.
Preferiblemente, el conjugado se administra al sujeto en una cantidad cuya razón de porcentaje inducido de células NK proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Preferiblemente, el conjugado se administra al sujeto en una cantidad cuya razón de porcentaje inducido de células T CD8 proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2.
La introducción del conjugado en estos intervalos de dosis puede llevarse a cabo como tratamiento único o a lo largo de una serie de tratamientos. En efecto, mientras que una dosificación única proporciona beneficios y puede usarse eficazmente para el tratamiento/la gestión de una enfermedad, un transcurso de tratamiento preferido puede producirse a lo largo de varias etapas; lo más preferiblemente, dicha cantidad administrada corresponde a una cantidad administrada diaria. Esta cantidad puede administrarse una vez al día durante entre uno y 20 días, tal como entre uno y 10 días, preferiblemente entre 2 y 5 días y lo más preferiblemente entre 2 y 4 días. Ahora, la cantidad administrada puede estar en una forma de larga duración que da como resultado una administración a largo plazo con una concentración en sangre diaria de conjugado similar.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado que va a administrarse a un sujeto que padece un cáncer, una infección o un trastorno inmunodeficiente, comprendiendo dicho método las etapas de:
i) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dicho sujeto con cantidades crecientes del conjugado definido anteriormente en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC;
ii) poner en contacto otras PBMC de dicho sujeto con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2) en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC; y
iv) seleccionar una cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado, induciendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado una proliferación de células NK de dichas PBMC que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2.
Preferiblemente, dicha cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado induce una proliferación de células T CD8 de dichas PBMC que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2.
Dicha cantidad terapéuticamente eficaz seleccionada está adaptada para tratar un cáncer, una infección o un trastorno inmunodeficiente en dicho sujeto.
Todavía preferiblemente, dicha cantidad terapéuticamente eficaz está asociada con una razón de porcentaje inducido de células NK y/o de células T CD8 proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes que es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL- 2.
Ahora, dicha cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado induce una proliferación de células NK y/o T CD8 que es al menos el 50% mayor que la obtenida con el medio de cultivo sin conjugado (es decir, sin HDIL-2 ni tampoco IL-15).
El experto conoce bien las condiciones de cultivo que permiten la proliferación de PBMC en presencia de HDIL-2 y se describen en los ejemplos.
Las cantidades crecientes de conjugado corresponden a una concentración de conjugado comprendida entre 4 fmol/ml y 120 pmol/ml (entre 0,1 y 3.000 ng/ml), preferiblemente entre 40 fmol/ml y 80 pmol/ml (entre 1 y 2.000 ng/ml) y todavía preferiblemente entre 80 fmol/ml y 40 pmol/ml (entre 2 y 1.000 ng/ml).
La HDIL-2 la conoce bien un experto y corresponde a la incubación de PBMC con 50 UI/ml (MURPHY, WELNIAK, BACK et al., J. Immunol., vol. 170, págs.: 2727-33, 2003; ITOH et al., Cancer Immunol. Immunother., vol. 32(2), págs.: 88-94, 1990; ETTINGHAUSEN y ROSENBERG, Cancer Res., vol. 46(6), págs.: 2784-92, 1986). En una primera realización preferida, dicho sujeto padece una enfermedad asociada con un mal pronóstico. En dicha realización, la etapa iii) corresponde a la selección de una cantidad de conjugado que induce una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK), proliferación que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Preferiblemente, la etapa iii) también corresponde a la selección de una cantidad de conjugado que induce una proliferación de células T CD8, proliferación que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2.
En una segunda realización preferida, dicho conjugado se usa para tratar a un sujeto que tiene un buen pronóstico.
En dicha realización, la etapa iii) corresponde a la selección de una cantidad de conjugado que induce una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o como máximo el 50 o el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 20% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 10% mayor que la obtenida con HDIL-2.
Preferiblemente, la etapa iii) también corresponde a la selección de una cantidad de conjugado que induce una proliferación de células T CD8, proliferación que es la misma o como máximo el 200% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 150% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 100% mayor que la obtenida con HDIL-2.
En una tercera realización preferida, el método de la invención comprende además la etapa de:
iii) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dicho sujeto con cantidades equimolares crecientes de IL-15 en comparación con el conjugado en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC.
A continuación, la invención se describe con más detalle con referencia a secuencias de aminoácidos, secuencias de ácido nucleico y ejemplos. Sin embargo, los detalles de los ejemplos no pretenden limitar la invención. Más bien, la invención se refiere a cualquier realización que comprenda detalles que no se mencionen explícitamente en los ejemplos en el presente documento, pero que el experto halle sin un esfuerzo excesivo. Ejemplos
Para determinar la eficiencia de RLI, en primer lugar se usó un modelo in vitro correspondiente a células NK y T CD8 purificadas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de donantes sanos humanos.
1) Inducción de proliferación de linfocitos humanos mediante RLI
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de voluntarios sanos mediante gradiente de FICOLL-HYPAQUE (LYMPHOPREP™; 1,077 g/ml). La sangre de donantes se obtuvo según el acuerdo de ética oficial.
En resumen, se marcan PBMC con 2,5 |iM de CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína) durante 5 minutos y se lavan con NaCl. A continuación, se incuban PBMC durante de tres a siete días a 37°C en el 95% de aire humidificado y el 5% de CO2. Se recogen las células y se tiñen con anticuerpo anti-CD3, CD4, CD8, CD56 y LIVE/DEAD® Fixable Aqua para seleccionar las células viables. Se adquieren las células teñidas inmediatamente en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD BIOSCIENCES) y se realizaron análisis usando el software FLOWJO (TREE STAR).
Se cultivaron 2 * 105 PBMC por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos en 100 |il de medio completo (RPMI 1640 suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10% L-glutamina al 1% aminoácidos no esenciales al 1% piruvato de sodio al 1% penicilina-estreptomicina al 1%). A continuación, se añadieron al cultivo 100 |il de medio 2X para obtener una concentración final de 2,5 pg/ml, 25 pg/ml, 250 pg/ml, 2,5 ng/ml o 25 ng/ml de RLI (SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18) producida en células CHO.
Como control negativo, se incubaron PBMC con un medio de cultivo.
Como control positivo, se incubaron PBMC con 50 UI/ml (3 ng/ml) de IL-2 humana (PROLEUKIN, NOVARTIS PHARMA), siendo dicha cantidad equivalente a una dosis alta de IL-2 para su uso en seres humanos (MURPHY, WELNIAK, BACK et al., J. Immunol., vol. 170, págs.: 2727-33, 2003; iTo H et al., Cancer Immunol. Immunother., vol. 32(2), págs.: 88-94, 1990; ETTINGHAUSEN y ROSENBERG, Cancer Res., vol. 46(6), págs.: 2784-92, 1986). Como control positivo también se usaron 2,5 ng/ml de IL-15 humana recombinante (CELLGENIX, PRECLINICAL CELLGRO®) correspondiente a la misma molaridad que HDIL-2.
Se determinaron los porcentajes de células NK, células T CD8+ y células T CD4+ proliferantes diariamente desde el día 3 hasta el día 7 mediante dilución con CFSE.
La figura 1 muestra el efecto de la dosis in vitro de RLI sobre células mononucleares de sangre periférica humanas (A). Se tiñeron PBMC humanas con CFSE en el día 0 y después se trataron durante 4 y 7 días con concentraciones crecientes de dosis de RLI (2,5; 25; 250; 2500 y 25000 pg/ml). En el día 4 y el día 7, se recogieron PBMC, se tiñeron y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células de control no tratadas se incubaron simultáneamente en medio solo. Después de la exclusión de células muertas y dobletes, las células CD3' CD56+ se consideran como células NK, las células CD3+ CD8+ se consideran como células T CD8+ y las células CD3- CD4+ se consideran como células T CD4+. La proporción de células NK (panel izquierdo), células T CD8+ (panel central) y células T CD4+ (panel derecho) proliferantes se presentan en el panel superior A. La figura 1B muestra la capacidad proliferativa de RLI, rhIL-15 y rhIL-2. Se trataron PBMC humanas durante 4 y 7 días con RLI a 2,5 ng/ml, rhIL-15 a 2,5 ng/ml y rhIL-2 a 50 UI/ml (3 ng/ml). Los datos sin procesar se resumen en la tabla 1 (células NK), la tabla 2 (células T CD8+) y la tabla 3 (células T CD4+).
Tabla 1
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Tabla 2
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Tabla 3
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Los resultados muestran que, tal como se muestra en las tablas 1 a 3 y en la figura 1, RLI puede inducir cierta proliferación in vitro con una dosis de tan sólo 25 pg/ml (1 fmol/ml) para células NK y 250 pg/ml para células T CD8+.
Tal como se muestra en las tablas 1 y 2, a las dosis de 25 y 250 pg/ml, RLI induce una proliferación de células NK y células T CD8+, respectivamente, equivalente a 2.500 pg/ml de rhIL-15 durante los primeros días. Considerando la proliferación en el día 7, RLI indujo una proliferación de células NK el 300% mayor que rhIL-15 a una dosis de 250 pg/ml (10 veces menor que rhIL-15) y el 50% mayor a una dosis de 25 pg/ml (100 veces menor que rhIL-15). En el mismo día, RLI indujo una proliferación de células CD8+ el 100% mayor que rhIL-15 a una dosis de 25 pg/ml (100 veces menor que rhIL-15). Por tanto, considerando estos parámetros, RLI es de 10 a 100 veces más bioactivas que rhIL-15.
Por el contrario, RLI a las dosis de 250 y 2500 pg/ml mostró una mayor capacidad proliferativa en comparación con 3.000 pg/ml de IL-2 para células NK y T c D8+, respectivamente (obsérvese que una dosificación equimolar de IL-2 habría sido de 150 a 1500 pg/ml, es decir, de 3 a 30 UI/ml). En células NK, los resultados muestran que RLI indujo una proliferación de células NK el 30% mayor que rhIL-2 pero a una dosis de 25 pg/ml (100 veces menor que rhIL-2) y equivalente a 2,5 pg/ml (1.000 veces menor que rhIL-2). En células T CD8+, la eficiencia de RLI es casi el 400% mayor que rhIL-2 a una dosis de 250 pg/ml, el 100% mayor a una dosis de 25 pg/ml y equivalente a una dosis de 2,5 pg/ml. Por tanto, considerando estos parámetros, RLI es al menos de 2 a 10 veces más bioactiva que rhIL-2.
Se reprodujo el mismo experimento con una concentración equimolar de RLI, rhIL-2 y rhIL-15.
Las figuras 12A y 12B muestran la capacidad proliferativa de RLI, rhIL-15 y rhIL-2 en los días 3, 4, 5, 6 y 7 en células NK y células T CD8, respectivamente.
Los resultados confirman que RLI induce una proliferación de células NK, pero también de células T CD8, que es mayor que la obtenida con rhIL-15 equimolar y también con rhIL-2 equimolar y que la del tercer día tras la activación hasta el séptimo día.
2) Células T reguladoras humanas y RLI
Se analizaron células Treg tal como se publicó en otra parte (MIYARA et al., Immunity, vol. 30(6), págs.: 899-911, 2009). Esta estrategia permite la distinción entre células Treg activadas (células T Foxp3alto CD4+), Treg en reposo natural (células T Foxp3bajo CD45RA+ CD4+) y T CD4+ efectoras activadas (células T Foxp3bajo CD45RA' CD4+).
En resumen, se obtuvieron PBMC marcadas con CFSE tal como se describió anteriormente en el punto 1). Se cultivaron dos millones de PBMC a partir de voluntarios sanos en placas de 6 pocillos con rhIL-15 (2,5 ng/ml), rhIL-2 (50 UI/ml = 3 ng/ml), RLI Pichia (2,5 ng/ml) o medio solo durante 6 días. A continuación, se recogieron las células y se tiñeron con anticuerpo anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y LIVE/DEAD® Fixable Aqua para seleccionar las células viables. Se permeabilizaron las células siguiendo un protocolo de fijación/permeabilización de Foxp3 (EBIOSCIENCE) y se tiñeron con anticuerpo anti-Foxp3. Se adquirieron las células marcadas inmediatamente con un citómetro de flujo.
La figura 2A muestra la proporción de células T Foxp3‘ CD4+ proliferantes.
La figura 2B muestra la proporción de células T Foxp3+ CD4+ (panel izquierdo), células T Foxp3bajo CD4+ (panel central) y células T Foxp3alto CD4+ (panel derecho) proliferantes.
Los resultados muestran que RLI no induce ninguna proliferación de subconjuntos de células T Foxp3+ CD4+. Por otro lado, rhIL-2 induce una fuerte proliferación de subconjuntos de células T Foxp3+ CD4+ incluyendo células T Foxp3alto CD4+, que son células Treg altamente supresoras.
=> Con el fin de definir mejor las propiedades in vivo de RLI, se decidió usar dos modelos animales complementarios correspondientes a:
1 ) primero, el macaco, que es un buen modelo in vivo para estudiar la actividad del fármaco y la farmacocinética del fármaco; y
2) segundo, el ratón, que es un buen modelo in vivo para estudiar los efectos secundarios de citocinas y, más particularmente, el síndrome de fuga vascular (VLS), puesto que el macaco no puede usarse para predecir el VLS humano.
3) Ratón: confirmación de la seguridad de RLI
Simultáneamente, quiso determinarse la seguridad de RLI en comparación con dosis similares de hIL-2 y de hIL-15. Para este propósito, se usaron ratones como modelo animal para determinar la activación de células inmunitarias y para VLS humano. En primer lugar, se determinó la actividad de RLI en este modelo animal. a) Bioactividad de RLI en modelo in vivo de ratón
A ratones C57BL/6 obtenidos de Harlan Laboratories se les inyectaron por vía intraperitoneal (i.p) 100 |il de PBS como control negativo, rhIL-2 (250.000 UI/ratón) como control positivo, rhIL-15 (1,2 |ig/ratón) como comparación y RLI (2,5 |ig/ratón) siguiendo el protocolo presentado en la figura 3.
Se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se extirparon los bazos en el día 4. Se disoció el bazo en una suspensión unicelular en un filtro celular de 100 |im con la parte posterior de una jeringa. A continuación, se lisaron las células sanguíneas usando una disolución de ACK (cloruro de amonio-potasio). Se lavaron los esplenocitos dos veces en medio completo y se contaron las células viables usando portaobjetos KOVA. Se tiñeron dos millones de esplenocitos con los siguientes anticuerpos: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, NKp46 y LIVE/DEAD® Fixable Aqua para seleccionar las células viables. A continuación, se permeabilizaron los esplenocitos según el protocolo de fabricación (tampones de permeabilización de FoxP3 de EBIOSCIENCE) y se tiñeron con anticuerpo anti-FoxP3 y Ki67. Se usó el isotipo de Ki67 para identificar las células positivas. Se adquirieron las células teñidas inmediatamente en un citómetro de flujo FACSCANTO II y se realizaron análisis usando el software FLOWJO (TREE STAR). Las células NK son células negativas para CD3 y positivas para NKp46. Se analizaron las células T CD 8+ seleccionando en células doblemente positivas para CD3 y CD8. Para los análisis de células T reguladoras, se realizó una tinción intranuclear de Foxp3 para distinguir las células T reguladoras de las efectoras en la población doblemente positiva para CD4 y CD3.
La figura 4 representa la proporción de células NK, células T CD8+, células T Foxp3+ CD4+ y células T Foxp3‘ CD4+ proliferantes en el día 4.
La figura 5 muestra la razón de células NK proliferantes con respecto a la razón de células T Foxp3+ (Treg) en el día 7.
Los resultados muestran que RLI induce una potente proliferación de células efectoras sin inducir la acumulación de Treg en comparación con IL-2 e IL-15; siendo estos resultados los mismos en los días 4 y 7.
A continuación, se determinó la activación de células inmunitarias en este modelo animal mediante RLI en comparación con IL-2 e IL-15.
Para ello, se obtuvieron los esplenocitos siguiendo el protocolo anteriormente descrito.
Para los ensayos de secreción, se cultivaron esplenocitos en medio completo complementado con 5 ng/ml de PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) y 500 ng/ml de ionomicina durante 4 horas. Se usó una disolución de brefelfina A para inhibir el transporte de proteínas (EBIOSCIENCE). A continuación, se recogieron las células y se tiñeron con los siguientes anticuerpos: anti-CD3, CD4, CD8, NKp46 y LIVE/DEAD® Fixable Aqua para seleccionar las células viables. Después de la tinción de superficie, se fijaron las células y se permeabilizaron siguiendo el protocolo de fabricación (BD BIOSCIENCES, tinción intracelular). A continuación, se tiñeron las células permeabilizadas usando anticuerpo anti-IFNy y se adquirieron inmediatamente en un citómetro de flujo FACS Canto II.
Para los ensayos de citotoxicidad in vitro, se enriquecieron las células NK usando el kit II de aislamiento de células NK de ratón (MILTENYI BIOTECH). Se controló la pureza mediante citometría de flujo. Se cultivaron 2 x 104 células YAC-1 en placas de fondo en v de 96 pocillos con diferentes cantidades de células NK (razón efector:diana de (1:1); (5:1) y (10:1)). El volumen final era de 100 |il por pocillo. Después de 4 horas de cocultivo, se recogieron los sobrenadantes y se midió la LDH liberada usando el kit de detección de citotoxicidad de LDH (Roche Applied Science). Se calcularon los porcentajes de citotoxicidad siguiendo esta fórmula: Citotoxicidad (%) = [((“efector:diana” - “control de células efectoras”) - “control bajo”) / (“control alto” - “control bajo”)] x 100.
La figura 6 muestra (A) el porcentaje de células productoras de IFNy entre las células NK (panel izquierdo), células T CD8+ (panel central) y células T CD4+ (panel derecho) y (B) la citotoxicidad de células NK contra la línea celular YAC-1 para los ratones en los que se inyectó PBS, IL-2, IL-15 o RLI.
Los resultados muestran que, considerando las células NK y las células T CD8+, RLI mostró una bioactividad más fuerte en comparación con la dosificación equimolar de rhIL-15 y con el régimen de dosis alta de IL-2 in vivo en ratones (250.000 UI/día, es decir, 15 |ig/día).
Por tanto, estos datos confirman datos con seres humanos in vitro que muestran que, a una dosificación de tan sólo 2 |i g/inyección cada 3 días, RLI es más bioactiva que una inyección diaria de 15 |ig de IL-2.
Para evaluar mejor la seguridad de RLI, se comparó simultáneamente, en un modelo tumoral in vivo experimental, las actividades antitumorales de tal régimen de citocinas.
Para ello, se inyectaron 106 células de melanoma B16F10 en la dermis superior del lomo de ratones. El tratamiento según el régimen anteriormente descrito se inició en el día 6 después de la inoculación del tumor, punto de tiempo en el cual los nódulos tumorales eran claramente visibles y palpables a un tamaño de = 50­ 55 mm3. Se midieron los tumores palpables en dos diámetros perpendiculares usando calibres, y se estimó el radio dividiendo el diámetro medio entre dos. Se calculó el volumen tumoral suponiendo un crecimiento esférico, usando la fórmula 4/3(rcr3).
La figura 9(A) representa la evolución del volumen tumoral dependiendo del régimen de citocinas. La figura 9(B) muestra el área bajo la curva (AUC) para el crecimiento de tumor subcutáneo en ratones tratados con los reactivos indicados. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
Tal como se muestra en las figuras 9A y B y en comparación con el grupo de PBS, LDRLI reduce el crecimiento del tumor primario en un 47%, lo cual es similar a HDRLI que reduce el crecimiento del tumor primario en un 46%. LDIL-2 no tiene ningún efecto terapéutico, mientras que LDIL-15 tiene un efecto terapéutico muy moderado (-9% sobre el crecimiento del tumor primario). De manera interesante, HDIL-2 y HDIL-15 presentan efectos terapéuticos moderados pero significativos sobre el crecimiento del tumor primario (-22% y -28%, respectivamente). IL-15/IL-15Ralfa-Fc reduce el crecimiento del tumor primario en un 37%, lo cual es menor que con LD y HDRLI, a pesar de un efecto similar sobre células T CD8 y NK. No obstante, la razón de Treg CD8/CD4 y NK/Treg CD4 es menos favorable con IL-15/IL-15Ralfa-Fc que con RLI. IL2/AcM 602 reduce el crecimiento del tumor primario en un 51%, lo cual es un poco mayor que con LD o HDRLI, a pesar de un efecto similar sobre células T CD8 y NK y razones de Treg CD8/CD4 y NK/Treg CD4 menos favorables que con RLI. Esto indica que los impulsores inmunitarios más importantes para controlar el crecimiento del tumor primario B6F10 están más relacionados con la expansión cuantitativa de células T CD8 y NK que con la razón relativa de estas células con Treg CD4. No obstante, muchos estudios implican el desarrollo y la actividad de Treg CD4 en cánceres de ratón y seres humanos como células inmunosupresoras críticas que favorecen la progresión del tumor a través del escape inmunitario.
Experimentos in vivo adicionales sobre el carcinoma de células renales metastásico (Renca) confirman los efectos terapéuticos moderados pero significativos sobre el crecimiento del tumor primario de IL-15 y de IL-2, mientras que se observó una fuerte inhibición del desarrollo de metástasis al pulmón con una inyección diaria i.p. en los días 1-4 con 2 |i g de RLI.
b) Síndrome de fuga vascular (VLS)
Se transfirieron células T Ly5.1 CD8+ marcadas con CFSE enriquecidas a ratones de tipo natural, seguido por 4 inyecciones diarias de PBS, 1,5 |i g (dosis baja, LD) o 15 |ig (dosis alta, HD) de citocina humana recombinante, incluyendo LDIL-2, LDIL-15, HDIL-2 y HDIL-15; 1,5 |i g de citocina más anticuerpo anti-citocina humana (IL-2/602); 1,5 |i g de IL-15 más IL-15Ra-Fc soluble (IL-15/sIL-15Ra también denominado complejo no covalente de IL-15); y 2,25 |ig de RLI (LDRLI) o 15 |ig de RLI (HDRLI). Esta dosis de IL-2 puede considerarse como la dosis límite más alta en cuanto a inducción de VLS basándose en la seguridad, es decir, relación beneficio/riesgo aceptable, denominada HDIL-2.
En el día 5, se analizaron células del bazo para determinar (A) perfiles de CFSE de células Ly5.1+ CD8+ de donante, células T CD8+ con fenotipo de memoria CD44alto CD122alto de huésped (CD8+ Mp ), células T reguladoras (Treg) CD4+ CD25+ y linfocitos citolíticos naturales (NK) CD3' NK1.1+.
La figura 7 muestra los números de células totales de células de donante, células T CD8+ MP y células NK que se calcularon. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
Los resultados muestran que LDRLI induce una fuerte proliferación y expansión de células T Ly5.1+ CD8+ transferidas, enriquecidas para células CD122+ CD44+ (células T CD8 efectoras y de memoria central), el 89% de células proliferantes frente al 97% de células proliferantes en el grupo de HDRLI. Por tanto, LDRLI o HDRLI inducen efectos farmacológicos casi similares sobre las células diana, lo que significa que no se requieren concentraciones tan altas de RLI para lograr efectos farmacológicos máximos.
LDRLI induce mucha más proliferación de células T CD8 transferidas que LDIL-2 (12%), LDIL-15 (13,5%) equimolares e incluso HDIL-2 (52%) o HDIL-15 (62%).
Además, LDRLI y HDRLI se comparan muy bien con el complejo no covalente superagonista de IL-2 (IL2/AcM 602; 98%) y de IL-15 (IL-15/IL-15Ralfa-Fc; 98%).
En conclusión, RLI es altamente eficaz para amplificar células NK y T CD8 con la eficacia más limitada en la expansión de Treg CD4, presentando la mejor capacidad de entre todos reactivos y regímenes sometidos a prueba para desplazar el equilibrio inmunomodulador hacia la inmunocitotoxicidad sin amplificar la inmunosupresión.
Para determinar el síndrome de fuga vascular (VLS), se evaluó el edema de pulmón con respecto a la razón entre los pesos de tejidos húmedos y secos. Se desangraron los ratones con anestesia. Se recogieron los pulmones, se pesaron inmediatamente y se desecaron durante 2 días a 50°C. Se obtuvo el flujo de entrada de agua restando los pesos secos a los húmedos de los pulmones.
La figura 8 representa el edema de pulmón (mayor que la línea discontinua) como porcentaje del peso total de los ratones. La línea discontinua representa el nivel inicial fisiológico. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
En comparación con el peso húmedo pulmonar (PWW) normal del grupo de PBS, LDIL-15 y LDIL-2 inducen un aumento moderado de PWW del 7,3% y del 17,9%, respectivamente. HDIL-15 y HDIL-2 aumentan el PWW en aproximadamente el 54,5% y el 120%, respectivamente. HDIL-2 induce un aumento de PWW muy importante, compatible con el síndrome de fuga vascular que surge en algunos pacientes tratados con HDIL-2. Para HDIL-15, el aumento de PWW es mucho menor que el inducido por HDIL-2, aunque tal aumento de PWW no es significativo.
Sorprendentemente, los resultados muestran que, en comparación con el límite más alto para VLS, los inducidos por RLI a dosis baja y alta parecen aceptables, mientras que la inducción de células NK y CD8+ por RLI es mayor que la obtenida por hIL-15 y hIL-2 (más de 3 veces).
I L-15/I L-15Ralfa-Fc aumenta el PWW en un 76,4%, que es el doble del VLS inducido por LDRLI a pesar de una menor eficacia terapéutica. IL-2/AcM 602 aumenta el PWW en un 62,6%, que es un 39% más que el VLS inducido por LDRLI a pesar de una eficacia terapéutica similar. Además, es interesante observar que HDRLI aumenta el PWW en un 96,7% frente al 38,2% en el grupo de LDRLI a pesar de efectos farmacológicos casi similares sobre células NK y T CD8 y una eficacia terapéutica casi similar. Por tanto, aunque LDRLI y HDRLI se comparan muy bien en cuanto a actividad de células NK y T CD8 y actividad terapéutica, lo que significa que la meseta de eficacia se alcanza con este régimen de LD, aumentar la dosis de RLI puede inducir un mayor v Ls , lo que significa que este efecto tóxico no está relacionado con los mecanismos implicados en la eficacia del tratamiento.
Para representar la seguridad, es decir, fuerte eficiencia y baja toxicidad, de RLI frente a IL-2 e IL-15, la figura 11 representa el VLS en función de las células NK y T CD8+, respectivamente, para los ratones en los que se inyecta PBS, IL-2, IL-15 y RLI.
Finalmente, los presentes resultados muestran que RLI tiene una seguridad muy diferente en comparación con la de IL-2 pero también con la de IL-15 (aunque IL-15 y RLI posiblemente usan las mismas rutas de señalización), seguridad de RLI que es mucho más favorable que tanto la de IL-15 como la de IL-2. En consecuencia, RLI presenta un margen de dosis y una ventana terapéutica mejorados en comparación con IL-15 e IL-2 para aprovechar las células inmunitarias efectoras para inducir efectos terapéuticos sin efectos secundarios. En cambio, parece difícil lograr una correcta estimulación del sistema inmunitario con IL-2, e incluso con IL-15, sin inducir rápidamente el fenómeno de VLS.
c) Efecto de respuesta a la dosis sobre la expansión de células NK frente a toxicidad (VLS)
Se evaluaron los efectos de determinación de la dosis de RLI sobre la expansión de células NK frente a VLS en pulmón e hígado según el protocolo que se describió anteriormente. Los ratones recibieron 4 inyecciones diarias de RLI CHO a 0,2 |ig, 0,5 |ig, 1 |ig o 2 |ig por inyección i.p desde el día 0 hasta el día 3, y después se sacrificaron en el día 4.
La figura 13 muestra los efectos de respuesta a la dosis de RLI sobre la expansión de células NK.
Los resultados muestran que el tratamiento con RLI induce una expansión dependiente de la dosis de células NK en el bazo con un efecto inicial desde la primera dosis de 0,2 |ig hasta 2 |ig, con una meseta que comienza a 1 H-g.
En paralelo a la expansión de NK, se evaluó el VLS en pulmones e hígados de ratones tratados frente a ratones de control (PBS).
La figura 14 muestra los efectos de respuesta a la dosis de RLI sobre VLS en pulmones e hígados de ratones. Los resultados muestran que las dosis sometidas a prueba de RLI no inducen un VLS significativo en pulmón e hígado en comparación con el PWW de ratones no tratados. Ahora, puede considerarse que aparece una señal emergente de VLS a la dosis más alta de 2 |ig.
De nuevo, se evaluaron los efectos de determinación de la dosis de RLI sobre la expansión de células NK frente a VLS en pulmón según el protocolo que se describió anteriormente con dos nuevas dosis. Los ratones recibieron 4 inyecciones diarias de RLI CHO a 0,2 |ig, 0,5 |ig, 1 |ig, 2 |ig, 5 |ig o 25 |ig por inyección i.p. desde el día 0 hasta el día 3, y después se sacrificaron en el día 4.
La figura 15 muestra los efectos de respuesta a la dosis de RLI sobre VLS en pulmones.
Una vez más, RLI no induce VLS en pulmón desde dosis de 0,2 |ig hasta 2 |ig, mientras que RLI a 5 |ig y 25 |ig induce un potente VLS con una intensidad similar y máxima.
Para las células NK, la figura 16 muestra la respuesta a la dosis de RLI en la expansión de células NK, mientras que la figura 17 muestra la respuesta a la dosis de RLI en la expansión de Treg.
Una vez más, RLI desde la dosis de 0,2 hasta 5 |ig por inyección induce una expansión de células NK dependiente de la dosis en el bazo, mientras que RLI a 25 |ig pierde la actividad y puede considerarse perjudicial. En paralelo, RLI a dosis de desde 0,2 hasta 2 |ig no aumenta el porcentaje de Treg, mientras que estos regímenes inducen un aumento similar del número de Treg en comparación con el control. En cambio, RLI a las dosis más altas (5 y 25 |ig) aumenta el porcentaje y el número de Treg CD4.
La figura 18 muestra el efecto de respuesta a la dosis de RLI sobre la razón de porcentaje de Treg CD4 frente a células NK y establece que RLI presenta una actividad dependiente de la dosis específica en la proliferación de células NK sin actividad específica en Treg CD4. Además, el margen de dosis entre 0,2 y 2 |ig parece activo y seguro, lo que refleja la posibilidad de estimular células inmunitarias citotóxicas, tales como células NK, sin inducir VLS. La existencia de un margen farmacéutico de este tipo es crítica para gestionar la eficacia y la seguridad en pacientes.
La figura 19 resume la comparación entre la estimulación de células NK y T CD8 frente a VLS inducido por el tratamiento con RLI en ratones sanos, además del efecto terapéutico celular sobre el desarrollo metastásico de células Renca.
Finalmente, estos resultados confirman la gran seguridad de RLI, en comparación tanto con IL-15 como con IL-2, y establecen que puede usarse RLI en una ventana terapéutica, lo que es impensable tanto para IL-2 como para IL-15: dosis muy altas para pacientes con mal pronóstico y dosis muy bajas para pacientes con buen pronóstico. Farmacocinética con el macaco
A macacos cangrejeros de 4 años de edad de desde aproximadamente 3 hasta 4 kg se les inyectó RLI (bolo intravenoso, 15 min) a diferentes dosis (2 macacos a 20 mcg/kg; 2 macacos a 3,5 mcg/kg; macacos).
El estudio se llevó a cabo cumpliendo con los reglamentos de BPL actuales tal como se describe en los documentos de la OECD “principios de buenas prácticas de laboratorio” (revisado en 1997). Este protocolo lo revisó el comité ético de VETAGRO Sup (Francia) y lo aprobó con el número 1162. Todos los experimentos se llevarán a cabo según la Directiva europea 86/609/CEE tal como se publica en el Boletín oficial francés del 13 de febrero de 2001.
Se realizó el análisis de las características farmacocinéticas llevando a cabo un bioensayo ELISA específico para RLI en el suero sanguíneo en diferentes puntos de tiempo: t-72h como t0, t+10min, t+30min, t+1h, t+4h, t+6h, t+24h y t+72h. Se analizó la curva experimental basada en concentraciones medidas con un modelo bicompartimental con cero en inyección intravenosa según la ecuación habitual: concentración ajustada = IF(tiempo<tinf;InfR*A*(1-EXP(-Jbd1*tiempo))+InfR*B*(1-EXP(lbdz1tiempo)); InfR*A*(EXP(_lbd1‘tiempo)) * EXP(-_lbd1‘tiempo) InfR*B* (EXP(lbdz*tiempo)) * EXP(-lbdz*tiempo)). (Fórmula de concentración ajustada (EXCEL, análisis de ajuste, modelo bicompartimental con infusión intravenosa de orden cero)).
La figura 10A representa la evolución observada y modelada de la concentración de RLI dependiendo de la dosis inyectada en función del tiempo. Los datos son representativos de dos macacos diferentes por dosis.
Las semividas del segundo compartimento (t1/2P) son de aproximadamente 3 horas para cada experimento. Las curvas ajustadas permiten evaluar la concentración restante de RLI en todo el torrente sanguíneo durante un tiempo prolongado, que se representan en la figura 10 (B).
Los resultados muestran que, para el grupo de 20 mcg/kg, las concentraciones en sangre a las 6 h y 12 h son de 28,67 y 6,02 ng/ml, respectivamente. Para el grupo de 3,5 mcg/kg, las concentraciones en sangre a las 6 h y 12 h son de 0,55 y 0,03 ng/ml, respectivamente, lo que significa 550 pg/ml y 30 pg/ml, respectivamente.
Según las tablas 1 y 2, tales concentraciones bajas y muy bajas son altamente eficaces para estimular células NK y T CD8 humanas, respectivamente. Ahora, se confirmó dicha inducción de proliferación de células NK y T CD8 en los macacos, aunque no se observó ningún efecto sobre Treg (datos no mostrados).
Para una mejor conversión de dosis animales en dosis equivalente para seres humanos, existe un modelo teórico basado en BSA.
La determinación de la dosis equivalente para seres humanos (DEH) puede obtenerse basándose en la siguiente fórmula:
DEH (mg/kg) = dosis animal (mg/kg) x (Km animal / Km humano) En esta fórmula, Km es un factor de corrección que refleja la relación entre el peso corporal y el área de superficie corporal.
Para un adulto típico (peso corporal de 60 lb, área de superficie corporal de 1,6 m2), Km es de 37.
Para las especies de animales de laboratorio usadas con más frecuencia, los Km promedio son de 3 para ratón, 6 para conejo, 12 para macacos, 20 para perro, 37 para adulto humano (véase “Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. (2002) Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, EE.UU.”). Basándose en dichos elementos, pueden aproximarse algunas de las dosis equivalentes para seres humanos máximas de RLI en comparación con los experimentos con ratones. Dichas dosis se resumen en la tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000020_0001
De manera interesante, se ha mostrado que dosis altas (25 ng/ml), pero también dosis muy bajas (2,5 pg/ml o 25 pg/ml), pueden estimular células NK y T CD8 humanas de PBMC humanas ex vivo (tablas 1 y 2, figura 1). En macacos, tales concentraciones débiles o muy débiles pueden alcanzarse al nivel sérico máximo (0,25 horas) (figuras 10A y B). Por ejemplo, a una dosis de 0,01 mcg/kg en macacos cangrejeros, la concentración en sangre máxima puede alcanzar aproximadamente 62,5 pg/ml según un análisis de regresión casi lineal de curvas experimentales (figura 10B). Tal como se muestra en la tabla 1, RLI a 25 pg/ml es todavía superior a HDIL-2 para inducir la proliferación en células NK humanas. Basándose en estas concentraciones en sangre, en sangre de macaco, y en vista a la fórmula anterior, se determinó la dosis equivalente para seres humanos de RLI (DEH de RLI) para diferentes concentraciones, DEH de RLI que se resumen en la tabla 5.
Tabla 5: Ilustraciones de algunas dosis equivalentes para seres humanos mínimas de RLI basándose en PBMC de macaco in vivo y humanas ex vivo.
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
En conclusión, la cantidad diaria administrada de RLI puede variar entre 1 ng/kg y 60 mcg/kg, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que va a tratarse.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica que comprende un conjugado para su uso en el tratamiento de un cáncer, una infección o un trastorno de inmunodeficiencia en un ser humano, en la que el conjugado se administra en una cantidad eficaz para inducir una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o mayor que la obtenida con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2), en la que dicho conjugado comprende: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma que tienen al menos el 10% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225 y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92,5% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y
b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo que tienen al menos el 10% de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleucina 15 humana y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9;
opcionalmente asociado con un portador farmacéuticamente aceptable,
en la que la cantidad eficaz de dicho conjugado es de entre 2 y 200 pmol/kg, preferiblemente entre 8 y 200 pmol/kg y todavía preferiblemente entre 20 y 80 pmol/kg.
2. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la cantidad eficaz de dicho conjugado es de entre 50 y 5.000 ng/kg, preferiblemente entre 200 y 5.000 ng/kg y todavía preferiblemente entre 500 y 2.000 ng/kg.
3. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicho derivado de interleucina 15 tiene al menos el 25% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225, más preferiblemente al menos el 50%, y/o
tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 98,5% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, preferiblemente de al menos el 99%.
4. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho derivado del dominio sushi de IL-15Ra tiene al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano, y/o
tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 96% con una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, preferiblemente de al menos el 98%.
5. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8 mayor que la obtenida con HDIL-2.
6. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición es para tratar un cáncer avanzado (grado IV del TNM) o uno metastásico y dicha cantidad administrada de conjugado induce una proliferación de células NK que es mayor que la obtenida con HDIL-2.
7. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 6 , en la que dicho conjugado se administra (I) en una cantidad que induce una proliferación de células NK, que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o
(II) en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8+, que es al menos el 20% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 25% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 30% mayor que la obtenida con HDIL-2.
8. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición es para tratar un cáncer no metastásico, preferiblemente un cáncer de grado I, II o III del TNM, o una infección, y dicha cantidad administrada de conjugado induce una proliferación de células NK, que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2.
9. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que
(I) dicho conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de linfocitos citolíticos naturales (células NK) que es la misma o como máximo el 50 o el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 20% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 10% mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o
(II) dicho conjugado se administra en una cantidad que induce una proliferación de células T CD8+ que es la misma o como máximo el 200% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente la misma o como máximo el 150% mayor; y todavía preferiblemente la misma o como máximo el 100% mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o (III) en la que el conjugado se administra en una cantidad correspondiente a una concentración en sangre comprendida entre 40 fmol/ml y 12 pmol/ml (entre 1 ng/ml y 300 ng/ml), preferiblemente entre 80 fmol/ml y 12 pmol/ml (entre 2 ng/ml y 300 ng/ml) y todavía preferiblemente entre 0,16 y 4 pmol/ml (entre 4 y 100 ng/ml).
10. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la cantidad administrada de conjugado induce una proliferación de células Treg (FoxP3+CD4+CD25alt°) que es menor que la obtenida con HDIL-2, en la que la cantidad administrada de conjugado induce preferiblemente una proliferación de células Treg que es al menos el 5% menor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 10 o el 20% menor; y todavía preferiblemente al menos el 50% menor que la obtenida con HDIL-2.
11. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que (I) la cantidad administrada corresponde a una razón de porcentaje inducido de células NK proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes que es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o
(II) la cantidad administrada de conjugado corresponde a una razón de porcentaje inducido de células T CD8 proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes que es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2.
12. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que (I) los polipéptidos a) y b) del conjugado están unidos de manera covalente en una proteína de fusión; y/o (II) dicha interleucina 15 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y el dominio sushi de IL-15Ra tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y/o
(III) dicho conjugado comprende la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 o derivados de la misma en una posición C-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo; y/o
(IV) la secuencia de aminoácidos de la interleucina 15 o derivados de la misma y la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados están separadas por una secuencia de aminoácidos de ligador que tiene una longitud de 5-30 aminoácidos, comprendiendo dicho ligador aminoácidos casi neutros seleccionados del grupo que comprende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) y Gln (Q).
13. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que (I) la cantidad administrada corresponde a una cantidad de administración diaria; y/o
(II) dicha composición se administra por vía parenteral, preferiblemente por vía intravenosa.
14. Método in vitro para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado que va a administrarse a un sujeto que padece un cáncer, una infección o un trastorno de inmunodeficiencia, comprendiendo dicho método las etapas de:
i) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dicho sujeto con cantidades crecientes del conjugado definido anteriormente en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC;
ii) poner en contacto otras PBMC de dicho sujeto con una dosis alta de interleucina 2 (HDIL-2) en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC; y
iv) seleccionar una cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado, induciendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz una proliferación de células NK de dichas PBMC que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2; en el que dicho conjugado comprende:
a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de interleucina 15 o derivados de la misma que tienen al menos el 10% de la actividad de interleucina 15 humana en la inducción de proliferación de la línea celular kit225 y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92,5% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y
b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio sushi de IL-15Ra o derivados del mismo que tienen al menos el 10% de la actividad de unión del dominio sushi de IL-15Ra humano a interleucina 15 humana y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 92% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
(I) dicha cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado induce una proliferación de células T CD8 de dichas PBMC que es la misma o mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o
(II) dicha cantidad terapéuticamente eficaz de conjugado corresponde a una razón de porcentaje inducido de células NK y/o de células T CD8 proliferantes con respecto al porcentaje inducido de células Treg proliferantes que es al menos el 25% mayor que la obtenida con HDIL-2; preferiblemente al menos el 50% mayor; y todavía preferiblemente al menos el 75% mayor que la obtenida con HDIL-2; y/o
(III) las cantidades crecientes de conjugado corresponden a una concentración de conjugado comprendida entre 4 fmol/ml y 120 pmol/ml (entre 0,1 y 3.000 ng/ml), preferiblemente entre 40 fmol/ml y 80 pmol/ml (entre 1 y 2.000 ng/ml) y todavía preferiblemente entre 80 fmol/ml y 40 pmol/ml (entre 2 y 1.000 ng/ml); y/o
(IV) dicho método de la invención comprende además la etapa de:
iii) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de dicho sujeto con cantidades equimolares crecientes de IL-15 en comparación con el conjugado en condiciones de cultivo que permiten la proliferación de dichas PBMC.
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