BR112015021414B1

BR112015021414B1 - vírus da doença newcastle e seus usos

Info

Publication number: BR112015021414B1
Application number: BR112015021414-2A
Authority: BR
Inventors: Peter Palese; Adolfo Garcia-Sastre; Dmitriy Zamarin; James Allison; Jedd D Wolchok
Original assignee: Icahn School Of Medicine At Mount Sinai; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2020-11-10
Also published as: AU2014241843B2; MD4655C1; WO2014158811A1; MY180687A; CN111172120A; AP2015008685A0; PH12015502087B1; ZA201506192B; CN105188746A; CN105188746B; US20180078592A1; IL264385A; JP2018198621A; MA38406A1; MX2019008086A; JP2023002553A; HK1216618A1; CA2905272A1; AU2019206040A1; GEP20196976B

Abstract

VÍRUS DA DOENÇA NEWCASTLE E SEUS USOS A invenção se refere ao vírus quimérico da doença de Newcastle geneticamente modificado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e composições compreendendo tais vírus. A invenção se refere também a um vírus quimérico da doença de Newcastle geneticamente modificado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune e composições compreendendo tais vírus. O vírus quimérico da doença de Newcastle e as composições são úteis no tratamento de câncer. Além disso, a invenção proporciona métodos de tratamento de câncer compreendendo administrar o vírus da doença de Newcastle em combinação com um agonista de um sinal coestimulador a uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune.

Description

[1] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US N° 61/782.994, depositado em 14 de março de 2013, que está aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[2] Esta invenção foi realizada, em parte, com o suporte governamental sob as concessões n— 5T32CA009207-35 e HHSN26620070010C outorgada pelo National Institutes of Health. 0 governo tem alguns direitos na invenção.

1. INTRODUÇÃO

[3] São aqui descritos virus quiméricos da doença de Newcastle manipulados para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e composições compreendendo tais vírus. Também são aqui descritos vírus quiméricos da doença de Newcastle manipulados para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune e composições compreendendo tais vírus. Os vírus quiméricos da doença de Newcastle e composições são úteis no tratamento de câncer. Além disso, métodos para o tratamento do câncer que compreende a administração do vírus da doença de Newcastle, em combinação com um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imunesão aqui descritos.

2, ANTECEDENTES

[4] Vírus da Doença de Newcastle (NDV) pertence à família Paramyxoviridae, gênero Avulavirus, que foi mostrado por infectar uma série de espécies de aves (Alexander, DJ (1988).Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, pp 1-22) . NDV possui urn RNA de filamento únicoenvolvido do genoma no sentido negativo e não se submetem a recombinação com o genoma do hospedeiro ou com outros vírus Alexander, DJ (1988). Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, pp 1-22). 0 RNA genômico contém genes na ordem de 3'-NP-P-M-F-HN-L- 5',, descrito em maiores detalhes abaixo. Duas proteínas adicionais, V e W, são produzidos por NDV a partir do gene P por mRNAs alternativos que são gerados pela edição de RNA. 0 RNA genômico também contém uma sequência de comando na extremidade 3'.

[5] Os elementos estruturais do virion incluem o vírus do invólucro, que é um derivado da bicamada lipídica da membrana plasmática da célula. A glicoproteína, hemaglutinina-neuraminidase (HN) se projeta do invólucro, permitindo que o vírus contenha tanto a hemaglutinina (por exemplo, receptores de ligação/Fusogênico) atividades e neuraminidase. A glicoproteína de fusão (F) , que também interage com a membrana virai, é inicialmente produzidacomo um precursor inativo, em seguida, clivado pós- translacionalmente para produzir dois polipeptídeos ligados dissulfureto. A proteína ativa F é envolvida na penetração de NDV nas células hospedeiras por facilitar a fusão do invólucro viral com a membrana plasmática da célula hospedeira. A proteína de matriz (M) é envolvida com a montagem virai, e interage tanto com a membrana virai quanto com as proteínas da nucleocapisídeo.

[6] A subunidadeda proteína principal do nucleocapisideo é a proteína nucleocapisideo (NP) que confere simetria helicoidal no capsídeo. Em associação com o nucleocapisídeoestão as proteínas P e L. A fosfoproteína (P) , que é submetida à fosforilação, é de opinião que executa um papel regulador da transcrição, e pode também ser envolvida na metilação, fosforilação e poliadenilação. 0 gene L, que codifica para uma polimerase de RNA dependente de RNA é necessário para a síntese do RNA virai juntamente com a proteína P. A proteína G, que aceita quase metade da capacidade de codificação do genoma virai é a maior das proteínas virais, e desempenha um papel importante tanto na transcrição e replicação. A proteína V foi mostradapor inibir o interferon-alfa e por contribuir para a virulência da cepa de NDV (Huang et al. (2003) . A proteína V do vírus da doença de Newcastle está relacionada com patogênese viral e funciona como um antagonistas do interferon alfa. Journal of Virology 77 : 8676-8685).

[7] A ocorrência natural de NDV tem sido relatada como sendo um agente oncolítico eficaz em uma variedade de modelos de tumor animais (Sinkovics, JG, and Horvath, JC (2000) . Newcastle disease virus (NDV) : brief history of its oncolytic strains J. Clin Virollβ: 1-15; Zamarin et al., 2009; Mol Ther 17: 697; Elankumaran et al., 2010; J Virol 84: 3835; Schirrmacher et al., 2009; Methods Mol Biol 542: 565; Bart et al., 1973; Nat New Biol 245: 229).Estirpes NDV de ocorrência natural foram usadas em vários ensaios clínicos contra cânceres humanos ((Sinkovics, JG, and Horvath, JC (2000).Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.J Clin Virollδ: 1-15; Lorence et al. (2007) . Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. Curr Cancer Drug Targets'!: 157-167; Hotte et al. (2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin Cancer Resl3: 977-985; Freeman et al. (2006) . Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol Therl3: 221-228; Pecora et al. (2002). Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol20: 2251-2266; Csatary et al. (2004) . MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas. J NeurooncolGI: 83-93). No entanto, o sucesso de cepas de NDV de ocorrência natural nestes ensaios clínicos para cânceres humanos avançados foi apenas marginal (Hotte et al. (2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin Cancer Resl3: 977-985; Freeman et al. (2006). Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol Therl3: 221-228; Pecora et al. (2002) . Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin 0ncol2Q: 2251-2266). Como tal, continua existindo a necessidade de terapias baseadas em NDV úteisno tratamento de câncer, especialmente para câncer avançado.

3. SUMÁRIO

[8] Em um aspecto, são aqui apresentados os virus quiméricosda doença de Newcastle (NDVs) manipulados para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Em uma modalidade específica, sãoapresentados no presente documento os NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, em que o agonista é expresso. Em uma modalidade específica, sãoapresentado no presente documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, em que o antagonista é expresso.

[9] Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e uma proteína F mutada que faz com que o NDV seja altamente fusogênico, em que o agonista e a proteína F mutada são expressos. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e uma proteína F mutada com um local de clivagem mutado, em que o agonista e a proteína F mutada são expressos. Em uma modalidade específica, os NDVs quiméricos que expressam a proteína F mutada aumentaram a atividade fusogênica em relação ao vírus correspondente expressando a proteína F homóloga sem as mutações no local de clivagem. Em uma outra modalidade específica, a proteína F modificada é incorporado no virion.

[10] Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune e uma proteína F mutada que faz com que o NDV seja altamente fusogênico, em que o antagonista e a proteína F mutada são expressos. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codificas antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune e uma proteína F mutada com um local de clivagem mutado, em que o antagonista e a proteína F mutada são expressos. Em uma modalidade específica, os NDVs quiméricos que expressam a proteína F mutada aumentoaram a atividade fusogênica em relação ao vírus correspondente que expressa a proteína F homóloga sem as mutações no local de clivagem. Em uma outra modalidade específica, a proteína F modificada é incorporada no virion.

[11] Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e uma citoquina (por exemplo, interleucina (IL-2)), em que o agonista e a citoquina são expressas. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, uma citocina (por exemplo, IL-2) e uma proteína F mutada que faz com que o NDV seja altamente fusogênico, em que o agonista, a citocina e a proteína F mutada são expressos. Em uma outramodalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, uma citocina (por exemplo, IL-2) e uma proteína F mutada com um local de clivagem mutada, em que do agonista, a citocina e a proteína F mutada são expressos. Em uma modalidade específica, os NDVs quiméricos que expressam a proteína F mutada com o sítio de clivagem mutados são altamente fusogênico. Em uma outra modalidade específica, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[12] Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune de uma célula imune e uma citoquina (por exemplo, IL-2), em que o antagonista e a citoquina são expressas. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, uma citocina (por exemplo, IL-2) e uma proteína F mutada que faz com que o NDV seja altamente fusogênico, em que o antagonista, a citocina e a proteína F mutada são expressos. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, uma citocina (por exemplo, IL-2) e uma proteína F mutada com um local de clivagem mutado, em que o antagonista, a citocina e a proteína F mutada são expressos. Em uma modalidade específica, os NDVs quiméricos que expressam a proteína F mutada com o sítio de clivagem mutados são altamente fusogênico. Em uma outra modalidade específica, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[13] Em uma modalidade específica, o agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune é um agonista de um receptor coestimulador expresso por uma célula imune. Exemplos específicos de receptores co-estimulantes incluem receptor de fator de necrose tumoral induzida por glucocorticóides (GITR), induzível coestimulador das células T (ICOS ou CD278), 0X40 (CD134), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD40, CD226, molécula citotóxica e células T reguladoras (CRTAM), receptor exterminador 3 (DR3), receptor de linfotoxina-beta (LTBR), ativador transmembranar e interactor CAML (TACI), receptor do fator de ativação de células B (BAFFR), e a proteína de maturação das células B (BCMA). Em uma modalidade específica, o agonista de um receptor coestimulador expresso por uma célula imune é um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno) ou ligante que se liga especificamente ao receptor coestimulador. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um sc-Fv. Em uma modalidade específica, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a dois receptores de uma célula imune. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico se liga a um receptor em uma célula imune e para outro receptor em uma célula cancerosa. Em modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Em certas modalidades, o ligante ou o anticorpo é uma proteína quimérica compreendendo uma proteína F de NDV ou seu fragmento, ou proteína HN de NDV ou seu fragmento. Os métodos para gerar essas proteínas quiméricas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, na publicação do pedido de patente dos Estados Unidos No. 2012-0122185, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Também veja Park et al, PNAS., 2006; 103:. 8203-8 e Murawski et. al., J Virol 2010; 84: 1110-1123, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, o ligante ou o anticorpo é expresso como uma proteína F quimérica ou proteína de fusão F do NDV, em que a proteína F quimérica ou a proteína de fusão F do NDV compreende os domínios transmembranares e citoplasmáticos ou seus fragmentos da glicoproteína F do NDV e o domínio extracelular compreende o ligante ou anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante é expresso como uma proteína HN quimérica ou da proteína de fusão HN do NDV, em que a proteína HN quimérica ou a proteína de fusão HN do NDV compreende os domínios extracelulares e transmembranares ou seus fragmentos da glicoproteína HN doe NDV e compreende um domínio extracelular o ligante ou anticorpo. Em uma modalidade específica, o ligante ou o anticorpo é expresso como uma proteína quimérica, tal como descrito na Seção 7, Exemplo 2, infra.

[14] Em uma modalidade específica, o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune é um antagonista de um receptor inibidor expresso por uma célula imune. Exemplos específicos de receptores inibidores incluem receptor do tipo imunoglobulina associado linfócitos T citotóxicos associado ao antígeno 4 (CTLA-4 ou CD52) proteínas da morte programada (PD1 ou CD279), atenuador do linfócito T e B (BTLA), receptores semelhantes à imunoglobulina de células exterminadoras (KIR), gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), ou membrana de célula T da proteína 3 (TIM3), receptor de adenosina A2a (A2aR), imunorreceptor de células T com imunoglobulina e domínios ITIM (TIGIT), receptor do tipo imunoglobulina associado a um leucócito (LAIR1), e CD160. Em uma modalidade específica, o antagonista de um receptor inibidor expresso por uma célula imune é um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao receptor coestimulador. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um sc-Fv. Em modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Em uma outra modalidade específica, o antagonista de um receptor inibidor é um receptor solúvel ou um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a um ligante do receptor inibitório. Em certas modalidades, o anticorpo é uma proteína quimérica compreendendo uma proteína F de NDV ou seu fragmento, ou proteína HN de NDV ou seu fragmento. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente Norte-americano No. 2012- 0122185, Park et al, PNAS., 2006; 103: 8203-8, e Murawski et al, J. Virol 2010; 84: 1110-1123, sendo cada uma aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, o anticorpo é expresso como uma proteína quimérica ou a proteína de fusão F de NDV-F, em que a proteína F quimérica ou a proteína de fusão F de NDV compreende os domínios transmembranares e citoplasmáticos ou seus fragmentos da glicoproteína F de NDV e o domínio extracelular compreende o anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é expresso como uma proteína HN quimérica ou proteína de fusão HN de NDV, em que a proteína HN quimérica ou a proteína de fusão HN de NDV compreende os domínios transmembranares e intracelulares ou seus fragmentos da glicoproteína HN de NDV e o domínio extracelular compreende o anticorpo.

[15] Em outro aspecto, são aqui apresentados os métodos para a propagação NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos). Os NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos) podem ser propagados em qualquer célula, tecido, órgão ou sujeito susceptível a uma infecção por NDV. Em uma modalidade, os NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos) podem ser propagados em uma linhagem celular. Em uma outra modalidade, os NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos) podem ser propagados em células cancerosas. Em uma outra modalidade, os NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos) podem ser propagados em um ovo embrionado. Em certas modalidades são aqui apresentadas células isoladas, tecidos ou órgãos infectados com um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito) . Ver, por exemplo, Seção 5.4, infra, para exemplos de células, animais e ovos para infectar com um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em modalidades específicas, apresentadas aqui as células cancerosas são infectadas com um NDV isolado descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em certas modalidades são aqui apresentadas linhagens celulares infectadas com um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em outras modalidades são aqui apresentados ovos embrionados infectados com NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito).

[16] Em outro aspecto, são aqui apresentadas composições que compreendem um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em uma modalidade específica, são apresentadas no presente documento as composições farmacêuticas compreendendo um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento composições farmacêuticas que compreendem células cancerosas infectadas com um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito), e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades específicas, as células cancerosas foram tratadas com radiação gama antes da incorporação na composição farmacêutica. Em modalidades específicas, as células cancerosas foram tratadas com radiação gama antes da infecção com o NDV (por exemplo, NDV quimérico) . Em outras modalidades específicas, as células cancerosas foram tratadas com radiação gama após a infecção com o NDV (por exemplo, NDV quimérico). Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento composições farmacêuticas compreendendo concentrado de proteína a partir de células de câncer infectadas com NDV lisados (por exemplo, células cancerosas infectadas com NDV quimérico), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[17] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para a produção de composições farmacêuticas compreendendo um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em uma modalidade, um método para a produção de uma composição farmacêutica que compreende: (a) propagar um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito aqui) em uma linhagem celular que é susceptível a uma infecção de NDV; e (b) recolher a progenitura virai, em que o vírus é cultivado em quantidades suficientes e sob condições suficientes para que o vírus esteja livre de contaminação, de modo que a progenitura virai seja adequada para a formulação em uma composição farmacêutica. Em uma outra modalidade, um método para a produção de uma composição farmacêutica inclui: (a) propagar um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito) em um ovo embrionado; e (b) recolher a progenitura virai, em que o vírus é cultivado em quantidades suficientes e sob condições suficientes para que o vírus esteja livre de contaminação, de modo que a progenitura virai seja adequada para a formulação em uma composição farmacêutica.

[18] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para o tratamento do câncer utilizando um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou uma composição que compreende um NDV quimérico. Em uma modalidade específica, um método para o tratamento do câncer que compreende a infecção de uma célula de cancerosa em um sujeito com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, uma quantidade eficaz de um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra) ou uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um NDV quimérico presentemente descrito, é administrada a um sujeito para tratar o câncer. Em modalidades específicas, o NDV quimérico compreende um genoma, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune). Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada. Em certas modalidades, dois ou mais NDVs quiméricos são administrados a um sujeito para tratar o câncer.

[19] Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo células cancerosas infectadas com um NDV quimérico descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, as células cancerosas foram tratadas com radiação gama antes da administração ao sujeito ou incorporação na composição. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo um concentrado de proteína ou fragmentos de membrana plasmática a partir de células de câncer infectadas com NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, o NDV quimérico compreende um genoma, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um inibidor sinal de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune). Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada.

[20] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para o tratamento do câncer utilizando um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico tal como descrito na Seção 5.2, infra) ou uma composição compreendendo tal NDV em combinação com uma ou mais terapias. Em uma modalidade são aqui apresentados métodos para tratar o câncer compreendendo administrar a um sujeito de um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico, tal como descrito na Seção 5.2.1, infra) e uma ou mais outras terapias. Em uma outra modalidade são aqui apresentados métodos para tratar o câncer compreendendo administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de um NDV descrito aqui ou uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um NDV descrito aqui, e uma ou mais outras terapias. 0 NDV e uma ou mais outras terapias podem ser administrados, ao mesmo tempo ou sequencialmente, ao sujeito. Em certas modalidades, o NDV e uma ou mais outras terapias são administradas na mesma composição. Em outras modalidades, o NDV e uma ou mais outras terapias são administradas em composições diferentes. 0 NDV e uma ou mais outras terapias podem ser administrados pelas mesmas ou diferentes vias de administração ao sujeito.

[21] Qualquer tipo ou cepa de NDV pode ser utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita, incluindo, mas não limitado às cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, os vírus recombinantes mutagenizados, e/ou vírus geneticamente modificados. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em combinação com uma ou mais terapias é uma cepa de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, o NDV usado em combinação com uma ou mais outras terapias é um NDV quimérico. Em uma modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreende uma citoquina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17, ou IL-21). Em modalidades específicas, a citocina é expressa por células infectadas com NDV quimérico. Em uma modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo um antígeno tumoral. Em modalidades específicas, o antígeno tumoral é expresso por células infectadas com NDV quimérico. Em uma modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo uma molécula de pro-apoptótica ou uma molécula anti-apoptótica. Em modalidades específicas, a molécula pró-apoptótica ou molécula anti-apoptótica é expressa por células infectadas com NDV quimérico.

[22] Em uma outra modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune). Em modalidades específicas, o agonista e/ou antagonista são expressos por células infectadas com NDV quimérico. Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada. Em certas modalidades, uma ou mais terapias utilizadas em combinação com um NDV descritas aqui é uma ou mais outras terapias descritas na Seção 5.6.4 infra. Em modalidades particulares, as uma ou mais terapias utilizadas em combinação com um NDV descrita aqui é um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (ver, por exemplo, Seção 5.6.4.1, infra). Ver, por exemplo, Seção 5.2.1, infra, para exemplos de agonistas de um sinal coestimulador de uma célula imune e antagonistas de um sinal inibidor de uma célula imune. Em uma modalidade específica, o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune é o anticorpo anti-CTLA-4 descritos nas Secções 6 e 7, infra. Em uma outra modalidade específica, o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune é anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-Ll descrito na Seção 7, infra. Em uma outra modalidade específica, o agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune é o ligante ICOS descrito nas Secções 6 e 7, infra.

3.1 TERMINOLOGIA

[23] Os termos "cerca de" ou "aproximadamente", quando usados em conjunto com um número se refere a qualquer número dentro de 1, 5 ou 10% do número mencionado.

[24] Tal como aqui utilizado, o termo "agonista" refere-se a uma molécula que se liga a outra molécula e induz a uma reação biológica. Em uma modalidade específica, um agonista é uma molécula que se liga a um receptor em uma célula e desencadeia uma ou mais vias de transdução de sinal. Por exemplo, um agonista inclui um anticorpo ou ligante que se liga a um receptor em uma célula e induz uma ou mais vias de transdução de sinal. Em certas modalidades, o anticorpo ou o ligante se liga a um receptor em uma célula e induz uma ou mais vias de transdução de sinal. Em outras modalidades, o agonista facilita a interação do ligante nativo com o receptor nativo.

[25] Tal como aqui utilizado, o termo "antagonista" se refere a uma molécula que inibe a ação de uma outra molécula sem provocar uma resposta biológica própria. Em uma modalidade específica, um antagonista é uma molécula que se liga a um receptor em uma célula e bloqueia ou atenua a atividade biológica de um agonista. Por exemplo, um antagonista inclui um anticorpo ou ligante que se liga a um receptor em uma célula e bloqueia ou atenua a ligação do ligante nativo à célula, sem indução de uma ou mais vias de transdução de sinal. Outro exemplo de um antagonista inclui um anticorpo ou um receptor solúvel que compete com o receptor nativo em células para se ligarem ao ligante nativo, e, assim, bloqueia ou atenua uma ou mais vias de transdução de sinal induzida quando o receptor nativo liga- se ao ligante nativo.

[26] Tais como aqui utilizados, os termos "anticorpo" e "anticorpos" se referem às moléculas que contêm um local de ligação ao antígeno, por exemplo, imunoglobulinas. Os anticorpos incluem, mas não estão limitados aos anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais, anticorpos de domínio simples, anticorpos camelizados, Fv (scFv) de cadeia simples, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs biespecíficos ligados por dissulfureto (sdFv), intracorpos e anti-idiotípicos (anti- Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id e anticorpos anti-Id para anticorpos), e fragmentos que se ligam ao epítopo de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse. Em uma modalidade específica, um anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Em uma outra modalidade específica, um anticorpo é um anticorpo monoclonal ou scFv. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado ou scFv. Em outras modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a um receptor coestimulador de uma célula imune ou um receptor inibitório de um imune, e um receptor em uma célula cancerosa. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a dois receptores de células imunes, por exemplo, receptores de dois coestimuladores em células imunes, dois receptores inibitórios sobre células do sistema imunológico do receptor, ou um coestimulador nas células imunes e um receptor inibidor em células imunológicas.

[27] Tal como aqui utilizado, o termo "derivado", no contexto de proteínas ou polipeptídeos refere-se a: (a) um polipeptideo que é pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%, ou seja,, 40% a 65%, 50% a 90%, 65% a 90%, 70% a 90%, 75% a 95 %, 80% a 95%, ou 85% a 99% idêntico a um polipeptideo nativo; (b) um polipeptideo codificado por uma sequência de ácido nucleico que é, pelo menos, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%, ou seja, 40% a 65%, 50% a 90%, 65% a 90%, 70% a 90%, 75% a 95%, 80% a 95%, ou 85% a 99% idênticas a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptfdeo nativo; (c) urn polipeptideo que contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais, ou2a5, 2 a 10, 5 a 10, 5a 15, 5 a 20, 10 a 15, ou mutações de ácidos aminados 15 a 20 (ou seja, adições, deleções e/ou substituições) em relação a um polipeptideo nativo; (d) um polipeptideo codificado pela sequência de ácido nucleico que pode hibridar sob condições de alta, moderada ou típicas de rigor de hibridação com uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo nativo; (e) um polipeptideo codificado por uma sequência de ácido nucleico que pode hibridar sob condições de alta, moderada ou típicas de rigor de hibridação com uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento de um polipeptideo nativo de pelo menos 10 aminoácidos contíguos, pelo menos 12 aminoácidos contíguos, pelo menos 15 aminoácidos contíguos, pelo menos 20 aminoácidos contíguos, pelo menos 30 aminoácidos contíguos, pelo menos 40 aminoácidos contíguos, pelo menos 50 aminoácidos contíguos, pelo menos 75 aminoácidos contíguos, pelo menos 100 aminoácidos contíguos, pelo menos 125 aminoácidos contíguos, pelo menos 150 aminoácidos contíguos, ou 10 a 20, 20 a 50, 25 a 75, 25 a 100, 25 a 150, 50 a 75, 50 a 100, 75 a 100, 50 a 150, 75 a 150, de 100 a 150, ou 100 a 200 aminoácidos contíguos; ou (f) um fragmento de um polipeptideo nativo. Os derivados também incluem um polipeptideo que compreende a sequência de aminoácidos de uma forma madura de ocorrência natural de um polipeptídeo de mamífero e uma sequência heteróloga de aminoácidos do peptideo sinal. Além disso, os derivados incluem polipeptídeos que foram quimicamente modificados por, por exemplo, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, por derivatização conhecidos grupos protetores/bloqueadores, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra porção de proteína, etc. Além disso, derivados incluem polipeptídeos que compreendem um ou mais aminoácidos não clássicos. Em uma modalidade, um derivado é isolado. Em modalidades específicas, um derivado retém uma ou mais funções do polipeptídeo nativo a partir do qual foi derivado.

[28] A percentagem de identidade pode ser determinada utilizando qualquer método conhecido por uma pessoa versada na arte. Em uma modalidade específica, a percentagem de identidade é determinada utilizando o "melhor ajuste" ou "Gap" Program of the Sequence Analysis Software Package (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin). Informações relativas às condições de hibridação (por exemplo, condições de alta, moderada, típicos e rigor) já foram publicadas anteriormente como, por exemplo, na publicação do pedido de patente US No. US 2005/0048549 (por exemplo, nos 72-73) .

[29] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" é o contexto de um fragmento de um agente proteico (por exemplo, uma proteína) se refere a um fragmento que é de 8 ou mais aminoácidos contíguos, 10 ou mais aminoácidos contíguos, 15 ou mais aminoácidos contíguos, de 20 ou mais aminoácidos contíguos, 25 ou mais aminoácidos contíguos, 50 ou mais aminoácidos contíguos, 75 ou mais aminoácidos contíguos, 100 ou mais aminoácidos contíguos, 150 ou mais aminoácidos contíguos, 200 ou mais aminoácidos contíguos, ou na gama de entre 10 a 300 aminoácidos contíguos, 10 a 200 aminoácidos contíguos, 10 a 250 aminoácidos contíguos, 10 a 150 aminoácidos contíguos, de 10 a 100 aminoácidos contíguos, de 10 a 50 aminoácidos contíguos, 50 para 100 aminoácidos contíguos, de 50 a 150 aminoácidos contíguos, de 50 a 200 aminoácidos contíguos, 50 e 250 aminoácidos contíguos, de 50 a 300 aminoácidos contíguos, de 25 a 50 aminoácidos contíguos, de 25 a 75 aminoácidos contíguos, de 25 a 100 aminoácidos contíguos, ou 75 a 100 aminoácidos contíguos de um agente proteináceo. Em uma modalidade específica, um fragmento de um agente proteico retém uma ou mais funções do agente proteico - por outras palavras, é um fragmento funcional. Por exemplo, um fragmento de um agente proteico retém a capacidade de interagir com uma outra proteína e/ou para induzir, aumentar ou ativar uma ou mais vias de transdução de sinal.

[30] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento funcional", no contexto de um agente proteico, refere-se a uma porção de um agente proteico que retém uma ou mais atividades ou funções do agente proteináceo. Por exemplo, um fragmento funcional de um receptor inibitório pode reter a capacidade de se ligar um ou mais dos seus ligantes. Um fragmento funcional de um ligante de um receptor coestimulador pode reter a capacidade de se ligarem ao receptor e/ou induzir, aumentar ou ativar uma ou mais vias de transdução de sinal mediada pela ligação ao seu receptor coestimulador do ligante.

[31] Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" refere-se a entidade não encontrada na natureza para ser associado com (por exemplo, codificado por e/ou expresso pelo genoma de) um NDV que ocorre naturalmente.

[32] Tal como aqui utilizado, o termo "humano idoso" refere-se a um ser humano de 65 anos ou mais.

[33] Tal como aqui utilizado, o termo "adulto humano" refere-se a um ser humano que tem 18 anos ou mais.

[34] Tal como aqui utilizado, o termo "jovem humano" refere-se a um ser humano que tem 1 ano a 18 anos de idade.

[35] Tal como aqui utilizado, o termo "criança humana" refere-se a um ser humano que é de 1 ano a 3 anos de idade.

[36] Tal como aqui utilizado, o termo "lactente humano" refere-se a um ser humano recém-nascido a 1 ano de idade.

[37] Em certas modalidades, os termos "altamente fusogênico" e "aumento da atividade fusogênica", e semelhantes, tal como aqui utilizado, refere-se a um aumento na capacidade do NDV para formar sincícios que envolvem um grande número de células. Em uma modalidade especifica, as células infectadas com um NDV descrito aqui que é manipulada para expressar uma proteína F mutada têm uma capacidade aumentada para formar sincícios em relação às células infectadas com o vírus parental a partir do qual o vírus é derivado, o qual o vírus parental tem uma proteína F não mutada. Em uma outra modalidade específica, a cerca de 10% a cerca de 25%, cerca de 25% a cerca de 50%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 50% a cerca de 75%, cerca de 50% a cerca de 95%, ou cerca de 75% a cerca de 99% ou cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais das células infectadas com um NDV aqui descritas que são manipuladas para expressar uma forma proteína F mutada de sincícios em relação ao número de células formadoras de sincícios que estão infectadas com o vírus parental a partir do vírus quimérico é derivado possuindo uma proteína F não mutada. Em certas modalidades, o sincícios são quantificados microscopicamente contando-se o número de núcleos por sincícios após um certo período de tempo (por exemplo, cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, cerca de 12 horas a cerca de 24 horas, cerca de 24 horas a cerca de 36 horas, ou cerca de 36 horas até cerca de 48 horas).

[38] Tal como aqui utilizado, o termo "antagonista de interferon"refere-se a um agente que reduz ou inibe a resposta imunitária celular interferon. Em uma modalidade, um antagonista de interferon é um agente proteináceo que reduz ou inibe a resposta imunitária celular interferon. Em uma modalidade específica, um antagonista do interferon é uma proteína viral ou polipeptideo que reduz ou inibe a resposta de interferon celular.

[39] Em uma modalidade específica, um antagonista do interferon é um agente que reduz ou inibe a expressão e/ou atividade do interferon. Em uma modalidade, o antagonista do interferon reduz ou inibe a expressão e/ou atividade de IFN tipo I. Em uma outra modalidade, o antagonista do interferon reduz ou inibe a expressão e/ou atividade de IFN de tipo II. Em uma outra modalidade, o antagonista do interferon reduz ou inibe a expressão e/ou atividade de IFN de tipo III. Em uma modalidade específica, o antagonista de interferon reduz ou inibe a expressão e/ou atividade de qualquer IFN-α, IFN-β ou ambos. Em uma outra modalidade específica, o antagonista de interferon reduz ou inibe a expressão e/ou a atividade de IFN-y. Em uma outra modalidade, o antagonista do interferon reduz ou inibe a expressão e/ou atividade de uma, duas ou todas de IFN-α, IFN-β, e IFN-y.

[40] Em certas modalidades, a expressão e/ou a atividade de IFN-α, IFN-β e/ou IFN-y em um ovo embrionado ou célula é reduzida de cerca de 1 a cerca de 100 vezes, cerca de 5 a cerca de 80 vezes, cerca de 20 a cerca de 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, cerca de 1 a cerca de 5 vezes, cerca de 40 a cerca de 80 vezes, ou 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes por um antagonista de interferon em relação à expressão e/ou a atividade de IFN-α, IFN-β, e/ou IFN-Y θm um ovo embrionado de controle ou uma célula não expressando ou não contatando com um antagonista de interferon, tal como medido por meio das técnicas aqui descritas ou conhecidas por um perito na arte. Em outras modalidades, a expressão e/ou a atividade de IFN-α, IFN-β e/ou IFN-y θm um ovo embrionado ou célula é reduzida em pelo menos 20% a 25%, pelo menos 25% a 30%, em menos 30% a 35%, pelo menos 35% a 40%, pelo menos 40% a 45%, pelo menos 45% a 50%, pelo menos 50% a 55%, pelo menos 55% a 60%, pelo menos 60 % a 65%, pelo menos 65% a 70%, pelo menos 70% a 75%, pelo menos 75% a 80%, pelo menos 80% a 85%, pelo menos 85% a 90%, pelo menos 90% de 95%, pelo menos 95% a 99% ou em 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% por um antagonista de interferon em relação à expressão e/ou a atividade de IFN-α, IFN-β, e/ou IFN-y em um ovo embrionado de controle ou uma célula que não expressa ou contata com um antagonista, tal como o interferon medido pelas técnicas aqui descritas ou conhecidas por uma pessoa versada na arte.

[41] Tal como aqui usado, as frases "sistemas deficientes IFN" ou "substratos deficientes IFN"referem-se a sistemas, por exemplo, células, linhagens celulares e animais, tais como camundongos, galinhas, perus, coelhos, ratos, cavalos, etc., os quais não fazem produzir um, dois ou mais tipos de IFN, ou não produz qualquer tipo de IFN, ou produzir níveis baixos de um, dois ou mais tipos de IFN, ou produzir níveis baixos de qualquer IFN (ou seja, uma redução de qualquer expressão de IFN de 5 a 10%, 10 a 20%, 20 a 30%, 30 a 40%, 40 a 50%, 50 a 60%, 60 a 70%, 70 a 80%, 80 a 90 ou mais, quando comparado ao sistemas competente IFN nas mesmas condições), não respondem ou respondem de forma menos eficiente para um, dois ou mais tipos de IFN, ou que não respondem a qualquer tipo de IFN, tem uma resposta retardada de um, dois ou mais tipos de IFN, e/ou são deficientes na atividade de genes antivirais induzida por um, dois ou mais tipos de IFN, ou induzida por qualquer tipo de IFN.

[42] Tais como aqui utilizados, os termos "se liga imunoespecificamente""reconhece imunoespecificamente", "liga-se especificamente", e "reconhece especificamente" são termos análogos, no contexto de anticorpos e referem-se a moléculas que se ligam especificamente a um antígeno (por exemplo, complexo imune ou epítopo) , como entendido por um perito na arte. Uma molécula que se liga especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com menor afinidade, como determinado por, por exemplo, imunoensaios (por exemplo, ELISA), ressonância de plásmon de superfície (por exemplo, BIAcore®) , um ensaio de KINEX (usando, por exemplo, um instrumento KinExA 3000 (Instruments Sapidyne, Boise, ID)), ou outros ensaios conhecidos na arte. Em uma modalidade específica, as moléculas que se ligam especificamente a um antígeno que se liga ao antígeno com uma constante de dissociação (isto é, Ka) que é pelo menos 2 logs, 2,5 logs, 3 logs, 3,5 logs, 4 logs ou maior do que o Ka quando as moléculas se ligam a urn outro antígeno. Em uma outra modalidade específica, as moléculas que se ligam especificamente a um antígeno não apresentam reação cruzada com outras proteínas.

[43] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal"é um termo da arte e, geralmente, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos, e cada anticorpo monoclonal reconhece tipicamente um único epítopo (por exemplo, conformação de epítopo) no antígeno.

[44] Tal como aqui utilizada, a frase "multiplicidade ou infeção"ou "MOI" é o número médio de vírus por célula infectada. MOI é determinado dividindo-se o número de vírus adicionado (ml adicionadas x Pfu) pelo número de células adicionadas (ml adicionadas x células/ mL) .

[45] Tal como aqui utilizado, o termo "ligante natural" refere-se a qualquer ligante que ocorre naturalmente que se liga a um receptor de ocorrência natural. Em uma modalidade específica, o ligante é um ligante de mamífero. Em uma outra modalidade específica, o ligante é um ligante humano.

[46] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptideo nativo", no contexto de proteínas ou polipeptídeos refere-se a qualquer sequência de aminoácidos de ocorrência natural, incluindo formas imaturas ou precursoras e maduras de uma proteína. Em uma modalidade específica, o polipeptideo nativo é uma proteína humana ou polipeptideo.

[47] Tal como aqui utilizado, o termo "receptor nativo" se refere a qualquer receptor de ocorrência natural que se liga a um ligante que ocorre naturalmente. Em uma modalidade específica, o receptor é um receptor de mamífero. Em uma outra modalidade específica, o receptor é um receptor humano.

[48] Tal como aqui utilizado, os termos "sujeito" ou "paciente" são utilizados alternadamente. Tal como aqui utilizado, os termos "sujeito" e "sujeitos"referem-se a um animal. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, incluindo um não primata (por exemplo, um camelo, burro, zebra, vaca, cavalo, gato, cão, rato e camundongo) e um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé, e um ser humano). Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não-humano. Em certas modalidades, o indivíduo é um animal de estimação (por exemplo, cão ou gato) ou animal de criação (por exemplo, um cavalo, um porco ou uma vaca) . Em outras modalidades, o sujeito é um ser humano. Em certas modalidades, o mamífero (por exemplo, humanos) possui de 0 a 6 meses de idade, 6 a 12 meses de idade, 1 a 5 anos, 5 a 10 anos, 10 a 15 anos, de 15 a 2 0 anos de idade, de 2 0 a 2 5 anos de idade, 25 a 30 anos, 30 a 35 anos, 35 a 40 anos, 40 a 45 anos, 45 a 50 anos, 50 a 55 anos, 55 a 60 anos, 60 a 65 anos idade, 65 a 7 0 anos, 7 0 a 75 anos, 75 a 80 anos, 80 a 85 anos, 85 a 90 anos, 90 a 95 anos de idade ou 95 a 100 anos de idade. Em modalidades específicas, o sujeito é um animal que não é uma ave.

[49] Tais como aqui utilizados, os termos "tratar" e "tratamento", no contexto da administração de uma terapia referem-se a um tratamento/ terapia de que um sujeito recebe um efeito benéfico, tais como a redução, redução, atenuação, diminuição, estabilização, remissão, supressão, inibição ou paragem do desenvolvimento ou progressão de câncer, ou de seu sintoma. Em certas modalidades, o tratamento/terapia que um sujeito recebe resultados de, pelo menos, um ou mais dos seguintes efeitos: (i) a redução ou melhoria da severidade do câncer e/ou um sintoma associado com o mesmo; (ii) a redução da duração de um sintoma associado com o câncer; (iii) a prevenção da recorrência de um sintoma associado com câncer; (iv) a regressão do câncer e/ou um sintoma associado com o mesmo; (v) a redução da hospitalização de um sujeito; (Vi) a redução no tempo de internação hospitalar; (vii) o aumento da sobrevivência de um sujeito; (viii) a inibição da progressão do câncer e/ou um sintoma associado com o mesmo; (ix) o aumento ou melhoria do efeito terapêutico de uma outra terapia; (x) a redução ou a eliminação na população de células de câncer; (xi) uma redução no crescimento de um tumor ou neoplasma; (xii) uma redução no tamanho do tumor; (xiii) uma redução na formação de um tumor; (xiv) a erradicação, remoção ou controle de câncer primário, regional e/ou metastático; (xv) uma diminuição no número ou tamanho das metástases; (xvi) a redução da mortalidade; (xvii) um aumento na taxa de sobrevivência livre do câncer dos pacientes; (xviii) um aumento na sobrevida livre de recidiva; (cix) um aumento do número de pacientes em remissão; (Xx) uma diminuição na taxa de hospitalização; (xxi) o tamanho do tumor é mantido e não aumentam de tamanho ou aumenta o tamanho do tumor em menos de 5% ou 10% após a administração de uma terapia, tal como medido por métodos convencionais disponíveis para uma pessoa versada na arte, tais como ressonância magnética, raio-X, e tomografia computorizada; (xxii) a prevenção do desenvolvimento ou aparecimento de câncer e/ou um sintoma associado com o mesmo; (xxiii) um aumento no comprimento de remissão em pacientes; (xxiv) a redução no número de sintomas associados com o câncer; (xxv) um aumento na sobrevida livre de sintomas de pacientes com câncer; e/ou (xxvi) limitação ou a redução na metástase. Em algumas modalidades, o tratamento/terapia que um sujeito recebe não cura o câncer, mas impede a progressão ou agravamento da doença. Em certas modalidades, o tratamento/ terapia que um sujeito recebe não impede o aparecimento/ desenvolvimento de câncer, mas pode prevenir o aparecimento de sintomas de câncer.

[50] Tal como aqui utilizado, o termo "em combinação" no contexto da administração da terapia ou terapias a um sujeito, refere-se ao uso de mais do que uma terapia. 0 uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um sujeito. Uma primeira terapia pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequentemente ao (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, uma semana, duas semanas, três semanas, 4 semanas, cinco semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) a administração de uma segunda terapia a um suj eito.

[51] Tais como aqui utilizados, os termos "terapias" e "terapia" podem referir-se a qualquer protocolo(s), o método(s), e/ou agente (s) que pode ser utilizado no tratamento de câncer. Em certas modalidades, os termos "terapias" e "terapia"referem-se à terapia biológica, a terapia de suporte, a terapia hormonal, quimioterapia, imunoterapia e/ou outras terapias, úteis no tratamento de câncer. Em uma modalidade específica, uma terapia inclui a terapia adjuvante. Por exemplo, usando uma terapia em conjunto com uma terapia de drogas, terapia biológica, cirurgia e/ou terapia de suporte. Em certas modalidades, o termo "terapia"refere-se a um NDV quimérico aqui descrito. Em outras modalidades, o termo "terapia"refere-se a um agente que não é um NDV quimérico

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[52] Figura 1. A infecção NDV regula positivamente a expressão de MHC I, II do MHC, e ICAM-1 na superfície das células infectadas in vitro,B16-F10 (24 horas pós- infecção).

[53] Figuras 2A-2E. Tratamento intratumoral NDV leva à infiltração com macrófagos, células NK, células efetoras CD8 e CD4 e diminui a freqüência de Tregs. A) Esquema geral do estudo. B) total CD45+ infiltrados. C) Total de infiltrados de células imunes. D) Gráficos de pontos da citometria representante do fluxo dos subconjuntos CD4 FoxP3+ e FoxP3-. E) Taxas Teff/Treg e CD8/Treg.

[54] Figuras 3A-3C. Terapia com NDV apresenta efeitos favoráveis sobre o microambiente do tumor de tumores distantes. A) Gráficos de pontos da citometria representante de fluxo dos subconjuntos CD4 FoxP3+ e FoxP3-. B) Números absolutos de células efetoras CD4, Treg, e CD8 por grama de tumor. C) Taxas Tef/Treg e CD8/Treg.

[55] Figuras 4A-4C. Os linfócitos que infiltram tumores distantes regulam positivamente os marcadores de ativação, líticas, e proliferação. Gráficos representativos da expressão nas células efetoras CD4 (esquerda) e as porcentagens correspondentes nas efetoras CD4, CD8, Tregs (direita) são mostradas para A) CD44, B) Granzima B, e C) Ki-67.

[56] Figuras 5A-5D. Monoterapia NDV retarda o crescimento de tumores distantes e proporciona alguma proteção contra a subsequente provocação do tumor. Tumores dos flancos bilaterais foram estabelecidos, tal como descrito na Figura 2A e os animais foram tratados e seguido para a sobrevivência. A) 0 crescimento dos tumores do lado direito (tratado) . B) 0 crescimento dos tumores do lado esquerdo (não-tratados). C) A sobrevida global. Os números nas caixas indicam a porcentagem dos animais livres de tumores. D) Sobrevivência em animais curados de melanoma B16-F10 por NDV desafiados novamente no dia 75 com células de melanoma B16-F10. Os resultados representativos de duas experiências diferentes com 10 ratos por grupo.

[57] Figuras 6A-6B. linfócitos que infiltram tumores a partir de tumores tratados e não tratados regulam positivamente CTLA-4 na resposta à terapia de NDV. A) Gráficos de pontos representativos da expressão CTLA-4 em efetoras CD8, CD4, e Tregs em tumores (tratado) na direita. B) Gráficos de pontos representativos da expressão CTLA-4 em efetoras CD8, CD4, e Tregs em tumores (não-tratados) esquerdo.

[58] Figura 7A-7C. A terapia de combinação com NDV e CTLA-4 melhora o bloqueio o efeito antitumor nos tumores injetados e distantes. Tumores do lado B16 bilaterais foram estabelecidos e os animais foram tratados como descrito na Figura 2A, com ou sem anti-CTLA-4 9H10. A) Crescimento de tumores tratados. B) Crescimento de tumores distantes. Os números nas caixas representam percentagem de ratos livres de tumores. C) Sobrevida em longo prazo. Os resultados representativos de duas experiências diferentes, com 10 ratos por grupo.

[59] Figura 8. Terapia de combinação com NDV e anti-CTLA-4 é sistemicamente eficaz contra tumores da próstata TRAMP não permissiva de vírus. Tumores TRAMP lado do esquerdo (dia 3) e direito (dia 12) foram estabelecidos e os animais foram tratados com NDV tal como descrito na Figura 2A, com ou sem anticorpo anti-CTLA-4 sistémico. Crescimento dos tumores do lado esquerdo (não-injetado) é mostrado. Os números nas caixas indicam a porcentagem dos animais livres de tumores.

[60] Figura 9A-9C. Infecção por NDV regula positivamente a expressão de DP-L1 em tumores B16-F10. A) Expressão de superfície de PD-L1 em células B16-F10 infectadas com NDV por 24 horas. B) Expressão de superfície de PD-L1 em células B16-F10 infectadas com NDV sobrenadante inativado por UV a partir de células B16-F10 infectadas. C) A regulação positiva de PD-L1 sobre a superfície de células tumorais isoladas de tumores injetados e distantes dos animais tratados, como na Figura 2A (Gráficos de pontos da citometria representativos de painéis esquerdo 2, médias calculadas painel da direita - médias calculas de cinco ratos por grupo).

[61] Figuras 10A-10F. A terapia de combinação com NDV e anti-DP-1 é sistemicamente eficaz contra o melanoma B16 e resulta no aumento da infiltração de células T com a regulação positiva de marcadores de ativação. A) A sobrevida global. Os animais foram tratados como descrito na Figura 2A, com ou sem anticorpo anti-DP-1. B) Números absolutos de células efetoras CD45, CD3, CD8, CD4 e em tumores. C) Porcentagem relativa de células T regulatórias em linfócitos infiltrantes tumorais. D-E) Linfócitos que infiltram tumores distantes foram isolados e coradas para expressão de ICOS (D) e Granzima B (E) . F) Linfócitos que infiltram tumores foram reestimuladas com células dendríticas carregadas com tumor lisados e avaliadas para a expressão da gama IFN por coloração de citocinas intracelulares.

[62] Figura 11. A terapia de combinação com NDV e CTLA-4 induz a regulação positiva de células efetoras CD4 ICOS e em tumores distantes e nódulos linfáticos que drenam tumor (TDLN).

[63] Figuras 12A-12D. Geração e avaliação in vitro de vírus NDV-ICOSL. A) Esquema de construção genômica virai. B) Expressão de ICOSL na superfície das células B16-F10 infectadas durante 24 horas (histograma representativo, para a esquerda e média de 3 amostras por grupo, à direita) . C) Atividade citolítica de NDV nas células B16-F10 infectadas determinadas pelo ensaio de LDH. D) Replicação de NDV recombinante nas células B16-F10.

[64] Figuras 13A-13C. Terapia de combinação com NDV-mICOSL e anti-CTLA-4 protege camundongos do desafio ao tumor contralateral e resulta em sobrevivência a longo prazo dos animais. Os animais foram desafiados com uma dose maior do tumor e foram tratados com NDV, tal como descrito na Figura 2A, com ou sem anticorpo anti-CTLA-4 sistémico. Crescimento dos tumores do lado esquerdo (não-injetado) é mostrado. B) A sobrevida em longo prazo. Os números nas caixas indicam a porcentagem dos animais protegidos de tumores. Conjunto de dados de 3 experiências diferentes de 5 a 10 ratos por grupo. C) Os ratos tratados com terapia de combinação desenvolvem vitiligo nos locais nateriores do tumor, mas não sistemicamente.

[65] Figura 14A-14B. Terapia de combinação com NDV-mICOSL e anti-CTLA-4 protege camundongos do desafio ao tumor contralateral e resulta na sobrevivência a longo prazo dos animais no modelo de carcinoma de cólon CT26. Os animais foram desafiados com uma dose maior do tumor e tratados com NDV, tal como descrito na Figura 2A, com ou sem anticorpo anti-CTLA-4 sistémico. Crescimento dos tumores do lado esquerdo (não-injetado) é mostrado. Os números nas caixas indicam a porcentagem dos animais protegidos de tumores. B) Sobrevida em longo prazo. Experiência representativa com 5 a 10 ratos por grupo (A) dados agrupados de dois experimentos diferentes de 5 a 10 ratos por grupo (B).

[66] Figuras 15A-15C. Tratamento de NDV leva a tumor B16 distante que infiltram com macrófagos, células NK, células efetoras CD8 e CD4 e diminui a frequência de Tregs. A) Total de infiltrados CD45+, CD3+, CD8+, CD4+FoxP3-(Tef), e CD4+FoxP3+ (Treg). B) Tef/Treg e CD8/Treg Taxas. C) Total de infiltrados celulares de macrófagos, NK e NKT.

[67] Figura 16A-16B. Linfócitos que infiltram tumores B16 distantes regula positivamente os marcadores de ativação, líticas, e proliferação. Representante Ki-67, Granzima B (GRB) e ICOS parcelas de expressão (A) e as porcentagens correspondentes nas efetoras CD4 e CD8 (B).

[68] Figura 17. Linfócitos que infiltram tumores de animais tratados que secretam IFN-gama em resposta à estimulação com DC's carregados com lisados de células B16- F10. Gráficos de pontos representativos são mostrados.

[69] As figuras 18A-18B. Os animais curados por terapia de combinação são protegidos de outro desafio do tumor. A) Melanoma B16-F10, dia 120 novo desafio com 1 x 105 células. B) Carcinoma de cólon CT26, dia 90 novo desafio com 1 x 106 células. Os resultados representativos de duas experiências diferentes com 10 ratos por grupo.

[70] Figura 19A-19B. Proteína quimérica recombinante ICOSL-F é eficientemente expressa na superfície. A) Representação esquemática da proteína quimérica. B) Expressão da proteína de fusão quimérica ICOSL-Ftm na superfície de células transfectadas.

[71] Figura 20A-20D. Infecção por NDV é restrita ao tumor injetado. A) Recombinante NDV-Fluc foi administrado de modo intratumoral (IT) ou intravenoso (IV) em animais de Balb/C portadores de tumores CT26 e imagens foram adquiridas ao longo das próximas 72 horas. B) NDV-Fluc foi administrado a ratos C57BL/6 portadores de tumores de melanoma B16-F10 bilaterais e os animais foram monitorados durante 120 horas. Imagens de luminescência representativas são mostradas. C) Quantificação de luminescência a partir do local do tumor normalizada ao fundo de luminescência. D) A área sob a curva (AUC) calculada dos dados no painel (C) . Os dados mostram resultados representativos de 1 de 3 experiências independentes com 3 a 5 ratos/grupo. ***P<0,001.

[72] Figura 21A-21F. Infecção por NDV aumenta a infiltração de leucócitos nos tumores injetados com vírus. Os animais foram tratados de acordo com o esquema descrito na figura 22A. Os tumores foram excisados no dia 15, e TILs foram marcados e analisados por citometria de fluxo. A) Gráficos de pontos de citometria representando de porcentagens células CD45+ e CD3+ que infiltram o tumor. B) Números absolutos de células CD45+/g tumor. C) Números absolutos de células imune inata/g tumor. D) Gráficos representativos dos percentuais de células CD4+FoxP3+ (Treg) e CD4+FoxP3-(T conv). E) Números absolutos de células convencionais e regulatótias células CD4+ e CD8+/g tumor. F) Taxas Tconv/Treg e CD8+/Treg calculadas de tumores. Os dados representam os resultados cumulativos de três experimentos independentes com 3 a 5 ratos/grupo. A média +/-SEM é mostrada. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001.

[73] Figura 22A-22M. NDV aumenta os linfócitos que infiltram tumores distantes e atrasa o crescimento do tumor. A) esquema de tratamento. B) Gráficos de pontos da citometria representante das porcentagens de células CD3+ CD45+ e que infiltram o tumor. C) Números absolutos de células CD45+/g tumor. D) Números absolutos de células imune inata/g tumor. E) Secções tumorais de tumores distantes foram coradas com H & E (painéis superiores) ou rotulados para CD3 e FoxP3 (painéis inferiores) e analisados por microscopia. Áreas indicadas por setas indicam áreas de necrose e infiltrado inflamatório. As barras de escala representam 200 pm. F) Gráficos de pontos da citometria representante de porcentagens de CD4+FoxP3-(Tconv) e células CD4+FoxP3 + (Treg). G) Números absolutos de células convencionais de regulação de células CD4+ e CD8+/g tumor calculado a partir de citometria de fluxo. H) Porcentagens relativas de Tregs fora das células CD45+. I) Taxas Tconv/Treg e CD8+/Treg calculadas. (J, K) Regulação positiva de ICOS, Ggranzima B, e Ki-67 em Tconv que se infiltram no tumor (J) e células CD8+ (K) . L) Crescimento de tumores distantes e injetados NDV. M) A sobrevida global animal. Os dados representam os resultados cumulativos de 3 (BK) ou 2 experiências independentes (L-M) com n = 3 a 5 por grupo. A média +/-SEM é mostrada. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****p<o,0001.

[74] Figuras 23A-23E. Terapia NDV aumenta linfócitos que infiltram tumores distantes em modelo de melanoma dos pés bilateral. Os animais portadores de tumores de melanoma foram tratados de acordo com a programação descrita na Figura 22A. Os tumores distantes foram excisados no dia 15 e TILs foram marcados e analisados por citometria de fluxo. A) Gráficos de pontos da citometria representante das porcentagens de que infiltram o tumor células CD45+ e CD3+. B) Gráficos de pontos da citometria representante de porcentagens de células CD4+Foxp3+ e CD4+FoxP3-. C) Números absolutos de células convencionais e regulamentares CD4+ e CD8+/g tumor. D, E) A regulação positiva de ICOS, Granzima B, e Ki-67 em linfócitos que se infiltram em tumor CD8+ (D) e Tconv (E) . Os dados mostram resultados representativos de 1 de 2 experimentos independentes com 5 ratos/grupo. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001.

[75] Figura 24A-24I. NDV induz a infiltração de linfócitos específicos de tumores adotivamente transferidos e facilita a inflamação do tumor. A) esquema de tratamento. B) Imagens representativas de iluminescência de animais tratados com NDV e linfócitos TRP1-FLUC adotivamente transferidos. C) Quantificação média de luminescência dos locais do tumor. D) A área sob a curva (AUC) calculada a partir dos dados no painel (C). E) Número absoluto de linfócitos PMEL de tumores distantes calculados da citometria de fluxo. F) Gráficos de pontos da citometria representantes das porcentagens de células CD3+ CD45+ que se infiltram nos tumores distantes dos animais tratados pelo regime de tratamento no painel (A) . G) Esquema experimental da transferência de soro de animais tratados intratumoralmente com injeção única de NDV ou PBS. H) Gráficos de pontos da citometria das porcentagens de células CD3+ CD45+ que se infiltram nos tumores injetados no soro. I) Números absolutos do conjunto de células indicada nos tumores injetados no soro, calculados da citometria de fluxo. Dados para os B-E representam 1 de 3 experimentos com n = 4-5 por grupo. Os dados reunidos dos painéis G-I representam dados de dois experimentos independentes com n = 5 por grupo. A média +/-SEM é mostrada. *P<0,05, **P<0,01, ***p<0,001, ****P<0,0001.

[76] Figura 25. NDV intratumoral fornece proteção contra o tumor redesafiado. Animais curados de melanoma B16- F10 receberam injeções de NDV no dia 75 com lxlO5 células de melanoma B16-F10, monitorados para o crescimento tumoral, e sacrificados quando os tumores atingiram lOOOmm3. A sobrevida global do animal é mostrada. Os dados mostram os resultados cumulativos de 1 de 2 experimentos independentes com 10 ratos/grupo. ****P<0,0001.

[77] Figura 26A-26B. Linfócitos CD8+ que infiltram tumores regulam positivamente CTLA-4 em resposta à terapia de NDV. Gráficos de pontos representativos (esquerda) e dos resultados cumulativos (direita) da expressão CTLA-4 em células CD8+ nos tratados com NDV (A) , e tumores distantes (B) . Os resultados representativos de 1 de 3 experiências, com três ratos por grupo. *P<0,05.

[78] Figura 27A-27K. NDV e CTLA-4 bloqueiam a sinergia para rejeitar tumores locais e distantes. A) esquema de tratamento. B) Crescimento de tumores B16-F10 tratados com vírus (lado direito). C) Crescimento de tumores B16-F10 distante (lado esquerdo). D) Sobrevivência a longo prazo no modelo B16-F10. E) , Animais sobreviventes foram injetados com lxlO5 células B16-F10 no lado direito no dia 90 e deixados para a sobrevivência. Os dados representam os resultados cumulativos de três experimentos com n = 6-11 por grupo. F) Crescimento de tumores TRAMP C2 lado esquerdo distante e (lado direito) tratado com vírus. G) Sobrevivência a longo prazo no modelo TRAMP C2. H) Sensibilidade in vitrode células B16-F10 e células TRAMP C2 para lise mediada por NDV em diferentes multiplicidades de infecção (MOI 's). I-K) Regulação positiva de MHC I, MHC II, CD80, e CD86 em células B16-F10 e TRAMP C2 infectadas com NDV. Pontos de citometria de fluxo representativos de células B16-F10 (I) Média da intensidade de fluorescência calculada (MFI) por B16-F10 (J) e células TRAMP C2 (K) são mostradas. Média +/- SEM é mostrada. Os dados representam os resultados de 1 de 3 (B-E) , ou 1 de 2 (F, G) experimentos independentes com n = 5 a 10 por grupo. *P<0,05, **P<0,01, ***p<0,001, ****P<0,0001.

[79] Figura 28A-28E. Efeito antitumoral sistémico está restrito ao tipo de tumor injetado. A) Animais foram injetados no lado direito com o melanoma B16-F10, carcinoma do cólon MC38, ou PBS, e no lado esquerdo com células B16- F10 e tratados como descrito no esquema. B, C) Crescimento de tumores distantes (B) e sobrevivência global (C) dos animais que receberam B16-F10 no lado direito ou nada deste lado. Os dados mostram resultados representativos de 1 de 2 experimentos independentes com 5 a 10 ratos/grupo. D, E) Crescimento de tumores distantes (D) e sobrevivência global (E) dos animais que receberam tumores B16-F10 ou MC38 no lado direito. Dados representam resultados de 1 de 2 experiências independentes com n = 10 por grupo. **P<0,01, ****p<0,0001.

[80] Figura 29A-29E. A terapia de combinação com NDV e anti-CTLA-4 aumenta a infiltração do tumor com células do sistema imune adaptativa e inata. Os animais foram tratados com a terapia de combinação, tal como descrito na Figura 27A. Os tumores foram colhidos no dia 15 e analisados para infiltrar células imunes através de citometria de fluxo. A) Números absolutos de células CD45+/g tumor. B) Números absolutos de CDllb+ e NK 1.1+ células/g tumor. C) Números absolutos de células convencionais e regulamentares CD4+ e CD8+ células/g tumor. D) Porcentagens relativas de Tregs fora das células CD45+. E) Tconv/Treg calculado e taxas de CD8+/Treg. Os dados representam resultados acumulados de quatro experimentos independentes com 3-5 ratos/grupo. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001.

[81] Figura 30A-30J. A terapia de combinação com NDV e bloqueio CTLA-4 induz alterações inflamatórias em tumores distantes. Os animais foram tratados pelo esquema na Figura 27A. Os tumores foram colhidos no dia 15 e analisados para infiltração de células imunes. A) Secções de tumores de tumores distantes foram coradas com H&E (painéis superiores) ou por CD3 e FoxP3 (painéis inferiores) e analisadas por luz e microscopia de fluorescência, respectivamente. Áreas indicados por setas indicam necrose e infiltrados inflamatórios. As barras de escala representam 200 pm. B) Número absoluto de tumor infiltrante CD45+ e CD3+ células/g tumor calculado a partir de citometria de fluxo. C) Pontos da citometria de fluxo representante da percentagem de células CD4+ e CD8+ que se infiltram no tumor, selecionadas da população de CD45+. D) números absolutos de células Tconv, Treg e CD8+ por grama de tumor. E) Porcentagens relativas de Tregs fora das células CD45+ que se infiltram no tumor. F) Taxas Tconv/Treg e CD8+/Treg calculadas. G-I) Regulação positiva de ICOS, Granzima B, e Ki-67 em CD8+ que se infiltra em tumores e linfócitos Tconv. Pontos representantes da citometria de fluxo (painéis superiores) e resultados acumulados (painéis inferiores) são mostrados. J) TILs foram reestimuladas com DC's pulsadas com lisados do tumor B16-F10, e a produção de IFNy foram determinadas por coloração de citocinas intracelulares. Pontos representantes da citometria de fluxo (painel esquerdo) e resultados acumulados (painel direito) são mostrados. Os dados representam os resultados cumulativos de 5 (A-I) ou 2 (J) experiências independentes com n = 3-5 por grupo. Média +/- SEM é mostrada. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****p<0,0001.

[82] Figura 31. Os anticorpos para CD8, CD4, e NK1.1 esgotar as células de interesse in vivo. Anticorpos que destroem foram injetados como discutido em Materiais e Métodos na Seção 7.1, infra. As amostras de sangue foram recolhidas no dia 5 e processadas por citometria de fluxo de células CD4+, CD8+ e células NK com anticorpos não de reação cruzada. A coloração positiva é representada pelas barras horizontais. Gráficos representativos de 1 de 2 experimentos independentes com cinco ratos por grupo são mostrados.

[83] Figura 32A-32F. A atividade antitumoral da terapia de combinação NDV depende de células CD8+ e NK e interferões do tipo I e tipo II. A-C) Os animais foram tratados, tal como descrito na Fig. 27A, com ou sem anticorpos de esgotamento para células CD4+, CD8+, NK, ou IFNy. A) Crescimento de tumores injetados. B) Crescimento de tumores distantes. C) Sobrevida em longo prazo. D-F) RIFNA - /- ou ratos pareados por idade C57BL/6 (BL/6) foram tratados tal como descrito na Fig. 3A e monitorados para o crescimento do tumor. D) Crescimento de tumores injetados. E) Crescimento de tumores distantes. F) Sobrevida a longo prazo. Os dados para todos os painéis representam os resultados cumulativos de dois experimentos independentes com n = 3-10 por grupo. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****p<0,0001.

[84] Figura 33A-33B. Terapia de NDV leva a regulação positiva de PD-L1 nos tumores e leucócitos que infiltram tumores. A). Expressão PD-L1 em células B16-F10 infectadas in vitro(painel da esquerda), e in vivo em vírus injetado e tumores distantes. Esquerda, histogramas representante da citometria de fluxo, direita, média da intensidade de fluorescência mediana (MFI) da expressão PD- LI em células B16-F10 de tumores. B) Expressão de DP-L1 sobre a superfície de leucócitos que infiltram tumores, isolada de tumores distantes. Esquerda: histogramas representante de citometria de fluxo, direita: média calculada MFI para cada subconjunto de células.

[85] Figura 34A-34D. Terapia de combinação de NDV com anticorpos bloqueadores de DP-1 conduz a um aumento da eficácia antitumor no do modelo de melanoma B16 no lado bilateral. A) Esquema de tratamento. B) Crescimento do tumor (NDV-injetado) no lado direito. C) Crescimento do tumor (distante) lado esquerdo. D) Sobrevida global.

[86] Figura 35A-35D. Terapia de combinação de NDV com anticorpos bloqueadores PD-L1 leva a eficácia antitumor melhorada no modelo de melanoma B16 no lado bilateral. A) Esquema de tratamento. B) Crescimento do tumor (NDV- injetado) no lado direito. C) Crescimento do tumor (distante) lado esquerdo. D) Sobrevida global.

[87] Figura 36A-36E. Terapia de combinação com NDV e terapia anti-DP-1 resulta em um aumento da infiltração tumoral distante com o efetor, mas não com a célula T reguladora. A) Pontos da citometria representante das porcentagens de células CD4+ e CD8+ em tumores. B) Pontos da citometria representante das porcentagens de Tconv (CD4+FoxP3-) e células Treg (CD4+FoxP3+). C) Números absolutos de subconjuntos de células T por grama de tumor, calculados da citometria de fluxo. D) Porcentagens relativas de Tregs de células CD4+ T. E) Taxas Tconv/Treg e CD8/Treg calculadas.

[88] Figura 37A-37B. TILs de tumores distantes nos animais tratados com a combinação de NDV e terapia anti-DP-1 regulam positivamente marcadores de proliferação e líticas. A) Pontos da citometria representante das porcentagens de Tconv e linfócitos CD8 positivos para Granzima B e Ki67. B) Porcentagens de Tconv e células T CD8+ positivas para Granzima B e Ki67.

[89] Figura 38A-38C. NDV induz a infiltração do tumor imune e a regulação positiva de ICOS em células CD4 e CD8 nos vírus injetados e tumores distantes. A) Esquema de tratamento. B) Expressão de ICOS em células CD4+FoxP3- e CD8+ que infiltram tumores isoladas de tumores injetados com NDV no lado direito). Pontos da citometria de fluxo representante (em cima) e intensidades de fluorescência mediana (MFI) (em baixo) são mostrados. C) Expressão de ICOS em células CD4+FoxP3- e CD8+ isoladas de tumores distantes (lado esquerdo). Pontos da citometria de fluxo representante (em cima) e intensidades de fluorescência mediana (MFI) (em baixo) são mostrados.

[90] Figura 39A-39D. Geração e avaliação in vitro do vírus NDV-ICOSL. A) Esquema de construção genômica virai. B) Expressão de ICOSL na superfície das células B16-F10 infectadas durante 24 horas (histograma representativo à esquerda e média de 3 amostras por grupo à direita) . C) Atividade citolítica de NDV nas células B16-F10 infectadas determinadas pelo ensaio de LDH. D) Replicação de NDV recombinante nas células B16-F10.

[91] Figura 40A-40F. NDV-ICOSL causa o atraso no crescimento de tumores distantes e induz uma melhor infiltração de linfócitos de tumor. Tumores B16-F10 bilaterais foram estabelecidos como anteriormente e os animais foram tratados com quatro injeções intratumorais do vírus indicado à direita do tumor. A) Crescimento de tumores injetados com vírus. B) Crescimento de tumores distantes. C) Sobrevida global. D) Números absolutos de leucócitos que infiltram tumores na direita (tumores com injeção de vírus). E) Números absolutos de leucócitos que infiltram tumores na esquerda (tumores distantes). F) Pocentagem relativa de Tregs nos tumores distantes.

[92] Figura 41A-41E. Terapia de combinação de NDV- ICOSL e CTLA-4 bloqueia resultados na rejeição dos tumores distantes e injetados do modelo B16-F10 e protege contra redesafio do tumor. A) Esquema de tratamento. B) Crescimento de tumores (à direita) injetado por vírus. C) Crescimento de tumores distantes (esquerda). D) Sobrevida global. E) Animais sobreviventes no dia 90 foram redesafiados no lado direito com 2xl05 células B16-F10 e deixado para a sobrevivência.

[93] Figura 42A-42E. Terapia de combinação de NDV- ICOSL e CTLA-4 resultados do bloqueio na rejeição dos tumores distantes e injetados do modelo CT26. A) Esquema de tratamento. B) Crescimento de tumores (à direita) injetado por vírus. C) Crescimento de tumores distantes (esquerda). D) Sobrevida global. E) Animais sobreviventes no dia 90 foram redesafiados no lado direito com lxlO6 células CT26 e deixado para a sobrevivência.

[94] Figura 43A-43J. Terapia de combinação de NDV- ICOSL e anti-CTLA-4 conduz a uma melhor infiltração do tumor com células do sistema imune adaptativa e inata. Os animais portadores de tumores bilaterais B16-F10 foram tratados de acordo com a programação descrita na figura 41A. No dia 15 os animais foram sacrificados e os tumores distantes foram processados para análise de Til's. A) Pontos da citometria de fluxo representante de células CD3+ e CD45+ pegando em toda a população de células tumorais. 0 número absoluto de células CD45+(B) , CDllb + (C) e NK1.1+ que se infiltram no tumor, e (D) por grama de tumor foi calculado a partir da citometria de fluxo. E) Números absolutos de tumores infiltrantes, CD3+, CD8+, CD4+FoxP3- (CD4eff), e CD4+FoxP3 + (Treg) por grama de tumor. F) Porcentagem relativa de Tregs de todas as células CD45+. G) Efetora calculada/Taxas de Treg. H, I, J) porcentagens relativas de células efetoras CD8+ e CD4+ que infiltram tumores positivos para ICOS, granzima B, e Ki67, respectivamente.

[95] Figura 44A-44C. Diagrama esquemático para virus NDV recombinantes adicionalmente gerados que expressam proteínas imunoestimulantes nativas e quiméricas. A) Diagrama de proteínas quiméricas da superfamília de receptores de TNF (GITRL, OX40L, 4-1BBL, CD40L) fundidas com a região transmembranar e intracelular do HN de NDV de HN no terminal N (painel superior). 0 painel inferior mostra o diagrama de proteínas quiméricas da superfamília de receptores de imunoglobulina, com domínios extracelulares anti-CD28scfv e ICOSL fundidos com a região transmembranar e intracelular de F no terminal C. B) Comprimento dos domínios extracelulares e intracelular transmembranar (HN e F) de cada uma das proteínas quiméricas descritas. C) Diagrama esquemático do local de inserção do transgene e lista de todos os NDVs recombinantes que expressam ligantes imunoestimulantes gerados por esta estratégia.

[96] Figura 45A-45C. Confirmação de salvamento do recombinante NDV. A) Ensaio de Hemaglutinação demonstrando atividade hemaglutinante positiva nos poços para NDV-HN- GITRL, NDV-aCD28scfv-F, NDV-HN-OX40L, NDV-HN-CD40L, NDV- IL15, e NDV-IL21. B) Iniciadores para a confirmação da inserção do gene nos vírus resgatado por RT-PCR. C) RT-PCR em RNA isolado a partir dos vírus resgatados.

[97] Figura 46. As células B16-F10 infectadas com NDVs recombinantes expressam os ligantes sobre a superfície. As células B16-F10 foram infectadas com o recombinante de NDV's em MOI de 2 e foram analisadas quanto à expressão do ligante de superfície por citometria de fluxo 18 horas depois. Os oontos da citometria de fluxo representante são mostrados.

[98] Figura 47. NDV-HN-4-1BBL induz aumento da infiltração de tumores distante imune. Os animais portadores de tumores de melanoma B16 bilaterais foram tratados em intratumoralmente em um único lado com o vírus indicado como anteriormente. Após três tratamentos, os animais foram sacrificados e os linfócitos que infiltram tumores de tumores distantes foram analisados por citometria de fluxo. 0 número total de células CD3, CD4+FoxP3+ (Treg), CD4+FoxP3- (Tconv) , CD8, NK, e CDllb+ que infiltram tumores por grama de tumor é mostrado.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA

[99] Em um aspecto, são aqui apresentados os vírus quiméricos da doença de Newcastle (NDVs) manipulados para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Em uma modalidade específica, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, em que o agonista é expresso. Em uma modalidade específica, são apresentados no presente documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma empacotado que codifica um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, em que o antagonista é expresso.

[100] Em outro aspecto, são aqui apresentados os métodos para a propagação NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos). Os NDVs aqui descritos (por exemplo, NDVs quiméricos aqui descritos) podem ser propagados em qualquer célula, sujeito, tecido, órgão ou animal susceptível a uma infecção por NDV.

[101] Em outro aspecto, são aqui apresentadas composições que compreendem um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em uma modalidade específica, são apresentadas no presente documento composições farmacêuticas compreendendo um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento composições farmacêuticas que compreendem células cancerosas infectadas com um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito), e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, são apresentados no presente documento composições farmacêuticas compreendendo concentrado de proteína a partir de células de câncer infectadas com NDV lisadas (por exemplo, células cancerosas infectadas com NDV quimérico), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[102] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para a produção de composições farmacêuticas compreendendo um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito). Em uma modalidade, um método para a produção de uma composição farmacêutica que compreende: (a) propagar um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito aqui) em uma linhagem celular que é susceptível a uma infecção de NDV; e (b) recolher a progenitura viral, em que o vírus é cultivado em quantidades suficientes e sob condições suficientes para que o vírus esteja livre de contaminação, de modo que a progenitura viral seja adequada para a formulação em uma composição farmacêutica. Em uma outra modalidade, um método para a produção de uma composição farmacêutica inclui: (a) propagar um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito) em um ovo embrionado; e (b) recolher a progenitura viral, em que o vírus é cultivado em quantidades suficientes e sob condições suficientes para que o vírus esteja livre de contaminação, de modo que a progenitura viral seja adequada para a formulação em uma composição farmacêutica.

[103] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para o tratamento do câncer utilizando um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou uma composição que compreende um NDV quimérico. Em uma modalidade específica, um método para o tratamento do câncer que compreende a infecção de uma célula de cancerosa em um sujeito com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, uma quantidade eficaz de um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra) ou uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um NDV quimérico, presentemente descrito, é administrada a um sujeito para tratar o câncer. Em modalidades específicas, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um sinal inibitório de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune) , em que o agonista e/ou antagonista são expressos pelo NDV. Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada. Em certas modalidades, dois ou mais NDVs quiméricos são administrados a um sujeito para tratar o câncer.

[104] Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, células cancerosas infectadas com um NDV quimérico descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, as células cancerosas foram tratadas com radiação gama antes da administração ao sujeito ou incorporação na composição. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de câncer que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, um concentrado de proteína ou fragmentos de membrana plasmática de células de câncer infectadas com NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra), ou sua composição. Em modalidades específicas, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um sinal inibitório de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune), em que o agonista e/ou antagonista são expressos pelo NDV. Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada, que é expresso por NDV.

[105] Em outro aspecto, são aqui apresentados métodos para o tratamento do câncer utilizando um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico, tal como descrito na Seção 5.2, infra) ou uma composição compreendendo, tal NDV em combinação com uma ou mais outras terapias. Em uma modalidade são aqui apresentados métodos para tratar o câncer compreendendo administrar a um sujeito de um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico, tal como descrito na Seção 5.2, infra) e uma ou mais outras terapias. Em uma outra modalidade são aqui apresentados métodos para tratar o câncer compreendendo administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de um NDV descrito aqui ou uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um NDV descrito aqui, e uma ou mais outras terapias. 0 NDV e uma ou mais outras terapias podem ser administrados ao mesmo tempo ou sequencialmente, ao sujeito. Em certas modalidades, o NDV e uma ou mais outras terapias são administradas na mesma composição. Em outras modalidades, o NDV e uma ou mais outras terapias são administradas em composições diferentes. 0 NDV e uma ou mais outras terapias podem ser administrados pelas mesmas ou diferentes vias de administração ao sujeito.

[106] Qualquer tipo ou cepa de NDV pode ser utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita, incluindo, mas não se limitando às cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, os vírus recombinantes mutagenizados, e/ou vírus geneticamente modificados. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em combinação com um ou mais outras terapias é uma cepa de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, o NDV usado em combinação com uma ou mais outras terapias é um NDV quimérico. Em uma modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreende uma citoquina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17 ou IL-21). Em modalidades específicas, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma que compreende um antígeno tumoral. Em modalidades específicas, o antígeno tumoral é expresso por células infectadas com NDV quimérico. Em uma outra modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo uma molécula pró-apoptótica (por exemplo, Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxa, Puma, AIF, FasL, e TRAIL ou uma molécula anti-apoptótica (por exemplo, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, e XIAP. Em modalidades específicas, a molécula pró- apoptótica ou molécula anti-apoptótica é expressa por células infectadas com NDV quimérico. Em uma outra modalidade específica, o NDV quimérico compreende um genoma empacotado, o genoma compreendendo um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (por exemplo, um agonista de um receptor coestimulador de uma célula imune) e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (por exemplo, um antagonista de um receptor inibitório de uma célula imune). Em modalidades específicas, o agonista e/ou antagonista são expressos por células infectadas com NDV quimérico. Em certas modalidades, o genoma do NDV também compreende uma proteína F mutada, um antígeno tumoral, um antagonista de interferon heterólogo, uma molécula pró- apoptóticas e/ou uma molécula anti-apoptótica. Em certas modalidades, os uma ou mais terapias utilizadas em combinação com um NDV aqui descrito é uma ou mais outras terapias descritas na Seção 5.6.4 infra. Em modalidades particulares, as uma ou mais terapias utilizadas em combinação com um NDV aqui descritas é um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Ver, por exemplo, Seção 5.2.1, infra, para exemplos de agonistas de um sinal coestimulador de uma célula imune e antagonistas de um sinal inibidor de uma célula imune. Em uma modalidade específica, o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune é o anticorpo anti-CTLA-4 descritos na Seção 6, infra. Em uma outra modalidade específica, o agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune é o ligante de ICOS descrito na Seção 6, infra.

5.1 VÍRUS DA DOENÇA NEWCASTLE

[107] Qualquer tipo ou cepa de NDV pode ser utilizada em uma terapia de combinação aqui descrita, incluindo, mas não se limitando às cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, os vírus recombinantes mutagenizados, e/ou vírus geneticamente modificados. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa de ocorrência natural. Em certas modalidades, o NDV é uma cepa lítica. Em outras modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa não lítica. Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é a cepa lentogênica. Em algumas modalidades, o NDV é uma cepa mesogênica. Em outras modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa velogênica. Os exemplos específicos de cepas de NDV incluem, mas não estão limitados à cepa 73-T, cepa NDV HUJ, cepa Ulster, cepa MTH-68, cepa Italien, cepa Hickman, cepa PV701, cepa Hitchner BI (ver, por exemplo, Genbank No. AF309418 or NC_002617) , cepa La Sota (ver, por exemplo Genbank No. AY845400), cepa YG97, cepa MET95, cepa Roakin, e cepa F48E9. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita que é a cepa Hitchner BI. Em uma outra modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa BI como identificado por Genbank AF309418 ou NC_002617. Em uma outra modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita, é o NDV identificado por ATCC n° VR2239. Em uma outra modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita, é a cepa La Sota.

[108] Em modalidades específicas, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita não são de aves patogênicas, tal como avaliado por uma técnica conhecida por um especialista. Em certas modalidades específicas, o NDV utilizado em uma terapia de combinação é não patogênico, tal como avaliado por injeção intracraniana de pintos de um dia de idade com o vírus, e o desenvolvimento da doença e morte ocorrendo durante 8 dias. Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita tem um índice de patogenicidade intracraniana de menos do que 0,7, menos do que 0,6, menos do que 0,5, menos do que 0,4, menos do que 0,3, menos do que 0,2 ou menos do que 0,1. Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita tem um índice de patogenicidade intracraniana de zero.

[109] Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa mesogênica que foi geneticamente modificada de modo a não ser um patogênico considerado em aves como avaliado por meio de técnicas conhecidas por uma pessoa versada na arte. Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa velogênica que foi geneticamente modificada de modo a não ser um patogênico considerado em aves como avaliado por meio de técnicas conhecidas por uma pessoa versada na arte.

[110] Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita expressa uma proteína F mutada. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação expressa uma proteína F mutada é altamente fusogênico e capaz de formar sincicios. Em uma outra modalidade específica, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[111] Em uma modalidade, um genoma de um NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é manipulado para expressar uma proteína F mutada com um local de clivagem mutado. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é manipulado para expressar uma proteína F mutada na qual o sítio de clivagem da proteína F é mutada para produzir uma sequência de aminoácidos polibásico, o que permite que a proteína seja clivada por proteases intracelular, o que torna o vírus mais eficaz em entrar nas células e na formação de sincícios. Em uma outra modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é manipulado para expressar uma proteína F mutada no qual o sítio de clivagem da proteína F é substituído por um contendo um ou dois resíduos de arginina suplementares, permitindo que o local de clivagem mutante seja ativado por proteases ubiquamente expressas da família da furina. Exemplos específicos de tais NDVs que expressam uma proteína F mutada incluem, mas não estão limitados a rNDV/F2aa e rNDV/F3aa. Para uma descrição de mutações introduzidas em uma proteína F de NDV para produzir uma proteína mutante F com um local de clivagem mutado, ver, por exemplo, Park et al. (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203-2808, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação L289A do aminoácido. Em modalidades específicas, a proteína mutada F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de divagem. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em algumas modalidades, a proteína F mutada é em adição a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV.

[112] Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é atenuado de modo a que o NDV permanece, pelo menos parcialmente, infeccioso e pode replicar in vivo, mas apenas gerar títulos baixos, resultando em níveis subclínicos de infecção que são não-patogênicosa (veja, por exemplo, Khattar et al, 2009, J. Virol 83: 7779-7782). Em uma modalidade específica, o NDV é atenuado pela deleção da proteína V, tais NDVs atenuados podem ser especialmente adequados para modalidades em que o vírus é administrado a um sujeito, de modo a agir como um imunógeno, por exemplo, uma vacina viva. Os vírus podem ser atenuados através de qualquer método conhecido na arte.

[113] Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita não compreende uma sequência que codifica a proteína V de NDV. Em outras modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita expressa de uma proteína V mutada. Ver, por exemplo, Elankumaran et al. , 2010, J. Virol. 84 (8) : 3835- 3 844, que é aqui incorporado por referência, para exemplos de proteínas V mutadas. Em certas modalidades, uma cepa de NDV mesogênico ou velogênico utilizada em uma terapia de combinação aqui descrita expressa uma proteína V mutada, tal como descrito por Elankumaran et al., 2010, J. Virol. 84 (8) : 3835-3844.

[114] Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é um NDV divulgado nas patentes US 7.442.379, US 6.451.323, ou US 6.146.642, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Em modalidades específicas, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é geneticamente modificado para codificar e expressar um peptideo heterólogo ou uma proteína. Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico conhecido para uma pessoa versada na arte, ou um NDV quimérico aqui descrito (ver, por exemplo, Seção 5.2, infra). Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico compreendendo um genoma manipulado para expressar um antígeno do tumor (veja abaixo exemplos de antígenos tumorais). Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico compreendendo um genoma manipulado para expressar um antagonistas do interferon heterólogo (veja abaixo exemplos de antagonistas do interferon heterólogo). Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico descrito na publicação do pedido de patente americano No. 2012/0058141, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico descrito na publicação do pedido de patente americano No. 2012/0122185, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico compreendendo um genoma manipulado para expressar uma citocina, tal como, por exemplo, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IFN- gama, GM-CSF e TNF-alfa. Em algumas modalidades, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico compreendendo um genoma manipulado para expressar IL-2, IL-15, ou IL-21. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui descrita é um NDV quimérico compreendendo um genoma manipulado para expressar uma citocina, tal como descrita na Seção 7, Exemplo 2, infra.

5.2 VÍRUS QUIMÉRICOS DA DOENÇA NEWCASTLE

[115] Em um aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou célula exterminadora natural (NK). Em algumas modalidades, o agonista e/ou antagonista é incorporado no virion. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK. Em uma outra modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK. Em outras palavras, o NDV serve como "estrutura" que é manipulada para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou célula exterminadora natural (NK) . Os exemplos específicos de agonistas de sinais coestimuladores, bem como exemplos específicos de antagonistas de sinal inibitório são fornecidos abaixo.

[116] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma proteína F mutada. Em uma modalidade, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma proteína F mutada. Em uma outra modalidade, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma proteína F mutada. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica e capaz de formar sincícios. Em uma outra modalidade específica, a proteína F mutada é incorporada no virion. Em certas modalidades, o genoma de um NDV manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, compreende uma sequência de codificação da proteína V de NDV.

[117] Em uma modalidade, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma proteína F mutada com um local de clivagem mutado. Em uma modalidade específica, o NDV é manipulado para expressar uma proteína F mutada no qual o sítio de clivagem da proteína F é mutado para produzir uma sequência de aminoácidos polibásicos, o que permite que a proteína seja clivada por proteases intracelulares, o que torna o vírus mais eficaz para entrar nas células e prover a formação de sincícios. Em uma outra modalidade específica, o NDV é manipulado para expressar uma proteína F mutada no qual o sítio de clivagem da proteína F é substituído por um contendo um ou dois resíduos de arginina suplementares, permitindo que o local de clivagem mutante seja ativado por proteases ubiquamente expressas da família furin. Exemplos específicos de tais NDVs que expressam uma proteína F mutada incluem, mas não estão limitados a rNDV/F2aa e rNDV/F3aa. Para uma descrição de mutações introduzidas em uma proteína F de NDV para produzir uma proteína mutante F com um local de clivagem mutado, ver, por exemplo, Park et al. (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203- 2808, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo diferente ou cepa de NDV que a estrutura do NDV. Em modalidades específicas da proteína mutada F L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada é em adição a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[118] Em algumas modalidades, o genoma de um NDV manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, compreende uma sequência de codificação da proteína V do NDV mutado, tal como foi descrito por Elankumaran et al. , 2010, J. Virol. 84 (8): 3835-3844. Em outras modalidades, o genoma de um NDV manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK não compreendem uma sequência de codificação de proteína V de NDV. Em certas modalidades, a estrutura parental do NDV quimérico é um mesogênico velogênico ou a cepa de NDV que é manipulada para expressar uma proteína V mutado, tal como descrito por Elankumaran et al. , 2010, J. Virol. 84 (8) : 3835-3844.

[119] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma citocina. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma citocina. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma citocina. Exemplos específicos de citocinas incluem, mas não se limitam a interleucina (IL)-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, interferon (IFN) gamma, GM-CSF, e fator de necrose tumoral (TNF-alfa).

[120] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, uma proteína F mutada, e uma citoquina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IFN- gama, GM-CSF e TNF-alfa). Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada tem um local de clivagem mutante (tal como aqui descrito). Em algumas modalidades, a proteína F mutada compreende a mutação do aminoácido L289A. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada está em adição a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[121] Em certos aspectos, são aqui proporcionados NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar uma citocina tal como, por exemplo, IL-7, IL-15, IL-21 ou de uma outra citocina aqui descrita ou conhecida por uma pessoa versada na arte. Ver, por exemplo, Seção 7 para exemplos de NDVs quiméricos manipulados para expressar citocinas, bem como métodos de produção de tais NDVs quiméricos.

[122] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar (i) um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, e (ii) um antígeno do tumor. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e um antígeno do tumor. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e um antígeno do tumor.

[123] Antígenos tumorais incluem antígenos associados a tumores e antígenos específicos de tumores. Os exemplos específicos de antígenos tumorais incluem, mas não estão limitados a MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N- acetilglucosaminiltransferase V, p-15, gplOO, MART-l/MelanA, TRP-1 (gp75), tirosinase, dependente da ciclina quinase 4, β-catenina, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, papilomavírus humano E6, papilomavírus humano E7, CD20, antígeno carcinoembrionário (CEA), receptor do fator de crescimento epidérmico, MUC-1, caspase-8, CD5, mucina-1, Lewisx, CA-125, pl85HER2, IL-2R, Fap a, tenascina, antígenos associados com uma metaloproteinase, e CAMPATH-1. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados ao antígeno KS 1/4 pan-carcinoma, antígeno de carcinoma de ovário (CA125), fosfato ácido prostático, antígeno específico da próstata, antígeno associado ao melanoma p97, antígeno de melanoma gp75, antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno específico da membrana da próstata, CEA, antígeno da mucina epitelial polimórfica, antígeno do glóbulo de gordura do leite, antígenos associados a tumores coloretal (tais como: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 e LEA) , antígeno do linfoma de Burkitt 38.13, antígeno do linfoma B CD20, CD33, antígenos específicos de melanoma (tais como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2, gangliósido GM3), antígeno da superfície celular do tipo transplante de tumor-específico (TSTA) (tais como, antígenos de tumores induzidos por vírus, incluindo antígeno T do DNA dos vírus tumor e os antígenos do envelope do vírus de tumor de RNA), antígeno oncofetal-alfa-fetoproteína, tais como, CEA do cólon, antígeno oncofetal do tumor da bexiga, antígeno de diferenciação (tais como, antígeno do carcinoma do pulmão humano L6 e L20), antígenos de fibrossarcoma, antígeno de leucemia de células T GP37, neoglicoproteína, esfingolipídios, antígenos de câncer de mama (como EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), antígeno HER2 (pl85.sup.HER2) e epítopo HER2 neu) polimórficos, mucina epiteliais (PEM), antígeno linfócito humano malignas APO-1, antígeno de diferenciação (tal como, antígeno I encontrado em eritrócitos fetais, endoderma primário, antígeno I encontrado em eritrócitos adultos, embriões pré-implantação, I (Ma) encontrados em adenocarcinomas gástricos, M18, M39 encontrada no epitélio mamário, SSEA-1 encontrado em células mielóides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, D.sub.156-22 encontrado em câncer colorretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H) , C14 encontrados em adenocarcinoma do cólon, F3 encontrado em adenocarcinoma do pulmão, AH6 encontrado no câncer gástrico, hapteno Y, Le.sup.y encontrado em células de carcinoma embrionário, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor de EGF encontrado em células A431, série El (grupo sanguíneo B) encontrados em câncer de pâncreas, FC10.2 encontrada em células embrionárias de carcinoma, antígeno adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrados em adenocarcinoma, NS-10 encontrados em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado no receptor EGF das células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/ Ley) encontrados em adenocarcinoma do cólon, 19,9 encontrados no câncer de cólon, câncer gástrico mucinas, T5A7 encontrada em células mielóides, R24 encontrado no melanoma, 4.2, GD3, Dl.l, OFA- 1, GM2, OFA-2, GD2, e Ml:22:25:8 encontrados em células de carcinoma embrionário, e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em 4 a 8 células em estágio embrionário), receptor de células T peptideo derivado de um linfoma de célula T cutânea, proteína C-reativa (CRP), antígeno do cancer 50 (CA-50), antígeno do câncer 15-3 (CA15-3) associado com o câncer de mama, antígeno do câncer 19 (CA-19) e antígeno do câncer 242 associada com os cânceres gastrointestinais, antígeno associado ao carcinoma (CEA), cromogranina A, antígeno da mucina epitelial (MC5), antígeno específico do epitélio humano (EIA), antígeno de Lewis(a), antígeno de melanoma, antígenos associados a 100, 25, e 150, antígeno associado a carcinoma semelhante à mucina, proteínas relacionadas a resistência a múltiplas drogas (MRPm6), proteínas relacionadas à resistência a múltiplas drogas (MRP41), proteína do oncogene Neu (C-erbB-2), enolase neuronal específica (NSE), P-glicoproteína (produto do gene mdr 1) , antígeno relacionados a resistência a múltiplas drogas, pl70, antígeno relacionados a resistência a múltiplas drogas, antígeno específico da próstata (PSA), CD56, e MACN.

[124] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, uma proteína F mutada, e um antígeno do tumor. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada tem um local de clivagem mutante (tal como aqui descrito). Em algumas modalidades, a proteína F mutada compreende a mutação do aminoácido L289A. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em modalidades específicas da proteína F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada está em adição à estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[125] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar (i) um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, e (ii) um antagonista de interferon heterólogo. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e um antagonista de interferon heterólogo. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e um antagonista de interferon heterólogo. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente US No. 2012-0058141, a qual é aqui incorporada por referência, para exemplos de NDV quimérico manipulado para expressar os antagonistas heterólogos do interferon.

[126] Antagonistas do interferon podem ser identificados utilizando qualquer técnica conhecida por uma pessoa versada na arte, incluindo, por exemplo, as técnicas descritas nas patentes US 6,635,416; US 7,060,430; e US 7,442,527; que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Em uma modalidade específica, o antagonista de interferon heterólogo é uma proteína virai. Tais proteínas virais podem ser obtidas ou derivadas de qualquer vírus e o vírus pode infectar quaisquer espécies (por exemplo, o vírus pode infectar os seres humanos ou mamíferos não humanos). Antagonistas do interferon heterólogo exemplificativos incluem, sem se limitar a proteína do vírus Nipah W, proteína Nipah V, proteína VP35 do vírus Ebola, proteína E3L vírus vaccinia, proteína NS1 do vírus da gripe, proteína NS2 do vírus sincicial respiratório (RSV), proteína ICP34.5 do vírus do herpes simplex (HSV) do tipo 1, vírus da hepatite C de protease NS3-4, proteínas celulares dominantes negativas que bloqueiam a indução de resposta ou a imunidade inata (por exemplo, STAT1, MyD88, IKK e TBK), e reguladores celulares da resposta imune inata (por exemplo, proteínas SOCS, proteínas Pias, proteínas CYLD, proteína IkB, proteína Atg5, proteína Pinl, proteína IRAK-M, e UBP43) . Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente americano No. 2012-0058141, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade, para informação adicional sobre antagonistas do interferon heterólogo.

[127] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, uma proteína F mutada, e um antagonista de interferon heterólogo. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada tem um local de divagem mutante (tal como aqui descrito). Em algumas modalidades, a proteína F mutada compreende a mutação do aminoácido L289A. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em modalidades específicas da proteína F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada está em adição à estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[128] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula pró-apoptótica. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula pró-apoptótica. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula pró- apoptótica. Os exemplos específicos de moléculas pro- apoptóticas incluem, mas não estão limitados a Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxas, Puma, FIA, FasL, e TRAIL.

[129] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, uma proteína F mutada, e uma molécula pró- apoptótica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada tem um local de clivagem mutante (tal como aqui descrito). Em algumas modalidades, a proteína F mutada compreende a mutação do aminoácido L289A. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em modalidades específicas da proteína F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada está em adição à estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[130] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos, compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula anti-apoptótica. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula anti-apoptótica. Em uma modalidade específica, um genoma de um NDV é manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e uma molécula anti-apoptótica. Os exemplos específicos de moléculas anti-apoptóticas incluem, mas não estão limitados a Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, e XIAP.

[131] Em outro aspecto, são descrito neste documento NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, uma proteína F mutada, e uma molécula anti-apoptótica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada é altamente fusogênica. Em uma modalidade específica, a proteína F mutada tem um local de clivagem mutante (tal como aqui descrito). Em algumas modalidades, a proteína F mutada compreende a mutação do aminoácido L289A. Em algumas modalidades, o NDV quimérico é manipulado para expressar uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A. Em certas modalidades, a proteína F mutada é de um tipo ou cepa de NDV diferente da estrutura do NDV. Em modalidades específicas da proteína F mutada L289A possui um, dois ou três resíduos de arginina no local de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína F mutada está em adição à estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada substitui a estrutura da proteína F de NDV. Em modalidades específicas, a proteína F mutada é incorporada no virion.

[132] Em certos aspectos, aqui proporcionados são NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado de expressar uma molécula de pro-apoptótica. Em certos aspectos, aqui proporcionados são NDVs quiméricos compreendendo um genoma manipulado para expressar uma molécula de anti-apoptótica. Exemplos de moléculas pro- apoptóticas e moléculas anti-apoptóticas são aqui proporcionados.

[133] Qualquer tipo ou cepa de NDV pode ser utilizado como uma estrutura que é manipulada para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e em certas modalidades, é modificado para expressar uma citocina, antígeno de tumor, antagonistas heterólogos do interferon, molécula pró-apoptótica, molécula anti- apoptótica e/ou proteína F mutada, incluindo, mas não se limitando às cepas que ocorrem naturalmente, variantes ou mutantes, os vírus recombinantes mutagenizados, e/ou vírus geneticamente modificados. Em uma modalidade específica, o NDV utilizado em uma terapia de combinação aqui apresentada é uma cepa de ocorrência natural. Em certas modalidades, o NDV que serve como a estrutura de engenharia genética é uma cepa lítica. Em outras modalidades, o NDV que serve como a estrutura de engenharia genética é uma cepa não lítica. Em certas modalidades, o NDV que serve como a base para a engenharia genética é a cepa lentogênica. Em algumas modalidades, o NDV que serve como a base para a engenharia genética é a cepa mesogênica. Em outras modalidades, o NDV que serve como a estrutura de engenharia genética é uma cepa velogênica. Exemplos específicos de cepas de VDN incluem, mas não se limitam a, cepa 73-T, cepa Ulster, cepa MTH-68, cepa Italien, cepa Hickman, cepa PV701, cepa Hitchner Bl, cepa La Sota, cepa YG97, cepa MET95 e cepa F48E9. Em uma modalidade específica, o VDN que serve de estrutura para a engenharia genética é a cepa Bl Hitchner. Em outra modalidade específica, o VDN que serve de estrutura para a engenharia genética é a cepa La Sota.

[134] Em certas modalidades, a atenuação, ou atenuação adicional do NDV quimérico é desejado de modo a que o NDV quimérico permanece, pelo menos parcialmente, infeccioso e pode replicar in vivo, mas apenas gerar títulos baixos, resultando em níveis subclínicos de infecção que são não patogênicos (ver, por exemplo, Khattar et al, 2009, J. Virol 83: 7779-7782.). Em uma modalidade específica, o NDV é atenuado por deleção da proteína V, tais NDVs quiméricos atenuados podem ser especialmente adequados para modalidades em que o vírus é administrado a um sujeito, de modo a agir como um imunógeno, por exemplo, uma vacina viva. Os vírus podem ser atenuados através de qualquer método conhecido na arte.

[135] Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito, expressa um, dois, três, ou mais, ou todos os seguintes, e um gene suicida: (1) um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune; (2) um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune; (3) uma citocina; (4) um antígeno do tumor; (5) um antagonista heterólogo do interferon; (6) uma molécula de pro-apoptótica; (7) uma molécula anti-apoptótica; e/ou (8) uma proteína F mutada. Em modalidades específicas, além de expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e em certa modalidades, uma proteína F mutada e uma citocina, um NDV quimérico é manipulado para expressar um gene suicida (por exemplo, timidina-quinase) ou outra molécula que inibe a replicação ou a função de NDV (um gene que torna NDV sensível a um antibiótico ou um agente anti-viral). Em algumas modalidades, além de expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T ou uma célula NK, e em certa modalidades, uma proteína F mutada e uma citocina, um NDV quimérico é manipulado para codificar locais alvo do microRNA (miARN) específico do tecido (por exemplo, locais alvejadios por miR-21, miR-184, miR-133a/133b, miR-137, e/ou miR-193a microRNAs).

[136] Em certas modalidades, o tropismo do NDV quimérico é alterado. Em uma modalidade específica, o tropismo do vírus é alterado por uma modificação do local de clivagem da proteína F para ser reconhecido pelas proteases específicas para tecidos ou tumores específicos, tais como metaloproteases da matriz (MMP) e uroquinase. Em outras modalidades, o tropismo do vírus é alterado pela introdução de locais alvo de miARN específicos do tecido. Em certas modalidades, a proteína NH de NDV é mutada para reconhecer o receptor específico do tumor.

[137] Em certas modalidades, um ou mais dos procedimentos a seguir são expressos por um NDV quimérico, como uma proteína ou proteína de fusão quimérica: (1) um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune; (2) um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune; (3) uma citocina; (4) um antígeno do tumor; (5) um antagonista heterólogo do interferon; (6) uma molécula de pro- apoptótica; (7) uma molécula anti-apoptótica; e/ou (8) uma proteína F mutada. Em modalidades específicas, a proteína ou proteína de fusão quimérica compreende os domínios transmembranares e citoplasmáticos ou seus fragmentos da proteína F de NDV ou HN de NDV e um domínio extracelular que compreende uma das moléculas referenciadas anteriormente. Veja o pedido de patente US No. 2012-0122185 para uma descrição de tais proteínas quiméricas ou proteínas de fusão, e a publicação do pedido internacional WO 2007/064802, que são aqui incorporados por referência.

[138] Em modalidades desta invenção, o agonista de um sinal coestimulador e/ou o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune pode ser inserido no genoma da estrutura NDV entre duas unidades de transcrição. Em uma modalidade específica, o agonista de um sinal coestimulador e/ou o antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune é inserido no genoma da estrutura NDV entre as unidades de transcrição M e P ou entre as unidades de transcrição HN e L. De acordo com outras modalidades aqui, a citoquina, antígeno de tumor, antagonistas heterólogos do interferon, molécula pró-apoptótica, molécula anti- apoptótica e/ouproteína F mutada são inseridos no genoma da estrutura NDV entre duas ou mais unidades de transcrição (por exemplo, entre as unidades de transcrição M e P ou entre as unidades de transcrição HN e L).

5.2.1 AGENTES ESTIMULADORES DA CÉLULA IMUNE

[139] Os NDVs quiméricos aqui descritos podem ser modificados para expressar qualquer agonista de um sinal coestimulador e/ou qualquer antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, tais como, por exemplo, um linfócito T, células NK ou células que apresentam o antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica ou macrófago), conhecido por uma pessoa versada na arte. Em modalidades específicas, o agonista e/ou antagonista é um agonista de um sinal coestimulador humano de uma célula imune e/ou antagonista de um sinal inibidor humano de uma célula imune. Em certas modalidades, o agonista de um sinal coestimulador é um agonista de uma molécula coestimuladora (por exemplo, coestimuladora do receptor) encontrado em células imunes, tais como, por exemplo, os linfócitos T (por exemplo, CD4 + ou CD8+ Linfócitos T), células NK e/ou células apresentadoras de antígeno (por exemplo, células dendriticas ou macrófagos). Os exemplos específicos de moléculas coestimuladoras incluem o receptor de fator de necrose tumoral induzida por glucocorticóides (GITR), coestimulador das células T induzível (ICOS ou CD278), 0X40 (CD134), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD40, linfotoxina alfa (alf LT) , LIGHT (semelhante a linfotoxinae, exibe a expressão induzível, e compete com o vírus do herpes simples glicoproteína D para HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) , CD226, molécula de células T reguladoras e citotóxica (CRTAM), receptor exterminador 3 (DR3), receptor de linfotoxina-beta (LTBR), ativador transmembranar e interator CAML (TACI), eceptor de fator de ativação de células B (BAFFR), e a proteína de maturação das células B (BCMA). Em modalidades específicas, o agonista é um agonista de um receptor coestimulador humano de uma célula imune. Em certas modalidades, o agonista de um receptor coestimulador não é um agonista de ICOS. Em algumas modalidades, o antagonista é um antagonista de uma molécula inibidora (por exemplo, receptor do inibidor) encontrado em células imunes, tais como, por exemplo, os linfócitos T (por exemplo, linfócitos T CD4+ ou CD8 + ) , células NK e/ou antígeno as células que apresentam (por exemplo, células dendríticas ou macrófagos). Os exemplos específicos de moléculas inibidoras incluem, linfócitos T citotóxicos associado ao antígeno 4 (CTLA-4 ou CD52), proteína da morte celular programada 1 (PD-1), atenuador do linfócito de B e de T (BTLA), receptores semelhantes à imunoglobulina de células exterminadoras (KIR), gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), ou membrana de célula T da proteína 3 (TIM3), CD160, receptor A2a de adenosina (A2aR), imunorreceptor de células T com imunoglobulina e domínios ITIM (TIGIT), receptor do tipo imunoglobulina associado a um leucócito (LAIR1), e CD160. Em modalidades específicas, o antagonista é um antagonista de um receptor inibidor humano de uma célula imune.

[140] Em uma modalidade específica, o agonista de um receptor coestimulador é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao receptor coestimulador. Os exemplos específicos de receptores coestimuladores incluem GITR, ICOS, 0X40, CD27, CD28, 4-1BB, CD40, LT alfa, LIGHT, CD226, CRTAM, DR3, LTBR, TACI, BAFFR, e BCMA. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outras modalidades específicas, o anticorpo é um sc-Fv. Em uma modalidade específica, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a dois receptores de uma célula imune. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico se liga a um receptor em uma célula imune e para outro receptor em uma célula cancerosa. Em modalidades especificas, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é expresso como uma proteína quimérica com proteína F de NDV ou seu fragmento, ou proteína HN de NDV ou seu fragmento. Veja, por exemplo, a publicação do pedido de patente americano No. 2012/0122185, que é aqui incorporado por referência para uma descrição sobre geração de quimérico F ou proteínas HN quiméricas. Em uma modalidade específica, a proteína quimérica é a proteína F quimérica descrito nas Secções 6 e/ou 7, infra. As técnicas descritas abaixo para gerar a proteína ICOSL-F quimérica e a proteína CD28-F quimérica pode ser utilizada para produzir outras proteínas F quiméricas ou proteínas HN quiméricas.

[141] Em uma outra modalidade, o agonista de um receptor coestimulador é um ligante do receptor coestimulador. Em certas modalidades, o ligante é um fragmento de ligando nativo. Os exemplos específicos de ligantes nativos incluem ICOSL, B7RP1, CD137L, OX40L, CD70, mediador da entrada do vírus herpes (HVEM), CD80 e CD86. As sequências de nucleótidos que codificam os ligantes nativos, bem como as sequências de aminoácidos dos ligantes nativos são conhecidas na arte. Por exemplo, as sequências de nucleótidos e de aminoácidos de B7RP1 (também são conhecidas como ICOSL; GenBank human: NM_015259.4, NP_056074.1 murine: NM_015790.3, NP_056605.1), CD137L(GenBank human: NM_003811.3, NP_003802.1, murine: NM_009404.3, NP_033430.1), OX40L(GenBank human: NM_003326.3, NP_003317.1, murine: NM_009452.2, NP_033478.1), CD70(GenBank human: NM_001252.3, NP_001243.1, murine: NM_011617.2, AAD00274.1), CD80(GenBank human: NM_005191.3, NP_005182.1, murine: NM_009855.2, NP_033985.3), e CD86(GenBank human: NM_005191.3, CAG46642.1, murine: NM_019388.3, NP_062261.3) pode ser encontrado em GenBank. Em outras modalidades, o ligante é um derivado de um ligante nativo. Em algumas modalidades, o ligante é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma porção do ligante nativo ou um derivado do ligante nativo que se liga especificamente ao receptor coestimulatório, e uma sequência heteróloga de aminoácidos. Em modalidades específicas, a proteína de fusão compreende pelo menos uma porção do ligante nativo ou um derivado do ligante nativo que se liga especificamente ao receptor coestimulatório, e a porção Fe de uma imunoglobulina ou seu fragmento. Um exemplo de uma proteína ligante de fusão é um ligante 4-1BB fundido a porção Fc da imunoglobulina (descrito por Meseck M et al., J Immunother. 2011 34:175-82) Em algumas modalidades, o ligante é expresso como uma proteína quimérica com a proteína F de NDV ou seu fragmento, ou proteína HN de NDV ou seu fragmento. Em uma modalidade específica, a proteína é a proteína HN quimérica descrita na Seção 7, infra. As técnicas descritas abaixo para gerar o quimérico HN-GITRL, quimérico HN-OX40-L, quimérico HN-4-1BBL, quimérico e/ou HN- CD40L podem ser utilizadas para produzir outras proteínas F quiméricas ou proteínas HN quiméricas.

[142] Em uma outra modalidade, o antagonista de um receptor inibidor é um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) ou um receptor solúvel que se liga especificamente ao ligante nativo para o receptor inibitório e bloqueia o ligante nativo de se ligar ao receptor e transduzir um sinal inibidor. Exemplos específicos de ligantes nativos para os receptores inibitórios incluem PDL- 1, PDL-2, B7-H3, B7-H4, HVEM, Gal9 e adenosina. Exemplos específicos de receptores inibidores que se ligam a um ligante nativo incluem CTLA-4, DP-1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, e A2aR.

[143] Em modalidades específicas, o antagonista de um receptor inibidor é um receptor solúvel que se liga especificamente ao ligante nativo para o receptor inibitório e bloqueia o ligante nativo da ligação para o receptor inibitório e transduzir um sinal ou sinais inibidores. Em certas modalidades, o receptor solúvel é um fragmento de um receptor inibidor nativo ou um fragmento de um derivado de um receptor inibidor nativo que se liga especificamente ao ligante nativo (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor inibidor nativo ou um derivado de um receptor inibitório). Em algumas modalidades, o receptor solúvel é uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma porção do receptor inibidor nativo ou um derivado do receptor inibidor nativo (por exemplo, o domínio extracelular do receptor do inibidor nativo ou um derivado do receptor inibidor nativo), e uma sequência heteróloga de aminoácidos. Em modalidades específicas, a proteína de fusão compreende pelo menos uma porção do receptor inibidor nativo ou um derivado do receptor inibidor nativo, e a porção Fe de uma imunoglobulina ou seu fragmento. Um exemplo de uma proteína de fusão do receptor solúvel é uma proteína de fusão LAG3-Ig (descrito por Huard B et al. , Eur J Immunol. 1995 25:2718-21) .

[144] Em modalidades específicas, o antagonista de um receptor inibidor é um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao ligante nativo para o receptor inibitório e bloqueia o ligante nativo da ligação para o receptor inibitório e transduzir um sinal inibidor. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outras modalidades específicas, o anticorpo é um scFv. Em modalidades particulares, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Um exemplo específico de um anticorpo para o ligante é o anticorpo inibidor anti-PD-Ll (Iwai Y, et al. PNAS 2002; 99:12293-12297).

[145] Em uma outra modalidade, o antagonista de um receptor inibidor é um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) ou um ligante que se liga ao receptor inibidor, mas não transduz um sinal inibidor. Exemplos específicos de receptores inibitórios incluem CTLA-4, PD1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, e A2aR. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outras modalidades específicas, o anticorpo é um scFv. Em modalidades particulares, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Um exemplo específico de um anticorpo para o receptor inibitório é anti-CTLA-4 (Leach DR, et al. Science 1996; 271: 1734-1736). Outro exemplo de um anticorpo para o receptor inibitório é o anticorpo anti-DP-1 (Topalian, SL, NEJM 2012; 28: 3167-75).

[146] Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito é concebido para um antagonista de CTLA-4, tais como, por exemplo, ipilimumab ou tremelimumabe. Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito é concebido para um antagonista de PD1, tais como, por exemplo, MDX-1106 (BMS-936558), MK3475, CT-011, AMP-224, ou MDX-1105. Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito é manipulado para expressar um antagonista de LAG3, tais como, por exemplo, IMP321. Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito é manipulado para expressar um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, ou scFv) que se liga a B7- H3, tais como, por exemplo, MGA271. Em modalidades específicas, um NDV quimérico aqui descrito é manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune descrita na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra. Em modalidades específicas, NDV aqui descrito é projetado para expressar anti-CD28 scvFv, ICOSL, CD40L, OX40L, CD137L, GITRL, e/ou CD70.

[147] Em certas modalidades, um agonista de um sinal coestimulador induz uma célula imune (por exemplo, seletivamente) induz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzidas pela ligação de um receptor coestimulador para o seu ligante. Em modalidades específicas, um agonista de um receptor coestimulador induz um ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ou mais dos seus ligantes em pelo menos 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% a 75%, 50% a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ou mais dos seus ligantes na ausência do agonista. Em modalidades específicas, um agonista de um receptor coestimulador: (i) induz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ligante particular por, pelo menos, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% a 75 %, 50% a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para o ligante específico na ausência do agonista; e (ii) não induz ou induz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador a um ou mais de outros ligantes por, pelo menos, 20%, 15%, 10%, 5%, ou 2%, ou no intervalo entre 2% a 5%, 2% a 10%, 5% a 10%, 5% a 15%, 5% a 20%, 10% a 15%, ou 15% a 20 % em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para tais um ou mais outros ligantes na ausência do agonista.

[148] Em certas modalidades, um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune ativa ou melhora (por exemplo, seletivamente ativa ou aumenta) uma ou mais das vias de transdução de sinal induzidas pela ligação de um receptor coestimulador para o seu ligante. Em modalidades específicas, urn agonista de urn receptor coestimulador ativa ou intensifica uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ou mais dos seus ligantes em pelo menos 25%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% e 75%, 50% a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ou mais dos seus ligantes na ausência do agonista. Em modalidades específicas, um agonista de um receptor coestimulatório: (i) um agonista de um sinal coestimulador ativa ou melhora uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ligante particular por, pelo menos, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% a 75%, 50% a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para o ligante específico na ausência do agonista; e (ii) não ativar ou aumentar, ou ativa ou melhora uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para um ou mais outros ligantes por pelo menos 20%, 15%, 10%, 5%, ou 2%, ou no intervalo entre 2% a 5%, 2% a 10%, 5% a 10%, 5% a 15%, 5% a 20%, 10% a 15%, ou 15% a 20% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor coestimulador para tais um ou mais outros ligantes na ausência do agonista.

[149] Em algumas modalidades, um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (por exemplo, seletivamente) inibe ou reduz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzidas pela ligação de um receptorinibitório ao seu ligante. Em modalidades específicas, um antagonista de um receptor inibitório inibe ou reduz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor inibitório de um ou mais dos seus ligantes em pelo menos 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% a 75%, 50 % a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor inibitório de um ou mais dos seus ligantes na ausência do antagonista. Em modalidades específicas, um antagonista de um receptor inibitório: (i) inibe ou reduz uma ou mais das vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor inibitório para um ligante particular por, pelo menos, 25%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, ou no intervalo entre 25% a 50%, 25% a 75%, 50% e 75%, 50% a 95%, 75% a 95%, ou 75% a 100% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor inibitório para um ligante particular, na ausência do antagonista; e (ii) não inibir ou reduzir, ou inibir ou reduz uma ou mais das vias de transdução do sinal induzido pela ligação do receptor inibitório de um ou mais de outros ligantes por, pelo menos, 20%, 15%, 10%, 5%, ou 2%, ou no intervalo entre 2% a 5%, 2% a 10%, 5% a 10%, 5% a 15%, 5% a 20%, 10% a 15%, ou 15% a 20% em relação a uma ou mais vias de transdução de sinal induzido pela ligação do receptor inibitório que tais um ou mais de outros ligantes na ausência do antagonista.

[150] Em modalidades especificas, um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune induz, ativa e/ou intensifica uma ou mais atividades imunes, respostas ou funções. As uma ou mais atividades imunes, respostas ou funções podem estar na forma de, por exemplo, uma resposta do anticorpo (resposta humoral) ou uma resposta imunitária celular, por exemplo, secreção de citocinas (por exemplo, interferon-gama), a atividade auxiliar ou citotoxicidade celular. Em uma modalidade, a expressão de um marcador de ativação das células imunes (por exemplo, CD44, granzima, ou Ki-67), a expressão de um receptor coestimulador nas células imunes (por exemplo, ICOS, CD28, 0X40, ou CD27), expressão de um ligante para um receptor coestimuladores (por exemplo, B7HRP1, CD80, CD86, OX40L, ou CD70), secreção de citoquina, infiltração de células imunes (por exemplo, linfócitos T, linfócitos B e/ou células NK) para um tumor, produção de anticorpo, função efetora, ativação das células T, diferenciação de células T, proliferação de células T, diferenciação de células B, proliferação de células B, e/ou a proliferação de células NK é induzida, ativada e/ou melhorada seguindo o contato com um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Em uma outra modalidade, infiltração e proliferação do tumor derivado de células supressoras mielóides (MDSC), infiltração tumoral Treg, ativação e proliferação, sangue periférico MDSC e contagem de Treg são inibidos após contato com um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune.

5.3 CONSTRUÇÃO DE NDVs

[151] Os NDVs aqui descritos podem ser gerados utilizando a técnica de genética inversa. A técnica de genética inversa envolve a preparação de RNA virais recombinantes sintéticos que contêm as regiões não codificantes do RNA de cadeia negativa, virais que são essenciais para o reconhecimento por polimerases virais e para os sinais de empacotamento necessários para gerar um virion maduro. Os RNAs recombinantes são sintetizados de um modelo de DNA recombinante e reconstituídos in vitro com complexo de polimerase viral purificado para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNPs) que podem ser utilizadas para transfectar as células. Uma transfecção mais eficaz é obtida se as proteínas de polimerase virai estiverem presentes durante a transcrição dos RNAs sintéticos, seja in vitroou in vivo. Os RNPs recombinantes sintéticos pode ser resgatados em partículas de vírus infecciosas. As técnicas anteriores são descritos na patente US 5,166,057 emitida em 24 novembro 24 de 1992; na patente US 5,854,037 emitida em 29 de dezembro de 1998; na patente US 6,146,642 emitida em em 14 novembro 14 de 2000; na publicação do pedido de patente europeu EP 0702085A1, publicada em 20 de fevereiro de 1996; no pedido de patente americano n° de série US 09/152,845; nas publicações internacionais PCT WO97/12032 publicada em 03 de april 3 de 1997; WO96/34625 publicada em 7 de novembro de 1996; na publicação do pedido de patente europeu EP A780475; WO 99/02657 publicada em 21 de janeiro de 1999; WO 98/53078 publicada em 26 de novembro de 1998; WO 98/02530 publicada em 22 de janeiro de 1998; WO 99/15672 publicada em 1 de abril de 1999; WO 98/13501 publicada em 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicada em 20 de fevereiro de 1997; e EPO 780 475A1 publicada em junho 25, 1997, cada um destes estão aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[152] A tecnologia plasmídeo livre de ajudante também pode ser utilizada para produzir um NDV aqui descrito. Resumidamente, um cDNA completo de um NDV (por exemplo, a cepa Hitchner Bl) é construído, inserido em um vetor plasmídeo e modificado para conter um único local de restrição entre duas unidades de transcrição (por exemplo, os genes P e M NDV; ou HN de NDV e os genes L) . Uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência heteróloga de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de nucleótidos que codifica um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune) pode ser inserida no genoma viral no único local de restrição. Alternativamente, uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência heteróloga de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de nucleótidos que codifica um agonista de um sinal coestimulador e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune) pode ser manipulada em uma unidade de transcrição de NDV de modo que a inserção não afecta a capacidade do vírus para infectar e replicar. 0 segmento único está posicionado entre o promotor T7 e a ribozima do vírus da hepatite delta para produzir um transcrito negativo exato da polimerase de T7. Os vetores de plasmídeo e vetor de expressão compreendendo as proteínas virais necessárias são transfectados para as células que conduzem à produção de partículas virais recombinantes (ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 01/04333; U.S. Patent Nos. 7,442,379, 6,146,642, 6,649,372, 6,544,785 and 7,384,774; Swayne et al. (2003). Avian Dis. 47:1047-1050; e Swayne et al. (2001). J. Virol. 11868-11873, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[153] As técnicas para a produção de um NDV quimérico que expressam um anticorpo são conhecidas na arte. Veja, por exemplo, Puhler et al., Gene Ther. 15(5): 371-283 (2008) para a geração de um NDV recombinante que expressa uma IgG completo de dois transgenes.

[154] Técnicas bicistrônicas para produzir múltiplas proteínas a partir de um único mRNA são conhecidas para uma pessoa versada na arte. Técnicas bicistrônicas permitem a engenharia das sequências de codificação de proteínas múltiplas em um único mRNA através da utilização de sequências IRES. As sequências IRES direcionam o recrutamento interno de ribossomas para a molécula de RNA e permitem a tradução a jusante de maneira independente do capacete (cap). Em termos sucintos, uma região codificadora de uma proteína é inserida na fase de leitura aberta (ORF) de uma segunda proteína. A inserção é flanqueada por uma IRES e por quaisquer sequências de sinal não traduzidas necessárias à expressão e/ou função apropriada. A inserção não deve degradar ORF, promotores transcricionais ou de poliadenilação da segunda proteína (consulte, por exemplo, García-Sastre et al., 1994, J. Virol. 68:6254-6261 e García- Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246, sendo cada um deles aqui incorporado por meio de citação em sua totalidade).

5.4 PROPAGAÇÃO DE NDVs

[155] Os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem ser propagados em qualquer substrato que permite que o vírus para cresça em titulações que permitem os usos dos vírus aqui descritos. Em uma modalidade, o substrato permite que os NDVs aqui descritos (por exemplo, o NDVs quimérico) cresçam em titulações comparáveis com os valores determinados para os vírus correspondentes do tipo selvagem.

[156] Os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem crescer em células (por exemplo, células de aves, células de galinha, etc) que são susceptíveis a infecção pelo vírus, os ovos embrionados (por exemplo, ovos de galinha ou de ovos de codornas) ou animais (por exemplo, aves). Tais métodos são bem conhecidos dos peritos na arte. Em uma modalidade específica, os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem ser propagados em células cancerosas, por exemplo, células de carcinoma (por exemplo, células de câncer da mama e células de câncer da próstata), células de sarcoma, células de leucemia, células de linfoma, e células tumorais germinais de células (por exemplo, células de câncer do testículo e células de câncer do ovário). Em uma outra modalidade específica, os NDVs aqui descrito (por exemplo, o NDVs quimérico) podem ser propagados em linhagens celulares, por exemplo, linhagens celulares de câncer, tais como células HeLa, células MCF-7, células THP-1, células U87, células DU145, células LNCaP, e células T47D. Em certas modalidades, as células ou linhagens celulares (por exemplo, células de câncer ou linhagens celulares de câncer) são obtidas e/ou derivadas de seres humanos. Em uma outra modalidade, os NDVs aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) são propagados em células de galinha ou ovos embrionados. Células de galinha representativas incluem, mas não se limitam a fibroblastos do embrião da galinha e células do rim do embrião da galinha. Em uma modalidade específica, os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) são propagados em células Vero. Em uma outra modalidade específica, os NDVs aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) são propagadas em células cancerosas de acordo com os métodos descritos na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra. Em uma outra modalidade específica, os NDVs aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) são propagados em ovos de galinha ou de ovos de codorna. Em certas modalidades, um vírus NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico) é primeiro propagado em ovos embrionados e em seguida propagado em células (por exemplo, uma linhagem celular).

[157] Os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem ser propagados em ovos embrionados, por exemplo, de 6 a 14 dias de idade, 6 a 12 dias de idade, 6 a 10 dias de idade, 6 a 9 dias de idade, 6 a 8 dias de idade, ou 10 a 12 dias de idade. Ovos embrionados imaturos ou novos podem ser usados para propagar os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos). Ovos embrionados imaturos abrangem ovos que são ovos de idade inferior a 10 dias, por exemplo, ovos de 6 a 9 dias de idade ou 6 a 8 dias de idade que são deficientes em IFN. Ovos embrionados imaturos também abranger os ovos que são artificialmente imaturos até, mas menos do que 10 dias de idade, como resultado de alterações nas condições de crescimento, por exemplo, mudanças nas temperaturas de incubação; tratamento com fármacos; ou qualquer outra alteração que resulta em um ovo com um desenvolvimento retardado, de tal modo que o sistema IFN não está totalmente desenvolvido, em comparação com ovos de 10-12 dias de idade. Os NDVs aqui descritos (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem ser propagados em diferentes locais do ovo embrionado, por exemplo, na cavidade alantóide. Para uma discussão detalhada sobre o crescimento e propagação do vírus, ver, por exemplo, a patente americana US 6,852,522 e US 7,494,808, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[158] Para isolamento de virus, os NDVs aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) podem ser removidos de cultura de células e separados dos componentes celulares, tipicamente por meio de processos de clarificação bem conhecidos, por exemplo, tais como centrifugação em gradiente e cromatografia em coluna, e pode ser ainda purificado como desejado usando processos bem conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, ensaios de placas.

5.5 COMPOSIÇÕES E ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO

[159] Este documento abrange a utilização de um NDV aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) nas composições. A utilização de fragmentos da membrana plasmática de células de NDV infectados ou de células cancerosas inteiras infectadas com NDV em composições também é aqui abrangida. Em uma modalidade específica, as composições são composições farmacêuticas, tais como formulações imunogênicas (por exemplo, formulações da vacina). As composições podem ser usadas em métodos de tratamento do câncer.

[160] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende um NDV aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos), em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra. Em uma modalidade específica, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um NDV aqui descrito (por exemplo, os NDVs quiméricos) , e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos profiláticos adicionais, em um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o NDV (por exemplo, um NDV quimérico) é o único ingrediente ativo incluído na composição farmacêutica.

[161] Em uma outra modalidade, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma vacina antitumor) compreende um concentrado de proteína ou uma preparação de fragmentos de membrana plasmática a partir de células cancerosas infectadas com NDV, em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra. Em uma outra modalidade, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma vacina de célula inteira) compreende células cancerosas infectadas com NDV, em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra.

[162] Como aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora de um governo estadual ou federal ou que se encontra listado na Farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, mais particularmente em humanos. 0 termo "carreador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com que a composição farmacêutica é administrada. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e substâncias do gênero. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. A formulação deve ajustar-se ao modo de administração.

[163] Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas são formuladas para servirem à via de administração pretendida para um sujeito. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada para adequar-se à administração parenteral, intravenosa, intra-arterial, intrapleural, por inalação, intraperitoneal, por via oral, intradérmica, colo-retal, intraperitoneal, intracraniana, e intratumoral. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa, intra-arterial, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, intrapleural, intracraniana, subcutânea, intramuscular, tópica, pulmonar, ou intratumoral.

5.6 USO DE ANTI-CANCER E OUTROS USOS

[164] Em um aspecto, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), pode ser utilizado no tratamento de câncer. Em uma modalidade, proporcionam-se aqui métodos para tratar o câncer, que compreendem administrar a um sujeito com necessidade do mesmo, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição. Em uma modalidade específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) ou sua composição.

[165] Em modalidades específicas, um NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune, ou sua composição é administrado a um sujeito para tratar o câncer. Em outras modalidades específicas, um NDV quimérico manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune, ou sua composição é administrado a um sujeito para tratar o câncer. Em certas modalidades, um NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e uma proteína F mutada ou uma sua composição é administrada a um sujeito para tratar o câncer. Em certas modalidades, um NDV quimérico manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune e uma proteína F mutada ou uma sua composição é administrada a um sujeito para tratar o câncer.

[166] Um NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira do câncer utilizada em um método para o tratamento do câncer podem ser utilizadas como qualquer linha de terapia (por exemplo, uma primeira, segunda, terceira, quarta ou quinta linha terapêutica).

[167] Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), é o único ingrediente ativo administrado para tratar o câncer. Em modalidades específicas, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), é o único ingrediente ativo em uma composição administrada para tratar o câncer.

[168] O NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição pode ser administrado localmente ou sistemicamente a um sujeito. Por exemplo, o NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição podem ser administrados por via parentérica (por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, ou por via subcutânea), intratumoral, intrapleural, intranasalmente, intraperitonealmente, intracranianamente, por via oral, por via retal, por inalação, por via intramuscular, por via tópica ou por via intradérmica, a um sujeito. Em uma modalidade específica, o NDV quimérico é administrado através da artéria hepática, por exemplo, por injeção da artéria hepática, que pode ser realizada por radiologia intervencionai ou através da colocação de uma bomba de infusão arterial. Em uma outra modalidade específica, o NDV quimérico é administrado intra-operatório, por laparoscopia, ou por via endoscópica. Em uma modalidade específica, a administração intraperitoneal do NDV quimérico é realizada por injeção direta, através do cateter de infusão, ou injeção durante a laparoscopia.

[169] Em certas modalidades, os métodos aqui descritos incluem o tratamento de câncer para o qual não existe tratamento. Em algumas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição é administrada a um sujeito para tratar o câncer como uma alternativa a outras terapias convencionais.

[170] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) ou uma composição dos mesmos e uma ou mais terapias adicionais, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra. Em uma modalidade particular, uma ou mais terapias são administradas a um indivíduo em combinação com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição para tratar o câncer. Em uma modalidade específica, as terapias adicionais são atualmente utilizadas, foram utilizadas ou são conhecidas por serem úteis no tratamento do câncer. Em uma outra modalidade, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou sua composição é administrada a um sujeito em combinação com uma terapia de suporte, uma terapia de alívio da dor, ou outra terapia que não tenha um efeito terapêutico sobre o câncer. Em uma modalidade específica, as uma ou mais terapias adicionais administradas em combinação com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) é uma ou mais das terapias descritas na Seção 5.6.4.1, infra. Em certas modalidades, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) e uma ou mais terapias adicionais são administrados na mesma composição. Em outras modalidades, um NDV quimérico e uma ou mais terapias adicionais são administrados em composições diferentes.

[171] Em certas modalidades, dois, três ou vários NDVs (incluindo um, dois ou mais NDVs quiméricos aqui descritos, tais como um, dois, ou mais dos NDVs quiméricos descritos na Seção 5.2, supra) são administrados a um sujeito para tratar o câncer. 0 segundo ou mais NDVs quiméricos utilizados de acordo com métodos aqui descritos, que compreendem a administração de dois, três ou vários NDVs a um sujeito para tratar o câncer podem ser NDVs quiméricos de ocorrência natural ou modificados ou NDVs quiméricos que foram manipuladas para expressar a sequência heteróloga de aminoácidos (por exemplo, uma citocina). Os primeiros e segundos NDVs quiméricos podem ser parte da mesma composição farmacêutica ou de diferentes composições farmacêutica. Em certas modalidades, o primeiro NDV quimérico e o segundo NDV quimérico são administrados pela mesma via de administração (por exemplo, ambos são administrados por via intravenosa ou intratumoral). Em outras modalidades, o primeiro NDV quimérico e o segundo NDV quimérico são administrados por diferentes vias de administração (por exemplo, um é administrado intratumoralmente e o outro é administrado por via intravenosa).

[172] Em modalidades especificas, um primeiro NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune é administrado a um paciente para tratar o câncer em combinação com um segundo NDV quimérico manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Em outras modalidades específicas, um primeiro NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma imune é administrado em combinação com um segundo NDV quimérico manipulado para expressar um, dois ou mais dos seguintes: uma citoquina (por exemplo, IL-2), um antagonista interferon heterólogo, um antígeno tumoral, uma molécula pró-apoptótica, e/ou uma molécula anti-apoptótica. Em uma modalidade específica, o primeiro NDV quimérico, o segundo NDV quimérico, ou ambos expressam uma proteína F mutada que aumenta a atividade fusogênica do NDV quimérico. Em uma outra modalidade específica, o primeiro NDV quimérico, o segundo NDV quimérico ou ambos expressam uma proteína F mutada com uma mutação no local de clivagem (como aqui descrito).

[173] Em modalidades específicas, uma primeira composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) contendo um primeiro NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune é administrado a um paciente para tratar o câncer em combinação com uma segunda composição (por exemplo, uma composição farmacêutica), que compreende um segundo NDV quimérico manipulado para expressar um antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune. Em outras modalidades específicas, uma primeira composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) contendo um primeiro NDV quimérico manipulado para expressar um agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um antagonista de um sinal inibidor de uma imune é administrado em combinação com uma segunda composição (por exemplo, uma composição farmacêutica), que compreende um segundo NDV quimérico manipulado para expressar um, dois ou mais dos seguintes: uma citoquina (por exemplo, IL-2), um antagonista do interferon heterólogo, um antígeno tumoral, uma molécula pró-apoptótica, e/ou uma molécula anti-apoptótica. Em uma modalidade específica, o primeiro NDV quimérico, o segundo NDV quimérico, ou ambos expressam uma proteína F mutada que aumenta a atividade fusogênica de NDV quimérico. Em uma outra modalidade específica, o primeiro NDV quimérico, o segundo NDV quimérico ou ambos expressam uma proteína F mutada com uma mutação no local de clivagem (como aqui descrito).

[174] Em um outro aspecto, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), pode ser utilizado em combinação com uma ou mais terapias, tais como aqui descritos na Seção 5.6.4, infra (por exemplo, Seção 5.6.4.1, infra), no tratamento de câncer. Em uma modalidade, proporcionam-se aqui métodos para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), ou sua composição e uma ou mais terapias adicionais, como descritas aqui na Seção 5.6.4, infra. (Por exemplo, Seção 5.6.4.1). Em uma modalidade específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), ou sua composição e uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias, tais como descritos na Seção 5.6.4, infra. (Por exemplo, Seção 5.6.4.1). Em certas modalidades, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) e uma ou mais terapias adicionais, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra (por exemplo, Seção 5.6.4.1), são administrados sob a mesma composição. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) e uma ou mais terapias adicionais são administrados em composições diferentes.

[175] O NDV usado em combinação com uma ou mais outras terapias podem ser administrados sistemicamente ou localmente. Por exemplo, o NDV ou sua composição podem ser administrados por via parentérica (por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, ou por via subcutânea), intratumoral, intrapleural, intranasalmente, intraperitonealmente, intracranianamente, por via oral, por via retal, por inalação, por via intramuscular, por via tópica ou por via intradérmica, a um sujeito. Em uma modalidade específica, o NDV é administrado através da artéria hepática, por exemplo, por injeção na artéria hepática, que pode ser realizada por radiologia intervencionai ou através da colocação de uma bomba de infusão arterial. Em uma outra modalidade específica, o NDV é administrado intra-operatório, por laparoscopia, ou por via endoscópica. Em uma modalidade específica, a administração intraperitoneal do NDV é realizada por injeção direta, através do cateter de infusão, ou injeção durante a laparoscopia.

[176] Um NDV (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira câncer em combinação com uma ou mais terapias, tais como aqui descritos na Seção 5.6.4, infra, pode ser utilizado como qualquer linha de terapia (por exemplo, uma primeira, segunda, terceira e quarta ou quinta terapia, linha) para o tratamento de câncer, em conformidade com um método aqui descrito.

[177] Em um outro aspecto, as células cancerosas inteiras infectadas com NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) pode ser utilizada para tratar o câncer. Em uma modalidade específica, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), pode ser posto em contato com uma célula de cancerosa ou uma população de células cancerosas e as células cancerosas ou população de células cancerosas infectada pode ser administrado a um sujeito para tratar o câncer. Em uma modalidade, as células cancerosas são submetidas à radiação gama antes da infecção com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra). Em uma outra modalidade, as células cancerosas são submetidas à radiação gama após a infecção com um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra). Em uma modalidade particular, as células de câncer são tratadas antes de ser administrada a um sujeito de modo a que as células de câncer não podem-se multiplicar no sujeito. Em uma modalidade específica, as células cancerígenas não podem multiplicar-se no sujeito e o vírus não pode infectar o sujeito. Em uma modalidade, as células cancerosas são submetidas à radiação gama antes da administração ao sujeito. Em uma outra modalidade, as células cancerosas são sonicada antes de serem administradas a um sujeito. Em uma outra modalidade, as células cancerosas são tratadas com mitomicina C antes de serem administradas a um sujeito. Em uma outra modalidade, as células cancerosas são tratadas por congelamento e descongelamento antes de serem administradas a um sujeito. Em uma outra modalidade, as células cancerosas são tratadas com um tratamento térmico antes de serem administradas a um sujeito. As células cancerosas podem ser administradas localmente ou sistemicamente a um sujeito. Por exemplo, as células cancerosas podem ser administradas por via parentérica (por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea), intratumoral, intranasal, por via oral, por inalação, intrapleural, topicamente ou por via intradérmica, a um sujeito. Em uma modalidade específica, as células cancerosas são administradas intratumoral ou pela pele (por exemplo, por via intradérmica) de um sujeito. As células cancerosas podem ser utilizadas de modo autólogo ou alogênico. Em uma modalidade específica, a estrutura do NDV quimérico é uma cepa não lítica. As células cancerosas podem ser administradas a um indivíduo por si só ou em combinação com uma terapia adicional. As células cancerosas são, de preferência, em uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, as células cancerosas são administradas em combinação com uma ou mais terapias, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra. Em certas modalidades, as células cancerosas e uma ou mais terapias adicionais são administradas na mesma composição. Em outras modalidades, as células cancerosas e uma ou mais terapias adicionais são administradas em composições diferentes.

[178] Em um outro aspecto, as células cancerosas inteiras infectadas com NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) podem ser utilizadas em combinação com uma ou mais terapias adicionais aqui descritas na Seção 5.6.4, infra, no tratamento de câncer. Em uma modalidade, proporcionam-se aqui métodos para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito com necessidade do mesmo, células cancerosas inteiras infectadas com NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), em combinação com uma ou mais terapias adicionais descritas aqui na Seção 5.6.4, infra. Em uma modalidade específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de células cancerosas inteiras infectadas com NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), em combinação com uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias adicionais descrito na Seção 5.6.4, infra. Em certas modalidades, as células cancerosas inteiras infectadas com NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) e uma ou mais terapias adicionais descritas na Seção 5.6.4, infra, são administradas na mesma composição. Em outras modalidades, as células cancerosas inteiras infectadas com NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) e uma ou mais terapias adicionais são administradas em composições diferentes.

[179] Em outro aspecto, uma preparação de membrana plasmática ou concentrado de proteína a partir de células cancerosas lisadas infectadas com um NDV quimérico (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra) pode ser utilizada para tratar o câncer. Em uma modalidade, uma preparação de membrana plasmática que compreende fragmentos de células de câncer infectadas com NDV quimérico aqui descrito pode ser utilizada para tratar o câncer. Em uma outra modalidade, um concentrado de proteína a partir de células de câncer infectadas com NDV quimérico aqui descrito pode ser utilizado para tratar o câncer. Técnicas conhecidas por uma pessoa versada na arte podem ser utilizadas para produzir o concentrado de proteínas ou preparar a membrana plasmática. Em uma modalidade específica, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), pode ser posto em contato com uma célula de cancerosa ou uma população de células cancerosas e as células cancerosas infectadas ou a população de células cancerosas podem ser ligadas usando técnicas conhecidas por uma pessoa versada na arte para obter fragmentos de concentrado de proteína ou membrana plasmática das células cancerosas infectadas com NDV, e os fragmentos de concentrado de proteína ou de membrana plasmática das células cancerosas infectadas com NDV podem ser administrados a um sujeito para tratar o câncer. Os fragmentos da membrana plasmática ou do concentrado de proteína podem ser administrados localmente ou sistemicamente a um sujeito. Por exemplo, fragmentos da membrana plasmática ou do concentrado de proteína podem ser administrados por via parentérica, intratumoral, intranasal, intrapleural, por via oral, por inalação, topicamente ou por via intradérmica, a um sujeito. Em uma modalidade específica, tal preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína é administrada intratumoralmente ou pela pele (por exemplo, por via intradérmica) de um sujeito. As células cancerígenas utilizadas para produzir o concentrado de proteínas ou preparação de membrana plasmática podem ser de modo autólogo ou alogênico. Em uma modalidade específica, a estrutura do NDV quimérico é uma cepa lítica. A preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína pode ser administrada a um sujeito por si só ou em combinação com uma terapia adicional. A preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína é, de preferência, em uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, a preparação de concentrado de proteína ou da membrana plasmática é administrada em combinação com uma ou mais terapias, tais como os descritos na Seção 5.6.4, infra (por exemplo, Seção 5.6.4.1) Em certas modalidades, a preparação da membrana plasmática ou o concentrado de proteína e uma ou mais terapias adicionais são administrados na mesma composição. Em outras modalidades, o concentrado de proteínas ou preparação de membrana plasmática e uma ou mais terapias adicionais são administrados em composições diferentes.

[180] Em outro aspecto, uma preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína a partir de células cancerosas lisadas infectadas com NDV (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra) pode ser utilizada em combinação com uma ou mais terapias, tais como aqui descritos na Seção 5.6.4, infra (por exemplo, Seção 5.6.4.1), no tratamento de câncer. Em uma modalidade, proporcionam-se aqui métodos para tratar o câncer, que compreendem administrar a um sujeito com necessidade do mesmo, uma preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína a partir de células cancerosas lisadas infectadas com NDV um (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), em combinação com uma ou mais terapias, tais como aqui descritos na Seção 5.6.4, infra. (Por exemplo, Seção 5.6.4.1). Em uma modalidade específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma preparação da membrana plasmática ou do concentrado de proteína a partir de células cancerosas lisadas infectadas com NDV (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, supra), em combinação com uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias, tais como descritos na Seção 5.6.4, infra. (Por exemplo, Seção 5.6.4.1) . Em certas modalidades, a preparação da membrana ou concentrado de proteína do plasma e uma ou mais outras terapias, tal como descrito na Seção 5.6.4, infra, são administrados na mesma composição. Em outras modalidades, o concentrado de proteínas ou preparação da membrana plasmática e uma ou mais terapias adicionais são administrados em composições diferentes.

[181] Em outro aspecto, os NDVs quiméricos aqui descritos (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), podem ser utilizados para produzir anticorpos que podem ser utilizados em imunoensaios de diagnóstico, imunoterapia passiva, e a geração de anticorpos anti-idiotipicos. Por exemplo, um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), pode ser administrado a um indivíduo (por exemplo, um camundongo, rato, porco, cavalo, burro, pássaro ou humano) para gerar anticorpos que podem em seguida, ser isolados e usados, por exemplo, em ensaios de diagnóstico, imunoterapia passiva e geração de anticorpos anti- idiotipicos. Em certas modalidades, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1 ou 5.2, supra), é administrado a um sujeiro (por exemplo, um camundongo, rato, porco, cavalo, burro, ave, ou humana) em combinação com uma ou mais terapias adicionais, como descrito na Seção 5.6.4, infra, para anticorpos gerados que podem então ser isolados e utilizados, por exemplo, em ensaios de diagnóstico, imunoterapia passiva e geração de anticorpos anti- idiotipicos. Os anticorpos gerados podem ser isolados por norma técnicas conhecidas na arte (por exemplo, cromatografia de imunoafinidade, centrifugação, precipitação, etc.) e utilizados em imunoensaios de diagnóstico, imunoterapia passiva e geração de anticorpos anti-idiotipicos.

[182] Em certas modalidades, os anticorpos isolados de sujeitos em que se administrou um NDV quimérico aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, supra), ou isolado a partir de indivíduos administrada um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV descrito na Seção 5.1, ou 5.2, supra), em combinação com uma ou mais terapias, tais como os descritos na Seção 5.6.4, infra, são usadas para avaliar a expressão das proteínas de NDV, um peptideo heterólogo ou proteína expressa por um NDV quimérico, ou ambos. Qualquer sistema de imunoensaio conhecido na arte pode ser utilizado para esta proposta, incluindo, mas não se limitando aos sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas, tais como radioimunoensaios, ELISA (ensaios de imunossorvente ligado à enzima), imunoensaios em "sandwich", reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e ensaios de imunoelectroforese, apenas para citar alguns.

5.6.1 POPULAÇÃO DE PACIENTE

[183] Em algumas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito com predisposição ou susceptível ao câncer. Em algumas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou uma de suas composições, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito diagnosticado com câncer. Exemplos específicos dos tipos de câncer são aqui descritos. Em uma modalidade, o sujeito tem câncer metastático. Em outra modalidade, o sujeito tem fase 1, fase 2, fase 3, ou fase 4 do câncer. Em uma outra modalidade, o sujeito está em remissão. Em ainda outra modalidade, o sujeito tem uma recorrência do câncer.

[184] Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, um NDV, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um ser humano que é de 0 a 6 meses de idade, de 6 a 12 meses de idade, 6 a 18 meses de idade, de 18 a 36 meses, 1 a 5 anos, 5 a 10 anos, 10 a 15 anos, 15 a 20 anos, 20 a 25 anos, 25 a 30 anos de idade, de 3 0 a 35 anos, 35 a 40 anos, 40 a 45 anos, 45 a 50 anos, 50 a 55 anos, 55 a 60 anos, 60 a 65 anos, 65 a 70 anos, 70 a 75 anos, 75 a 80 anos, 80 a 85 anos, 85 a 90 anos, 90 a 95 anos de idade ou 95 a 100 anos de idade. Em algumas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrada a um lactente humano. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a uma criança humana. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a uma criança humana. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um ser humano adulto. Em ainda outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um ser humano idoso.

[185] Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito com um estado imunocomprometido ou em estado imunodeprimido ou em risco de está imunocomprometidos ou imunossuprimidos. Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrada a um sujeito que recebe ou se recupera da terapia imunossupressora. Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito que tem ou está em risco de contrair câncer. Em certas modalidades, o sujeito foi, é ou será submetido à cirurgia, quimioterapia e/ou terapia de radiação. Em certas modalidades, o paciente foi submetido à cirurgia para remover o tumor ou neoplasma. Em modalidades específicas, o paciente é administrado um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita seguida de cirurgia para remover um tumor ou neoplasma. Em outra modalidade, o paciente é administrado um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita antes de se submeter à cirurgia para remover um tumor ou neoplasia. Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito que teve, tem, ou terá um transplante de tecidos, transplante de órgãos ou transfusão.

[186] Em algumas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um paciente que se mostrou refratário a outras terapias sem ser NDV quimérico ou a sua composição, vacina antitumor, células inteiras, ou uma terapia de combinação, mas não que são estas terapias. Em uma modalidade específica, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um paciente que se mostrou refratário à quimioterapia. Em uma modalidade, um câncer que é refratário à terapia significa que, pelo menos, uma parte significativa das células cancerosas não morreu ou não teve sua divisão celular interrompida. A determinação de se as células cancerosas são refratárias pode ser feita in vivo ou in vitropor qualquer método conhecido na técnica para testar o efeito de uma terapia de células cancerosas, utilizando os significados caitos na arte de "refratária", em tal contexto. Em uma determinada modalidade, um paciente refratário é um paciente refratário à terapia padrão. Em certas modalidades, um paciente com câncer, é refratário a uma terapia em que o tumor ou neoplasma significativamente não tenha sido erradicado e/ou os sintomas não foram significativamente atenuados. A determinação se um paciente é refratário pode ser feito in vivo ou in vitropor qualquer método conhecido na arte para ensaiar a eficácia de um tratamento de câncer, utilizando significados aceitos na arte de "refratária", em tal contexto.

[187] Em certas modalidades, o paciente a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é um paciente já tratado com antibióticos, antivirais, antifúngicos, ou outra terapia biológica/terapia imunoterapia anticâncer ou imunoterapia. Entre esses pacientes são pacientes refratários, e pacientes que são demasiado jovens para as terapias convencionais. Em algumas modalidades, o sujeito a ser administrado com um NDV (por exemplo, um NDV quimérico), uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita não recebeu a terapia antes da administração do NDV quimérico ou composição, vacina antitumor, ou vacina de células inteiras, ou terapia de combinação.

[188] Em algumas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um paciente para prevenir o aparecimento de câncer, em um paciente com risco de desenvolver câncer. Em algumas modalidades, os compostos são administrados a pacientes que são susceptíveis de reações adversas a terapias convencionais.

[189] Em algumas modalidades, o sujeito a ser administrado com um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita que não tenha recebido uma terapia anterior. Em outras modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita é administrado a um sujeito que tenha recebido um tratamento prévio para administração de NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou composição, vacina antitumor, vacina de células inteiras, ou terapia de combinação. Em algumas modalidades, o sujeito administrado com um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, ou uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita experimentaram efeitos colaterais adversos de um tratamento prévio ou uma terapêutica prévia, teve a administração interrompida devido a níveis inaceitáveis de toxicidade ao sujeito.

5.6.2 DOSAGEM & FREQUÊNCIA

[190] A quantidade de um NDV ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira que será eficaz no tratamento do câncer dependerá da natureza do câncer, a via de administração, o estado geral de saúde do sujeito, etc. e deve ser decidido de acordo com o julgamento de um médico. Técnicas clínicas convencionais, tais como ensaios in vitro,podem opcionalmente ser utilizados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. No entanto, as faixas dosagem adequadas de um NDV para administração são geralmente de cerca de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x IO6, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x IO10, 5 x IO10, 1 x 1011, 5 x 1011or 1012 pfu, e mais preferencialmente cerca de 104 até cerca de 1012, 106 a 1012, 108 a 1012, 109 a 1012 ou 109a 1011, e pode ser administrada a um sujeito uma vez, duas, três, quatro ou mais vezes com intervalos com a frequência conforme a necessidade. As faixas de dosagem de vacinas antitumor para administração pode incluir 0,001 mg, 0,005 mg, 0,01 mg, 0,05 mg, 0,1 mg, 0,5 mg, 1,0 mg, 2,0 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 10,0 mg, 0,001 mg a 10,0 mg, 0,01 mg a 1,0 mg, 0,1 mg a 1 mg, e 0,1 mg a 5,0 mg, e pode ser administrada a um sujeito uma vez, duas, três ou mais vezes com intervalos quantas vezes forem necessárias. As faixas de dosagem das vacinas de células inteiras para administração pode incluir 102, 5 x 102 , 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 10s, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x IO10, 5 x IO10, 1 x 1011, 5 x 1011 ou 1012 células, e pode ser administrada a um sujeito uma vez, duas, três ou mais vezes com intervalos com a frequência necessária. Em certas modalidades, as dosagens semelhantes às atualmente usadas em ensaios clínicos para NDV, vacinas antitumor ou vacinas de células inteiras são administradas a um sujeito. As doses eficazes podem ser extrapoladas das curvas de resposta à dose derivadas dos sistemas de teste de modelo in vitroou animal.

[191] Em certas modalidades, um NDV (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição é administrado a um sujeito como uma única dose seguida de uma segunda dose de 1 a 6 semanas, 1 a 5 semanas, 1 a 4 semanas, 1 a 3 semanas, 1 a 2 semanas mais tarde. De acordo com estas modalidades, as inoculações de reforço podem ser administradas ao sujeito em intervalos de 6 a 12 meses após a segunda inoculação. Em certas modalidades, uma vacina antitumor ou uma vacina de célula inteira é administrada a um paciente como uma única dose seguida de uma segunda dose de 1 a 6 semanas, 1 a 5 semanas, 1 a 4 semanas, 1 a 3 semanas, 1 a 2 semanas mais tarde.

[192] Em certas modalidades, a administração do mesmo NDV (por exemplo, NDV quimérico) ou sua composição, vacina antitumor, ou vacina de células inteiras pode ser repetida e as administrações podem ser separadas por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 15 dias, 21 dias, 28 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou, pelo menos, seis meses. Em outras modalidades, a administração do mesmo NDV (por exemplo, um NDV) ou sua composição, vacina antitumor, ou vacina de células inteiras pode ser repetida e as administrações podem ser separadas por 1 a 14 dias, 1 a 7 dias, 7 a 14 dias, 1 a 30 dias, 15 a 30 dias, 15 a 45 dias, 15 a 75 dias, 15 a 90 dias, 1 a 3 meses, 3 a 6 meses, 3 a 12 meses, ou 6 a 12 meses. Em algumas modalidades, um primeiro NDV (por exemplo, um primeiro NDV quimérico) ou sua composição é administrado a um sujeito, seguido da administração de um segundo NDV (por exemplo, um segundo NDV quimérico) ou sua composição. Em certas modalidades, o primeiro e segundo NDVs (por exemplo, os primeiros e segundos NDVs quiméricos) ou suas composições podem ser separados por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 15 dias, 21 dias, 28 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou, pelo menos, seis meses. Em outras modalidades, os primeiros e segundos NDVs (por exemplo, os primeiros e segundos NDVs quiméricos) ou suas composições podem ser separados por 1 a 14 dias, 1 a 7 dias, 7 a 14 dias, 1 a 30 dias, 15 a 30 dias, 15 a 45 dias, 15 a 75 dias, 15 a 90 dias, 1 a 3 meses, 3 a 6 meses, de 3 a 12 meses, ou 6 a 12 meses.

[193] Em certas modalidades, um NDV ou sua composição, ou vacina antitumor ou vacina de célula inteira é administrado a um sujeito em combinação com uma ou mais terapias, tais como uma terapia descrita na Seção 5.6.4, infra. A dosagem das outras uma ou mais terapias adicionais dependerão de vários fatores, incluindo, por exemplo, a terapia, a natureza do câncer, a via de administração, o estado geral de saúde do sujeito, etc, e deve ser decidida de acordo com o julgamento de um médico. Em modalidades específicas, a dose da outra terapia e/ou frequência de administração da terapia recomendada para a terapia de uso como um agente único é usada de acordo com os métodos aqui revelados. Em outras modalidades, a dose da outra terapia é uma dose mais baixa e/ou administração menos frequente da terapia do que o recomendado para a terapia de uso como um único agente é usada de acordo com os métodos aqui revelados. As doses recomendadas para as terapias aprovadas podem ser encontrados em Physician's Desk Reference.

[194] Em certas modalidades, um NDV ou sua composição, ou vacina antitumor ou vacina de célula inteira é administrado a um sujeito simultaneamente com a administração de uma ou mais terapias adicionais. Em outras modalidades, um NDV ou sua composição, ou vacina antitumor ou vacina de célula inteira é administrado a um sujeito a cada 3 a 7 dias, 1 a 6 semanas, 1 a 5 semanas, 1 a 4 semanas, 2 a 4 semanas, 1 a 3 semanas, ou 1 a 2 semanas e uma ou mais terapias adicionais (tal como descrito na Seção 5.6.4, infra) é administrado a cada 3 a 7 dias, 1 a 6 semanas, 1 a 5 semanas, 1 a 4 semanas, 1 a 3 semanas, ou 1 a 2 semanas. Em certas modalidades, um NDV ou sua composição, ou vacina antitumor ou vacina de célula inteira é administrado a um sujeito a cada 1 a 2 semanas e uma ou mais terapias adicionais (tal como descrito na Seção 5.6.4, infra) é administrado a cada 2 a 4 semanas. Em algumas modalidades, um NDV ou sua composição, ou vacina antitumor ou vacina de célula inteira é administrado a um sujeito a cada semana e uma ou mais terapias adicionais (tal como descrito na Seção 5.6.4, infra) é administrado a cada 2 semanas.

5.6.3 TIPOS DE CÂNCER

[195] Exemplos específicos de cânceres que podem ser tratados de acordo com os métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a: leucemias, tais como, mas não limitados a leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, tais como, mieloblástica, promielocitica, mielomonocítica, monocítica e leucemias eritroleucémia e síndrome mielodisplásica; leucemias crônicas, tais como, mas não limitado a mielocítica crônica (granulocítica), leucemia linfocítica crônica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas, tais como, mas não se limitando a doença de Hodgkin, doença de não-Hodgkin; mielomas múltiplos, tais como, mas não se limitando a mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteoesclerótico, leucemia de células placancer, plasmocitoma solitária e plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gamopatia monoclonal de significado indeterminado; gamopatia monoclonal benigna; doença de cadeia pesada; sarcomas ósseos e dos tecidos conjuntivos, tais como, mas não limitado a sarcomas ósseos, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor de células gigantes malignas, fibrossarcoma dos ossos, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinovial; tumores do cérebro, tais como, mas não limitados a glioma, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglioma, tumor nonglial, glioblastoma multiforme, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primário; câncer da mama, incluindo, mas não se limitando a carcinoma ductal, adenocarcinoma, lobular (célula cancerosa), carcinoma intraductal, câncer da mama medular, câncer da mama mucinoso, câncer da mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget e câncer da mama inflamatório; câncer suprarrenal, tais como, mas, não se limitando a feocromocitomas e carcinoma adrenocortical; câncer da tireoide, tais como, mas não limitados a câncer de tireoide papilar ou folicular, câncer medular da tiróide e câncer anaplásico da tireoide; câncer do pâncreas, tais como, mas não limitados a insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina, e carcinóide ou tumores de células dos ilhéus; cânceres da hipófise, tais como, mas limitado a doença de Cushing, tumores que secreta prolactina, acromegalia, diabetes insipidus; cânceres oculares, tais como, mas não se limitando a melanoma ocular tal como melanoma da íris, melanoma coroidal, e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; cânceres vaginais, tais como o carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e melanoma; câncer vulvar, tais como carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basais, sarcoma e doença de Paget; cânceres cervicais, tais como, mas não limitados a carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma; cânceres uterinos tais como, mas não limitados a carcinoma endometrial e sarcoma uterino; cânceres do ovário, tais como, mas não limitados as carcinoma epitelial do ovário, tumor limítrofe, tumor de células germinativas, e tumor estromal; cânceres de esôfago, tais como, mas não limitado a câncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma adenoide cístico, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso, e carcinoma de células pequenas (célula cancerosa); cânceres do estômago, tais como, mas não limitados a adenocarcinoma, fungóide (polipóide), ulcerada, espalhamento superficial, difusamente espalhando, malignas do linfoma, lipossarcoma, fibrossarcoma, e carcinosarcoma; cânceres do cólon; cânceres retais; cânceres do fígado, tal como, mas não se limitando a carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma; câncer da vesícula biliar, tal como adenocarcinoma; colangiocarcinomas, tais como, mas não limitados a papilares, nodulares e difusos; cânceres do pulmão, como câncer de pulmão de células não- cancerosas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide), adenocarcinoma, carcinoma células de grandes e câncer de pulmão de células de câncer; cânceres testiculares, tais como, mas não se limitando a tumor germinal, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, nonseminoma, carcinoma embrionário, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor do saco vitelino), cânceres da próstata, tais como, mas não se limitando a, neoplasias intraepiteliais prostáticas, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, e rabdomiossarcoma; cânceres do pênis; cânceres orais, tais como, mas não se limitando a carcinoma de células escamosas; cânceres basais; cânceres das glândulas salivares, tais como mas não se limitando a adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermóide, e carcinoma adenoide cístico; cânceres da faringe, tais como, mas não se limitando a câncer das células escamosas, e verrucosos; cânceres da pele, tais como, mas não limitados a carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma nodular, lentigo melanoma maligno, melanoma acrolentiginoso; cânceres do rim, tais como, mas não se limitando a carcinoma das células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, câncer das células transicionais (pelve renal e ureter); 0 tumor de Wilms; cânceres da bexiga, tais como, mas não se limitando a carcinoma de células transicionais, câncer das células escamosas, adenocarcinoma carcinossarcoma. Além disso, cânceres incluem mixossarcoma, osteossarcoma, endoteliossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistoadenocarcinoma, carcinoma broncogênico, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais desordens, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

[196] Em uma modalidade específica, os NDVs quiméricos aqui descritos ou suas composições, uma vacina antitumor aqui descrita, a vacina de célula inteira aqui descrita, ou terapia de combinação aqui descrita são úteis no tratamento de uma variedade de cânceres e de doenças proliferativas anormais incluindo (mas não se limitando a) ao seguinte: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, cérvix, tiróide e pele; incluindo o carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfoma das células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielóides agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tiróide e teratocarcinoma.

[197] Em algumas modalidades, os cânceres associados a aberrações no apoptose são tratados de acordo com os métodos aqui descritos. Tais cânceres podem incluir, mas não estão limitados a, linfomas foliculares, carcinomas com mutações de p53, tumores dependentes de hormônios da mama, da próstata e do ovário, e lesões pré-cancerosas tais como polipose adenomatosa familiar, e síndromes mielodisplásicas. Em modalidades especificas, malignidade ou alterações disproliferativa (tais como metaplasias e displasias) ou desordens hiperproliferativas da pele, pulmão, fígado, osso, cérebro, estômago, cólon, mama, próstata, bexiga, rim, pâncreas, ovário, e/ou útero são tratados de acordo com os métodos aqui descritos. Em outras modalidades específicas, um sarcoma ou melanoma é tratado em conformidade com os métodos aqui descritos.

[198] Em uma modalidade específica, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é leucemia, linfoma ou mieloma (por exemplo, mieloma, múltiplo). Exemplos específicos de leucemias e outros cânceres transmitidos pelo sangue que podem ser tratadas de acordo com os métodos aqui descritos incluem, mas não se limitam a leucemia linfoblástica aguda "ALL", leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia de células T aguda linfoblástica, leucemia mieloblástica aguda "AML", leucemia promielocitica aguda "APL", monoblástica leucemia aguda, leucemia eritroleucémica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia não linfocítica crônica, leucemia aguda indiferenciada, leucemia mielocítica crônica "LMC", Leucemia Linfocítica Crônica "CLL", e leucemia das células pilosas.

[199] Exemplos específicos de linfomas que podem ser tratados de acordo com os métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a doença de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, e policitemia vera.

[200] Em uma outra modalidade, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é um tumor sólido. Exemplos de tumores sólidos que podem ser tratados de acordo com os métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendo- teliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de rim, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer bucal, câncer nasal, câncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer uterino, câncer testicular, carcinoma do pulmão de células cancerosas, carcinoma da bexiga, câncer de pulmão, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, o câncer de pele, melanoma, neuroblastoma, e retinoblastoma. Em uma outra modalidade, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é um metastático. Em uma outra modalidade, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é maligno.

[201] Em uma modalidade específica, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é um câncer que tem um prognóstico pobre e/ou tem uma fraca resposta às terapias convencionais, tais como a quimioterapia e radiação. Em uma outra modalidade específica, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é o melanoma maligno, glioma maligno, carcinoma de células renais, adenocarcinoma pancreático, mesotelioma pleural maligno, adenocarcinoma do pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, carcinoma de células escamosas do pulmão, câncer da tiróide anaplásico e câncer células de escamosas do pescoço ou da cabeça. Em uma outra modalidade específica, o câncer a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos é um tipo de câncer descrito na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra.

5.64 TERAPIAS ADICIONAIS

[202] Terapias adicionais que podem ser utilizados em combinação com um NDV aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de células inteiras para o tratamento de câncer incluem, mas não se limitam a moléculas pequenas, drogas sintéticas, peptideos (incluindo peptideos cíclicos), polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e RNA nucleótidos, incluindo, mas não limitado aa sequências de nucleótidos anti-sentido, hélices triplas, RNAi, e sequências de nucleótidos que codificam proteínas biologicamente ativas, polipeptídeos ou peptideos), anticorpos, moléculas inorgânicas naturais ou sintéticas, agentes miméticos e moléculas orgânicas naturais ou sintéticas. Em uma modalidade específica, a terapia adicional é um agente quimioterapêutico.

[203] Em algumas modalidades, um NDV descrito no presente documento ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira é utilizado em combinação com a terapia de radiação que compreende a utilização de raios-x, raios gama e outras fontes de radiação para destruir as células cancerosas. Em modalidades específicas, a terapia de radiação é administrada como a radiação com feixe externo ou teleterapia, em que a radiação é direcionada de uma fonte remota. Em outras modalidades, a terapia de radiação é administrada como terapia interna ou braquiterapia, em que uma fonte radioativa é colocada no interior do corpo perto de células cancerosas e/ou uma massa de tumor.

[204] Em certas modalidades, um NDV descrito no presente documento ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina contra o câncer de célula inteira é utilizado em combinação com a terapia com células T adotiva. Em uma modalidade específica, as células T utilizadas na terapia adotiva de células T são os linfócitos infiltrantes tumorais que foram isoladas de um sujeito e uma determinada célula T ou clone foi expandido para o uso dos mesmos. Em algumas modalidades, as células T utilizadas na terapia adotiva de células T são as células T retiradas do sangue de um paciente depois de ter recebido uma vacina contra o câncer e expandidas in vitroantes da sua utilização. Em uma outra modalidade específica, as células T utilizadas na terapia adotiva de células T são as células T que foram influenciadas a reconhecer e atacar tumores de forma potente. Em uma outra modalidade específica, as células T utilizadas na terapia adotiva de células T forma geneticamente modificadas para expressar o receptor antígeno ao tumor específico das células T ou um receptor antígeno quimérico (CAR). Em uma modalidade específica, a terapia adotiva de células T utilizada é análoga a descrita na Seção 7, infra.

[205] Em certas modalidades, um NDV descrito no presente documento ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina contra o câncer de célula inteira é usado em combinação com uma citoquina. Em uma modalidade específica, um NDV descrito no presente documento ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina contra o câncer de célula inteira é usado em combinação com o interferon (por exemplo, IFN-y)•

[206] Atualmente as terapias contra o câncer disponíveis e suas dosagens, vias de administração e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritas na literatura, tais como Physician's Desk Reference (67th ed., 2013) .

[207] Exemplos específicos de agentes anticâncer que podem ser utilizados em combinação com um NDV aqui descrito ou sua composição incluem: agentes hormonais (por exemplo, inibidor da aromatase, modulador seletivo do receptor de estrógeno (SERM) e antagonista do receptor de estrogênio), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, microtúbulos bloqueador, anti-metabolito, inibidor de topoisomerase, e agente de reticulação do DNA ou agente de danificação), agentes anti-angiogênicos (por exemplo, antagonista de VEGF, antagonistas do receptor, antagonista de integrina, agente de direcionamento vascular (VTA)/agente de interrupção vascular (VDA)), terapia de radiação e cirurgia convencional.

[208] Exemplos de agentes hormonais que podem ser utilizados em combinação com um NDV aqui descrito ou sua composição incluem inibidores da aromatase, SERM, e antagonistas de receptores de estrogênio não limitativos. Agentes hormonais que são inibidores da aromatase podem ser esteróide ou não esteróide. Exemplos de agentes não esteróides hormonais não limitativos incluem o letrozol, anastrozol, aminoglutetimida, fadrozol, e vorozol. Exemplos não limitativos de agentes hormonais esteróides incluem aromasin (exemestano), formestano, e testolactona. Exemplos de agentes hormonais que são SERMs não limitativos incluem o tamoxifeno (marca/comercializado como Nolvadex®) , afimoxifene, arzoxifeno, bazedoxifeno, clomifeno, Femarelle, lasofoxifeno, ormeloxifene, raloxifeno, e toremifeno. Exemplos não limitativos de agentes hormonais que são antagonistas do receptor de estrogênio inclui fulvestrant. Outros agentes hormonais incluem, mas não estão limitados a abiraterona e lonaprisana.

[209] Exemplos de agentes quimioterapêuticos que podem ser usados em combinação com um NDV aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula completa incluem bloqueador de desmontagem de microtúbulos, antimetabolito, inibidor de topoisomerase, e agente de reticulação ou agente de danificação de DNA não limitativos. Os agentes quimioterapêuticos que são bloqueadores de desmontagem de microtúbulos incluem, mas não estão limitados a, taxanes (por exemplo, paclitaxel (marca/comercializado como TAXOL®) , docetaxel, Abraxane, larotaxel, ortataxel, e tesetaxel); epotilonas (por exemplo, ixabepilona); e alcalóides vinca (por exemplo, vinorelbina, vinblastina, vindesina, e vincristina (marca/comercializado como ONCOVIN®) ) .

[210] Os agentes quimioterapêuticos que são antimetabolitos incluem, mas não se limitam a, antimetabolitos de folato (por exemplo, metotrexato, aminopterina, pemetrexed, raltitrexed); antimetabolitos (por exemplo, purina, cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina, pentostatina, tioguanina); antimetabolitos (por exemplo, pirimidina, 5-fluorouracilo, capecitabina, gemcitabina (GEMZAR) , citarabina, decitabina, floxuridina, tegafur); e antimetabolitos desoxirribonucleótidos (por exemplo, hidroxiureia).

[211] Os agentes quimioterapêuticos que são inibidores da topoisomerase incluem, mas não estão limitados a, Classe I (Camptotheca) inibidores da topoisomerase (por exemplo, topotecano (marca/comercializado como HYCAMTIN ) irinotecano, rubitecano, e belotecano); classe II (Podophyllum) inibidores da topoisomerase (por exemplo, etoposido ou VP-16, e teniposido); antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina, epirrubicina, Doxil, aclarubicina, amrubicina, daunorubicina, idarubicina, pirarubicina, valrubicina, e zorubicina); antracenodionas e (por exemplo, mitoxantrona, e pixantrona).

[212] Os agentes quimioterapêuticos que são agentes de ligação cruzada de DNA (ou agentes que danificam o DNA) incluem, mas não estão limitados aos agentes de alquilação (por exemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, ifosfamida (marca/comercializado como IFEX°) , trofosfamida, clorambucil, melfalano, prednimustina, bendamustina, uramustine, estramustina, carmustina (marca/comercializado como BiCNU°) , lomustina, semustina, fotemustina, nimustina, ranimustina, estreptozocina, busulfano, mannosulfano, treosulfano, carboquona, N,N',N'-trietilenotiofosforamida, triaziquona, trietilenomelamina); agentes alquilantes (por exemplo, como, carboplatina (marca/comercializado como PARAPLATIN ) , cisplatina, oxaliplatina, nedaplatina, tetranitrato de triplatina, satraplatina, picoplatina) ; reticuladores de DNA não clássico (por exemplo, procarbazina, dacarbazina, temozolomida (marca/comercializado como TEMODAR®) , altretamina, mitobronitol); e agentes intercalantes (por exemplo, actinomicina, bleomicina, mitomicina, e plicamicina).

5.6.4.1 MODULADORES IMUNES

[213] Em modalidades específicas, um NDV aqui descrito (por exemplo, uma proteína quimérica de NDV) ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira é administrado a um sujeito em combinação com um ou mais dos seguintes: qualquer agonista de um sinal coestimulador de uma célula imune (tal como, por exemplo, um linfócito T, células NK ou células que apresentam o antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica ou macrófago) e/ou qualquer antagonista de um sinal inibidor de uma célula imune (tal como, por exemplo, um linfócito T, células NK ou células que apresentam o antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica ou macrófago) , conhecido por uma pessoa versada na arte. Em modalidades particulares, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico) ou uma composição deste, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira é administrado a um sujeito em combinação com um ou mais dos agonistas de um sinal coestimulador de uma célula immune descrito na Seção 5.2.1, supra. Em algumas modalidades, um NDV descrito aqui (por exemplo, um NDV quimérico) ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira é administrado a um sujeito em combinação com um ou mais dos antagonistas de um sinal inibidor de uma célula imune descrito na Seção 5.2.1, supra. Em certas modalidades, um NDV descrito aqui (por exemplo, uma proteína quimérica de NDV) ou sua composição, uma vacina antitumor, ou uma vacina de célula inteira é administrada a um sujeito em combinação com um ou mais dos agonistas de um sinal coestimulador de uma célula imune e/ou um ou mais dos antagonistas de um sinal inibidor de uma célula imune descrito na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra (por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, um ICOS-G, um anticorpo anti-PD-1, ou um anticorpo anti-PD-Ll)

5.7 ENSAIOS BIOLÓGICOS Ensaios virais in Vitro

[214] Ensaios virais incluem aqueles que medem a replicação virai alterada (tal como determinado, por exemplo, por formação de placa) ou a produção de proteínas virais (tal como determinado, por exemplo, por análise de western blots) ou RNAs virais (tal como determinado, por exemplo, por RT-PCR ou A análise de northern blot) em células cultivadas in vitroutilizando métodos que são bem conhecidos na arte.

[215] Crescimento dos NDVs aqui descritos podem ser avaliados por qualquer método conhecido na técnica ou aqui descritos (por exemplo, em cultura de células (por exemplo, culturas de células do rim do embrião da galinha ou culturas de fibroblastos embrionários da galinha (CEF)). A titulação virai pode ser determinada através da inoculação de diluições seriadas de um NDV descritos aqui em culturas de células (por exemplo, CEF, MDCK, EFK-2, células Vero, células de veia umbilical humanas primárias endoteliais (HUVEC), linhagem celular epitelial humana H292 ou células HeLa), embriões de galinha, ou animais vivos (por exemplo, aves) . Após a incubação do vírus durante um tempo especificado, o vírus é isolado usando métodos convencionais. A quantificação física da titulação do vírus pode ser realizada utilizando PCR aplicado aos sobrenadantes virais (Quinn &Trevor, 1997;. Morgan et al. , 1990), os testes de hemaglutinação, doses infecciosas para cultura de tecidos (TCID50) ou doses infecciosas de ovos (DIE 50) . Um método exemplificative de avaliar a titulação virai é descrito na Seção 6 e Seção 7, abaixo.

[216] A incorporação das sequências de nucleótidos que codificam um peptideo heterólogo ou uma proteína (por exemplo, uma citocina, uma proteína F mutada, uma proteína V mutada, ou local alvo míARN no genoma de um NDV quimérico aqui descritos pode ser avaliada por qualquer método conhecido na arte ou aqui descrito (por exemplo, na cultura celular, um modelo animal ou cultura virai em ovos embrionados). Por exemplo, as partículas virais de cultura de células do fluido alantóico de ovos embrionados podem ser purificadas por centrifugação através de uma almofada de sacarose e, subsequentemente, analisadas para a expressão da proteína de fusão por métodos de Westerning blotting bem conhecidos na arte.

[217] Abordagens baseadas em imunofluorescência também podem ser utilizadas para detectar o vírus e avaliar o crescimento virai. Estas abordagens são bem conhecidas por aqueles versados na arte, por exemplo, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (ver Seção 6, e Seção 7, infra).

Ensaios em anticorpos

[218] Os anticorpos gerados pelos NDVs aqui descritos podem ser caracterizados por uma variedade de maneiras bem conhecidas por um perito na arte (por exemplo, ELISA, exibição de ressonância de plásmons de superfície (BIAcore), Western blot, imunofluorescência, imunocoloração e/ou ensaios de microneutralização). Em particular, os anticorpos gerados pelos NDVs quiméricos aqui descritos podem ser testados quanto à capacidade para se ligarem especificamente a um antígeno do vírus ou a um peptideo heterólogo ou uma proteína. Tal ensaio pode ser efetuado em solução (por exemplo, Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421), on beads (Lam, 1991, Nature 354:82 84), on chips (Fodor, 1993, Nature 364:555 556), on bacteria (U.S. Patent No. 5,223,409), on spores (U.S. Patent Nos. 5,571,698; 5,403,484; e 5,223,409), on plasmids (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869) ou on phage (Scott and Smith, 1990, Science 249:386 390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382; e Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310) (cada uma destas referências é aqui incorporada na sua totalidade por referência).

[219] Os anticorpos gerados pelos NDVs quiméricos aqui descritos que foram identificados para se ligarem especificamente a um antígeno do vírus ou a um peptideo heterólogo ou proteína podem ser ensaiados quanto à sua especificidade para o referido antígeno do vírus ou peptideo heterólogo ou proteína. Os anticorpos podem ser ensaiados quanto à ligação específica a um antígeno do vírus ou um peptideo heterólogo ou uma proteína e para a sua reatividade cruzada com outros antígenos por qualquer método conhecido na arte. Os imunoensaios que podem ser utilizados para analisar a ligação específica e a reatividade cruzada incluem, mas não estão limitados aos sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima), imunoensaios em "sandwich", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitação, reações de precipitação de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, apenas para citar alguns. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Ausubel et al. , eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que é incorporado como referência aqui na sua totalidade).

[220] A afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno e a taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno pode ser determinada por ensaios de ligação competitivos. Alternativamente, um ensaio de ressonância de plásmon de superfície (por exemplo, Análise cinética BIAcore) ou ensaio KinExA (Blake, et al., Analytical Biochem., 1999, 272:123-134) podem ser usados para determinar a ligação e taxa de dissociação de anticorpos para um antígeno dos NDVs quiméricos aqui descritos.

Ensaios IFN

[221] A indução de IFN e liberação por um NDV aqui descrita pode ser determinada utilizando técnicas aqui descritas ou conhecidas dos especialistas na arte. Por exemplo, a quantidade de IFN induzidas em células após infecção com um NDV aqui descrito, pode ser determinada utilizando um ensaio imunológico (por exemplo, em ELISA ou ensaio Western Blot) para medir a expressão IFN ou para medir a expressão de uma proteína cuja expressão é induzida pela IFN. Alternativamente, a quantidade de IFN induzida pode ser medida em nível do RNA por ensaios, tais como Northern blot e RT-PCR quantitativo, conhecidos por uma pessoa versada na arte. Em modalidades específicas, a quantidade de IFN liberada pode ser medida utilizando um ensaio ELISPOT. (Veja, por exemplo, os métodos descritos na Seção 6, e Seção 7, abaixo) . Além disso, a indução e a liberação de citocinas podem ser determinadas por, por exemplo, um imunoensaio ou ensaio ELISPOT ao nível da proteína e/ou RT-PCR quantitativo ou Northern blots ao nível do RNA. Veja a Seção 6 e/ou Seção 7, infra, sobre os ensaios para medir a indução e liberação das citocinas.

Ensaios de marcadores de ativação

[222] Técnicas para avaliar a expressão do marcador de ativação, molécula coestimuladora, ligante, ou uma molécula inibidora por células do sistema imunológico são conhecidos para uma pessoa versada na arte. Por exemplo, a expressão de um marcador de ativação, molécula coestimuladora, ligante, ou uma molécula inibidora por uma célula imune (por exemplo, linfócitos T ou células NK) pode ser avaliada por citometria de fluxo. Em uma modalidade específica, as técnicas descritas na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra, são usadas para avaliar a expressão de um marcador de ativação, molécula coestimuladora, ligante, ou uma molécula inibidora por uma célula imune.

Ensaio de infiltração de célula imune

[223] Técnicas para avaliar a infiltração de células imunes são conhecidos para uma pessoa versada na arte. Em uma modalidade específica, as técnicas descritas na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra, são usadas para avaliar a infiltração de células imunes.

Estudos de Toxidade

[224] Em algumas modalidades, os NDVs aqui descritos ou suas composições, vacinas antitumor aqui descrito, as vacinas de células inteiras aqui descritas, ou terapias de combinação aqui descritas, são testadas quanto à citotoxicidade, em linhagens celulares de mamíferos, preferivelmente humanos (ver, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade descrito na Seção 6 e/ou Seção 7, infra). Em certas modalidades, a citotoxicidade é avaliada em um ou mais dos seguintes exemplos não limitativos de linhagens celulares: células U937, uma linhagem celular de monócitos humanos; células primárias periféricas mononucleares de sangue periférico (PBMC); Huh7, uma linhagem celular de hepatoblastoma humano; células HL60, HT1080, células HEK 293T e 293H, células MLPC, linhagem celular do rim embrionário humano; linhagens celulares de melanoma humano, tais como SkMel2, SKMEL-119 e SKMEL-197; THP-1, células monocíticas; uma linhagem celular de HeLa; e linhagens celulares de neuroblastoma, tais como MC-IXC, SK-N-MC e SK- N-MC e SK-N-DZ, SH-SY5Y e BE(2)-C. Em certas modalidades, a citotoxicidade é avaliada em células de câncer diferentes. Em algumas modalidades, o ensaio ToxLite é utilizado para avaliar a citotoxicidade.

[225] Muitos ensaios bem conhecidos na arte podem ser utilizados para avaliar a viabilidade das células ou linhagens celulares, após a infecção com um NDV aqui descrito ou sua composição, ou tratamento com uma vacina antitumor aqui descrita, uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita e, assim, determinar a citotoxicidade do NDV ou sua composição, vacina antitumor, vacina de células inteiras, ou terapia de combinação. Por exemplo, a proliferação celular pode ser analisada pela medida da incorporação de Bromodesoxiuridina (BrdU), incorporação de timidina (3H) , por contagem celular direta, ou detecção de modificações na transcrição, tradução ou atividade de genes conhecidos como proto-oncogenes (por exemplo, fos, myc) ou marcadores do ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, DI, D2, D3, E, etc.). Os níveis de tal proteína e mRNA e atividade podem ser determinados por qualquer método bem conhecido na técnica. Por exemplo, a proteína pode ser quantificada por métodos imunodiagnósticos conhecidos como ELISA, Western blotting ou imunoprecipitação usando anticorpos, incluindo anticorpos comercialmente disponíveis. 0 mRNA pode ser quantificado usando métodos que são bem conhecidos e rotineiros na técnica, por exemplo, usando análise northern, proteção de RNase ou reação de polimerase em cadeia em conexão com transcrição reversa. A viabilidade celular pode ser avaliada usando marcação com azul de tripano ou outros marcadores de viabilidade ou morte celular conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, o nível de ATP celular é medido para determinar a viabilidade celular. Em modalidades preferidas, um NDV aqui descrito ou a sua composição, vacina antitumor, vacina de células inteiras, ou terapia de combinação mata as células cancerosas, mas não matam as células normais (isto é, não cancerosas). Em uma modalidade, um NDV aqui descrito ou sua composição, vacina antitumor, terapia de vacinas de células inteiras, ou combinação preferencialmente mata as células cancerosas, mas não matam as células normais (isto é, não cancerosas).

[226] Em modalidades específicas, a viabilidade celular é medida em períodos de três dias e de sete dias usando um padrão de ensaio na técnica, como o Kit de Ensaio CellTiter-Glo (Promega) que mede os níveis de ATP intracelular. Uma redução do ATP celular é indicativa de um efeito citotóxico. Em outra modalidade específica, a viabilidade celular pode ser medida no ensaio de absorção de vermelho neutro. Em outras modalidades, a observação visual das modificações morfológicas pode incluir alargamento, granulosidade, células com bordas irregulares, uma aparência membranosa, arredondamento, separação da superfície do poço, ou outras modificações.

[227] Os NDVs aqui descritos ou suas composições, vacinas antitumor, vacinas de células inteiras ou terapias de combinação podem ser testados quanto à toxicidade in vivo em modelos animais (ver, por exemplo, os modelos animais descritos na Seção 6 e/ou na Seção 7, abaixo). Por exemplo, os modelos animais aqui descritos, e/ou outros conhecidos na arte, utilizados para testar os efeitos dos compostos sobre o câncer também podem ser utilizados para determinar a toxicidade in vivo dos NDVs aqui descritos ou suas composições, vacinas antitumor, células inteiras vacinas, ou terapias de combinação. Por exemplo, os animais são administrados uma gama de pfu de um NDV aqui descrito (por exemplo, um NDV quimérico descrito na Seção 5.2, infra). Subsequentemente, os animais são monitorados ao longo do tempo para letalidade, perda de peso ou falência de ganho de peso e/ou níveis de marcadores séricos que podem ser indicativos de dano tecidual (por exemplo, o nível de creatina fosfoquinase como um indicador do dano tecidual geral, nível de ácido oxálico glutâmico transaminase ou ácido pirúvico transaminase como indicadores do possível dano hepático). Estes ensaios in vivo também podem ser adaptados para testar a toxicidade do modo de administração e/ou regime além das dosagens.

[228] A toxicidade e/ou a eficácia de um NDV aqui descrito ou sua composição, uma vacina antitumor aqui descrita, uma vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas experimentais de células ou animais, por exemplo, para determinar a LD50 (dose letal para 50% da população) e a ED50 (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção LD5o/ED5o.S São preferenciais terapias que exibem grandes índices terapêuticos. Embora terapias que exibe efeitos secundários tóxicos possa ser utilizada, cuidados devem ser tomados para projetar um sistema de entrega que direcione estas terapias ao local do tecido afetado a fim de minimizar o dano potencial a células não cancerosas e, por meio disso, reduzir os efeitos colaterais.

[229] Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e estudos animais podem ser usados na formulação de uma faixa da dosagem das terapias para uso em sujeitos. A dosagem de tais agentes está preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a EDS0 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer terapia aqui descrita, a dose terapeuticamente eficaz eficaz pode ser estimada inicialmente de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentração do NDV quimérico que alcança uma metade da inibição máxima dos sintomas) como determinado na cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais exatamente as doses úteis no sujeito. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, pela cromatografia líquida de alto desempenho.

Estudo anticâncer

[230] Os NDVs aqui descritos ou suas composições, vacinas antitumor aqui descrita, vacinas de células inteiras aqui descrita, terapias de combinação aqui descritas podem ser testados quanto à atividade biológica utilizando modelos animais para o câncer. Tais sistemas de modelo animal incluem, mas não estão limitados a ratos, camundogos, galinhas, vacas, macacos, porcos, cães, coelhos, etc. Em uma modalidade específica, a atividade anticâncer de um NDV descrito no presente documento ou a terapia de combinação é testada em um sistema de modelo de rato. Tais sistemas modelo são amplamente utilizados e bem conhecidos pelos especialistas na matéria, tais como o modelo de rato SCID ou ratos transgênicos.

[231] A atividade anticâncer de um NDV descrito no presente documento ou sua composição, vacina antitumor aqui descrita, a vacina de célula inteira aqui descrita, ou uma terapia de combinação aqui descrita pode ser determinada administrando o NDV ou sua composição, vacina antitumor, vacina de células inteiras, ou combinação de terapia para um modelo animal e verificar que o NDV ou sua composição, vacina antitumor, vacina de células inteiras, ou terapia de combinação é eficaz na redução da severidade do câncer, reduzindo os sintomas de câncer, reduzir a metástase do câncer, e/ou reduzindo o tamanho de um tumor no referido modelo animal (ver, por exemplo, Seção 6 e/ou na Seção 7, abaixo). Exemplos de modelos animais para o câncer em geral incluem, incluem, mas não estão limitados aos tumores de animais de estimação que ocorre espontaneamente (ver, por exemplo, Vail & MacEwen, 2000, Câncer Invest 18 (8) : 781-92) . Exemplos de modelos animais para o câncer do pulmão incluem, mas não estão limitados aos modelos animais de câncer do pulmão descritos por Zhang e Roth (1994, in vivo 8 (5) : 755-69) e um modelo de rato transgênico com a função de p53 interrompido (ver, por exemplo, Morris et al. , 1998, J La State Med Soc 150(4) : 17 9- 85) . Um exemplo de um modelo animal de câncer da mama incluei, mas não está limitado a um camundongo transgênico que expressa sobre ciclina Dl (ver, por exemplo, Hosokawa et al. , 2001, Transgenic Res 10 (5) : 471-8) . Um exemplo de um modelo animal para o câncer do cólon inclui, mas não está limitado a rato de duplo nocaute TCR b e p53 (ver, por exemplo, Kado et al., 2001, Cancer Res. 61(6):2395-8) . Exemplos de modelos animais para o câncer do pâncreas incluem, mas não estão limitados a um modelo metastático de adenocarcinoma pancreático Panc02 de murino (ver, por exemplo, Wang et al. , 2001, Int. J. Pancreatol. 29(1) :37- 46) e camundongos nu-nu gerado em tumores pancreáticos subcutâneas (ver, por exemplo, Ghaneh et al., 2001, Gene Ther. 8(3) :199-208) . Exemplos de modelos animais para o linfoma de não-Hodgkin incluem, mas não estão limitados a uma imunodeficiência combinada grave ("SCID") de camundongo (ver, por exemplo, Bryant et al. , 2000, Lab Invest 80 (4) : 553-73) e um camundongo transgênico IgHmu-HOXll (ver, por exemplo, Hough et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23) : 13853-8) . Um exemplo de um modelo animal para o câncer esofágico inclui, mas não está limitado a um camundongo transgênico para o papilomavírus humano tipo 16 oncogene E7 (ver, por exemplo, Berber et al. , 1996, J. Virol. 70(3):1873-81). Exemplos de modelos animais para carcinomas colorretais incluem, mas não estão limitados aos modelos rato Ape (ver, por exemplo, Fodde &Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8):369 73 e Kuraguchi et al., 2000). Em uma modalidade específica, os modelos animais para o câncer descrito na Seção 6 e/ou na Seção 7, infra, são usadas para avaliar a eficácia de um NDV ou sua composição, um antitumor, uma vacina de células inteiras, ou uma terapia de combinação.

6. EXEMPLO 1

[232] Este exemplo demonstra a eficácia terapêutica da terapia de NDV em combinação com moduladores do ponto de verificação que são imunes imunoestimulante no tratamento de câncer.

6.1 MATERIAIS & MÉTODOS Ratos

[233] Ratinhos atinhos Balb/C (6 a 8 semanas de idade), e Ratinhos WT C57BL/6 foram adquiridos de Jackson Laboratory. Todos os ratos foram mantidos em gaiolas microisolator e tratados de acordo com NH e merican Association of Laboratory Animal Care regulations. Todos os procedimentos com os ratos e experiências para este estudo foram aprovados pelo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care e Use Committee.

Linhagem de celulares

[234] As linhagens celulares de câncer murino para o melanoma (B16-F10), e carcinoma do cólon (CT26 e MC38) foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro e penicilina com estreptomicina. A linhagem celular TRAMP-C2 de câncer da próstata de murino foi mantida em meio DMEM suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (FCS; Mediatech, Inc.), 5% de Soro IV Nu (BD Biosciences) de HEPES, 2-ME, pen/strep, L-glut, 5 pg/ml de insulina (Sigma), e 10 nmol/L de DHT (Sigma).

Anticorpos

[235] Anti-CTLA-4 terapêutico (clone 9H10), anti-DP-1 (clone RMP1-14), e anticorpos monoclonais anti-PD- L1 foram produzidos por BioXcell. Os anticorpos utilizados para a citometria de fluxo foram adquiridos a eBioscience, BioLegend, Invitrogen, e BD Pharmingen.

Vírus e Clonagem

[236] A cepa de NDV LaSota lentogênica recombinante foi usada para todas as experiências. Para gerar vírus NDV expressando murino ICOSL, um fragmento de DNA que codifica o murino ICOSL flanqueado pelos sinais de transcrição de RNA específicos de NDV apropriados foi inserido no sítio SacII criado entre os genes P e M de pT7NDV/LS. Os vírus foram resgatadas de cDNA, utilizando métodos descritos anteriormente e sequenciado por PCR de transcrição inversa para a fidelidade da inserção. Os títulos de vírus foram determinados por diluição em série e imunofluorescência em células Vero. Construto de fusão ICOSL-F recombinante foi gerado por amplificação PCR do DNA ICOSL que codifica o domínio extracelular (aminoácidos 1- 277) com flanqueamento MluI e EcoRI de sítios de restrição, e o DNA de F de NDV que codifica a transmembrana F e domínios intracelulares (aminoácidos 501-554) com flanqueadores MluI e Xhol sítios de restrição. Os fragmentos de DNA resultantes foram reunidos no vetor pCAGGS utilizando 3 parte de ligação.

Experiências de infecçãoín vitro

[237] Para a avaliação da regulação positiva da superfície de MHC-I, MHC-II, e ICAM-1 por NDV, e para a avaliação da expressão de superfície do transgene ICOSL do vírus NDV-ICOSL, células B16-F10 foram infectadas em placas de 6 poços em MOI 2 em triplicado. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram colhidas por raspagem mecânica e processadas para marcação de superfície e quantificação por citometria de fluxo. Para experimentos da curva de crescimento do vírus, as células B16-F10 foram incubadas à temperatura ambiente com o vírus em placas de cultura de 6 poços no MOIs indicado em um volume total de 100 pl. Uma hora após a incubação, o meio de infecção foi aspirado e as células foram incubadas a 37°C em 1 ml de DMEM com 10% fluido alantóico de pintinho. Após 24, 48, e 72 horas, os sobrenadantes foram recolhidos e os títulos de vírus foram determinados como acima. Para as experiências de citotoxicidade in vitro,as infecções foram feitas de uma forma semelhante. 24, 48, 72, e 96 horas após a infecção as células foram lavadas e incubadas com 1% de Triton X-100 a 37°C por 30 minutos. A atividade de LDH nos lisados foi determinada utilizando o kit de ensaio Promega CytoTox 96, de acordo com as instruções do fabricante.

Experimentos de sobrevivência ao desafio tumoral.

[238] Modelos de tumor bilaterais foram estabelecidos para monitorar a eficácia terapêutica tanto em tumores injetados quanto sistêmicos. Foram estabelecidos esquemas de tratamento e doses de células para cada modelo de tumor para conseguir 10 a 20% de diminuição do tumor por NDV ou anti-CTLA-4/anti-DP-l, como agentes isolados. Para experiências que avaliaram a terapia de combinação de NDV do tipo selvagem (NDV-WT) com bloqueio imunológico da via de sinalização, tumores B16F10 foram implantados pela injeção de 2 x 105 células B16F10 do lado direito i.d. no dia 0 e 5 x 104 células no lado esquerdo no dia 4. Nos dias 7, 10, 13 e 16 os ratos foram tratados com 4 injeções intratumorais de 2 x 107 pfu de NDV em PBS em um volume total de 100 pl. Ao mesmo tempo, nos dias 7, 10, 13 e 16 os ratos receberam quatro injeções i.p. de anticorpo anti-CTLA-4 (100 pg) ou anticorpo anti-DP-1 (250 pg) . Os grupos de controle receberam uma dose correspondente de isotipo de anticorpo i.p. e injeção intratumoral de PBS. 0 tamanho do tumor e a incidência foram monitorados ao longo do tempo por medição com um calibrador.

[239] Para o modelo TRAMP-C2, 5 x 105 células foram implantadas no lado direito no dia 0 e 5 x 105 células foram implantadas no lado esquerdo no dia 8. 0 tratamento foi realizado nos dias 11, 14, 17, 20 e da forma semelhante acima para cima.

[240] Para experiências avaliando NDV recombinante que expressa ICOSL (NDV-ICOSL) , tumores B16F10 foram implantados por injeção de 2 x 105 células B16F10 no lado direito i.d. no dia 0 e 1 x 105 células no lado esquerdo no dia 4. 0 tratamento foi levado realizado como acima.

[241] Para o modelo CT26, os tumores foram implantados pela injeção de 1 x 10scélulas CT2 6 no lado direito i.d. no dia 0 e 1 x 10scélulas no lado esquerdo no dia 2. 0 tratamento foi realizado como descrito acima nos dias 6, 9 e 12.

Isolamento de linfócitos que infiltram tumores

[242] Tumores B16F10 foram implantados por injeção de 2 x 105 células B16F10 no lado direito i.d. no dia 0 e 2 x 105 células no lado esquerdo no dia 4. No dia 7, 10 e 13 os ratos foram tratados com três injeções intratumorais de 2 x 107 pfu de NDV, e 100 pg de i.p. anticorpo anti-CTLA-4 ou 2 50 pg de i.p. anti-PD-1, onde especificado. No dia 15, os ratos foram sacrificados por inalação de C02. Tumores e gânglios linfáticos de drenagem do tumor foram removidos com pinça e tesouras cirúrgicas e pesados. Os tumores de cada grupo foram picados com uma tesoura, antes da incubação com 1,67 Wunsch U/mL de Liberase e 0,2 mg/ml de DNase por 30 minutos a 37°C. Os tumores foram homogeneizados por pipetagem repetida e filtrados através de um filtro de náilon de 70pm. As suspensões de células foram lavadas uma vez com RPMI e purificadas em um gradiente Ficoll para eliminar as células mortas. As células de nódulos linfáticos que drenam tumor foram isoladas por trituração dos gânglios linfáticos através de um filtro de náilon de 7 0pm.

Citometria de Fluxo

[243] As células isoladas de tumores ou nódulos linfáticos de drenagem do tumor foram processados para marcação com vários painéis de anticorpos colorados CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, PD-1, ICOS, CDllc, CD19, NK1.1, CDllb, F4/80, Ly6C e Ly6G. Corante de viabilidade fixável eFluor780 (eBioscience) foi usada para distinguir as células vivas. As células foram ainda permeabilizadas com fixante FoxP3 e kit de permeabilização (eBioscience) e coradas com Ki-67, FoxP3, Granzima B, CTLA-4 e IFN gama. Os dados foram adquiridos utilizando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences) e analisados utilizando software FlowJo (Treestar).

Purificação DC e Carregamento

[244] Os baços de ratos sem tratamento foram isolados e digeridos com 1,67 Wunsch U/mL de Liberase e 0,2 mg/ml de DNase por 30 minutos a 37°C. As suspensões das células resultantes foram filtradas através de filtro de náilon de 70pm e lavadas uma vez com RPMI completo. Células dendríticas CDllc+ foram purificadas por seleção positiva utilizando esferas magnéticas de Miltenyi. Células dendríticas isoladas foram cultivadas durante a noite com GM-CSF recombinante e os lisados tumorais B16-F10 e foram purificados em gradiente de Ficoll.

Análise da produção de citocinas

[245] As suspensões de células de tumores ou nódulos linfáticos que drenam tumor foram reunidas e enriquecidas para células T utilizando um kit de purificação de célula T de Miltenyi. As células T isoladas foram contadas e cocultivados durante 8 horas com células dendríticas carregadas com células B16-F10 lisadas de células de tumor na presença de 20 U/ml de IL-2 (R e D) , além de Brefeldina A (BD Bioscience) . Depois da re- estimulação, os linfócitos foram processados por citometria de fluxo tal como acima.

Estatística

[246] Os dados foram analisados pelo teste T de Student, e P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

6.2 RESULTADOS

[247] Para caracterizar a resposta imunitária antitumoral induzida pela infecção do vírus da doença de Newcastle (NDV), a expressão das moléculas MHC I e MHC II, assim como ICAM-1 na superfície das células infectadas in vitroforam avaliadas. Como mostrado na Figura 1, a infecção de NDV em células de melanoma B16 induz a regulação positiva de MHC de classe I e moléculas II, bem como a molécula de adesão ICAM-1, os quais são considerados como sendo importantes para o recrutamento de linfócitos de tumor específico e ativação da resposta imunitária antitumoral. Em seguida, a resposta imunitária antitumoral induzida pela infecção por NDV in vivo foi avaliada em um modelo de melanoma murino e um modelo de 2 lados estabelecido que permitiu a monitorização das respostas tanto nos tumores injetados com nos vírus, bem como nos tumores distantes que não recebem o vírus. Como mostrado na Figura 2, os tumores infectados com vírus mostram infiltração dramática com células imunes, tais como células NK, macrófagos, e células CD8 e CD4, mas não em células T reguladoras. Uma vez que esta parte da resposta imunitária pode ser uma resposta ao vírus, em vez do tumor, a resposta imune em relação a tumores contralaterais foi avaliada (Figura 3) . Curiosamente, estes tumores demonstraram um grau semelhante de aumento de células efetoras CD8 e CD4, mas não o t reg infiltrado. Análise dessas células revelou que regulam positivamente a ativação, proliferação, e marcadores líticos (Figura 4) . Monoterapia NDV foi eficaz no controle dos tumores tratados (Figura 5A) , mas apenas ligeiramente mais lento o crescimento dos tumores contralaterais (Figura 5B). Os ratos que dimuiram os tumores, no entanto, demonstraram algum grau de proteção contra desafio adicional do tumor (Figura 5D) , o que sugere que a terapia de NDV pode induzir uma imunidade duradoura.

[248] Em seguida, avaliou-se se os mecanismos adicionais que poderiam ser direcionados para aumentar o efeito antitumoral gerado por NDV. A caracterização do slinfócitos que infiltram tumoreses de ambos os tumores de NDV injetados e não injetados revelou regulação positiva do receptor de CTLA-4 inibitórios em linfócitos (Figura 6). Em seguida foi avaliado se a inibição do receptor CTLA-4 pode resultar em uma melhor eficácia terapêutica de NDV. Surpreendentemente, a terapia de combinação resultou na rejeição de tumores bilaterais na maioria dos animais, um efeito que não foi observado com o tratamento por si só (Figura 7) . Este efeito esteve presente mesmo quando se utilizou o modelo TRAMP adenocarcinoma da próstata, o qual não é susceptível a infecção virai (Figura 8), sugerindo que a replicação virai mínima e a resposta inflamatória resultante foram suficientes para a geração de imunidade antitumoral protetora.

[249] Para determinar se a marcação de outras vias de sinalização imunitárias em combinação com a terapia de NDV pode ser benéfico, o efeito sobre a via DP-1 - PD-L1 seguindo à infecção de NDV foi avaliada. Como mostrado na Figura 9, as células tumorais infectadas com NDV tanto in vitro como in vivo regulou positivamente a expressão do ligante PD-L1 inibitório na superfície das células. Este efeito não foi apenas resultado de uma infecção direta por vírus, mas também foi visto quando as células não-infectadas foram tratadas com sobrenadantes inativado por UV a partir de células infectadas por vírus (Figura 9B) e nos tumores contralaterais, não infectados, (Figura 9C) . Isto levou a testes da terapia de combinação com NDV e anticorpo anti-DP- 1. Semelhante ao bloqueio CTLA-4, a terapia de NDV em combinação com anti-DP-1 no modelo de melanoma B16 agressivo resultou em cura na maioria dos animais, um efeito que foi associado com o aumento da infiltração de tumores com linfócitos efetores ativados (Figura 10).

[250] Ao longo dos estudos realizados, a eficácia terapêutica de uma terapia de combinação diminuiu quando o desafio do tumor maior foi usado. Em seguida, marcadores de ativação que poderiam prever uma resposta melhor e poderiam ser direcionados para melhorar ainda mais a eficácia terapêutica foram avaliados. A análise de linfócitos isolados de tumores e a regulação positiva dos nódulos linfáticos que drenam tumores identificados da molécula co-estimulatória ICOS como um dos marcadores de ativação nos animais tratados (Figura 11). A regulação positiva ICOS tem mostrado previamente está associada com respostas terapêuticas mais duráveis e aumento da sobrevivência em pacientes tratados com anti-CTLA-4 para a terapia de melanomas malignos. Foi avaliado se a expressão intratumoral do ligante de ICOS (ICOSL) poderia impulsionar ainda mais a resposta terapêutica da terapia de combinação. Usando o sistema de inversão genética para NDV, NDV expressando murino ICOSL (NDV-ICOSL) foram gerados. Caracterização in vitrodo vírus revelou que tinha replicativa semelhante e propriedades liticas para a cepa de NDV parental (Figura 12). Quando testados in vivo, no entanto, um desafio com tumor B16 maior, o NDV-ICOSL demonstrou vantagem significativa sobre o vírus NDV parental quando usado em combinação com bloqueio CTLA-4, com sobrevivência a longo prazo na maioria dos animais tratados (Figura 13) . Este efeito não se limitava ao melanoma B16 e foi demonstrado para o carcinoma do cólon CT2 6 na cepa de rato Balb/C, o que sugere que esta estratégia terapêutica pode ser traduzida, a diferentes tipos de tumores (Figura 14). Análise de tumores B16 dos animais tratados demonstrou infiltração significativa com diferentes subtipos de células imunes com regulação positiva dos marcadores de ativação (Figuras 15 e 16) . Estes linfócitos foram específicos de tumor e demonstrou secreção de IFN gama, em resposta à estimulação com células dendríticas carregadas com lisados de tumor (Figura 17) . Finalmente, os animais que foram curados dos seus tumores BI6 ou CT26 foram novamente desafiados com células tumorais e demonstraram uma proteção completa contra o novo desafio tumoral (Figura 18).

[251] Para melhorar ainda mais a expressão do ICOSL no tumor e para incorporar o ligante no virion, uma proteína quimérica constituída pelo domínio extracelular de ICOSL (aminoácidos 1-277) e os domínios intracelulares e a transmembrana da proteína F de NDV (aminoácidos 501-554) foram gerados (Figura 19A) . A transfecção da construção resultante em células B16-F10 resultou em um aumento da expressão do ligante ICOLS F quimérico na superfície das células transfectadas, quando comparado com o ICOSL native transfectado, sugerindo que os mecanismos de regulação que regula o transporte da proteína F de NDV para a superfície pode ser utilizada para aumentar a expressão da superfície dos ligantes estimuladores imunes (Figura 19B).

[252] Em geral, esses estudos demonstram que: 1) a combinação de NDV com anticorpos reguladores da via de sinalização imunológica pode ser utilizada como uma estratégia para contornar a limitação tanto da terapia por vírus oncolítico quanto pela terapia de anticorpos; e 2) a expressão de ligantes imunoestimulantes por NDV pode melhorar ainda mais a eficácia terapêutica do vírus, especialmente quando usada em combinação com anticorpos imunorreguladores. Estas conclusões têm aplicação clínica.

7. EXEMPLO 2

[253] Este exemplo demonstra as respostas imunitárias antitumorais induzidas por NDV oncolítico e as respostas antitumorais induzidas por NDV em combinação com o bloqueio CTLA-4.

7.1 MATERIAIS & METÓDOS RatOS

[254] Ratos C57BL/6J e Balb/C foram adquiridos pela Jackson Laboratory. Ratos IFNAR-/- em fundo C57BL/6J foi um presente gentil do Dr. Eric Pamer. Ratos transgênicos Trp-1 TCR e Pmel-1 foram relatados (Overwijk et al, 2003, J. Exp. Med, 198:568, Muransky et al, 2008, Blood 112:362) e foram fornecidos N. Restifo (National Cancer Institute, Bethesda, MD) . Ratos TRP1 foram cruzados com ratos luciferase: CD2 fornecidos por Patrick Hwu at MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) para criar ratos TRP1 luciferase* (TRP1-FLUC). Todos os ratos foram mantidos em gaiolas microisoladas e tratadas de acordo com a Associação Americana de NIH and American Association of Laboratory Animal Care regulations. Todos os procedimentos e experiências com ratos para este estudo foram aprovados pelo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee.

Linhagem celular

[255] As linhagens celulares de câncer murino para o melanoma (B16-F10), e carcinoma do cólon (CT26 e MC3 8) foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro e penicilina com estreptomicina. A linhagem celular TRAMP-C2 de câncer da próstata de murino foi mantida em meio DMEM suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (FCS; Mediatech, Inc.), 5% de Soro IV Nu (BD Biosciences) de HEPES, 2-ME, pen/strep, L-glut, 5 pg/ml de insulina (Sigma), e 10 nmol/L de DHT (Sigma).

Anticorpos

[256] Terapêuticos anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 (clone 9H10), anti-DP-1 (clone RMP1-14), anti- PD-L1 (clone 9G2), anti-CD8 (clone 2.43), anti-CD4 (clone GK1.5), anti-IFN-gama (XMG1.2 clone), e anti-NKl.l (clone PK136) foram produzidos por BioXcell. Os anticorpos utilizados para a citometria de fluxo foram adquiridos a eBioscience, BioLegend, Invitrogen, e BD Pharmingen.

Vírus e clonagem

[257] A cepa de NDV LaSota lentogênica recombinante foi usada para todas as experiências. Para gerar vírus NDV expressando murino ICOSL, um fragmento de DNA que codifica o murino ICOSL flanqueado pelos sinais de transcrição de RNA específicos de NDV apropriados foi inserido no sítio SacII criado entre os genes P e M de pT7NDV/LS. Os vírus foram resgatadas de cDNA, utilizando métodos descritos anteriormente e sequenciado por PCR de transcrição inversa para a fidelidade da inserção. Os títulos de vírus foram determinados por diluição em série e imunofluorescência em células Vero. Construto de fusão ICOSL-F recombinante foi gerado por amplificação PCR do DNA ICOSL que codifica o domínio extracelular (aminoácidos 1- 277) flanqueando MluI e EcoRI de sítios de restrição, e o DNA de F de NDV que codifica a transmembrana F e domínios intracelulares (aminoácidos 501-554) com flanqueadores MluI e Xhol sítios de restrição. Os fragmentos de DNA resultantes foram reunidos no vetor pCAGGS utilizando 3 parte de ligação. 0 construto de fusão CD28scfv-F foi gerado por amplificação PCR do cDNA que codifica anti -CD28scfv do hamster com flanqueamento MluI e EcoRI de sítios de restrição, e o DNA de F de NDV que codifica a transmembrana F e domínios intracelulares (aminoácidos 501-554) flanqueando MluI e Xhol sítios de restrição. Os fragmentos de DNA resultantes foram reunidos no vetor pCAGGS utilizando 3 parte de ligação e, em seguida, subclonados no vetor pNDV entre os genes P e M. Para gerar os vírus recombinantes que expressam outras proteínas quiméricas (HN-GITRL, HN-4-1BBL, HN-CD40L, OX40L-HN), o cDNA que codifica o domínio extracelular de cada gene (Figura 44) foi amplificado com os iniciadores específicos de gene com EcoRI e flanqueando os sítios de restrição Mlu I e EcoRI, e o domínio transmembranar e intracelular da proteína HN foi amplificado com os iniciadores específicos com os sítios de restrição que flanqueiam MluI e Xhol. Os genes quiméricos foram completos foram reunidos no vetor pCAGGS, utilizando 3 partes de ligação e, em seguida, subclonados no vetor NDV entre os genes P e M. Os detalhes de cada construção quimérica são demonstrados na Figura 44. Para gerar o NDV recombinante que codifica murino IL-2, IL-15 e IL-21, o cDNA para cada gene foi amplificado com os iniciadores específicos do gene que flanqueiam os sítios de restrição com SacII e depois clonado no pNDV entre os genes P e M. Os vírus foram resgatadas de cDNA, utilizando métodos descritos anteriormente e sequenciados por PCR de transcrição inversa para a fidelidade de inserção. Os títulos dos vírus foram determinados por diluição em série e imunofluorescência em células Vero.

Experiências de infecção in vitro

[258] Para a marcação da superfície celular, as células foram infectadas em placas de 6 poços em MOI 2 (B16-F10) ou MOI 5 (TRAMP C2), em triplicado. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram colhidas por raspagem e processadas para marcação de superfície e quantificação por citometria de fluxo. Para as experiências de citotoxicidade in vitro,as células foram infectadas nas MOI's indicadas e incubadas a 37°C em meio isento de soro na presença de 250 ng/ml de tripsina TPCK. Em 24, 48, 72, e 96 horas após a infecção as células foram lavadas e incubadas com 1% de Triton X-100 a 37°C durante 30 minutos. A atividade de LDH nos lisados foi determinada utilizando o kit de ensaio Promega CytoTox 96, de acordo com as instruções do fabricante.

Experiências de sobrevivência ao desafio tumoral

[259] Modelos de tumor bilaterais foram estabelecidos para monitorar a eficácia terapêutica tanto em tumores injetados quanto sistêmicos. Foram estabelecidos esquemas de tratamento e doses de células para cada modelo de tumor para conseguir 10 a 20% de diminuição do tumor por NDV ou anti-CTLA-4 como agentes isolados. Para experiências que avaliaram a terapia de combinação de NDV com anti-CTLA-4 de anticorpo, tumores B16F10 foram implantados pela injeção de 2 x 105 células B16F10 do lado direito intradérmica i.d. no dia 0 e 5 x 104 células no lado esquerdo no dia 4. Nos dias 7, 9, 11 e 13, os ratos foram tratados com injeções intratumorais de 2 x 107 pfu de NDV em PBS em um volume total de 100 pl. Ao mesmo tempo, nos dias 7, 9, 11 e 13 os ratos receberam injeções intraperitoneaos i.p. de anticorpo anti-CTLA-4 (100 pg) ou anticorpo anti-DP-1 (250 pg) ou anticorpo anti-Ll-PD (250 pg) . Os grupos de controle receberam uma dose correspondente do isotipo de anticorpo i.p. e injeção intratumoral de PBS. Os animais foram sacrificados ao mostrarem sinais de sofrimento ou quando o volume total do tumor atingiu lOOOmm3. Para a depleção de células imunes, nos ratos foram injetados i.p. 500 pg de anticorpos monoclonais para CD8+, CD4+, NK1.1 ou IFN-y, um dia antes e dois dias após a inoculação do tumor, seguido de injeção de 250 pg a cada 5 dias durante todo o experimento. Para o modelo TRAMP-C2, lxlO6 células foram implantadas no lado direito no dia 0 e 5 x 105 células foram implantadas no lado esquerdo no dia 4. 0 tratamento foi realizado nos dias 7, 10, 13, e 16 na forma semelhante à acima. Para o modelo CT26, os tumores foram implantados pela injeção de 1 x 106 de células CT26 no lado direito i.d. no dia 0 e 1 x 106 células no lado esquerdo no dia 2. 0 tratamento foi realizado como descrito acima nos dias 6, 9 e 12. Para experiências que avaliaram o NDV recombinante que expressa NDV ICOSL, 4-1BBL, OX40L, CD40L, GITRL, anti-CD28scfv, IL-2, IL-15 e IL-21 (NDV-transgene) , os tumores B16F10 são implantado por injeção de 2 x 105 células B16F10 no lado direito i.d. no dia 0 e 1 x 105 células no lado esquerdo no dia 4. Nos dias 7, 9, 11, e 13, os ratos são tratados com injeções intratumorais de 2 x 107 pfu de NDV em PBS em um volume total de 100 pl. Ao mesmo tempo, nos dias 7, 9, 11 e 13 os ratos receberam por via intraperitoneal (i.p.), injeções de anticorpo anti-CTLA-4 (100 pg), anticorpo 1- anti-PD (250 pg), ou anticorpo anti-LI-PD (250 pg).

Isolamento de linfócitos Pmel e Trpl e transferência adotiva

[260] Baços e nódulos linfáticos de ratos transgênicos foram isolados e moídos através de filtros de náilon 70 pm. As células CD4+ e CD8+ foram purificadas por seleção positiva utilizando esferas magnéticas de Miltenyi

[261] As células TRP1 ou PMEL isoladas foram injetadas em animais receptores através da veia da cauda no cronograma indicado em 2,5 x 104 células por rato e 1 x 106 células por rato, respectivamente.

Experiências de transferência de soro

[262] Grupos de ratos portadores de tumores foram tratados com uma única injeção intratumoral de NDV ou PBS. No dia 4, o sangue foi recolhido por sangramento terminal e o soro foi isolado por centrifugação. Os soros foram reunidos a partir de cada grupo e tratados com UV em Stratalinker 1800 com seis pulsos de luz de 300 mJ/cm2 UV para inativar qualquer vírus que possa ser potencialmente presente. 100 pl de soro não diluído foi injetado de modo intratumoral sem tratamento prévio em ratos portadores de tumores B16-F10 para um total de 3 injeções administradas em dias alternados. Os tumores foram removidos três dias após a última injeção e processados para o isolamento dos linfócitos que se infiltram no tumor, tal como descrito abaixo.

Imagem de bioluminescência

[263] Os ratos foram fotografados a cada 2 a 3 dias, começando no dia 6. Os ratos foram injetados retro- orbitalmente com 50 pl de 40 mg/mL D-luciferina (Caliper Life Sciences) em PBS e imediatamente fotografados utilizando o sistema de imagem IVIS (Caliper Life Sciences). As imagens fotográficas em escala de cinza e imagens coloridas de bioluminescência foram sobrepostas utilizando a The Living Sciences, versão 4.0 (Caliper Life Sciences) sobreposição de software. Uma região de interesse (ROI) foi selecionada manualmente sobre o tumor e a área da ROI foi mantida constante.

Isolamento de linfócitos que se infiltram no tumor

[264] Tumores B16-F10 foram implantados pela injeção de 2 x 105 células B16-F10 no lado direito i.d. no dia 0 e 2 x 105 células no lado esquerdo no dia 4. Nos dias 7, 9 e 11 os ratos foram tratados com injeções intratumorais de 2 x 107 pfu de NDV, e anticorpos anti-CTLA-4 ou anti-DP-1 i.p. onde especificado. Poucos animais morreram da carga tumoral (sempre em grupos de controle não tratados) ou animais que extinguiu completamente os tumores (sempre em grupos de tratamento) não foram utilizados para a análise. No dia 15, os ratos foram sacrificados e os tumores e os nódulos linfáticos que drenam tumores foram removidos utilizando fórceps e tesouras cirúrgicas e pesados. Os tumores de cada grupo foram picados com uma tesoura, antes da incubação com 1,67 Wunsch U/mL de Liberase e 0,2 mg/ml de DNase por 30 minutos a 37°C. Os tumores foram homogeneizados por pipetagem repetida e filtrou-se através de um filtro de náilon de 70 pm. As suspensões das células foram lavadas uma vez com meio RPMI completo e purificado em um gradiente de Ficoll para eliminar as células mortas. As células dos nódulos linfáticos que drenam tumor foram isoladas por trituração dos nódulos linfáticos através de um filtro de náilon de 70 pm.

A citometria de fluxo

[265] As células isoladas dos tumours ou nódulos linfáticos que drenam tumor foram processados para marcação de superfície com vários painéis de anticorpos coloração para CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, ICOS, CDllc, CD19, NK1.1, CDllb, F4/80, e Ly6C Ly6G. 0 corante de viabilidade fixável eFluor506 (eBioscience) foi usado para distinguir as células vivas. As células foram ainda permeabilizadas com FoxP3 fixação e kit de permeabilização (eBioscience) e coradas por Ki-67, FoxP3, Granzima B, CTLA-4 e IFNy. Os dados foram adquiridos utilizando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences) e analisados utilizando software FlowJo (Treestar).

Purificação DC e carregamento

[266] Os baços de ratos sem tratamento foram isolados e digeridos com 1,67 Wunsch U/mL de Liberase e 0,2 mg/ml de DNase por 30 minutos a 37°C. As suspensões das células resultantes foram filtradas através de filtro de náilon de 70pm e lavadas uma vez com RPMI completo. CDllc + DC foram purificadas por seleção positiva utilizando esferas magnéticas de Miltenyi. DC's isolados foram cultivados durante a noite com lisados tumorais B16-F10 e GM-CSF recombinantes e foram purificados em gradiente de Ficoll.

Análise da produção de citocinas

[267] As suspensões de células de tumores ou nódulos linfáticos que drenam tumor foram reunidas e enriquecidas com células T utilizando um kit de purificação de célula T de Miltenyi. As células T isoladas foram contadas e cocultivadas por 8 horas com DC's carregados com lisados de células de tumor B16-F10 na presença de 20 U/ml de IL-2 (R e D) mais Brefeldina A (BD Bioscience) . Após a re-estimulação, os linfócitos foram processados por citometria de fluxo, tal como acima.

Imunofluorescência e microscopia

[268] Os tumores foram dissecados dos ratos, lavados em PBS, fixados em paraformaldeído a 4% e processados para inclusão em parafina de acordo com os protocolos descritos anteriormente. As secções foram cortadas usando um micrótomo, montadas em lâminas, e processadas para coloração com hematoxilina e eosina (H&E) ou com um anticorpo anti-CD3 e anti-Foxp3. As lâminas foram analisadas em microscópio Zeiss Axio 2 wide-field usando objetiva de 10x e 20x.

Estatística

[269] Os dados foram analisados pelo teste T de Student (para comparações de 2 grupos) e ANOVA se necessário. Os dados de sobrevivência foram analisados pela Log-Rank (Mantel-Cox) Test. Frente e verso P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo (P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***), P<0,0001 (““)).

7.2 RESULTADOS

[270] A replicação de NDV é restrita ao sitio em que o tumor foi injetado

[271] As cinéticas de distribuição virais com a administração intratumoral e sistémica de NDV foram caracterizadas. A injeção intratumoral de NDV recombinante expressando repórter firefly luciferase (NDV-Fluc) resultou no sinal da luciferase sustentada no tumor do lado injetado, enquanto que a administração sistémica do vírus não resultou em nenhum sinal de luciferase detectável no tumor (Figura 20A) . Como vírus entrega sistémica limitada era improvável para induzir lise tumoral suficiente e resposta imune, a injeção intratumoral de NDV foi explorada como um meio para provocar uma resposta imune antitumor que possa potencialmente superar as limitações da terapia sistémica OV. Como tal, para estudos posteriores da doença metastática foi modelado utilizando o modelo de tumor B16-F10 usando ambos os lados (Figura 22A). A administração de NDV-Fluc no tumor do lado direito resultou na replicação virai dentro do tumor injetado, com o sinal de luciferase detectável por até 96 horas (Figura 20B-D). Nenhum vírus foi detectado na região contralateral (lado esquerdo) do tumor por imagem luminescente (Figura 20B-D), por meio de passagem em ovos embrionados, ou por RT-PCR. Este sistema permitiu, assim, para a caracterização das respostas imunes tanto em tumores com vírus injetados com distantes, que não foram diretamente afetados pelo NDV.

A terapia NDV aumenta a infiltração de linfócitos em tumor local e distante e atrasa o crescimento do tumor

[272] A análise dos tumores com virus injetados revelou uma resposta inflamatória, tal como evidenciado pelo aumento da infiltração com células que expressam antígeno leucocitário comum CD45 (Figuras 21A-B). Os infiltrados imunes foram caracterizados pelo aumento no compartimento imune inato, incluindo células mielóides, células NK e células NKT (figura 21C), e o compartimento adaptativo, incluindo células T CD8+ e CD4+FoxP3-(Tconv) convencionais, que conduzem a um aumento significativo de CD8 e Tconv para taxas de células T (Treg) regulatória (p = 0,0131 e p=0,0006, respectivamente) (Figuras 21D-21F). Notavelmente, a análise dos tumores contralaterais revelou um aumento semelhante nos infiltrados inflamatórios (Figura 22B, C), caracterizado pelos números crescentes de ambas as células imunes inatas (Figura 22D) e células T efetoras (figura 22E, G). Notavelmente, embora não tenha havido grandes alterações no número absoluto de Tregs (Figura 22G), houve uma diminuição substancial em suas porcentagens relativas (Figura 22E, F, H) , com melhoria significativa de CD8 e Tconv para Taxas de Treg (p = 0,002 e p = 0,0021, respectivamente) (Figura 221) . As células T efetoras isoladas de tumores distais expressou aumento da ativação, proliferação, e marcadores líticos ICOS, Ki-67 e Granzima B, respectivamente (Figura 1J, K). Tal como anteriormente, o RNA virai ou vírus foi incapaz de ser isolado a partir dos tumores distantes, sugerindo que as alterações observadas no microambiente tumoral distante não ocorreram devido à infecção viral. Para excluir ainda mais a possibilidade de disseminação virai local indetectável, foram implantados tumores em outros locais distantes, tais como pés posteriores bilaterais, que geraram resultados semelhantes (Figura 23).

[273] Coerente com o efeito inflamatório observado, a administração intratumoral de NDV resultou em atraso do crescimento, não só do injetado, mas também dos tumores contralaterais, resultando na sobrevivência prolongada do animal (Figura IL, M). Para determinar se este efeito era transiente e se a proteção antitumoral durável era possível, ratos portadores de tumores de um único lado B16-F10 foram tratados intratumoralmente com NDV, e nos sobreviventes por longo prazo foram injetados células B16- F10 no lado oposto. A maioria dos animais demonstraram o atraso no crescimento do tumor, e 30% dos animais rejeitou completamente as células redesafiadas, sugerindo que a terapia intratumoral com NDV pode de fato induzir respostas protetoras de memória antitumorais (Figura 25).

NDV induz a infiltração do tumor e a expansão de linfócitos específicos de tumores

[274] Para determinar se a resposta antitumor imune era dependente do tipo de tumor injetado com NDV ou um resultado de inflamação não específica, gerado pela infecção por NDV, a experiência foi realizada com os tumores heterólogos (carcinoma do cólon MC38 e melanoma B16-F10) implantados em lados opostos (Figura 24A) . Para acompanhar linfócitos específicos de tumores, o receptor transgênico da célula T marcou congenicamente células CD8+ (Pmel) ou células CD4+ (TRP1) marcadas por luciferase que reconhecem a diferenciação do antígeno gplOO de Melanoma (Pmel) e TRP1 (TRP1) foram adotivamente transferido (Muranski et al. , 2008, Blood, 112: 362; Overwijk et al. , 2003, J Exp Med, 198: 569). A imagem de bioluminescência foi usada para medir a distribuição e expansão cinética das células TRP1 adotivamente transferida. A transferência das células TRP1 em animais portadores de tumor tratados com PBS falharam ao resultar na acumulação de TRP1 nos tumores, realçando a natureza altamente imunossupressiva do microambiente do tumor neste modelo (Figura 24B-D) . A injeção de NDV em tumores B16-F10 resultou em aumento significativo no sinal da luciferase nos tumores injetados (Figura 24B-D), que indica a expansão das células T TRP1 (área sob a curva (AUC) p = 0,0084). Notavelmente, a expansão semelhante foi observada no tumor contralateral, embora a um atraso (p = 0,0009) (Figura 24B-D). Em contraste, a injeção de NDV em tumores MC38 não conseguiu induzir a infiltração substancial TRP1 para os tumores MC38 injetados ou tumores B16-F10 distantes (Figura 24B-D), o que sugere que a infiltração de linfócitos específicos do tumor distante é provavelmente dependente da identidade do antígeno tumor injetado. Do mesmo modo, a injeção intratumoral de NDV resultou em um aumento da infiltração das células PMEL em tumores distantes, que foi mais notório quando o tumor injetado foi células B16-F10, em vez de MC38 (Figura 24E).

[275] Interessantemente, embora a infiltração de tumores B16-F10 distantes com linfócitos adotivamente transferidos era dependente da identidade do tumor injetado, tumores distantes não demonstraram aumento da infiltração imune, mesmo quando o primeiro tumor injetado foi MC38 (Figura 24F), sugerindo que um componente de resposta inflamatória não específica também pode desempenhar um papel. De fato, o soro de animais tratados com NDV, tratados com irradiação de UV para inativar qualquer vírus potencial, infiltração de leucócitos induzida por tumor quando injetados intratumoralmente em ratos portadores de tumor B16-F10 sem tratamento (Figura 24G, H), com a maior parte do aumento observado nos compartimentos CD8 e NK (p = 0,0089 e p = 0,0443, respectivamente) (Figura 241).

NDV e CTLA-4 bloqueiam a sinergia para rejeitar tumores locais e distantes

[276] Apesar da resposta inflamatória proeminente e atraso do crescimento visto em tumores distantes, a rejeição de tumor contralateral completa com sobrevivência em longo prazo só foi observada em cerca de 10% dos animais (Figura 22M), sugestiva de mecanismos imunossupressores ativos no microambiente tumoral. A caracterização de tumores injetados com NDV e distantes revelaram a regulação positiva de CTLA-4 em células T que infiltram o tumor (Figura 26), sugerindo que a inflamação do tumor induzida por NDV tornaria os tumores sensíveis à terapia sistémica com bloqueio CTLA-4. Notavelmente, a terapia de combinação de NDV com anti-CTLA-4 (Figura 27A) resultou na rejeição de tumores bilaterais e na sobrevivência em longo prazo, na maioria dos animais, um efeito que não foi observado com o tratamento por si só (Figura 27B-D). Para determinar a durabilidade da proteção observada, células B16-F10 foram injetadas no lado direito dos animais sobreviventes no dia 90 sem qualquer tratamento adicional. Os animais tratados com NDV e a terapia de combinação anti-CTLA-4 demonstrou proteção de mais de 80% contra o novo desafio tumoral, comparado com a proteção de 40% nos animais tratados com um único agente anti-CTLA-4 (Figura 27E).

A terapia de combinação com o bloqueio de NDV e CTLA-4 é eficaz contra tumores permissivos não virais

[277] Para determinar se esta estratégia do tratamento pode ser estendida a outros tipos de tumores, a estratégia foi avaliada no modelo de adenocarcinoma da próstata TRAMP-C2 imunogênicamente fraco. De forma semelhante ao modelo B16-F10, a terapia de combinação provocou a regressão dos tumores injetados (Figura 27F), e atrasou tanto o crescimento de tumores distantes quanto levou a completar a regressão do tumor distante com prolongada sobrevivência em longo prazo (Figura 2 7F, G) . Curiosamente, enquanto que as células B16-F10 foram susceptíveis à lise mediada por NDV in vitro, as células TRAMP C2 foram fortemente resistente, com baixa citotoxicidade observada a uma multiplicidade de infecção (MOI) de até 10 (Figura 27H). Em ambas as linhagens celulares, a infecção por NDV in vitroresultou na regulação positiva da superfície MHC e moléculas coestimuladoras (Figura 27i-K). MHC de classe I foi regulada de maneira uniforme em todas as células, apesar de nem todas as células serem infectadas com NDV no MOI de 1. Estudos anteriores demonstraram que o NDV induz a expressão IFN tipo I em células B16-F10 (Zamarin et al., 2009, Mol Ther 17:697). Both type I IFN (Dezfouli et al., 2003, Immunol. Cell. Biol., 81:459, Seliger et al., 2001, Cancer Res., 61:1095) que são conhecidas por regular positivamente a MHC de classe I em células B16-F10, o que sugere que, no contexto dos tumores infectados estes mecanismos podem desempenhar um papel adicional no aumento da imunogenicidade do tumor. Estes resultados sugerem assim que a sensibilidade in vitro para a lise mediada por vírus não é necessária para a sensibilidade à terapia de NDV in vivo e realçar ainda mais a importância de uma resposta inflamatória gerada pelo vírus, em vez de oncólise direta, na eficácia antitumoral observada.

Efeito antitumoral antigênico-sistémico está restrito ao tipo de tumor injetado

[278] Para determinar se o efeito antitumoral observado no tumor distante era específico para o tipo de tumor injetado, a terapia de combinação em animais portadores de um tumor B16-F10 distante unilateral e em animais com os tipos de tumores (carcinoma do cólon heterólogos MC38 e de melanoma B16-F10) implantados nos lados opostos foi avaliado (Figura 28A) . Embora a administração do vírus por via intradérmica no lado direito sem conter tumor resultou em atraso no desenvolvimento de tumor lado esquerdo; este não conseguiu proteção e rejeição ao tumor por longo prazo em animais com tumores bilaterais B16-F10 (Figura 28B, C) . Do mesmo modo, a injeção de NDV no tumor MC38 lado direito dos animais portadores de tumores do lado esquerdo B16-F10 não conseguiu induzir a rejeição do tumor B16-F10 (Figura 28D, E) , sugerindo que a resposta imune induzida por NDV antitumoral é semelhante ao antígeno restrito ao tumor injetado.

Terapia de combinação com NDVe anti-CTLA-4 induz ainfiltração do tumor com linfócitos ativados

[2 79] Para examinar o microambiente do tumor B16-F10 nos animais tratados, tumores bilaterais foram recolhidos e processados para análise de células infiltrantes. A análise dos tumores injetados distantes e de animais tratados revelou infiltrados inflamatórios importantes e grandes áreas de necrose de tumor em animais tratados com a terapia de combinação (Figura 30A, Figura 29). Este correlacionado com o aumento do número de células CD45+ e células T no grupo de terapia de combinação (Figura 30A-C, Figura 29A-C). Como anteriormente, o aumento observado nas TILs foi principalmente devido à infiltração de CD8+ e Tconv, mas não em células Treg, induzindo o aumento efetor para as taxas de Treg (Figura 30D-F, Figura 29C-E). A caracterização fenotípica das células CD4+ e CD8+ TILs em animais que receberam o tratamento de combinação demonstrou a regulação positiva de ICOS, Granzima B, e Ki-67 em animais tratados com anti-CTLA-4 e animais não tratados (Figura 30G-I) e uma maior percentagem de células CD8+ que expressam gama IFN em resposta a re-estimulação com células dendríticas (DC's) pulsadas com lisados tumorais B16-F10 (Figura 30J) .

Atividade antitumoral da terapia de combinação NDV depende das células CD8+, células NK e interferões do tipo I e II

[280] Para determinar quais os componentes de imunidade celular forma responsáveis pelo efeito terapêutico observado, o tratamento foi repetido na presença de anticorpos para depleção de células CD4 + , CD8+, ou NK. A depleção de células adequada de cada subconjunto de células foi confirmada por citometria de fluxo do sangue periférico (Figura 31) . A depleção tanto das células CD8+ quanto NK resultaram na revogação do efeito terapêutico em ambos os tumores com injeção de vírus e distantes (Figura 32A, B) , com redução significativa na sobrevivência em longo prazo (P<0,0001 para CD8 e p = 0,0011 para a depleção de NK) (Figura 32C) . Compatível com o estes resultados, o tratamento dos animais com um anticorpo neutralizante anti- IFNy também diminuiu a eficácia terapêutica. Em contraste, a depleção de células T CD4 + não resultou em alteração apreciável no efeito antitumoral, embora estes resultados devam ser interpretados com cautela, uma vez que o depleção de anti-CD4+ também resulta na depleção simultânea das Tregs.

[281] IFN tipo I foi demostrou anteriormente desempenhar um papel importante na iniciação das células CD8+ para resposta imune antitumor ((Fuertes et al., 2011, J Exp Med, 2 08: 2 005; Diamond et al, 2011, J Exp Med, 208: 1989) . Para investigar o papel do IFN tipo I na rejeição do tumor por NDV, as experiências foram repetidas no ratinhos (IFNAR-/-) nocaute do receptor IFN tipo I demonstrou rápida progressão de ambos os tumores injetados e contralateral e foram completamente resistentes à terapia de combinação (Figura 32D-F). No geral, estes resultados destacam a importância do papel de ambas as respostas imune adaptativa e inata para a eficácia terapêutica sistémica do virus observado neste estudo.

Terapia de NDV leva a regulação positiva de PD-L1 em células tumorais e em leucócitos que infiltram tumores

[282] Para determinar se outras vias de sinalização alvo imunitários em combinação com a terapia de NDV pode ser benéfico, o efeito sobre a via DP-1 - PD-L1 seguindo à infecção NDV foi avaliada. Como mostrado na Figura 33, células tumorais infectadas com NDV tanto in vitro quanto in vivo regularam positivamente a expressão do ligante PD-L1 inibitório na superfície das células (Figura 33A), que também foi observado em tumores não infectados distantes. A regulação positiva de PD-L1 não foi restrita apenas para as células tumorais, mas também foi vista no tumor leucócitos de infiltração de ambas as linhagens imunes adaptativas e inatas (Figura 33B).

A terapia de combinação de NDV com anticorpos bloqueadores PD-L1 e de DP-1 conduz uma melhoria da imunidade antitumoral e sobrevivência em longo prazo dos animais

[283] A combinação de NDV com anticorpos que bloqueiam DP-1 e a combinação de NDV com anticorpo que bloqueiam PD-L1 foram avaliadas no modelo de melanoma bilateral descrito acima. Notavelmente, semelhante ao bloqueio de CTLA-4, a terapia de NDV em combinação com anticorpos anti-DP-1 ou anticorpo anti-PD-Ll conduziu a uma melhor sobrevivência dos animais (figuras 34 e 35). Tumores distantes de animais tratados com a combinação de NDV e anticorpo anti-DP-ls foram caracterizados. Como pode ser visto da Figura 36, a combinação de NDV intratumoral com o bloqueio PD-1 sistémico conduziu à infiltração tumoral distante marcada com células imunes, com o aumento de células CD8 que infiltram o tumor sendo mais constatado. A proliferação positiva regulou as células infiltrantes, marcadores líticos Ki67 e Granzima B, respectivamente (Figura 37).

NDV induz a regulação positiva da infiltração do tumor imune das células CD4 e CD8 em ICOs em tumores distantes e injetados por vírus e tumores distantes e nódulos linfáticos que drenam tumor (TDLN)

[284] Os resultados acima demonstraram que a combinação do NDV intratumoral com o bloqueio da via de sinalização imune sistêmica resulta na sinergia significativa entre as duas abordagens terapêuticas. Para reforçar estes resultados, o aumento da função efetora das células T dentro do microambiente do tumor através de uma via de coestimulação relevante pode conduzir uma melhor resposta antitumoral imunitária foi investigado. Estudos anteriores identificaram a regulação positiva sustentada do coestimulador indutível (ICOS) em células T como um forte indicador de resposta ao bloqueio CTLA-4 em pacientes (Carthon et al., 2010, Clin. Canc. Res., 16:2861). ICOS é um homólogo de CD28 regulada positivamente na superfície de células T ativadas que se monstrou essencial para respostas dos linfócitos B dependentes de células T e no desenvolvimento de todos os subconjuntos helper T (Simpson et al., 2010 Curr Opin Immunol. 22:326) . O papel de ICOS antitumoral do tumor na eficácia do bloqueio CTLA-4 foi recentemente confirmado nos estudos em ratos, onde os ratos com deficiência de ICOS foram severamente comprometidos no desenvolvimento de uma resposta antitumoral com o bloqueio CTLA-4 (Fu et al., 2011, Cancer Res., 71: 5445).

[285] A expressão de ICOS em modelos de tumores bilaterais tratados com NDV foi caracterizada para determinar se o receptor poderia servir como um alvo nesta abordagem terapêutica. Para caracterizar os efeitos locais e abscopal da terapia intratumoral de NDV, modelos de melanoma B16-F10 bilateral foram utilizados, com o vírus administrado a um tumor unilateral (Figura 3 8A) . Marcadores de ativação que poderiam prever uma resposta melhor e poderiam ser direcionados para melhorar ainda mais a eficácia terapêutica foram avaliados. 0 exemplo focado em ICOS, como regulação positiva ICOS sustentada tem sido mostrado previamente para ser associado com respostas terapêuticas mais duráveis e aumento da sobrevivência em pacientes tratados com terapia anti-CTLA-4 para melanomas malignos. Análise de linfócitos isolados de tumores e a regulação positiva identificada de nódulos linfáticos que drenam tumores da molécula co- estimulatória ICOS como um dos marcadores de ativação nos animais tratados (Figura 38B, C).

Geração e avaliação in vitro de vírus NDV-ICOSL

[286] Usando o sistema de genética reversa para NDV, murinho que expressa NDV ICOSL (NDV-ICOSL) foi gerado (Figura 39A). A expressão de ICOSL na superfície das células B16-F10 infectadas foi confirmada por citometria de fluxo após 24 horas da infecção (Figura 39B). Caracterização in vitrodo vírus revelou que tinha propriedades líticas (Figura 39C) e réplicas semelhantes (Figura 39D) para a cepa NDV parental.

Atraso no crescimento de NDV-ICOSL de tumores distantes e induz a infiltração de linfócitos aumentada

[287] Para avaliar NDV-ICOSL para eficácia terapêutica nos tumores injetados com vírus e distantes, os animais portadores de tumores B16-F10 bilaterais foram tratados com 4 injeções intratumorais de um determinado vírus em um tumor unilateral. Ambos NDV-ICOSL e NDV do tipo selvagem foram comparáveis na sua capacidade para causar regressões do tumor nos tumores diretamente injetados com o vírus (Figura 4 0A) . No entanto, quando comparado com o NDV do tipo selvagem, NDV-ICOSL resultou em atraso significativo no crescimento do tumor dos tumores distantes com vários animais permanescendo sem tumores por longo prazo (Figura 40B-C). Análise de tumores injetados com virus revelou um aumento da infiltração do tumor com células efetoras CD4 e CD8 nos animais tratados com NDV do tipo selvagem e NDV- ICOSL, embora as diferenças entre os dois vírus não foram estatisticamente significativas, refletindo a atividade semelhante dos dois vírus contra os tumores lado direito (Figura 40A e 40D) . Em contraste, a análise dos tumores do lado esquerdo revelou aumento mais proeminente em células CD8 e Tconv que infiltram o tumor no grupo tratado com NDV- ICOSL (Figura 40E) . Curiosamente, havia também um aumento absoluto no número de células T reguladoras, com o maior aumento observado no grupo NDV-ICOSL (Figura 40E) , embora a percentagem relativa de células T reguladoras foi significativamente menor nos animais tratados com NDV (Fig 40F) .

Terapia de combinação dos bloqueios de NDV-ICOSL e CTLA-4 resulta na rejeição dos tumores injetados e distantes

[288] No geral, os resultados acima demonstram que, apesar da resposta inflamatória significativa observada em tumores distantes com a administração intratumoral de NDV-ICOSL, a maioria dos animais sucumbiu ainda aos tumores, o que sugere que os mecanismos inibidores ativos dentro do microambiente do tumor previnam a rejeição do tumor pelas células imunes infiltrantes. Assim, a eficácia da terapia de combinação de NDV-ICOSL localizada com o bloqueio de CTLA-4 sistémico foi avaliada. Para estas experiências, as doses de desafio de tumor foram aumentadas para os níveis em que não foi observado nenhum efeito terapêutico significativo com NDV ou anti-CTLA-4 como agentes individuais. Como anteriormente, os animais foram tratados com 4 doses de NDV administradas a um tumor unilateral, concomitantemente dadas com anticorpo anti-CTLA-4 sistémico (Figura 41A) . No modelo de B16-F10, a terapia de combinação com NDV-ICOSL e anti- CTLA-4 levou à regressão da maioria dos tumores injetados e distantes com sobrevivência a longo prazo dos animais, que foi significativamente superior ao da combinação de NDV-WT com anti-CTLA-4 (Figura 41B-D). Para determinar se estas descobertas podem ser estendidas a outros modelos de tumor, a mesma experiência foi realizada no modelo de carcinoma do cólon CT26 bilateral. Apesar da baixa sensibilidade de células CT26 para a lise mediada por NDV in vitro,observou- se uma eficácia terapêutica significativa da terapia de combinação de NDV e anti-CTLA-4 contra ambos os tumores injetados com vírus e distantes, com uma eficácia superior novamente observada no grupo utilizando a combinação de NDV- ICOSL com anti-CTLA-4 (Figura 42A-D). Em ambos os modelos de tumor, os animais que extinguiram completamente os tumores foram novamente desafiados com dose letal de células tumorais no dia 90 sem qualquer outra terapia e a maioria dos animais demonstrou proteção contra o novo desafio (Figura 41E e Figura 42E) . Curiosamente, enquanto que no modelo CT26 todos os animais curados foram protegidos contra o novo desafio, no modelo de B16-F10 os animais tratados com a terapia de combinação demonstrou uma proteção superior, quando em comparação com os animais que foram curados apenas por anti-CTLA-4 (Figura 41E), indicando que a combinação conduz a abordagem a uma resposta de memória protetiva mais eficaz.

A terapia de combinação leva a uma melhor infiltração tumor com células imunes inatas e adaptativas

[289] A análise de tumores B16 distantes dos animais tratados com a combinação de NDV e a terapia anti- CTLA-4 demonstraram infiltração tumoral significativa com diferentes subtipos de células imunes (Figura 43A, B). 0 aumento da infiltração foi evidente tanto nos compartimentos imunes inatos (Figura 43C, D) quanto nos adaptativos (Figura 43E) , com o maior aumento observado no grupo tratado com a combinação de NDV-ICOSL e anti-CTLA-4. Curiosamente, enquanto que este grupo demonstrou o maior número de infiltração de linfócitos CD8+, houve também um aumento estatisticamente significativo nas células T reguladoras visto neste grupo (Figura 43E), embora a percentagem global de Tregs fosse significativamente diminuída, quando comparada com os animais tratadas ou animais não tratados com um único agente anti-CTLA-4 (Figura 43F), com o consequente aumento das efetoras para as taxas de Treg (Figura 43G) . Uma análise detalhada do TILs demonstrou que as TILs isoladas de animais tratados com a combinação NDV- ICOSL e anti-CTLA-4 expressou os níveis mais elevados de ativação, líticos, e marcadores de proliferação ICOS, Granzima B, e Ki67, respectivamente (Figura 43H- J).

Geração de NDV recombinante que expressa outras moléculas coestimuladoras.

[290] Portanto, este exemplo demonstra que a expressão de um ligante coestimulador por NDV pode resultar na ativação das respostas imunes mais fortes, o que pode conduzir a imunidade antitumoral mais eficaz, especialmente no contexto das terapias de combinação com o bloqueio imunológico da via de sinalização. Para avaliar as moléculas coestimuladoras adicionais, ligantes de segmentação da superfamília de receptores de imunoglobulina (ICOS e CD28) e da superfamília de receptores TNF (GITR, 4-1BB, 0X40, e CD40) foram estudados. Para rotular CD28, um ligante de artificial composto por uma proteína quimérica com os domínios citoplasmáticos e transmembranares da glicoproteína F de NDV e o domínio extracelular composto de um anticorpo de cadeia simples contra CD28 (aCD28-scFv) foi manipulado (Figura 44A, B). Para direcionar os ligantes de segmentação da superfamília de receptores de TNF, o domínio extracelular de cada ligante foi fundido com os domínios transmembranar e intracelular da glicoproteína HN de NDV, de modo a assegurar a expressão aumentada dos ligantes na superfície das células infectadas (Figura 44A, B) . Além disso, os vírus recombinantes que expressam as citocinas da família do receptor da cadeia gama comum (IL-2, IL-15 e IL-21) foram gerados. Os construtos resultantes encontram-se ilustrados no diagrama na Figura 44C. Os vírus recombinantes foram gerados por genética reversa e a presença dos vírus foi confirmada por ensaios de hemaglutinação (Figura 45A) . Para assegurar a fidelidade dos genes inseridos, o RNA foi isolado a partir de cada um dos vírus e o RT-PCR foi produzido com os iniciadores de recozimento externos a região do gene clonado (Figura 45B, C) . A sequência de cada gene foi ainda confirmada pelo sequenciamento de Sanger. Para confirmar a expressão dos ligantes coestimuladoras sobre as superfícies das células infectadas, as células B16- F10 cultivadas foram infectadas em MOI de 2 e analisadas 24 horas mais tarde por citometria de fluxo com anticorpos específicos para cada gene (Figura 46).

NDV-4-1BBL induz o aumento da infiltração de tumores com linfócitos nos tumores distantes

[291] A capacidade dos vírus modificados para demonstrar qualquer evidência da resposta imune intensificada foi avaliada a partir de NDV-4-1BBL como um exemplo. Os ratos portadores de melanomas B16-F10 em ambos os lados foram tratados com injeção intratumoral de tumor direito de controle de NDV ou NDV-4-1BBL, como descrito anteriormente e tumores distantes foram recolhidos no dia 15. Como se pode ver na Figura 47, a terapia com NDV-4-1BBL mostram um melhor infiltração de ambas as células imune adaptativa e inata nos tumores contralateral, consistentes com os encontrados anteriores que demonstram resultados semelhantes com NDV que expressa ICOSL (Figura 40) . No geral, estes resultados sugerem que a expressão de moléculas imunoestimulantes por NDV no contexto do microambiente do tumor pode levar a imunidade antitumoral melhorada.

[292] Os vírus gerados NDV-4-1BBL, NDV-GITRL, NDV-OX40L, NDV-CD40L, NDV-IL-2, NDV-IL-15, NDV-IL-21 são avaliados quanto à capacidade para induzir a infiltração do tumor imune utilizando ensaios semelhantes, tais como descritos nesta Seção 7. Além disso, para a avaliação terapêutica, cada um dos vírus é avaliado em modelos de tumor bilaterais com o vírus sendo administrado em um tumor de um único lado em combinação com anticorpos sistémicos destinados às vias de sinalização inibitórias DP-1, PD-L1, e/ou, CTLA-4

Conclusão

[293] Para provocar a morte das células tumorais imunogênicas e uma resposta inflamatória, NDV não patogênico foi utilizado, o qual, apesar da sua relativamente atividade lítica fraca, demonstrou ser um potente indutor da maturação IFN tipo I e DC (Wilden et al., 2009, Int J Oncol 34: 971; Kato et al. , 2005, Immunity 23: 1) . Um modelo de melanoma bilateral com implantação escalonada de tumores em um cronograma que foi anteriormente demonstrado não é afetado pela imunidade concomitante que foi utilizada (Turk et al., 2004, J Exp Med 200: 771). Este exemplo demonstra que a injeção intratumoral de NDV resulta na infiltração de tumor distantes imune na ausência da propagação do vírus distante. Notavelmente, este efeito foi associado com uma redução relativa no número de Tregs e aumento marcado das células T CD4 e CD8 efetoras para as taxas de Treg, a qual foi previamente demonstrada ser um marcador de uma resposta imunológica favorável para a imunoterapia (Quezada et al., 2006, J Clin Invest 116: 1935; Curran et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107: 4275) .

[294] Os dados deste exemplo demonstram que o NDV aumenta a infiltração do tumor com linfócitos específicos de tumores, um efeito que era dependente da identidade do tumor injetado com vírus. A infiltração do tumor aumentada e a expansão dos linfócitos adotivamente transferidos também sugerem a sinergia entre a terapia vírus oncolítica e as abordagens terapêuticas utilizando a transferência de células T adotiva. É plausível que os linfócitos específicos de tumores submetidos a ativação e a expansão no local do inicio da infecção virai, seguido por sua migração para outros sítios de tumores, é provável que dependente de receptores de endereçamento de linfócitos e quimiocinas (Franciszkiewicz et al., 2012, Cancer Res 72: 6325) . Os dados deste exemplo também demonstram que a infiltração do tumor distante imune estava na parte não específica e pode ser induzida por infecção de NDV de um tumor heterólogo ou pela transferência do soro de animais tratados para ratos portadores de tumor sem tratamento prévio. 0 aumento da permeabilidade vascular induzida por citocinas inflamatórias, tais como IL-6 pode contribuir fortemente para a ativação da vasculatura do tumor e recrutamento de linfócitos nos tumores (Fisher et al. , 2011, The Journal of clinical investigation 121: 3846).

[295] Apesar do aumento pronunciado nas TILs, o efeito terapêutico em tumores distantes foi bastante modesto com a monoterapia NDV, realçando a natureza imunossupressora do microambiente destes tumores (Spranger et al., 2013, Sei Transi Med 5). Notavelmente, a combinação do anticorpo anti-CTLA-4 sistêmico com NDV intratumoral levou à rejeição de tumores B16-F10 distantes com a sobrevivência dos animais em longo prazo. Os animais foram também protegidos contra novo desafio tumoral, sugestivo de estabelecimento da memória de longo prazo. Curiosamente, a eficácia terapêutica também foi observada com modelos tumorais TRAMP C2 e CT26, que exibem baixa sensibilidade à lise celular mediada por NDV in vitro. Estes resultados realçam a importância da resposta inflamatória/imune antitumor induzida por NDV, em vez da lise direta, enquanto o mecanismo principal conduz a eficácia antitumor neste modelo. De fato, a análise de tumores injetados com NDV e distantes tratados com a terapia de combinação demonstrou infiltração proeminente com células imunes inatas e células efetoras CD8+ e CD4 + ativadas, enquanto a depleção de células CD8+ e NK anularam a eficácia terapêutica. Além disso, a estratégia de combinação foi completamente ineficaz em ratos RIFNA-/-, que apoiam o papel da via IFN tipo I na indução da imunidade antitumor neste sistema (Fuertes et al. , 2 011, J Exp Med 208, 2 005; Diamond et al., 2011, J Exp Med 208: 1989; Swann et al., 2007, J Immunol 178: 7540).

[296] Em resumo, este exemplo demonstra terapia intratumoral localizada de melanoma B16 com NDV que induz respostas inflamatórias levando aos linfócitos infiltrados e efeito antitumoral em tumores distantes (não injetados) sem propagação do virus distante. 0 efeito inflamatório coincidiu com a infiltração do tumor distantes com células T CD4+ e CD8+ especificas para tumor que eram dependentes da identidade do tumor injetado com vírus. A terapia de combinação com NDV localizado e bloqueio CTLA-4 sistêmico levou à rejeição de tumores distantes pré- estabelecidos e proteção contra novo desafio tumoral em modelos de tumores pouco imunogênicos, independentemente da sensibilidade da linhagem celular do tumor para a lise mediada por NDV. 0 efeito terapêutico foi associado à infiltração de tumor distante marcado com as efetoras CD8+ e CD4+ e CD8+ ativadas, mas não com células T reguladoras, e foi dependente de células CD8+, células NK e de interferon de tipo I. Este exemplo demonstra que a terapia localizada com NDV oncolítico induz infiltrados imunes inflamatórios em tumores distantes, tornando-os susceptíveis à terapia sistémica com anticorpos imunomoduladores.

[297] A invenção não é para ser limitada pelo escopo das modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas descritas, serão evidentes para aqueles versados na arte a partir da descrição adada e figuras anexas. Tais modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas.

[298] Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade e para todos os fins na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido de patente ou patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

Claims

1. Uso de um vírus da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de morte celular programada 1 (PD1) para tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos.

2. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus, e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos.

3. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus, em que a citocina é interleucina-2 (IL-2), e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos.

4. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de cancer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo virus, em que a citocina é fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos.

5. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus, e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos, e em que o genoma empacotado do NDV quimérico não codifica uma proteína heteróloga adicional.

6. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus, em que a citocina é IL-2, e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos, e em que o genoma empacotado do NDV quimérico não codifica uma proteína heteróloga adicional.

7. Uso de um vírus quimérico da doença de Newcastle (NDV), CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para uso em combinação com um antagonista de PD1 para o tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o NDV quimérico compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus, em que a citocina é GM-CSF, e em que o antagonista de PD1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD1 e bloqueia a ligação a seus ligantes nativos, e em que o genoma empacotado do NDV quimérico não codifica uma proteína heteróloga adicional.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a citocina é interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina-17 (IL-17), interleucina-22 (IL-22), interferon-gama (IFN-gama), ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa).

9. Uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a citocina é interleucina-21 (IL-21).

10. Uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a citocina é interleucina-15 (IL-15).

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o NDV é de cepa LaSota e o genoma empacotado compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A, em que a proteína F mutada é expressa pelo NDV.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o NDV é de cepa La Sota e o NDV compreende um genoma empacotado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína F mutada com a mutação do aminoácido L289A, em que a proteína F mutada é expressa pelo NDV.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de o NDV é da cepa LaSota.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

15. NDV, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é MK3475.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer da mama, câncer do ovário, câncer das células renais, carcinoma de células escamosas do pescoço ou da cabeça, câncer de pâncreas ou câncer de fígado.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é mesotelioma, câncer colorretal, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de esôfago, carcinoma de células renais, câncer cervical, câncer uterino, câncer de pulmão, glioblastoma multiforme, melanoma, sarcoma, tumor cerebral, câncer de tireoide, câncer de fígado, câncer de glândula salivar, câncer de bexiga, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, carcinoma endometrial ou carcinoma hepatocelular.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é metastático.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é refratário ou recorrente.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o NDV é formulado para administração intratumoral.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD1 é formulado para administração sistêmica.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD1 é formulado para administração intravenosa.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD1 é formulado para administração subcutânea.

24.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é um ser humano.