JP2018198621A - ニューカッスル病ウイルス及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように改変されたキメラニューカッスル病ウイルス及びそのようなウイルスを含む組成物の提供。【解決手段】免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)であって、該アゴニストが該ウイルスによって発現される、前記ウイルス。又、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラＮＶＤであって、該アンタゴニストが該ウイルスによって発現される、前記ＮＶＤ。【選択図】なし

Description

本出願は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2013年3月14日に出願された
米国仮特許出願第61/782,994号に対する優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)の助成番号5T32CA009
207-35及びHHSN26620070010Cの下、政府支援を受けて一部行われた。政府は、本発明にお
ける一定の権利を有する。
(1.序論)
本明細書に記載されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように
改変されたキメラニューカッスル病ウイルス及びそのようなウイルスを含む組成物である
。また本明細書に記載されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現する
ように改変されたキメラニューカッスル病ウイルス及びそのようなウイルスを含む組成物
である。該キメラニューカッスル病ウイルス及び組成物は癌の治療において有用である。
さらに、本明細書に記載されるのは、癌を治療する方法であって、ニューカッスル病ウイ
ルスを、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのア
ンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、方法である。
(2.背景)
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は、いくつかの鳥類に感染することが示されている、
パラミクソウイルス科のアブラウイルス属のメンバーである(Alexander, DJの文献(1988)
。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイルス(Newcastle dis
ease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Kluwer Academic Publi
shers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22)。NDVは、マイナスセンスに一本鎖RNAゲ
ノムを保有し、宿主ゲノムとの組換えも、他のウイルスとの組換えも起こさない(Alexand
er, DJの文献(1988)。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイ
ルス(Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Klu
wer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22)。このゲノムRNAは、
以下でさらに詳細に記載される、3'-NP-P-M-F-HN-L-5'という順序で遺伝子を含有する。2
つのさらなるタンパク質であるV及びWは、RNA編集によって生成するオルタナティブmRNA
により、P遺伝子からNDVによって産生される。このゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー
配列を含有する。
ビリオンの構造エレメントは、細胞形質膜に由来する脂質二重層であるウイルスエンベ
ロープを含む。糖タンパク質である血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)が該エンベロープ
から突き出ることで、該ウイルスが血球凝集素(例えば、受容体結合/融合)活性とノイラ
ミニダーゼ活性の両方を含有することが可能になっている。同じくウイルス膜と相互作用
する融合糖タンパク質(F)が不活性な前駆体としてまず産生され、その後、翻訳後切断さ
れて、2つのジスルフィド結合ポリペプチドを産生する。活性型Fタンパク質は、ウイルス
エンベロープと宿主細胞形質膜との融合を容易にすることにより、宿主細胞へのNDVの侵
入に関与する。マトリックスタンパク質(M)は、ウイルス集合に関与し、ウイルス膜とヌ
クレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。
ヌクレオカプシドの主なタンパク質サブユニットは、該カプシドにらせん形の対称性を
付与するヌクレオカプシドタンパク質(NP)である。該ヌクレオカプシドと関連しているの
は、Pタンパク質とLタンパク質である。リン酸化を受けるホスホタンパク質(P)は、転写
において調節的な役割を果たすと考えられており、メチル化、リン酸化、及びポリアデニ
ル化にも関与し得る。RNA依存性RNAポリメラーゼをコードするL遺伝子は、Pタンパク質と
ともにウイルスRNA合成に必要とされる。ウイルスゲノムのコード容量のほぼ半分を占め
るLタンパク質は、ウイルスタンパク質のうちの最大のものであり、転写と複製の両方に
おいて重要な役割を果たす。Vタンパク質は、インターフェロン-αを阻害し、NDVの病原
性に寄与することが示されている(Huangらの文献(2003)。ニューカッスル病ウイルスVタ
ンパク質はウイルスの発病と関連し、αインターフェロンアンタゴニストとして機能する
(Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and fun
ctions as an Alpha Interferon Antagonist.)、Journal of Virology 77: 8676-8685)。
天然のNDVは、種々の動物腫瘍モデルにおいて有効な腫瘍溶解性因子であることが報告
されている(Sinkovics, JG及びHorvath, JCの文献(2000)。ニューカッスル病ウイルス(ND
V):その腫瘍溶解性株の概歴(Newcastle disease virus (NDV): brief history of its on
colytic strains.)、J Clin Virol 16: 1-15; Zamarinらの文献、2009; Mol Ther 17: 69
7; Elankumaranらの文献、2010; J Virol 84: 3835; Schirrmacherらの文献、2009; Meth
ods Mol Biol 542: 565; Bartらの文献、1973; Nat New Biol 245: 229)。天然のNDV株は
、進行性ヒト癌に対する多数の臨床試験で使用されている(Sinkovics, JG及びHorvath, J
Cの文献(2000)。ニューカッスル病ウイルス(NDV):その腫瘍溶解性株の概歴(Newcastle di
sease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.)、J Clin Virol 16: 1-
15; Lorenceらの文献(2007)。腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルスPV701の静脈内投与を
用いた第1相臨床実験(Phase 1 clinical experience using intravenous administration
of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus.)、Curr Cancer Drug Targets 7: 1
57-167; Hotteらの文献(2007)。腫瘍溶解性ウイルスPV701の最適化された臨床レジメン(A
n optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.)、Clin Cancer Res 13
: 977-985; Freemanらの文献(2006)。再発性多形性膠芽腫における静脈内NDV-HUJ腫瘍溶
解性ウイルスの第I/II相試験(Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic vir
us in recurrent glioblastoma multiforme.)、Mol Ther 13: 221-228; Pecoraらの文献(
2002)。進行性固形癌を有する患者における腫瘍溶解性ウイルスPV701の静脈内投与の第I
相試験(Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus,
in patients with advanced solid cancers.)、J Clin Oncol 20: 2251-2266; Csatary
らの文献(2004)。ヒト高悪性度神経膠腫におけるMTH-68/H腫瘍溶解性ウイルス治療(MTH-6
8/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas.)、J Neurooncol 67: 83
-93)。しかしながら、進行性ヒト癌に対するこれらの臨床試験における天然のNDV株の成
功は大したものではなかった(Hotteらの文献(2007)。腫瘍溶解性ウイルスPV701の最適化
された臨床レジメン(An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.)
、Clin Cancer Res 13: 977-985; Freemanらの文献(2006)。再発性多形性膠芽腫における
静脈内NDV-HUJ腫瘍溶解性ウイルスの第I/II相試験(Phase I/II trial of intravenous ND
V-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.)、Mol Ther 13: 221-2
28; Pecoraらの文献(2002)。進行性固形腫瘍を有する患者における腫瘍溶解性ウイルスPV
701の静脈内投与の第I相試験(Phase I trial of intravenous administration of PV701,
an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers.)、J Clin Oncol 20:
2251-2266)。したがって、癌、特に、進行癌の治療において有用なNDVベースの治療法が
依然として必要とされている。
(3.概要)
一態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト
及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変されたキメラ
ニューカッスル病ウイルス(NDV)である。具体的な実施態様において、本明細書に提示さ
れるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストをコードするパッケージングされたゲ
ノムを含み、該アゴニストが発現される、キメラNDVである。具体的な実施態様において
、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストをコードするパ
ッケージングされたゲノムを含み、該アンタゴニストが発現される、キメラNDVである。
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト及びNDVを高融合原性にする突然変異Fタンパク質をコードするパッケージングされ
たゲノムを含み、該アゴニスト及び該突然変異Fタンパク質が発現される、キメラNDVであ
る。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのア
ゴニスト及び突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードするパッケー
ジングされたゲノムを含み、該アゴニスト及び該突然変異Fタンパク質が発現される、キ
メラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質を発現するキメラND
Vは、切断部位に対する突然変異がない対応物Fタンパク質を発現する対応するウイルスと
比べて増大した融合活性を有する。別の具体的な実施態様において、修飾されたFタンパ
ク質はビリオンに取り込まれる。
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタ
ゴニスト及びNDVを高融合原性にする突然変異Fタンパク質をコードするパッケージングさ
れたゲノムを含み、該アンタゴニスト及び該突然変異Fタンパク質が発現される、キメラN
DVである。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナル
のアンタゴニスト及び突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードする
パッケージングされたゲノムを含み、該アンタゴニスト及び該突然変異Fタンパク質が発
現される、キメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質を発現
するキメラNDVは、切断部位に対する突然変異がない対応物Fタンパク質を発現する対応す
るウイルスと比べて増大した融合活性を有する。別の具体的な実施態様において、修飾さ
れたFタンパク質はビリオンに取り込まれる。
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト及びサイトカイン(例えば、インターロイキン(IL)-2)をコードするパッケージング
されたゲノムを含み、該アゴニスト及び該サイトカインが発現される、キメラNDVである
。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト、サイトカイン(例えば、IL-2)、及びNDVを高融合原性にする突然変異Fタンパク質
をコードするパッケージングされたゲノムを含み、該アゴニスト、該サイトカイン、及び
該突然変異Fタンパク質が発現される、キメラNDVである。別の実施態様において、本明細
書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト、サイトカイン(例えば、I
L-2)、及び突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードするパッケージ
ングされたゲノムを含み、該アゴニスト、該サイトカイン、及び該突然変異Fタンパク質
が発現される、キメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異した切断部位
を有する突然変異Fタンパク質を発現するキメラNDVは、高融合原性である。別の具体的な
実施態様において、該突然変異Fタンパク質はビリオンに取り込まれる。
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタ
ゴニスト及びサイトカイン(例えば、IL-2)をコードするパッケージングされたゲノムを含
み、該アンタゴニスト及び該サイトカインが発現される、キメラNDVである。別の実施態
様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、サ
イトカイン(例えば、IL-2)、及びNDVを高融合原性にする突然変異Fタンパク質をコードす
るパッケージングされたゲノムを含み、該アンタゴニスト、該サイトカイン、及び該突然
変異Fタンパク質が発現される、キメラNDVである。別の実施態様において、本明細書に提
示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、サイトカイン(例えば、IL-2)
、及び突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードするパッケージング
されたゲノムを含み、該アンタゴニスト、該サイトカイン、及び該突然変異Fタンパク質
が発現される、キメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異した切断部位
を有する突然変異Fタンパク質を発現するキメラNDVは、高融合原性である。別の具体的な
実施態様において、該突然変異Fタンパク質はビリオンに取り込まれる。
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、免疫細胞によ
って発現される共刺激受容体のアゴニストである。共刺激受容体の具体的な例としては、
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS又は
CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、CD226、細胞傷害性及び調節性
T細胞分子(CRTAM)、死受容体3(DR3)、リンホトキシン-β受容体(LTBR)、膜貫通活性化因
子及びCAML相互作用因子(TACI)、B細胞活性化因子受容体(BAFFR)、並びにB細胞成熟タン
パク質(BCMA)が挙げられる。具体的な実施態様において、免疫細胞によって発現される共
刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体に特異的に結合する抗体(もしくはその抗原
結合断片)又はリガンドである。一実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体で
ある。別の実施態様において、該抗体は、sc-Fvである。具体的な実施態様において、該
抗体は、免疫細胞上の2つの受容体に結合する二重特異性抗体である。一実施態様におい
て、該二重特異性抗体は、免疫細胞上の受容体に結合し、かつ癌細胞上の別の受容体に結
合する。具体的な実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。ある実施態
様において、該リガンド又は抗体は、NDV Fタンパク質もしくはその断片、又はNDV HNタ
ンパク質もしくはその断片を含むキメラタンパク質である。そのようなキメラタンパク質
を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、その開示が引用により完全に本明細
書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2012-0122185号を参照されたい。また、その開
示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Parkらの文献、PNAS 2006; 103:8203-
8及びMurawskiらの文献、J Virol 2010; 84:1110-23も参照されたい。ある実施態様にお
いて、該リガンド又は抗体は、キメラFタンパク質又はNDV F-融合タンパク質として発現
され、ここで、該キメラFタンパク質又はNDV F-融合タンパク質は、NDV F糖タンパク質の
細胞質及び膜貫通ドメイン又はその断片を含み、細胞外ドメインは、該リガンド又は抗体
を含む。いくつかの実施態様において、該リガンドは、キメラHNタンパク質又はNDV HN-
融合タンパク質として発現され、ここで、該キメラHNタンパク質又はNDV HN-融合タンパ
ク質は、NDV HN糖タンパク質の膜貫通及び細胞外ドメイン又はその断片を含み、該細胞外
ドメインは、該リガンド又は抗体を含む。具体的な実施態様において、該リガンド又は抗
体は、下の第7節の実施例2に記載されているようなキメラタンパク質として発現される。
具体的な実施態様において、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、免疫細胞に
よって発現される抑制受容体のアンタゴニストである。抑制受容体の具体的な例としては
、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4又はCD52)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1
又はCD279)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、キラー細胞免疫グロブリン様受容
体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、T細胞膜タンパク質3(TIM3)、アデノシンA2a受
容体(A2aR)、免疫グロブリンドメイン及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)
、リンパ球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)、並びにCD160が挙げられる。具体的な
実施態様において、免疫細胞によって発現される抑制受容体のアンタゴニストは、該共刺
激受容体に特異的に結合する抗体(又はその抗原結合断片)である。一実施態様において、
該抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施態様において、該抗体は、sc-Fvである
。具体的な実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。別の具体的な実施
態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体のリガンドに特異的に結合
する可溶性受容体又は抗体(もしくはその抗原結合断片)である。ある実施態様において、
該抗体は、NDV Fタンパク質もしくはその断片、又はNDV HNタンパク質もしくはその断片
を含むキメラタンパク質である。例えば、各々引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る、米国特許出願公開第2012-0122185号、Parkらの文献、PNAS 2006; 103: 8203-8、及び
Murawskiらの文献、J. Virol 2010; 84:1110-23を参照されたい。ある実施態様において
、該抗体は、キメラFタンパク質又はNDV F-融合タンパク質として発現され、ここで、該
キメラFタンパク質又はNDV-F-融合タンパク質は、NDV F糖タンパク質の細胞質及び膜貫通
ドメイン又はその断片を含み、細胞外ドメインは、該抗体を含む。いくつかの実施態様に
おいて、該抗体は、キメラHNタンパク質又はNDV HN-融合タンパク質として発現され、こ
こで、該キメラHNタンパク質又はNDV HN-融合タンパク質は、NDV HN糖タンパク質の膜貫
通及び細胞内ドメイン又はその断片を含み、細胞外ドメインは、該抗体を含む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を増殖させる方法である。本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書
に記載のキメラNDV)は、NDV感染を起こしやすい任意の細胞、対象、組織、又は器官で増
殖させることができる。一実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に
記載のキメラNDV)は、細胞株で増殖させることができる。別の実施態様において、本明細
書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)は、癌細胞で増殖させることができ
る。別の実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)
は、孵化卵で増殖させることができる。ある実施態様において、本明細書に提示されるの
は、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)に感染させた単離された
細胞、組織、又は器官である。本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラND
V)に感染させる細胞、動物、及び卵の例については、例えば、下の第5.4節を参照された
い。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例え
ば、本明細書に記載のキメラNDV)に感染させた単離された癌細胞である。ある実施態様に
おいて、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキ
メラNDV)に感染させた細胞株である。他の実施態様において、本明細書に提示されるのは
、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)に感染させた孵化卵である
。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を含む組成物である。具体的な実施態様において、本明細書に提示
されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)及び医薬として
許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の実施態様において、本明細書に提示される
のは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)に感染させた癌細胞及
び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。具体的な実施態様において、該癌
細胞は、該医薬組成物に組み込む前にγ線で処理されたものである。具体的な実施態様に
おいて、該癌細胞は、該NDV(例えば、キメラNDV)に感染させる前にγ線で処理されたもの
である。他の具体的な実施態様において、該癌細胞は、該NDV(例えば、キメラNDV)に感染
させた後にγ線で処理されたものである。別の実施態様において、本明細書に提示される
のは、溶解したNDV感染癌細胞(例えば、キメラNDV感染癌細胞)由来のタンパク質濃縮物及
び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を含む医薬組成物を製造する方法である。一実施態様において、医
薬組成物を製造する方法は:(a)本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラND
V)を、NDV感染を起こしやすい細胞株で増殖させること;及び(b)子孫ウイルスを回収する
ことを含み、ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するよ
うに、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長
させられる。別の実施態様において、医薬組成物を製造する方法は:(a)本明細書に記載の
NDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)を孵化卵で増殖させること;及び(b)子孫ウイル
スを回収することを含み、ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤
化に適するように、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な
条件下で成長させられる。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、
下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はそのようなキメラNDVを含む組成物を用いて癌を治療
する方法である。具体的な実施態様において、癌を治療する方法は、対象の癌細胞を、本
明細書に記載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物に感
染させることを含む。別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要とする対
象に、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組
成物を投与することを含む。具体的な実施態様において、有効量の本明細書に記載のキメ
ラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又は有効量の本明細書に記載のキメラNDV
を含む組成物を対象に投与して、癌を治療する。具体的な実施態様において、該キメラND
Vは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニ
スト)及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の抑制受容
体のアンタゴニスト)を含むゲノムを含む。ある実施態様において、該NDVのゲノムは、突
然変異Fタンパク質も含む。ある実施態様において、2以上のキメラNDVを対象に投与して
、癌を治療する。
別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記
載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌
細胞を投与することを含む。具体的な実施態様において、該癌細胞は、該対象に投与する
前に又は該組成物に組み込む前にγ線で処理されたものである。別の実施態様において、
癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、キメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載
のキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜断片
を投与することを含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、免疫細胞の共刺激
シグナルのアゴニスト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト)及び/又は免疫細
胞の抑制シグナルのアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニスト)を
含むゲノムを含む。ある実施態様において、該NDVのゲノムは、突然変異Fタンパク質も含
む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、下の第
5.2節に記載されているようなキメラNDV)又はそのようなNDVを含む組成物を1以上の他の
療法と組み合わせて用いて癌を治療する方法である。一実施態様において、本明細書に提
示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のNDV(例えば、下の
第5.2.1節に記載されているようなキメラNDV)及び1以上の他の療法を投与することを含む
、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法で
あって、対象に、有効量の本明細書に記載のNDV又は有効量の本明細書に記載のNDVを含む
組成物及び1以上の他の療法を投与することを含む、方法である。該NDV及び1以上の他の
療法は、該対象に同時に又は連続的に投与することができる。ある実施態様において、該
NDV及び1以上の他の療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該NDV
及び1以上の他の療法は、異なる組成物中で投与される。該NDV及び1以上の他の療法は、
同じ又は異なる投与経路で該対象に投与することができる。
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス
、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む任意のNDV型又は株を本明細書に開示さ
れる併用療法で使用することができる。具体的な実施態様において、1以上の他の療法と
組み合わせて使用されるNDVは、天然株である。別の実施態様において、1以上の他の療法
と組み合わせて使用されるNDVは、キメラNDVである。具体的な実施態様において、該キメ
ラNDVは、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15、IL-17、又はIL-21)を含むパッケー
ジングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該サイトカインは、該キメラND
Vに感染させた細胞によって発現される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、腫
瘍抗原を含むパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該腫瘍抗
原は、該キメラNDVに感染させた細胞によって発現される。具体的な実施態様において、
該キメラNDVは、アポトーシス促進分子又は抗アポトーシス分子を含むパッケージングさ
れたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該アポトーシス促進分子又は抗アポトー
シス分子は、該キメラNDVに感染させた細胞によって発現される。
別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニ
スト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト)及び/又は免疫細胞の抑制シグナル
のアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニスト)を含むパッケージン
グされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該アゴニスト及び/又はアンタゴニ
ストは、該キメラNDVに感染させた細胞によって発現される。ある実施態様において、該N
DVのゲノムは、突然変異Fタンパク質も含む。ある実施態様において、本明細書に記載のN
DVと組み合わせて使用される1以上の療法は、下の第5.6.4節に記載の1以上の他の療法で
ある。特定の実施態様において、本明細書に記載のNDVと組み合わせて使用される1以上の
療法は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのア
ンタゴニストである(例えば、下の第5.6.4.1節を参照されたい)。免疫細胞の共刺激シグ
ナルのアゴニスト及び免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストの例については、例えば
、下の第5.2.1節を参照されたい。具体的な実施態様において、免疫細胞の抑制シグナル
のアンタゴニストは、下の第6節及び第7節に記載の抗CTLA-4抗体である。別の具体的な実
施態様において、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、下の第7節に記載の抗PD-
1抗体又は抗PD-L1抗体である。別の具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナ
ルのアゴニストは、下の第6節及び第7節に記載のICOSリガンドである。
(3.1 用語)
本明細書で使用されるように、数字と一緒に使用される場合の「約(about)」又は「約(
approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指
す。
本明細書で使用されるように、「アゴニスト」という用語は、別の分子に結合し、生物
学的反応を誘導する分子を指す。具体的な実施態様において、アゴニストは、細胞上の受
容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘発する分子である。例えば、アゴニストに
は、細胞上の受容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘導する抗体又はリガンドが
含まれる。ある実施態様において、該抗体又はリガンドは、細胞上の受容体に結合し、1
以上のシグナル伝達経路を誘導する。他の実施態様において、該アゴニストは、天然リガ
ンドと天然受容体との相互作用を促進する。
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」という用語は、生物学的応答自体を
引き起こすことなく、別の分子の作用を阻害する分子を指す。具体的な実施態様において
、アンタゴニストは、細胞上の受容体に結合し、アゴニストの生物学的活性を遮断し又は
減衰させる分子である。例えば、アンタゴニストには、細胞上の受容体に結合し、1以上
のシグナル伝達経路を誘導することなく、細胞への天然リガンドの結合を遮断し又は減衰
させる抗体又はリガンドが含まれる。アンタゴニストの別の例には、天然リガンドへの結
合を細胞上の天然受容体と競合し、それにより、該天然受容体が該天然リガンドに結合す
るときに誘導される1以上のシグナル伝達経路を遮断し又は減衰させる抗体又は可溶性受
容体が含まれる。
本明細書で使用されるように、「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という用
語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリンを指す。抗体には、モノク
ローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キ
メラ抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖
抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合二重特異性抗体Fv(sdFv)、イントラボデ
ィ、及び抗イデオタイプ(抗Id)抗体(例えば、抗体に対する抗Id抗体及び抗-抗Id抗体を含
む)、並びに上記のもののいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定さ
れない。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性断
片が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA
、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又はサブクラス
のものであることができる。具体的な実施態様において、抗体は、ヒト又はヒト化抗体で
ある。別の具体的な実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はscFvである。あ
る実施態様において、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体又はscFvである。他の
具体的な実施態様において、抗体は、二重特異性抗体である。ある実施態様において、該
二重特異性抗体は、免疫細胞の共刺激受容体又は免疫の抑制受容体及び癌細胞上の受容体
に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該二重特異性抗体は、免疫細胞上の
2つの受容体、例えば、免疫細胞上の2つの共刺激受容体、免疫細胞上の2つの抑制受容体
、又は免疫細胞上の1つの共刺激受容体と免疫細胞上の1つの抑制受容体に特異的に結合す
る。
本明細書で使用されるように、タンパク質又はポリペプチドとの関連における「誘導体
」という用語は:(a)天然ポリペプチドと少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％
、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は40％〜65％、50％〜
90％、65％〜90％、70％〜90％、75％〜95％、80％〜95％、もしくは85％〜99％同一であ
るポリペプチド;(b)天然ポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又
は40％〜65％、50％〜90％、65％〜90％、70％〜90％、75％〜95％、80％〜95％、もしく
は85％〜99％同一である核酸配列によってコードされたポリペプチド;(c)天然ポリペプチ
ドと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0個、もしくはそれより多く、又は2〜5、2〜10、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、もしく
は15〜20個のアミノ酸突然変異(すなわち、付加、欠失、及び/又は置換)を含有するポリ
ペプチド;(d)高い、中程度の、又は典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション
条件下で、天然ポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核
酸配列によってコードされたポリペプチド;(e)高い、中程度の、又は典型的なストリンジ
ェンシーハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも10個の連続するアミノ酸、少なく
とも12個の連続するアミノ酸、少なくとも15個の連続するアミノ酸、少なくとも20個の連
続するアミノ酸、少なくとも30個の連続するアミノ酸、少なくとも40個の連続するアミノ
酸、少なくとも50個の連続するアミノ酸、少なくとも75個の連続するアミノ酸、少なくと
も100個の連続するアミノ酸、少なくとも125個の連続するアミノ酸、少なくとも150個の
連続するアミノ酸、又は10〜20個、20〜50個、25〜75個、25〜100個、25〜150個、50〜75
個、50〜100個、75〜100個、50〜150個、75〜150個、100〜150個、もしくは100〜200個の
連続するアミノ酸の天然ポリペプチドの断片をコードする核酸配列にハイブリダイズする
ことができる核酸配列によってコードされたポリペプチド;或いは(f)天然ポリペプチドの
断片を指す。誘導体には、天然の成熟形態の哺乳動物ポリペプチドのアミノ酸配列及び異
種の単一ペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。さらに、誘導体には、例
えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基
による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質部分への結合
などによって化学的に修飾されているポリペプチドが含まれる。さらに、誘導体には、1
以上の非古典的アミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。一実施態様において、誘導体は
、単離されている。具体的な実施態様において、誘導体は、それが由来した天然ポリペプ
チドの1以上の機能を保持する。
パーセント同一性は、当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができる。具体
的な実施態様において、パーセント同一性は、Sequence Analysis Software Package(バ
ージョン10; Genetics Computer Group社, University of Wisconsin Biotechnology Cen
ter, Madison, Wisconsin)の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを用いて決定される。
ハイブリダイゼーション条件に関する情報(例えば、高い、中程度の、及び典型的なスト
リンジェンシー条件)が記載されており、例えば、米国特許出願公開US 2005/0048549号(
例えば、段落72〜73)を参照されたい。
本明細書で使用されるように、タンパク質性物質(例えば、タンパク質)の断片との関連
における「断片」という用語は、タンパク質性物質の8個以上の連続するアミノ酸、10個
以上の連続するアミノ酸、15個以上の連続するアミノ酸、20個以上の連続するアミノ酸、
25個以上の連続するアミノ酸、50個以上の連続するアミノ酸、75個以上の連続するアミノ
酸、100個以上の連続するアミノ酸、150個以上の連続するアミノ酸、200個以上の連続す
るアミノ酸であるか、又は10〜300個の連続するアミノ酸、10〜200個の連続するアミノ酸
、10〜250個の連続するアミノ酸、10〜150個の連続するアミノ酸、10〜100個の連続する
アミノ酸、10〜50個の連続するアミノ酸、50〜100個の連続するアミノ酸、50〜150個の連
続するアミノ酸、50〜200個の連続するアミノ酸、50〜250個の連続するアミノ酸、50〜30
0個の連続するアミノ酸、25〜50個の連続するアミノ酸、25〜75個の連続するアミノ酸、2
5〜100個の連続するアミノ酸、もしくは75〜100個の連続するアミノ酸の範囲にある断片
を指す。具体的な実施態様において、タンパク質性物質の断片は、該タンパク質性物質の
1以上の機能を保持する−すなわち、それは、機能性断片である。例えば、タンパク質性
物質の断片は、別のタンパク質と相互作用し、及び/又は1以上のシグナル伝達経路を誘導
、増強、もしくは活性化する能力を保持する。
本明細書で使用されるように、タンパク質性物質との関連における「機能性断片」とい
う用語は、タンパク質性物質の1以上の活性又は機能を保持するタンパク質性物質の部分
を指す。例えば、抑制受容体の機能性断片は、1以上のそのリガンドに結合する能力を保
持し得る。共刺激受容体のリガンドの機能性断片は、受容体に結合し、及び/又はその共
刺激受容体へのリガンド結合によって媒介される1以上のシグナル伝達経路を誘導、増強
、もしくは活性化する能力を保持し得る。
本明細書で使用されるように、「異種」という用語は、天然のNDVと関連する(例えば、
天然のNDVによってコードされる及び/又は天然のNDVのゲノムによって発現される)ことが
天然では見出されない実体を指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト高齢者」という用語は、65歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト成人」という用語は、18歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト小児」という用語は、1歳から18歳までのヒトを
指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト幼児」という用語は、1歳から3歳までのヒトを指
す。
本明細書で使用されるように、「ヒト乳児」という用語は、新生児から1歳までのヒト
を指す。
ある実施態様において、本明細書で使用される「高融合原性」及び「増大した融合活性
」という用語、並びに同様の用語は、NDVが多数の細胞を含む合胞体を形成する能力の増
大を指す。具体的な実施態様において、突然変異Fタンパク質を発現するように改変され
ている本明細書に記載のNDVに感染した細胞は、該ウイルスが由来し、非突然変異Fタンパ
ク質を有する親ウイルスに感染した細胞と比べて、合胞体を形成する能力が増大している
。別の具体的な実施態様において、キメラウイルスが由来し、非突然変異Fタンパク質を
有する親ウイルスに感染した合胞体を形成する細胞の数と比べて、突然変異Fタンパク質
を発現するように改変されている本明細書に記載のNDVに感染した約10％〜約25％、約25
％〜約50％、約25％〜約75％、約50％〜約75％、約50％〜約95％、又は約75％〜約99％ o
r 約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％
、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは99％より多くの細胞が合胞体を形成する。あ
る実施態様において、合胞体は、一定期間(例えば、約8時間〜約12時間、約12時間〜約24
時間、約24時間〜約36時間、又は約36時間〜約48時間)後の合胞体当たりの核の数を計数
することにより顕微鏡で定量される。
本明細書で使用されるように、「インターフェロンアンタゴニスト」という用語は、細
胞性インターフェロン免疫応答を低下させ又は阻害する作用物質を指す。一実施態様にお
いて、インターフェロンアンタゴニストは、細胞性インターフェロン免疫応答を低下させ
又は阻害するタンパク質性物質である。具体的な実施態様において、インターフェロンア
ンタゴニストは、細胞性インターフェロン免疫応答を低下させ又は阻害するウイルスタン
パク質又はポリペプチドである。
具体的な実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、インターフェロン発
現及び/又は活性を低下させ又は阻害する作用物質である。一実施態様において、インタ
ーフェロンアンタゴニストは、I型IFNの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別
の実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、II型IFNの発現及び/又は活性
を低下させ又は阻害する。別の実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、
III型IFNの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。具体的な実施態様において、イ
ンターフェロンアンタゴニストは、IFN-α、IFN-β、又はその両方のいずれかの発現及び
/又は活性を低下させ又は阻害する。別の具体的な実施態様において、インターフェロン
アンタゴニストは、IFN-γの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別の実施態様
において、インターフェロンアンタゴニストは、IFN-α、IFN-β、及びIFN-γのうちの1
つ、2つ、又は全ての発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。
ある実施態様において、孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの
発現及び/又は活性は、本明細書に記載の又は当業者に公知の技術によって測定したとき
、そのようなインターフェロンアンタゴニストを発現していない、又はそのようなインタ
ーフェロンアンタゴニストと接触させていない対照孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-
β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性と比べて、インターフェロンアンタゴニストに
より、約1〜約100倍、約5〜約80倍、約20〜約80倍、約1〜約10倍、約1〜約5倍、約40〜約
80倍、又は1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、もしくは100倍低下させられる。他の実施態様において、孵化卵又
は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性は、本明細書に記
載の又は当業者に公知の技術によって測定したとき、そのようなインターフェロンアンタ
ゴニストを発現していない、又はそのようなインターフェロンアンタゴニストと接触させ
ていない対照孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は
活性と比べて、インターフェロンアンタゴニストにより、少なくとも20％〜25％、少なく
とも25％〜30％、少なくとも30％〜35％、少なくとも35％〜40％、少なくとも40％〜45％
、少なくとも45％〜50％、少なくとも50％〜55％、少なくとも55％〜60％、少なくとも60
％〜65％、少なくとも65％〜70％、少なくとも70％〜75％、少なくとも75％〜80％、少な
くとも80％〜85％、少なくとも85％〜90％、少なくとも90％〜95％、少なくとも95％〜99
％、又は20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、もしくは99％低下させられる。
本明細書で使用されるように、「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」という語句は
、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生せず、又は任意のタイプのIFNを
産生せず、又は低レベルの1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生し、又
は低レベルの任意のIFNを産生し(すなわち、同じ条件下のIFNコンピテントなシステムと
比較したとき、5〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70
％、70〜80％、80〜90％、もしくはそれを上回る任意のIFN発現の低下)、又は1つ、2つ、
もしくはそれより多くのタイプのIFNに応答せずもしくはあまり効率的には応答せず、又
は任意のタイプのIFNに応答せず、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNに対す
る応答が遅延し、及び/又は1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNによって誘導
されるもしくは任意のタイプのIFNによって誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損し
ている、システム、例えば、細胞、細胞株、及び動物、例えば、マウス、ニワトリ、シチ
メンチョウ、ウサギ、ラット、ウマなどを指す。
本明細書で使用されるように、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」
、「特異的に結合する」、及び「特異的に認識する」という用語は、抗体に関する類似用
語であり、当業者に理解されるような抗原(例えば、エピトープ又は免疫複合体)に特異的
に結合する分子を指す。抗原に特異的に結合する分子は、例えば、免疫アッセイ(例えば
、ELISA)、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore(登録商標))、KinExアッセイ(例えば、K
inExA 3000機器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)を使用するもの)、又は当技術分野で
公知の他のアッセイにより決定したとき、より低い親和性で他のペプチド又はポリペプチ
ドに結合することができる。具体的な実施態様において、抗原に特異的に結合する分子は
、該分子が別の抗原に結合するときのKaよりも少なくとも2log、2.5log、3log、3.5log、
4log、又はそれよりも大きい解離定数(すなわち、Ka)で該抗原に結合する。別の具体的な
実施態様において、抗原に特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。
本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、技術用語であり
、一般に、均質な又は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、各々のモノク
ローナル抗体は、通常、抗原上の単一のエピトープ(例えば、単一の立体構造エピトープ)
を認識する。
本明細書で使用されるように、「感染多重度」又は「MOI」という語句は、感染細胞当
たりのウイルスの平均数である。MOIは、添加したウイルスの数(添加したml×Pfu)を添加
した細胞の数(添加したml×細胞/ml)で割ることにより決定される。
本明細書で使用されるように、「天然リガンド」という用語は、天然受容体に結合する
任意の天然リガンドを指す。具体的な実施態様において、該リガンドは、哺乳動物リガン
ドである。別の具体的な実施態様において、該リガンドは、ヒトリガンドである。
本明細書で使用されるように、タンパク質又はポリペプチドとの関連における「天然ポ
リペプチド」という用語は、未成熟又は前駆体及び成熟形態のタンパク質を含む、任意の
天然アミノ酸配列を指す。具体的な実施態様において、天然ポリペプチドは、ヒトタンパ
ク質又はポリペプチドである。
本明細書で使用されるように、「天然受容体」という用語は、天然リガンドに結合する
任意の天然受容体を指す。具体的な実施態様において、該受容体は、哺乳動物受容体であ
る。別の具体的な実施態様において、該受容体は、ヒト受容体である。
本明細書で使用されるように、「対象」又は「患者」という用語は、互換的に使用され
る。本明細書で使用されるように、「対象」又は「患者」という用語は、動物を指す。い
くつかの実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ
、ウマ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例えば、サル、チンパン
ジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。いくつかの実施態様において、対象は、非ヒト
哺乳動物である。ある実施態様において、対象は、ペット(例えば、イヌもしくはネコ)又
は家畜(例えば、ウマ、ブタ、もしくはウシ)である。他の実施態様において、対象は、ヒ
トである。ある実施態様において、哺乳動物(例えば、ヒト)は、0〜6カ月、6〜12カ月、1
〜5歳、5〜10歳、10〜15歳、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜
45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜
85歳、85〜90歳、90〜95歳、又は95〜100歳である。具体的な実施態様において、対象は
、鳥ではない動物である。
本明細書で使用されるように、療法の投与との関連における「治療する(treat)」及び
「治療する(treating)」という用語は、対象が、癌又はその症状の発生又は進行の低下、
減少、減衰、縮小、安定化、緩和、抑制、阻害、又は停止などの有益な効果を受ける治療
/療法を指す。ある実施態様において、対象が受ける治療/療法は、以下の効果のうちの少
なくとも1つ以上をもたらす:(i)癌及び/又はそれと関連する症状の重症度の軽減又は改善
;(ii)癌と関連する症状の持続時間の短縮;(iii)癌と関連する症状の再発の予防;(iv)癌及
び/又はそれと関連する症状の退行;(v)対象の入院の減少;(vi)入院期間の短縮;(vii)対象
の生存の増加;(viii)癌及び/又はそれと関連する症状の進行の阻害;(ix)別の療法の治療
効果の増強又は改善;(x)癌細胞集団の低下又は排除;(xi)腫瘍又は新生物の成長の低下;(x
ii)腫瘍サイズの減少;(xiii)腫瘍の形成の低下;(xiv)原発性、局所性、及び/又は転移性
癌の根絶、除去、又は制御;(xv)転移の数又は大きさの減少;(xvi)死亡率の低下;(xvii)患
者の無癌生存率の増加;(xviii)無再発生存の増加;(xix)寛解期にある患者の数の増加;(xx
)入院率の減少;(xxi)腫瘍のサイズが維持され、サイズが増加しないか、又は当業者に利
用可能な従来の方法、例えば、MRI、X線、及びCATスキャンにより測定したとき、療法の
投与後、腫瘍のサイズを5％もしくは10％未満しか増加させないこと;(xxii)癌及び/又は
それと関連する症状の発症又は開始の予防;(xxiii)患者の寛解期間の延長;(xxiv)癌と関
連する症状の数の低下;(xxv)癌患者の無症状生存の増加;並びに/或いは(xxvi)転移の制限
又は軽減。いくつかの実施態様において、対象が受ける治療/療法は、癌を治癒させるの
ではなく、疾患の進行又は悪化を予防する。ある実施態様において、対象が受ける治療/
療法は、癌の開始/発症を予防するのではなく、癌の症状の開始を予防することができる
。
本明細書で使用されるように、対象への療法(単数又は複数)の投与との関連における「
併用」という用語は、複数の療法の使用を指す。「併用」という用語の使用は、療法が対
象に投与される順序を制限しない。第一の療法は、対象への第二の療法の投与の前に(例
えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間
、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週
間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間
、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週
間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
本明細書で使用されるように、「療法(therapies)」及び「療法(therapy)」という用語
は、癌の治療で使用することができる任意のプロトコル(複数可)、方法(複数可)、及び/
又は薬剤(複数可)を指すことができる。ある実施態様において、「療法(therapies)」及
び「療法(therapy)」という用語は、癌の治療において有用な生物療法、支持療法、ホル
モン療法、化学療法、免疫療法、及び/又は他の療法を指す。具体的な実施態様において
、療法には、補助療法が含まれる。例えば、ある療法を、薬物療法、生物療法、外科手術
、及び/又は支持療法とともに使用する。ある実施態様において、「療法(therapy)」とい
う用語は、本明細書に記載のキメラNDVを指す。他の実施態様において、「療法(therapy)
」という用語は、キメラNDVではない作用因子を指す。
(4.図面の簡単な説明)
図1。NDV感染は、(感染から24時間後に)インビトロで感染させたB16-F10細胞の表面でのMHC I、MHC II、及びICAM-1の発現を上方調節する。
図2A〜2E。腫瘍内NDV処置は、マクロファージ、NK細胞、CD8エフェクター細胞、及びCD4エフェクター細胞の浸潤を引き起こし、Tregの頻度を減少させる。A)全体の研究スキーム。B)全CD45+浸潤物。C)全免疫細胞浸潤物。D)関連のあるCD4 FoxP3+及びFoxP3-サブセットの代表的なフローサイトメトリードットプロット。E) Teff/Treg比及びCD8/Treg比。
図3A〜3C。NDVによる治療は、遠位腫瘍の腫瘍微小環境に対する望ましい効果を示す。A)関連のあるCD4 FoxP3+及びFoxP3-サブセットの代表的なフローサイトメトリードットプロット。B)腫瘍1グラム当たりのCD4エフェクター、Treg、及びCD8細胞の絶対数。C) Teff/Treg比及びCD8/Treg比。
図4A〜4C。遠位腫瘍に浸潤するリンパ球は、活性化、溶解、及び増殖マーカーを上方調節する。A) CD44、B)グランザイムB、及びC) Ki-67について、CD4エフェクター細胞の代表的な発現プロット(左)及びCD4エフェクター、CD8、Tregにおける対応するパーセンテージ(右)が示されている。
図5A〜5D。NDV単剤療法は遠位腫瘍の成長を遅延させ、腫瘍再投与に対する若干の防御を提供する。両側腹腫瘍を図2Aに記載の通りに樹立し、動物を処置し、生存について追跡調査した。A)右側腹(処置を受けた)腫瘍の成長。B)左側腹(処置を受けていない)腫瘍の成長。C)全体の生存。囲みの中の数字は、無腫瘍動物のパーセントを示している。D) NDVによってB16-F10メラノーマが治癒し、75日目にB16-F10メラノーマ細胞が再投与された動物の生存。1群当たり10匹のマウスを用いた2回の異なる実験の代表的な結果。
図6A〜6B。処置を受けた腫瘍と処置を受けていない腫瘍の両方に由来する腫瘍浸潤リンパ球は、NDV療法に応答してCTLA-4を上方調節する。A)右の(処置を受けた)腫瘍内のCD8、CD4エフェクター、及びTregにおけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット。B)左の(処置を受けていない)腫瘍内のCD8、CD4エフェクター、及びTregにおけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット。
図7A〜7C。NDVとCTLA-4遮断による併用療法は、注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍における抗腫瘍効果を増強する。両側性B16側腹腫瘍を樹立し、動物を、図2Aに記載の通りに、抗CTLA-4抗体9H10あり又はなしで処置した。A)処置を受けた腫瘍の成長。B)遠位腫瘍の成長。囲みの中の数字は、無腫瘍マウスのパーセントを表している。C)長期生存。1群当たり10匹のマウスを用いた2回の異なる実験の代表的な結果。
図8。NDVと抗CTLA-4による併用療法は、非ウイルス許容性前立腺TRAMP腫瘍に対して全身効果がある。右(12日)及び左(3日)の側腹TRAMP腫瘍を樹立し、動物を、図2Aに記載の通りに、全身性抗CTLA-4抗体あり又はなしで、NDVで処置した。左側腹(注射を受けていない)腫瘍の成長が示されている。囲みの中の数字は、無腫瘍動物のパーセントを示している。
図9A〜9C。NDV感染は、B16-F10腫瘍におけるPD-L1の発現を上方調節する。A) NDVに24時間感染させたB16-F10細胞上での表面PD-L1発現。B)感染B16-F10細胞由来のUV不活化上清で処理したB16-F10細胞上の表面PD-L1発現。C)図2Aと同様に処置された動物由来の注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍から単離された腫瘍細胞の表面でのPD-L1の上方調節(左の2枚のパネル−代表的なフローサイトメトリープロット、右のパネル−1群当たり5匹のマウスの計算された平均値)。
図10A〜10F。NDVと抗PD-1による併用療法は、B16メラノーマに対して全身効果があり、活性化マーカーの上方調節を伴うT細胞浸潤の増加をもたらす。A)全体の生存。動物を、図2Aに記載の通りに、抗PD-1抗体あり又はなしで処置した。B)腫瘍内のCD45、CD3、CD8、及びCD4エフェクター細胞の絶対数。C)腫瘍浸潤リンパ球における調節性T細胞の相対的パーセンテージ。D〜E)遠位腫瘍由来の腫瘍浸潤リンパ球を単離し、ICOS(D)及びグランザイムB(E)の発現について染色した。F)腫瘍浸潤リンパ球を、腫瘍溶解物をロードした樹状細胞で再刺激し、IFNγの発現について細胞内サイトカイン染色により評価した。
図11。NDVとCTLA-4による併用療法は、遠位腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節(TDLN)におけるICOS及びCD4エフェクター細胞の上方調節を誘導する。
図12A〜12D。NDV-ICOSLウイルスの作製及びインビトロ評価。A)ウイルスゲノムコンストラクトのスキーム。B) 24時間感染させたB16-F10細胞の表面でのICOSLの発現(代表的ヒストグラム(左)及び1群当たり3つの試料の平均値(右))。C) LDHアッセイにより決定された感染B16-F10細胞におけるNDVの細胞溶解活性。D) B16-F10細胞における組換えNDVの複製。
図13A〜13C。NDV-mICOSLと抗CTLA-4による併用療法は、マウスを対側腫瘍投与から防御し、長期の動物生存をもたらす。動物に、より大きい腫瘍用量を投与し、図2Aに記載の通りに、全身性抗CTLA-4抗体あり又はなしで、NDVで処置した。左側腹(注射を受けていない)腫瘍の成長が示されている。B)長期生存。囲みの中の数字は、腫瘍から防御された動物のパーセントを示している。1群当たり5〜10匹のマウスの3回の異なる実験のプールされたデータ。C)併用療法で処置されたマウスは、かつての腫瘍部位で白斑を発症するが、全身には発症しない。
図14A〜14B。NDV-mICOSLと抗CTLA-4による併用療法は、マウスを対側腫瘍投与から防御し、CT26結腸癌モデルで長期動物生存をもたらす。動物により大きい腫瘍用量を投与し、図2Aに記載の通りに、全身性抗CTLA-4抗体あり又はなしで、NDVで処置した。左側腹(注射されていない)腫瘍の成長が示されている。囲みの中の数字は、腫瘍から防御された動物のパーセントを示している。B)長期生存。1群当たり5〜10匹のマウスを用いた代表的な実験(A)及び1群当たり5〜10匹のマウスの2回の異なる実験のプールされたデータ(B)。
図15A〜15C。NDV処理は、マクロファージ、NK細胞、CD8及びCD4エフェクター細胞の遠位B16腫瘍浸潤を引き起こし、Tregの頻度を減少させる。A)全CD45+、CD3+、CD8+、CD4+ FoxP3-(Teff)、及びCD4+ FoxP3+(Treg)浸潤物。B) Teff/Treg比及びCD8/Treg比。C)全マクロファージ、NK、及びNKT細胞浸潤物。
図16A〜16B。遠位B16腫瘍に浸潤するリンパ球は、活性化、溶解、及び増殖マーカーを上方調節する。代表的なKi-67、グランザイムB(GrB)、及びICOS発現プロット(A)、並びにCD4エフェクター及びCD8細胞における対応するパーセンテージ(B)。
図17。処置を受けた動物由来の腫瘍浸潤リンパ球は、B16-F10溶解物をロードしたDCによる刺激に応答して、IFN-γを分泌する。代表的なドットプロットが示されている。
図18A〜18B。併用療法により治癒した動物は、さらなる腫瘍投与から防御される。A) B16-F10メラノーマ、120日目に1×105個の細胞を再投与。B) CT26結腸癌、90日目に1×106個の細胞を再投与。1群当たり10匹のマウスを用いた2回の異なる実験の代表的な結果。
図19A〜19B。組換えICOSL-Fキメラタンパク質は表面に効率的に発現される。A)キメラタンパク質の模式図。B)トランスフェクトされた細胞の表面でのキメラICOSL-Ftm融合タンパク質の発現。
図20A〜20D。NDV感染は注射を受けた腫瘍に限定される。A)組換えNDV-Flucを、CT26腫瘍を担持するBalb/C動物の腫瘍内(IT)又は静脈内(IV)に投与し、次の72時間にわたって画像を取得した。B) NDV-Flucを、両側性B16-F10メラノーマ腫瘍を担持するC57BL/6マウスに投与し、動物を120時間モニタリングした。代表的な発光画像が示されている。C)バックグラウンド発光に対して標準化した腫瘍部位からの発光の定量。D)パネル(C)のデータから計算された曲線下面積(AUC)。データは、1群当たり3〜5匹のマウスを用いた3回の独立した実験のうちの1つの代表的な結果を示している。***p＜0.001。
図21A〜21F。NDV感染は、ウイルス注射を受けた腫瘍における腫瘍白血球浸潤を増大させる。動物を図22Aに記載のスキームに従って処置した。腫瘍を15日目に摘出し、TILを標識し、フローサイトメトリーにより解析した。A)腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。B)腫瘍1g当たりのCD45+細胞の絶対数。C)腫瘍1g当たりの自然免疫細胞の絶対数。D) CD4+FoxP3+(Treg)細胞及びCD4+FoxP3-(T conv)細胞のパーセンテージの代表的なプロット。E)腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。F)腫瘍からの計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。データは、1群当たり3〜5匹のマウスを用いた3回の独立した実験の累積結果を表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図22A〜22M。NDVは、遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させ、腫瘍成長を遅延させる。A)処置スキーム。B)腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。C)腫瘍1g当たりのCD45+細胞の絶対数。D)腫瘍1g当たりの自然免疫細胞の絶対数。E)遠位腫瘍由来の腫瘍切片をH&Eで染色するか(上のパネル)又はCD3及びFoxP3について標識し(下のパネル)、顕微鏡法により解析した。矢印で示された領域は、壊死及び炎症性浸潤物の領域を示している。スケールバーは200μmを表している。F) CD4+FoxP3+(Treg)細胞及びCD4+FoxP3-(Tconv)細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。G)フローサイトメトリーから計算された腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。H) CD45+細胞のうちのTregの相対的パーセンテージ。I)計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。(J、K)腫瘍浸潤Tconv(J)及びCD8+細胞(K)におけるICOS、グランザイムB、及びKi-67の上方調節。L) NDV注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の成長。M)全体の動物生存。データは、1群当たりn＝3〜5匹を用いた3回(B〜K)又は2回(L〜M)の独立した実験の累積結果を表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図23A〜23E。NDV療法は、両側性足蹠メラノーマモデルで遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させる。両側性足蹠メラノーマ腫瘍を担持する動物を図22Aに記載のスケジュールに従って処置した。遠位腫瘍を15日目に摘出し、TILを標識し、フローサイトメトリーにより解析した。A)腫瘍浸潤CD45+細胞及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。B) CD4+FoxP3+細胞及びCD4+FoxP3-細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。C)腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。D、E)腫瘍浸潤CD8+リンパ球(D)及びTconvリンパ球(E)におけるICOS、グランザイムB、及びKi-67の上方調節。データは、1群当たり5匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの代表的な結果を示している。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図24A〜24I。NDVは、養子移植した腫瘍特異的リンパ球の浸潤を誘導し、腫瘍炎症を促進する。A)処置スキーム。B) NDVで処置し、Trp1-Flucリンパ球を養子移植した動物の代表的な発光画像。C)腫瘍部位からの平均発光の定量。D)パネル(C)のデータから計算された曲線下面積(AUC)。E)フローサイトメトリーから計算された遠位腫瘍由来のPmelリンパ球の絶対数。F)パネル(A)の処置スキームで処置された動物の遠位腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。G) NDV又はPBSの単回注射で腫瘍内処置された動物からの血清移植の実験スキーム。H)血清注射を受けた腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。I)フローサイトメトリーから計算された血清注射を受けた腫瘍における表示された細胞サブセットの絶対数。パネルB〜Eのデータは、1群当たりn＝4〜5匹を用いた3回の実験のうちの1つを表している。パネルG〜Iのデータは、1群当たりn＝5匹を用いた2回の独立した実験のプールされたデータを表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図25。腫瘍内NDVは腫瘍再投与からの防御をもたらす。NDVによりB16-F10メラノーマが治癒した動物に、75日目に、1×105個のB16-F10メラノーマ細胞を注射し、腫瘍成長についてモニタリングし、腫瘍が1000mm3に達したときに安楽死させた。全体の動物生存が示されている。データは、1群当たり10匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの累積結果を示している。****p＜0.0001。
図26A〜26B。腫瘍浸潤CD8+リンパ球は、NDV療法に応答してCTLA-4を上方調節する。NDVで処置した腫瘍(A)及び遠位腫瘍(B)のCD8+細胞におけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット(左)及び累積結果(右)。1群当たり3匹のマウスを用いた3回の実験のうちの1つの代表的な結果。*p＜0.05。
図27A〜27K。NDV及びCTLA-4遮断は相乗作用して、局所腫瘍及び遠位腫瘍を拒絶する。A)処置スキーム。B)ウイルス処置した(右側腹)B16-F10腫瘍の成長。C)遠位(左側腹)B16-F10腫瘍の成長。D) B16-F10モデルにおける長期生存。E) 90日目に、生き残った動物の右側腹に1×105個のB16-F10細胞を注射し、生存について追跡調査した。データは、1群当たりn＝6〜11匹を用いた3回の実験の累積結果を表している。F)ウイルス処置した(右側腹)TRAMP C2腫瘍及び遠位(左側腹)TRAMP C2腫瘍の成長。G) TRAMP C2モデルにおける長期生存。H)様々な感染多重度(MOI)でのNDV媒介性溶解に対するB16-F10細胞及びTRAMP C2細胞のインビトロ感受性。I〜K) NDVに感染させたB16-F10細胞及びTRAMP C2細胞におけるMHC I、MHC II、CD80、及びCD86の上方調節。B16-F10細胞の代表的なフローサイトメトリープロット(I)並びにB16-F10細胞(J)及びTRAMP C2細胞(K)の計算された平均蛍光強度中央値(MFI)が示されている。平均+/-SEMが示されている。データは、1群当たりn＝5〜10匹を用いた3回の独立した実験(B〜E)のうちの1つ、又は2回の独立した実験(F、G)のうちの1つの結果を表している。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図28A〜28E。全身性の抗腫瘍効果は注射された腫瘍型に限定される。A)動物の右側腹にB16-F10メラノーマ、MC38結腸癌、又はPBSを、左側腹にB16-F10細胞を皮内注射し、スキームに概説されているように処置した。B、C)右側にB16-F10が投与された動物又は右側腹に腫瘍が投与されていない動物の遠位腫瘍の成長(B)及び全体の生存(C)。データは、1群当たり5〜10匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの代表的な結果を表している。D、E)右側にB16-F10又はMC38腫瘍が投与された動物の遠位腫瘍の成長(D)及び全体の生存(E)。データは、1群当たりn＝10匹を用いた2回の独立した実験のうちの1つの結果を表している。**p＜0.01、****p＜0.0001。
図29A〜29E。NDVと抗CTLA-4による併用療法は、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の腫瘍浸潤を増強する。動物を、図27Aに記載の通りに、併用療法で処置した。腫瘍を15日目に回収し、浸潤免疫細胞についてフローサイトメトリーにより解析した。A)腫瘍1g当たりのCD45+細胞の絶対数。B)腫瘍1g当たりのCD11b+細胞及びNK 1.1+細胞の絶対数。C)腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。D) CD45+細胞のうちのTregの相対的パーセンテージ。E)計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。データは、1群当たりn＝3〜5匹のマウスを用いた4回の独立した実験の累積結果を表している。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図30A〜30J。NDVとCTLA-4遮断による併用療法は、遠位腫瘍における炎症性変化を誘導する。動物を図27Aの方式により処置した。腫瘍を15日目に回収し、浸潤免疫細胞について解析した。A)遠位腫瘍由来の腫瘍切片をH&Eで(上のパネル)又はCD3及びFoxP3について(下のパネル)染色し、ぞれぞれ、光学顕微鏡法及び蛍光顕微鏡法により解析した。矢印で示された領域は、壊死及び炎症性浸潤物を示している。スケールバーは200μmを表している。B)フローサイトメトリーから計算された腫瘍1g当たりの腫瘍浸潤CD45+細胞及びCD3+細胞の絶対数。C) CD45+集団に対してゲートをかけた腫瘍浸潤CD4+及びCD8+細胞のパーセントの代表的なフローサイトメトリープロット。D)腫瘍1g当たりのTconv、Treg、及びCD8+細胞の絶対数。E) CD45+細胞のうちの腫瘍浸潤Tregの相対的パーセンテージ。F)計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。G〜I)腫瘍浸潤CD8+リンパ球及びTconvリンパ球上でのICOS、グランザイムB、及びKi-67の上方調節。代表的なフローサイトメトリープロット(上のパネル)及び累積結果(下のパネル)が示されている。J) TILを、B16-F10腫瘍溶解物がパルスされたDCで再刺激し、IFNγ産生を細胞内サイトカイン染色により決定した。代表的なフローサイトメトリープロット(左のパネル)及び累積結果(右のパネル)が示されている。データは、1群当たりn＝3〜5匹を用いた5回(A〜I)又は2回(J)の独立した実験の累積結果を表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図31。CD8、CD4、及びNK1.1に対する抗体は、対象となる細胞をインビボで除去する。除去抗体を、下の第7.1節の材料及び方法において論じられるように注射した。血液試料を5日目に回収し、非交差反応性抗体を用いるCD4+、CD8+、及びNK細胞についてのフローサイトメトリーにより処理した。陽性染色は、水平の棒によって表されている。1群当たり5匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの代表的なプロットが示されている。
図32A〜32F。NDV併用療法の抗腫瘍活性は、CD8+細胞及びNK細胞並びにI型及びII型インターフェロンに依存する。A〜C)動物を、図27Aに記載の通りに、CD4+、CD8+、NK細胞、又はIFNγに対する除去抗体あり又はなしで処置した。A)注射を受けた腫瘍の成長。B)遠位腫瘍の成長。C)長期生存。D〜F) IFNAR-/-マウス又は年齢が一致したC57BL/6マウス(BL/6)を図3Aに記載の通りに処置し、腫瘍成長についてモニタリングした。D)注射を受けた腫瘍の成長。E)遠位腫瘍の成長。F)長期生存。全パネルのデータは、1群当たりn＝3〜10匹を用いた2回の独立した実験の累積結果を表している。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
図33A〜33B。NDV療法は、腫瘍及び腫瘍浸潤白血球上でのPD-L1の上方調節をもたらす。A)インビトロで感染させたB16-F10細胞上での(左のパネル)、並びにウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍におけるインビボでのPD-L1発現。左、代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。右、腫瘍由来のB16-F10細胞上でのPD-L1発現の平均蛍光強度中央値(MFI)。B)遠位腫瘍から単離された腫瘍浸潤白血球の表面でのPD-L1発現。左:代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。右:各々の細胞サブセットについての計算された平均MFI。
図34A〜34D。NDVとPD-1を遮断する抗体との併用療法は、両側腹B16メラノーマモデルで抗腫瘍効果の増強をもたらす。A)処置スキーム。B)右側腹(NDV注射を受けた)腫瘍成長。C)左側腹(遠位)腫瘍成長。D)全体の生存。
図35A〜35D。NDVとPD-L1を遮断する抗体との併用療法は、両側腹B16メラノーマモデルで抗腫瘍効力の増強をもたらす。A)処置スキーム。B)右側腹(NDV注射を受けた)腫瘍成長。C)左側腹(遠位)腫瘍成長。D)全体の生存。
図36A〜36E。NDV及び抗PD-1療法による併用療法は、エフェクターによる遠位腫瘍浸潤の増大をもたらすが、調節性T細胞による遠位腫瘍浸潤の増大をもたらさない。A)腫瘍内のCD4+細胞及びCD8+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。B) Tconv(CD4+FoxP3-)細胞及びTreg(CD4+FoxP3+)細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。C)フローサイトメトリーから計算された、腫瘍1g当たりのT細胞サブセットの絶対数。D) CD4+ T細胞由来のTregの相対的パーセンテージ。E)計算されたTconv/Treg比及びCD8/Treg比。
図37A〜37B。NDV及び抗PD-1併用療法で処置された動物の遠位腫瘍由来のTILは、溶解マーカー及び増殖マーカーを上方調節する。A)グランザイムB及びKi67陽性Tconv及びCD8リンパ球のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。B)グランザイムB及びKi67陽性Tconv及びCD8+ T細胞のパーセンテージ。
図38A〜38C。NDVは、腫瘍免疫浸潤並びにウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍におけるCD4細胞及びCD8細胞上でのICOSの上方調節を誘導する。A)処置スキーム。B) NDV注射を受けた(右側腹)腫瘍から単離された腫瘍浸潤CD4+FoxP3-細胞及びCD8+細胞上でのICOSの発現。代表的なフローサイトメトリープロット(上)及び蛍光強度中央値(MFI)(下)が示されている。C)遠位(左側腹)腫瘍から単離された腫瘍浸潤CD4+FoxP3-細胞及びCD8+細胞上でのICOSの発現。代表的なフローサイトメトリープロット(上)及び蛍光強度中央値(MFI)(下)が示されている。
図39A〜39D。NDV-ICOSLウイルスの作製及びインビトロ評価。A)ウイルスゲノムコンストラクトのスキーム。B) 24時間感染させたB16-F10細胞の表面でのICOSLの発現(代表的ヒストグラム(左)及び1群当たり3つの試料の平均(右))。C) LDHアッセイにより決定された感染B16-F10細胞におけるNDVの細胞溶解活性。D) B16-F10細胞における組換えNDVの複製。
図40A〜40F。NDV-ICOSLは、遠位腫瘍の成長遅延を引き起こし、腫瘍リンパ球浸潤の増強を誘導する。両側腹B16-F10腫瘍を先の通りに樹立し、動物を、右腫瘍への表示されたウイルスの4回の腫瘍内注射で処置した。A)ウイルス注射を受けた腫瘍の成長。B)遠位腫瘍の成長。C)全体の生存。D)右(ウイルス注射を受けた腫瘍)の腫瘍浸潤白血球の絶対数。E)左(遠位腫瘍)の腫瘍浸潤白血球の絶対数。F)遠位腫瘍におけるTregの相対的パーセンテージ。
図41A〜41E。NDV-ICOSL及びCTLA-4遮断の併用療法は、B16-F10モデルにおいて注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の拒絶をもたらし、腫瘍再投与から防御する。A)処置方式。B)ウイルス注射を受けた(右)腫瘍の成長。C)遠位(左)腫瘍の成長。D)全体の生存。E) 90日目の生存動物の右側腹に、2×105個のB16-F10細胞を再投与し、生存について追跡調査した。
図42A〜42E。NDV-ICOSL及びCTLA-4遮断の併用療法は、CT26モデルにおいて注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の拒絶をもたらす。A)処置方式。B)ウイルス注射を受けた(右)腫瘍の成長。C)遠位(左)腫瘍の成長。D)全体の生存。E) 90日目の生存動物の右側腹に、1×106個のCT26細胞を再投与し、生存について追跡調査した。
図43A〜43J。NDV-ICOSLと抗CTLA-4の併用療法は、自然免疫細胞及び適応免疫細胞による腫瘍浸潤の増強をもたらす。両側腹B16-F10腫瘍を担持する動物を図41Aに記載のスケジュールに従って処置した。15日目に、動物を屠殺し、遠位腫瘍をTILの解析用に処理した。A)全腫瘍細胞集団に対してゲートをかけたCD45+及びCD3+細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。腫瘍1g当たりの腫瘍浸潤CD45+細胞(B)、CD11b+細胞(C)、及びNK1.1+細胞(D)の絶対数をフローサイトメトリーから計算した。E)腫瘍1g当たりの腫瘍浸潤CD3+、CD8+、CD4+FoxP3-(CD4eff)、及びCD4+FoxP3+(Treg)の絶対数。F)全CD45+細胞のTregの相対的パーセンテージ。G)計算されたエフェクター/Treg比。H、I、J)それぞれ、ICOS、グランザイムB、及びKi67陽性の腫瘍浸潤CD8+及びCD4+エフェクター細胞の相対的パーセンテージ。
図44A〜44C。キメラ及び天然の免疫刺激タンパク質を発現する追加の作製された組換えNDVウイルスの模式図。A) NDV HNの細胞内及び膜貫通領域のHNとN末端で融合したTNF受容体スーパーファミリー(GITRL、OX40L、4-1BBL、CD40L)のキメラタンパク質の略図(上のパネル)。下のパネルは、抗CD28scfv及びICOSL細胞外ドメインが細胞内及び膜貫通領域のFとC末端で融合した免疫グロブリン受容体スーパーファミリーのキメラタンパク質の略図を示している。B)記載されているキメラタンパク質の各々の細胞内-膜貫通(HN及びF)ドメイン並びに細胞外ドメインの長さ。C)導入遺伝子の挿入部位の模式図及びこの戦略によって作製される免疫刺激リガンドを発現する全ての組換えNDVのリスト。
図45A〜45C。組換えNDVのレスキューの確認。A) NDV-HN-GITRL、NDV-aCD28scfv-F、NDV-HN-OX40L、NDV-HN-CD40L、NDV-IL15、及びNDV-IL21のウェルにおいて陽性の血球凝集活性を示す血球凝集アッセイ。B)レスキューされたウイルス中の遺伝子挿入物をRT-PCRにより確認するためのプライマー位置。C)レスキューされたウイルスから単離されたRNAに対するRT-PCR。
図46。組換えNDVに感染させたB16-F10細胞は、表面にリガンドを発現する。B16-F10細胞を、表示された組換えNDVに2のMOIで感染させ、18時間後、表面リガンド発現についてフローサイトメトリーにより解析した。代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。
図47。NDV-HN-4-1BBLは、遠位腫瘍免疫浸潤の増大を誘導する。両側腹B16メラノーマ腫瘍を担持する動物の1つの側腹の腫瘍内に、先の通りに、表示されたウイルスを入れて処置した。3回の処置の後、動物を安楽死させ、遠位腫瘍由来の腫瘍浸潤リンパ球をフローサイトメトリーにより解析した。腫瘍1g当たりの腫瘍浸潤CD3細胞、CD4+FoxP3+(Treg)細胞、CD4+FoxP3-(Tconv)細胞、CD8細胞、NK細胞、及びCD11b+細胞の総数が示されている。
(5.詳細な説明)
一態様において、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト
及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変されたキメラ
ニューカッスル病ウイルス(NDV)である。具体的な実施態様において、本明細書に提示さ
れるのは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストをコードするパッケージングされたゲ
ノムを含み、該アゴニストが発現される、キメラNDVである。具体的な実施態様において
、本明細書に提示されるのは、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストをコードするパ
ッケージングされたゲノムを含み、該アンタゴニストが発現される、キメラNDVである。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を増殖させる方法である。本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書
に記載のキメラNDV)は、NDV感染を起こしやすい任意の細胞、対象、組織、器官、又は動
物で増殖させることができる。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を含む組成物である。具体的な実施態様において、本明細書に提示
されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)及び医薬として
許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の実施態様において、本明細書に提示される
のは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)に感染させた癌細胞及
び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の実施態様において、本明細書
に提示されるのは、溶解したNDV感染癌細胞(例えば、キメラNDV感染癌細胞)由来のタンパ
ク質濃縮物及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、本明細
書に記載のキメラNDV)を含む医薬組成物を製造する方法である。一実施態様において、医
薬組成物を製造する方法は:(a)本明細書に記載のNDV(例えば、本明細書に記載のキメラND
V)を、NDV感染を起こしやすい細胞株で増殖させること;及び(b)子孫ウイルスを回収する
ことを含み、ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するよ
うに、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長
させられる。別の実施態様において、医薬組成物を製造する方法は:(a)本明細書に記載の
NDV(例えば、本明細書に記載のキメラNDV)を孵化卵中で増殖させること;及び(b)子孫ウイ
ルスを回収することを含み、ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製
剤化に適するように、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分
な条件下で成長させられる。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、
下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はそのようなキメラNDVを含む組成物を用いて癌を治療
する方法である。具体的な実施態様において、癌を治療する方法は、対象の癌細胞を、本
明細書に記載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物に感
染させることを含む。別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要とする対
象に、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組
成物を投与することを含む。具体的な実施態様において、有効量の本明細書に記載のキメ
ラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又は有効量の本明細書に記載のキメラNDV
を含む組成物は、癌を治療するために対象に投与される。具体的な実施態様において、該
キメラNDVは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体
のアゴニスト)及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の
抑制受容体のアンタゴニスト)を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ア
ゴニスト及び/又はアンタゴニストは、該NDVによって発現される。ある実施態様において
、該NDVのゲノムは、突然変異Fタンパク質も含む。ある実施態様において、2以上のキメ
ラNDVは、癌を治療するために対象に投与される。
別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記
載のキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌
細胞を投与することを含む。具体的な実施態様において、該癌細胞は、該対象に投与する
前に又は該医薬組成物に組み込む前にγ線で処理されたものである。別の実施態様におい
て、癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、キメラNDV(例えば、下の第5.2節に
記載のキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜
断片を投与することを含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、免疫細胞の共
刺激シグナルのアゴニスト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト)及び/又は免
疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニス
ト)を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該アゴニスト及び/又はアンタゴ
ニストは、該NDVによって発現される。ある実施態様において、該NDVのゲノムは、該NDV
によって発現される突然変異Fタンパク質も含む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載のNDV(例えば、下の第
5.2節に記載されているようなキメラNDV)又はそのようなNDVを含む組成物を1以上の他の
療法と組み合わせて用いて癌を治療する方法である。一実施態様において、本明細書に提
示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のNDV(例えば、下の
第5.2節に記載されているようなキメラNDV)及び1以上の他の療法を投与することを含む、
方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であ
って、対象に、有効量の本明細書に記載のNDV又は有効量の本明細書に記載のNDVを含む組
成物、及び1以上の他の療法を投与することを含む、方法である。該NDV及び1以上の他の
療法は、該対象に同時に又は連続的に投与することができる。ある実施態様において、該
NDV及び1以上の他の療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該NDV
及び1以上の他の療法は、異なる組成物中で投与される。該NDV及び1以上の他の療法は、
同じ又は異なる投与経路で該対象に投与することができる。
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス
、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む任意のNDV型又は株を本明細書に開示さ
れる併用療法で使用することができる。具体的な実施態様において、1以上の他の療法と
組み合わせて使用されるNDVは、天然株である。別の実施態様において、1以上の他の療法
と組み合わせて使用されるNDVは、キメラNDVである。具体的な実施態様において、該キメ
ラNDVは、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15、IL-17、又はIL-21)を含む、パッケ
ージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、腫瘍抗原を
含むパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該腫瘍抗原は、該
キメラNDVに感染させた細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、該キ
メラNDVは、アポトーシス促進分子(例えば、Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、P
uma、AIF、FasL、及びTRAIL)又は抗アポトーシス分子(例えば、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、
及びXIAP)を含む、パッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該
アポトーシス促進分子又は抗アポトーシス分子は、該キメラNDVに感染させた細胞によっ
て発現される。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、免疫細胞の共刺激シグ
ナルのアゴニスト(例えば、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト)及び/又は免疫細胞の
抑制シグナルのアンタゴニスト(例えば、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニスト)を含む
パッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該アゴニスト及び/又
はアンタゴニストは、該キメラNDVに感染させた細胞によって発現される。ある実施態様
において、該NDVのゲノムは、突然変異Fタンパク質、腫瘍抗原、異種インターフェロンア
ンタゴニスト、アポトーシス促進分子、及び/又は抗アポトーシス分子も含む。ある実施
態様において、本明細書に記載のNDVと組み合わせて使用される1以上の療法は、下の第5.
6.4節に記載の1以上の他の療法である。特定の実施態様において、本明細書に記載のNDV
と組み合わせて使用される1以上の療法は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/
又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストである。例えば、免疫細胞の共刺激シグナ
ルのアゴニスト及び免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストの例については、下の第5.
2.1節を参照されたい。具体的な実施態様において、該免疫細胞の抑制シグナルのアンタ
ゴニストは、下の第6節に記載の抗CTLA-4抗体である。別の具体的な実施態様において、
該免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、下の第6節に記載のICOSリガンドである。
(5.1 ニューカッスル病ウイルス)
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス
、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む任意のNDV型又は株を本明細書に開示さ
れる併用療法で使用することができる。具体的な実施態様において、本明細書に開示され
る併用療法で使用されるNDVは、天然株である。ある実施態様において、該NDVは、溶解性
株である。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、
非溶解性株である。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用される
NDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様において、該NDVは、亜病原性株である
。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、短潜伏期
性株である。NDV株の具体的な例としては、73-T株、NDV HUJ株、Ulster株、MTH-68株、It
alien株、Hickman株、PV701株、Hitchner B1株(例えば、Genbank No. AF309418又はNC_00
2617参照)、La Sota株(例えば、Genbank No. AY845400参照)、YG97株、MET95株、Roakin
株、及びF48E9株が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、
本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、Hitchner B1株である。別の具体的な
実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、Genbank No. AF3
09418又はNC_002617によって特定されるB1株である。別の具体的な実施態様において、本
明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、ATCC No. VR2239によって特定されるND
Vである。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるN
DVは、La Sota株である。
具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業
者に公知の技術によって評価したとき、鳥で病原性がない。ある具体的な実施態様におい
て、併用療法で使用されるNDVは、1日齢のニワトリへの該ウイルスの頭蓋内注射、並びに
8日間スコアリングしたときの疾患発症及び死によって評価したとき、病原性ではない。
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、0.7未
満、0.6未満、0.5未満、0.4未満、0.3未満、0.2未満、又は0.1未満の頭蓋内病原性指数を
有する。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、0と
いう頭蓋内病原性指数を有する。
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業者に
公知の技術によって評価したとき、鳥で病原性があるとは考えられないように遺伝子改変
された亜病原性株である。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用
されるNDVは、当業者に公知の技術によって評価したとき、鳥で病原性があるとは考えら
れないように遺伝子改変された短潜伏期性株である。
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異F
タンパク質を発現する。具体的な実施態様において、併用療法で使用されるNDVは、高融
合原性で、かつ合胞体を形成することができる突然変異Fタンパク質を発現する。別の具
体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質はビリオンに取り込まれる。
一実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVのゲノムは、突
然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。具体的
な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異Fタン
パク質を発現するように改変され、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、多塩基性アミ
ノ酸配列を生成させるように突然変異させられ、それにより、該タンパク質は、細胞内プ
ロテアーゼによって切断されることが可能になり、それにより、該ウイルスは、細胞に侵
入し、合胞体を形成するのにより効果的になる。別の具体的な実施態様において、本明細
書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異Fタンパク質を発現するように改変
され、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む
切断部位と置き換えられ、それにより、該突然変異切断部位は、広範に発現されるフュー
リンファミリーのプロテアーゼによって活性化されることが可能になる。そのような突然
変異Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げら
れるが、これらに限定されない。突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質を
産生するためにNDV Fタンパク質に導入される突然変異の説明については、例えば、引用
により完全に本明細書中に組み込まれる、Parkらの文献(2006)、二重特異性を有する改変
されたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered vir
al vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disea
se.)、PNAS USA 103: 8203-2808を参照されたい。いくつかの実施態様において、本明細
書に開示される併用療法で使用されるNDVは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異F
タンパク質を発現するように改変される。具体的な実施態様において、該L289A突然変異F
タンパク質は、1つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。ある実施
態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来する
ものである。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパ
ク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、
骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、該NDVが、
少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製することができるが、低い力価しか生じさ
せず、結果として、非病原性の無症候性レベルの感染をもたらすように、弱毒化される(
例えば、Khattarらの文献、2009, J. Virol. 83:7779-7782を参照されたい)。具体的な実
施態様において、該NDVは、Vタンパク質の欠失によって弱毒化される。そのような弱毒化
NDVは、該ウイルスが、免疫原、例えば、生ワクチンとして作用するために対象に投与さ
れる実施態様に特に適する場合がある。該ウイルスは、当技術分野で公知の任意の方法に
よって弱毒化することができる。
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、NDV Vタン
パク質コード配列を含まない。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で
使用されるNDVは、突然変異Vタンパク質を発現する。突然変異Vタンパク質の例について
は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、Elankumaranらの文献、2010, J. Vi
rol. 84(8): 3835-3844を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に開示される
併用療法で使用される亜病原性又は短潜伏期性NDV株は、Elankumaranらの文献、2010, J.
Virol. 84(8): 3835-3844に開示されているような突然変異Vタンパク質を発現する。
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、引用によ
り完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第7,442,379号、米国特許第6,451,323号、
又は米国特許第6,146,642号に開示されているNDVである。具体的な実施態様において、本
明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、異種ペプチド又はタンパク質をコード
し、発現するように遺伝子改変される。ある実施態様において、本明細書に開示される併
用療法で使用されるNDVは、当業者に公知のキメラNDV、又は本明細書に開示されるキメラ
NDV(例えば、下の第5.2節参照)である。いくつかの実施態様において、本明細書に開示さ
れる併用療法で使用されるNDVは、腫瘍抗原(腫瘍抗原の例については、下記参照)を発現
するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。ある実施態様において、本明細書
に開示される併用療法で使用されるNDVは、異種インターフェロンアンタゴニスト(異種イ
ンターフェロンアンタゴニストの例については、下記参照)を発現するように改変された
ゲノムを含むキメラNDVである。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併
用療法で使用されるNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許出願公
開第2012/0058141号に開示されているキメラNDVである。ある実施態様において、本明細
書に開示される併用療法で使用されるNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る米国特許出願公開第2012/0122185号に開示されているキメラNDVである。いくつかの実
施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、例えば、IL-2、IL-
7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、GM-CSF、及びTNF-αなどのサイトカイ
ンを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、IL-2、IL-15、又はIL-21を発
現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具体的な実施態様において、本
明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、下の第7節、実施例2に記載のサイトカ
インを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。
(5.2 キメラニューカッスル病ウイルス)
一態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、T-リンパ球又はナチュラルキラ
ー(NK)細胞などの免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアン
タゴニストを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。いくつかの実施
態様において、該アゴニスト及び/又はアンタゴニストは、ビリオンに取り込まれる。具
体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞
の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように改変される。別の具体的な実施態様にお
いて、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の抑制シグナルのア
ンタゴニストを発現するように改変される。言い換えると、該NDVは、例えば、T-リンパ
球又はナチュラルキラー(NK)細胞などの免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又
は抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変される「骨格」としての役割を果
たす。共刺激シグナルのアゴニストの具体例及び抑制シグナルのアンタゴニストの具体例
は、以下に提供されている。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並び
に突然変異Fタンパク質を発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。一実
施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激
シグナルのアゴニスト、及び突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。別の実
施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の抑制シ
グナルのアンタゴニスト、及び突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。具体
的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は高融合原性であり、かつ合胞体を形成
することができる。別の具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質はビリオン
に取り込まれる。ある実施態様において、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞
の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニストを発現するよう
に改変されたNDVのゲノムは、NDV Vタンパク質コード配列を含む。
一実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の
共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並びに突然変異
した切断部位を有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。具体的な実施
態様において、該NDVは、突然変異Fタンパク質を発現するように改変され、ここで、該F
タンパク質の切断部位は、多塩基性アミノ酸配列を生成させるように突然変異させられ、
それにより、該タンパク質は、細胞内プロテアーゼによって切断されることが可能になり
、それにより、該ウイルスは、細胞に侵入し、合胞体を形成するのにより効果的になる。
別の具体的な実施態様において、該NDVは、突然変異Fタンパク質を発現するように改変さ
れ、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む切
断部位と置き換えられ、それにより、該突然変異切断部位は、広範に発現されるフューリ
ンファミリーのプロテアーゼによって活性化されることが可能になる。そのような突然変
異Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられ
るが、これらに限定されない。突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質を産
生するためにNDV Fタンパク質に導入される突然変異の説明については、例えば、引用に
より完全に本明細書中に組み込まれる、Parkらの文献(2006)、二重特異性を有する改変さ
れたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered viral
vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease
.)、PNAS USA 103: 8203-2808を参照されたい。いくつかの実施態様において、該キメラN
DVは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される
。ある実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDV
に由来するものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパク質は、1
つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様におい
て、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な
実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるもので
ある。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取り込まれる
。
いくつかの実施態様において、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激
シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変さ
れたNDVのゲノムは、Elankumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844に開示さ
れているような、突然変異したNDV Vタンパク質コード配列を含む。他の実施態様におい
て、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又
は抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変されたNDVのゲノムは、NDV Vタン
パク質コード配列を含まない。ある実施態様において、該キメラNDVのもとの骨格は、Ela
nkumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844に開示されているような、突然変
異Vタンパク質を発現するように改変されている亜病原性又は短潜伏期性NDV株である。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並び
にサイトカインを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具体的な実
施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激
シグナルのアゴニスト、及びサイトカインを発現するように改変される。具体的な実施態
様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の抑制シグナ
ルのアンタゴニスト、及びサイトカインを発現するように改変される。サイトカインの具
体的な例としては、インターロイキン(IL)-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22
、インターフェロン(IFN)γ、GM-CSF、及び腫瘍壊死因子(TNF)-αが挙げられるが、これ
らに限定されない。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、突然
変異Fタンパク質、並びにサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-2
1、IL-22、IFN-γ、GM-CSF、及びTNF-α)を発現するように改変されたゲノムを含むキメ
ラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、高融合原性である
。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、突然変異切断部位(例えば、本
明細書に記載されているもの)を有する。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタン
パク質は、アミノ酸突然変異L289Aを含む。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは
、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。あ
る実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由
来するものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパク質は、1つ、2
つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、
該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施
態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである
。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取り込まれる。
ある態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、IL-7、IL-15、IL-21などのサ
イトカイン、又は本明細書に記載のもしくは当業者に公知の別のサイトカインを発現する
ように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。サイトカインを発現するように改変さ
れたキメラNDV及びそのようなキメラNDVを産生する方法の例については、例えば、第7節
を参照されたい。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、(i)免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並びに(ii)腫瘍抗原を発現するように
改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具体的な実施態様において、NDVのゲノムは、
例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト、及び腫瘍
抗原を発現するように改変される。具体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば
、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、及び腫瘍抗原
を発現するように改変される。
腫瘍抗原には、腫瘍関連抗原及び腫瘍特異的抗原が含まれる。腫瘍抗原の具体的な例と
しては、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼ-V、p-15、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、チロシナーゼ、サイクリン依
存性キナーゼ4、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、
ヒトパピローマウイルスE7、CD20、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体、MUC-1、カ
スパーゼ-8、CD5、ムチン-1、ルイスx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-α、テネイシン
、メタロプロテイナーゼと関連する抗原、及びCAMPATH-1が挙げられるが、これらに限定
されない。他の例としては、KS 1/4汎癌抗原、卵巣癌抗原(CA125)、前立腺酸性ホスフェ
ート、前立腺特異的抗原、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラ
ノーマ抗原(HMW-MAA)、前立腺特異的膜抗原、CEA、多形性上皮ムチン抗原、乳脂肪球抗原
、結腸直腸腫瘍関連抗原(例えば: CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、及びLEA)
、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19、Bリンパ腫抗原−CD20、CD33、メラノーマ特異
的抗原(例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリ
オシドGM3)、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)(例えば、DNA腫瘍ウイルスのT抗原及
びRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導性腫瘍抗原)、癌胎児抗原-α-
フェトタンパク質、例えば、結腸のCEA、膀胱腫瘍癌胎児抗原、分化抗原(例えば、ヒト肺
癌抗原L6及びL20)、線維肉腫の抗原、白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖タンパク質、スフィ
ンゴ脂質、乳癌抗原(例えば、EGFR(上皮成長因子受容体)、HER2抗原(p185HER2)及びHER2
neuエピトープ)、多形性上皮ムチン(PEM)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1、分化抗原(例え
ば、胎児赤血球、初期内胚葉に見られるI抗原、成体赤血球、着床前胚に見られるI抗原、
胃腺癌に見られるI(Ma)、M18、乳房上皮に見られるM39、骨髄細胞に見られるSSEA-1、VEP
8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌に見られるD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌に
見られるC14、肺腺癌に見られるF3、胃癌に見られるAH6、Yハプテン、胎生期癌細胞に見
られるLey、TL5(血液型A)、A431細胞に見られるEGF受容体、膵癌に見られるE1系列(血液
型B)、胎生期癌細胞に見られるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌に見られるCO-514(血液型Lea)
、腺癌に見られるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体に見られるG49、結腸
腺癌に見られるMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌に見られる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に
見られるT5A7、メラノーマに見られるR24、胎生期癌細胞に見られる4.2、GD3、D1.1、OFA
-1、GM2、OFA-2、GD2、及びM1:22:25:8、並びに4〜8細胞期胚に見られるSSEA-3及びSSEA-
4)、皮膚T細胞リンパ腫のT細胞受容体由来ペプチド、C反応性タンパク質(CRP)、癌抗原-5
0(CA-50)、乳癌と関連する癌抗原15-3(CA15-3)、消化器癌と関連する癌抗原-19(CA-19)及
び癌抗原-242、癌関連抗原(CAA)、クロモグラニンA、上皮ムチン抗原(MC5)、ヒト上皮特
異的抗原(E1A)、ルイス(a)抗原、メラノーマ抗原、メラノーマ関連抗原100、25、及び150
、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連タンパク質(MRPm6)、多剤耐性関連タンパク質(MRP4
1)、Neu癌遺伝子タンパク質(C-erbB-2)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、P-糖タンパク質(m
dr1遺伝子産物)、多剤耐性関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異的抗原(PSA)
、CD56、並びにNCAMが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、突然
変異Fタンパク質、並びに腫瘍抗原を発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVで
ある。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、高融合原性である。具体
的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、突然変異切断部位(例えば、本明細書
に記載のもの)を有する。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、アミ
ノ酸突然変異L289Aを含む。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、アミノ酸突然
変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。ある実施態様にお
いて、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来するものであ
る。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパク質は、1つ、2つ、又は3つの
アルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタ
ンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において
、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。具体的な実
施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取り込まれる。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、(i)免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並びに(ii)異種インターフェロンアン
タゴニストを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具体的な実施態
様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の共刺激シグ
ナルのアゴニスト、及び異種インターフェロンアンタゴニストを発現するように改変され
る。具体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免
疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、及び異種インターフェロンアンタゴニストを発
現するように改変される。異種インターフェロンアンタゴニストを発現するように改変さ
れたキメラNDVの例については、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許
出願公開第2012-0058141号を参照されたい。
インターフェロンアンタゴニストは、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込ま
れる:米国特許第6,635,416号;第7,060,430号;及び第7,442,527号に記載されている技術を
含む、当業者に公知の任意の技術を用いて同定することができる。具体的な実施態様にお
いて、該異種インターフェロンアンタゴニストは、ウイルスタンパク質である。そのよう
なウイルスタンパク質を任意のウイルスから入手し又は任意のウイルスから得ることがで
き、該ウイルスは、任意の種に感染することができる(例えば、該ウイルスは、ヒト又は
非ヒト哺乳動物に感染することができる)。例示的な異種インターフェロンアンタゴニス
トとしては、限定するものではないが、ニパウイルスWタンパク質、ニパVタンパク質、エ
ボラウイルスVP35タンパク質、ワクシニアウイルスE3Lタンパク質、インフルエンザウイ
ルスNS1タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス(RSV) NS2タンパク質、1型単純ヘルペスウイ
ルス(HSV) ICP34.5タンパク質、C型肝炎ウイルスNS3-4プロテアーゼ、自然免疫の誘導又
は自然免疫に対する応答を遮断するドミナントネガティブ型細胞タンパク質(例えば、STA
T1、MyD88、IKK、及びTBK)、並びに自然免疫応答の細胞性調節因子(例えば、SOCSタンパ
ク質、PIASタンパク質、CYLDタンパク質、IkBタンパク質、Atg5タンパク質、Pin1タンパ
ク質、IRAK-Mタンパク質、及びUBP43)が挙げられる。異種インターフェロンアンタゴニス
トに関するさらなる情報については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る米国特許出願公開第2012-0058141号を参照されたい。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、突然
変異Fタンパク質、並びに異種インターフェロンアンタゴニストを発現するように改変さ
れたゲノムを含むキメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質
は、高融合原性である。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、突然変
異切断部位(例えば、本明細書に記載のもの)を有する。いくつかの実施態様において、該
突然変異Fタンパク質は、アミノ酸突然変異L289Aを含む。いくつかの実施態様において、
該キメラNDVは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように
改変される。ある実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又
は株のNDVに由来するものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパ
ク質は、1つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施
態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである
。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換
わるものである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取
り込まれる。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並び
にアポトーシス促進分子を発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具
体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞
の共刺激シグナルのアゴニスト、及びアポトーシス促進分子を発現するように改変される
。具体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫
細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、及びアポトーシス促進分子を発現するように改変
される。アポトーシス促進分子の具体的な例としては、Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bi
m、Noxa、Puma、AIF、FasL、及びTRAILが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、突然
変異Fタンパク質、並びにアポトーシス促進分子を発現するように改変されたゲノムを含
むキメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、高融合原性
である。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、突然変異切断部位(例え
ば、本明細書に記載のもの)を有する。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタンパ
ク質は、アミノ酸突然変異L289Aを含む。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、
アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。ある
実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来
するものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパク質は、1つ、2つ
、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、該
突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態
様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。
具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取り込まれる。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、並び
に抗アポトーシス分子を発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。具体
的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞の
共刺激シグナルのアゴニスト、及び抗アポトーシス分子を発現するように改変される。具
体的な実施態様において、NDVのゲノムは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの免疫細胞
の抑制シグナルのアンタゴニスト、及び抗アポトーシス分子を発現するように改変される
。抗アポトーシス分子の具体的な例としては、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、及びXIAPが挙げら
れるが、これらに限定されない。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの
免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニスト、突然
変異Fタンパク質、並びに抗アポトーシス分子を発現するように改変されたゲノムを含む
キメラNDVである。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、高融合原性で
ある。具体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、突然変異切断部位(例えば
、本明細書に記載のもの)を有する。いくつかの実施態様において、該突然変異Fタンパク
質は、アミノ酸突然変異L289Aを含む。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、ア
ミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異Fタンパク質を発現するように改変される。ある実
施態様において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来す
るものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異Fタンパク質は、1つ、2つ、
又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、該突
然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様
において、該突然変異Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。具
体的な実施態様において、該突然変異Fタンパク質は、ビリオンに取り込まれる。
ある態様において、本明細書に提供されるのは、アポトーシス促進分子を発現するよう
に改変されたゲノムを含むキメラNDVである。ある態様において、本明細書に提供される
のは、抗アポトーシス分子を発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。
アポトーシス促進分子及び抗アポトーシス分子の例は、本明細書に提供されている。
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス
、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のNDV型又は株を、例えば、Tリ
ンパ球又はNK細胞などの、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の
抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変され、ある実施態様においては、サ
イトカイン、腫瘍抗原、異種インターフェロンアンタゴニスト、アポトーシス促進分子、
抗アポトーシス分子、及び/又は突然変異Fタンパク質を発現するように改変されている骨
格として使用することができる。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用
療法で使用されるNDVは、天然株である。ある実施態様において、遺伝子改変の骨格とし
ての役割を果たすNDVは、溶解性株である。他の実施態様において、遺伝子改変の骨格と
しての役割を果たすNDVは、非溶解性株である。ある実施態様において、遺伝子改変の骨
格としての役割を果たすNDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様において、遺
伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、亜病原性株である。他の実施態様において
、遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、短潜伏期性株である。NDV種の具体的な
例としては、73-T株、NDV HUJ株、Ulster株、MTH-68株、Italien株、Hickman株、PV701株
、Hitchner B1株、La Sota株(例えば、Genbank No. AY845400参照)、YG97株、MET95株、R
oakin株、及びF48E9株が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様におい
て、遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、Hitchner B1株である。別の具体的な
実施態様において、遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、Genbank No. AF30941
8又はNC_002617によって特定されるB1株である。別の具体的な実施態様において、遺伝子
改変の骨格としての役割を果たすNDVは、ATCC No. VR2239によって特定されるNDVである
。別の具体的な実施態様において、遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、La So
ta株である。
ある実施態様において、キメラNDVが、少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製
することができるが、低い力価しか生じさせず、結果として、非病原性の無症候性レベル
の感染をもたらすような、キメラNDVの弱毒化、又はさらなる弱毒化が望ましい(例えば、
Khattarらの文献、2009, J. Virol. 83:7779-7782を参照されたい)。具体的な実施態様に
おいて、該NDVは、Vタンパク質の欠失によって弱毒化される。そのような弱毒化NDVは、
該ウイルスが、免疫原、例えば、生ワクチンとして作用するために対象に投与される実施
態様に特に適する場合がある。該ウイルスは、当技術分野で公知の任意の方法によって弱
毒化することができる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラNDVは、以下のもの:(1)免疫細胞の共
刺激シグナルのアゴニスト;(2)免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト;(3)サイトカイ
ン;(4)腫瘍抗原;(5)異種インターフェロンアンタゴニスト;(6)アポトーシス促進分子;(7)
抗アポトーシス分子;及び/又は(8)突然変異Fタンパク質うちの1つ、2つ、3つ、もしくは
それより多く、又は全て、並びに自殺遺伝子を発現する。具体的な実施態様において、例
えば、Tリンパ球又はNK細胞などの、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免
疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、ある実施態様においては、突然変異Fタンパク
質及びサイトカインを発現することに加えて、キメラNDVは、自殺遺伝子(例えば、チミジ
ンキナーゼ)又はNDVの複製もしくは機能を阻害する別の分子(NDVを抗生物質もしくは抗ウ
イルス剤に対して感受性にする遺伝子)を発現するように改変される。いくつかの実施態
様において、例えば、Tリンパ球又はNK細胞などの、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニ
スト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト、ある実施態様においては、突
然変異Fタンパク質及びサイトカインを発現することに加えて、キメラNDVは、組織特異的
マイクロRNA(miRNA)標的部位(例えば、miR-21、miR-184、miR-133a/133b、miR-137、及び
/又はmiR-193aマイクロRNAによって標的とされる部位)をコードするように改変される。
ある実施態様において、キメラNDVの指向性が改変される。具体的な実施態様において
、該ウイルスの指向性は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)及びウロキナーゼなど
の組織特異的又は腫瘍特異的プロテアーゼによって認識されるようにFタンパク質切断部
位の修飾によって改変される。他の実施態様において、該ウイルスの指向性は、組織特異
的miRNA標的部位の導入によって改変される。ある実施態様において、NDV HNタンパク質
は、腫瘍特異的受容体を認識するように突然変異させられる。
ある実施態様において、以下のもの:(1)免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト;(2)免
疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト;(3)サイトカイン;(4)腫瘍抗原;(5)異種インター
フェロンアンタゴニスト;(6)アポトーシス促進分子;(7)抗アポトーシス分子;及び/又は(8
)突然変異Fタンパク質うちの1つ又は複数が、キメラNDVによって、キメラタンパク又は融
合タンパク質として発現される。具体的な実施態様において、該キメラタンパク質又は融
合タンパク質は、NDV Fタンパク質又はNDV HNタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメイン又
はその断片、並びに前の文に言及された分子のうちの1つを含む細胞外ドメインを含む。
そのようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の説明に関する米国特許出願第2012-012
2185号と、国際出願公開WO 2007/064802号とを参照されたく、これらは、引用により本明
細書中に組み込まれる。
本明細書中の実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑
制シグナルのアンタゴニストは、骨格NDVのゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入するこ
とができる。具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/
又は抑制シグナルのアンタゴニストは、骨格NDVのゲノムのM転写ユニットとP転写ユニッ
トの間又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間に挿入される。本明細書中の他の実施態
様によれば、サイトカイン、腫瘍抗原、異種インターフェロンアンタゴニスト、アポトー
シス促進分子、抗アポトーシス分子、及び/又は突然変異Fタンパク質は、骨格NDVのゲノ
ムの2以上の転写ユニットの間(例えば、M転写ユニットとP転写ユニットの間又はHN転写ユ
ニットとL転写ユニットの間)に挿入される。
(5.2.1.免疫細胞刺激剤)
本明細書に記載のキメラNDVは、当業者に公知の、例えば、T-リンパ球、NK細胞、又は
抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)などの免疫細胞の任意の共刺激
シグナルのアゴニスト及び/又は任意の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように
改変することができる。具体的な実施態様において、該アゴニスト及び/又はアンタゴニ
ストは、免疫細胞のヒト共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞のヒト抑制シグ
ナルのアンタゴニストである。ある実施態様において、該共刺激シグナルのアゴニストは
、例えば、Tリンパ球(例えば、CD4+もしくはCD8+ Tリンパ球)、NK細胞、及び/又は抗原提
示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)などの免疫細胞に見られる共刺激分子
(例えば、共刺激受容体)のアゴニストである。共刺激分子の具体的な例としては、グルコ
コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS又はCD278)
、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、リンホトキシンα(LTα)、LIGHT(リ
ンホトキシン様、誘導性発現を示し、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質DとHVEMを競合
する、Tリンパ球によって発現される受容体)、CD226、細胞傷害性及び調節性T細胞分子(C
RTAM)、死受容体3(DR3)、リンホトキシン-β受容体(LTBR)、膜貫通活性化因子及びCAML相
互作用因子(TACI)、B細胞活性化因子受容体(BAFFR)、並びにB細胞成熟タンパク質(BCMA)
が挙げられる。具体的な実施態様において、該アゴニストは、免疫細胞のヒト共刺激受容
体のアゴニストである。ある実施態様において、該共刺激受容体のアゴニストは、ICOSの
アゴニストではない。いくつかの実施態様において、該アンタゴニストは、例えば、Tリ
ンパ球(例えば、CD4+もしくはCD8+ Tリンパ球)、NK細胞、及び/又は抗原提示細胞(例えば
、樹状細胞もしくはマクロファージ)などの免疫細胞に見られる抑制性分子(例えば、抑制
受容体)のアンタゴニストである。抑制性分子の具体的な例としては、細胞傷害性Tリンパ
球関連抗原4(CTLA-4又はCD52)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1又はCD279)、B及びT-
リンパ球アテニュエーター(BTLA)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、リンパ球
活性化遺伝子3(LAG3)、T細胞膜タンパク質3(TIM3)、CD160、アデノシンA2a 受容体(A2aR)
、免疫グロブリンドメインとITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、白血球関連
免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)、並びにCD160が挙げられる。具体的な実施態様におい
て、該アンタゴニストは、免疫細胞のヒト抑制受容体のアンタゴニストである。
具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体に特異的に
結合する抗体又はその抗原結合断片である。共刺激受容体の具体的な例としては、GITR、
ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、、LTα、LIGHT、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TAC
I、BAFFR、及びBCMAが挙げられる。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクロ
ーナル抗体である。他の具体的な実施態様において、該抗体は、sc-Fvである。具体的な
実施態様において、該抗体は、免疫細胞上の2つの受容体に結合する二重特異性抗体であ
る。他の実施態様において、該二重特異性抗体は、免疫細胞上の受容体及び癌細胞上の別
の受容体に結合する。具体的な実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である
。いくつかの実施態様において、該抗体は、NDV Fタンパク質もしくはその断片、又はNDV
HNタンパク質もしくはその断片を有するキメラタンパク質として発現される。キメラFタ
ンパク質又はキメラHNタンパク質の作製に関する説明については、例えば、引用により本
明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0122185号を参照されたい。具体的な
実施態様において、該キメラタンパク質は、下の第6節及び/又は第7節に記載のキメラFタ
ンパク質である。キメラICOSL-Fタンパク質及びキメラCD28-Fタンパク質を作製するため
の下記の技術を用いて、他のキメラFタンパク質又はキメラHNタンパク質を作製すること
ができる。
別の実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体のリガンドであ
る。ある実施態様において、該リガンドは、天然リガンドの断片である。天然リガンドの
具体的な例としては、ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、ヘルペスウイルス侵入メデ
ィエーター(HVEM)、CD80、及びCD86が挙げられる。天然リガンドをコードするヌクレオチ
ド配列及び天然リガンドのアミノ酸配列は当技術分野で公知である。例えば、B7RP1(別名
、ICOSLとして知られている; GenBankヒト: NM_015259.4、NP_056074.1、マウス: NM_015
790.3、NP_056605.1)、CD137L(GenBankヒト: NM_003811.3、NP_003802.1、マウス: NM_00
9404.3、NP_033430.1)、OX40L(GenBankヒト: NM_003326.3、NP_003317.1、マウス: NM_00
9452.2、NP_033478.1)、CD70(GenBankヒト: NM_001252.3、NP_001243.1、マウス: NM_011
617.2、AAD00274.1)、CD80(GenBankヒト: NM_005191.3、NP_005182.1、マウス: NM_00985
5.2、NP_033985.3)、及びCD86(GenBankヒト: NM_005191.3、CAG46642.1、マウス: NM_019
388.3、NP_062261.3)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をGenBankで見出すことができ
る。他の実施態様において、該リガンドは、天然リガンドの誘導体である。いくつかの実
施態様において、該リガンドは、共刺激受容体に特異的に結合する天然リガンド又は天然
リガンドの誘導体の少なくとも一部と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質である。
具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、共刺激受容体に特異的に結合する天然
リガンド又は天然リガンドの誘導体少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断
片とを含む。リガンド融合タンパク質の一例は、免疫グロブリンのFc部分に融合した4-1B
Bリガンド(Meseck Mらの文献、J Immunother. 2011 34:175-82に記載されている)である
。いくつかの実施態様において、該リガンドは、NDV Fタンパク質もしくはその断片、又
はNDV HNタンパク質もしくはその断片を有するキメラタンパク質として発現される。具体
的な実施態様において、該タンパク質は、下の第7節に記載のキメラHNタンパク質である
。キメラHN-GITRL、キメラHN-OX40-L、キメラHN-4-1BBL、及び/又はキメラHN-CD40Lを作
製するための下記の技術を用いて、他のキメラFタンパク質又はキメラHNタンパク質を作
製することができる。
別の実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガンド
に特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナル(複数
可)を伝達するのを遮断する、抗体(もしくは抗原結合断片)又は可溶性受容体である。抑
制受容体の天然リガンドの具体的な例としては、PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Ga
l9、及びアデノシンが挙げられる。天然リガンドに結合する抑制受容体の具体的な例とし
ては、CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、及びA2aRが挙げられる。
具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガ
ンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナル(
複数可)を伝達するのを遮断する、可溶性受容体である。ある実施態様において、該可溶
性受容体は、天然リガンドに特異的に結合する天然の抑制受容体の断片又は天然の抑制受
容体の誘導体の断片(例えば、天然の抑制受容体又は抑制受容体の誘導体の細胞外ドメイ
ン)である。いくつかの実施態様において、該可溶性受容体は、天然の抑制受容体又は天
然の抑制受容体の誘導体(例えば、天然の抑制受容体又は天然の抑制受容体の誘導体の細
胞外ドメイン)の少なくとも一部と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質である。具
体的な実施態様において、該融合タンパク質は、天然の抑制受容体又は天然の抑制受容体
の誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片とを含む。可溶性受容
体融合タンパク質の一例は、LAG3-Ig融合タンパク質(Huard Bらの文献、Eur J Immunol.
1995 25:2718-21に記載されている)である。
具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガ
ンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナル(
複数可)をする伝達するのを遮断する、抗体(又は抗原結合断片)である。ある具体的な実
施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。他の具体的な実施態様において
、該抗体は、scFvである。特定の実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体であ
る。抑制性リガンドに対する抗体の具体的な例は、抗PD-L1抗体(Iwai Yの文献、PNAS 200
2; 99:12293-12297)である。
別の実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体に結合するが、
抑制シグナル(複数可)を伝達しない、抗体(もしくは抗原結合断片)又はリガンドである。
抑制受容体の具体的な例としては、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、及びA2aRが挙
げられる。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。他の
具体的な実施態様において、該抗体は、scFvである。特定の実施態様において、該抗体は
、ヒト又はヒト化抗体である。抑制受容体に対する抗体の具体的な例は、抗CTLA-4抗体(L
each DRらの文献、Science 1996; 271: 1734-1736)である。抑制受容体に対する抗体の別
の例は、抗PD-1抗体(Topalian SLの文献、NEJM 2012; 28:3167-75)である。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラNDVは、例えば、イピリムマブ又はト
レメリムマブなどのCTLA-4のアンタゴニストに改変される。ある実施態様において、本明
細書に記載のキメラNDVは、例えば、MDX-1106(BMS-936558)、MK3475、CT-011、AMP-224、
又はMDX-1105などのPD1のアンタゴニストに改変される。ある実施態様において、本明細
書に記載のキメラNDVは、例えば、IMP321などのLAG3のアンタゴニストを発現するように
改変される。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラNDVは、例えば、MGA271な
どの、B7-H3に結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、又
はscFv)を発現するように改変される。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキ
メラNDVは、下の第6節及び/又は第7節に記載の免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及
び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変される。具体的
な実施態様において、本明細書に記載のNDVは、抗CD28 scvFv、ICOSL、CD40L、OX40L、CD
137L、GITRL、及び/又はCD70を発現するように改変される。
ある実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激受容体のそ
のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を誘導する(例えば、選
択的に誘導する)。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激
受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、
該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘
導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％
、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、
50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で誘導する。具体的
な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは:(i)該共刺激受容体の1つの特定のリ
ガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在
下での該共刺激受容体の該特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル
伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％
、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、
75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で誘導し;及び(ii)該共刺激受容体の1以上の他
のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を誘導しないか、或い
は該シグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体のそのような1以
上の他のリガンドによって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、1
0％、5％、もしくは2％未満、又は2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜2
0％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範囲で誘導する。
ある実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激受容体のそ
のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を活性化又は増強する(
例えば、選択的に活性化又は増強する)。具体的な実施態様において、共刺激受容体のア
ゴニストは、該共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上の
シグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での共刺激受容体の1以上のそのリガンド
への結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％
、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜
50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲
で活性化又は増強する。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは:(i)該
共刺激受容体の1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経
路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体の該特定のリガンドへの結合によって
誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60
％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％
、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で活性化又は増強
し;及び(ii)該共刺激受容体の1以上の他のリガンドへの結合によって誘導される1以上の
シグナル伝達経路を活性化又は増強しないか、或いは該シグナル伝達経路を、該アゴニス
トの非存在下での該共刺激受容体のそのような1以上の他の結合によって誘導される1以上
のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％未満、又は2％〜5％
、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範
囲で活性化又は増強する。
いくつかの実施態様において、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、抑制受容
体のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を(例えば、選択
的に)阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニスト
は、該抑制受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝
達経路を、該アンタゴニストの非存在下での該抑制受容体の1以上のそのリガンドへの結
合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％
、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、
25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害
し又は低下させる。具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは:(i)該抑
制受容体の1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を
、該アンタゴニストの非存在下での該抑制受容体の該1つの特定のリガンドへの結合によ
って誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％
、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜
75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は
低下させ;及び(ii)該抑制受容体の1以上の他のリガンドの結合によって誘導される1以上
のシグナル伝達経路を阻害し又は低下させないか、或いは該シグナル伝達経路を、該アン
タゴニストの非存在下での抑制受容体のそのような1以上の他のリガンドへの結合によっ
て誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％
未満、又は2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もし
くは15％〜20％の範囲で阻害し又は低下させる。
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細
胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、1以上の免疫活性、機能、又は応答を誘導し、活
性化し、及び/又は増強する。該1以上の免疫活性、機能、又は応答は、例えば、抗体応答
(液性応答)又は細胞性免疫応答、例えば、サイトカイン分泌(例えば、インターフェロン-
γ)、ヘルパー活性、又は細胞傷害性の形態であることができる。一実施態様において、
免疫細胞上の活性化マーカー(例えば、CD44、グランザイム、もしくはKi-67)の発現、免
疫細胞上の共刺激受容体(例えば、ICOS、CD28、OX40、もしくはCD27)の発現、共刺激受容
体のリガンド(例えば、B7HRP1、CD80、CD86、OX40L、もしくはCD70)の発現、サイトカイ
ン分泌、免疫細胞(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、及び/もしくはNK細胞)の腫瘍への浸
潤、抗体産生、エフェクター機能、T細胞活性化、T細胞分化、T細胞増殖、B細胞分化、B
細胞増殖、並びに/又はNK細胞増殖は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は
免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストとの接触後に誘導され、活性化され、及び/又
は増強される。別の実施態様において、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の腫瘍浸潤及び
増殖、Tregの腫瘍浸潤、活性化、及び増殖、末梢血MDSC及びTregの数は、免疫細胞の共刺
激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストとの接触後
に阻害される。
(5.3 NDVの構築)
本明細書に記載のNDVは、リバースジェネティックス技術を用いて作製することができ
る。リバースジェネティックス技術は、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオ
ンを生成させるのに必要なシグナルのパッケージングに不可欠なマイナス鎖のウイルスRN
Aの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を伴う。該組換えRNAは、組換えDNA
鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体とともにインビトロで再構築されて
、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボヌクレオタンパク質
(RNP)を形成する。より効率的なトランスフェクションは、ウイルスポリメラーゼタンパ
ク質がインビトロ又はインビボのどちらかにおける合成RNAの転写中に存在する場合に達
成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前
述の技術は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1992年11月24日に
発行された米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号
; 2000年11月14日に発行された米国特許第6,146,642号; 1996年2月20日に公開された欧州
特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開された国際
特許公開PCT WO97/12032号; 1996年11月7日に公開されたWO96/34625号;欧州特許公開EP A
780475号; 1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号; 1998年11月26日に公開されたWO 9
8/53078号; 1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号; 1999年4月1日に公開されたWO 99
/15672号; 1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号; 1997年2月20日に公開されたWO 97/
06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、本明細書に記載のNDVを改変することもでき
る。簡潔に述べると、NDV(例えば、Hitchner B1株)の完全なcDNAを構築し、プラスミドベ
クターに挿入し、2つの転写ユニット(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子;又はNDV HN遺
伝子とNDV L遺伝子)の間にユニークな制限部位を含むように改変することができる。異種
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(例えば、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴ
ニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列)を該ユニ
ークな制限部位でウイルスゲノムに挿入することができる。或いは、挿入がウイルスの感
染及び複製能力に影響を及ぼさない限り、異種アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列(例えば、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は抑制シグナルのアンタゴニ
ストをコードするヌクレオチド配列)を改変して、NDV転写ユニット中に挿入することがで
きる。単一のセグメントをT7プロモーターとδ型肝炎ウイルスリボザイムの間に位置付け
て、T7ポリメラーゼから正確なマイナスの転写物を生成させる。必要なウイルスタンパク
質を含むプラスミドベクター及び発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウ
イルス粒子の産生をもたらす(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込
まれる、国際公開WO 01/04333号;米国特許第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372
号、第6,544,785号、及び第7,384,774号; Swayneらの文献(2003). Avian Dis. 47:1047-1
050;並びにSwayneらの文献(2001). J. Virol. 11868-11873を参照されたい)。
抗体を発現するキメラNDVの産生技術は、当技術分野で公知である。例えば、2つの導入
遺伝子から完全IgGを発現する組換えNDVの作製については、Puhlerらの文献、Gene Ther.
15(5): 371-283(2008)を参照されたい。
単一のmRNAから多数のタンパク質を産生する二シストロン性技術は当業者に公知である
。二シストロン性技術は、IRES配列の使用により、多数のタンパク質のコード配列を単一
のmRNAに改変することを可能にする。IRES配列は、RNA分子へのリボザイムの内部動員を
誘導し、キャップ非依存的な様式での下流の翻訳を可能にする。簡潔に述べると、1つの
タンパク質のコード領域を第二のタンパク質のORFに挿入する。挿入の両隣に、IRESと適
切な発現及び/又は機能に必要な任意の非翻訳シグナル配列とを配置する。挿入は、第二
のタンパク質のオープンリーディングフレームも、ポリアデニル化も、転写プロモーター
も破壊してはいけない(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる
、Garcia-Sastreらの文献、1994, J. Virol. 68:6254-6261及びGarcia-Sastreらの文献、
1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246を参照されたい)。
(5.4 NDVの増殖)
本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、該ウイルスを本明細書に記載のウイルス
の使用を可能にする力価まで成長させる任意の基体で増殖させることができる。一実施態
様において、該基体は、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、対応する野生型ウ
イルスについて決定された力価と同程度の力価まで成長させる。
本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、該ウイルスによる感染を起こしやすい細
胞(例えば、鳥細胞、ニワトリ細胞など)、孵化卵(例えば、鶏卵もしくはウズラ卵)、又は
動物(例えば、鳥類)で成長させることができる。そのような方法は、当業者に周知である
。具体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、癌細胞、例
えば、上皮癌(carcinoma)細胞(例えば、乳癌細胞及び前立腺癌細胞)、肉腫細胞、白血病
細胞、リンパ腫細胞、並びに胚細胞腫瘍細胞(例えば、精巣癌細胞及び卵巣癌細胞)で増殖
させることができる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キ
メラNDV)を、細胞株、例えば、癌細胞株、例えば、HeLa細胞、MCF7細胞、THP-1細胞、U87
細胞、DU145細胞、Lncap細胞、及びT47D細胞で増殖させることができる。ある実施態様に
おいて、該細胞又は細胞株(例えば、癌細胞又は癌細胞株)をヒト(複数可)から入手し、及
び/又はヒト(複数可)から得る。別の実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、
キメラNDV)をニワトリ細胞又は孵化卵で増殖させる。代表的なニワトリ細胞としては、ニ
ワトリ胚線維芽細胞及びニワトリ胚腎臓細胞が挙げられるが、これらに限定されない。具
体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)をVero細胞で増殖さ
せる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、下
の第6節及び/又は第7節に記載の方法に従って、癌細胞で増殖させる。別の具体的な実施
態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を鶏卵又はウズラ卵で増殖させ
る。ある実施態様において、本明細書に記載のNDVウイルス(例えば、キメラNDV)をまず孵
化卵で増殖させ、その後、細胞(例えば、細胞株)で増殖させる。
本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を、例えば、6〜14日齢、6〜12日齢、6〜10
日齢、6〜9日齢、6〜8日齢、又は10〜12日齢の孵化卵で増殖させることができる。幼若な
又は未成熟な孵化卵を用いて、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を増殖させるこ
とができる。未成熟な孵化卵は、IFNを欠損している、10日齢未満である卵、例えば、6〜
9日齢又は6〜8日齢の卵を包含する。未成熟な孵化卵は、IFNシステムが10〜12日齢の卵と
比較して完全には発達しないような、成長条件の変化、例えば、インキュベーション温度
の変化;薬物による処理;又は発育が遅延した卵を生じさせる任意の他の変化の結果として
、10日齢までの未成熟卵を人工的に模倣する卵も包含する。本明細書に記載のNDV(例えば
、キメラNDV)を、孵化卵の様々な場所、例えば、尿膜腔で増殖させることができる。ウイ
ルスの成長及び増殖に関する詳細な考察については、例えば、どちらも引用により本明細
書中に組み込まれる、米国特許第6,852,522号及び米国特許第7,494,808号を参照されたい
。
ウイルス単離のために、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を細胞培養物から取
り出し、通常、例えば、勾配遠心分離及びカラムクロマトグラフィーなどの周知の清澄化
手順によって、細胞成分から分離することができ、望ましい場合、当業者に周知の手順、
例えば、プラークアッセイを用いて、さらに精製することができる。
(5.5 組成物及び投与経路)
本明細書に包含されるのは、組成物中の本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)の使
用である。また本明細書に包含されるのは、組成物中のNDV感染細胞又はNDVに感染させた
全癌細胞由来の形質膜断片の使用である。具体的な実施態様において、該組成物は、免疫
原性製剤(例えば、ワクチン製剤)などの医薬組成物である。該組成物を癌の治療方法で使
用することができる。
一実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明
細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物
は、下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加の予防剤又は治療剤をさらに含む
。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の
本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)、及び任意に1以上の追加の予防剤又は治療剤
を含む。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)は、医薬組成物中に含ま
れる唯一の活性成分である。
別の実施態様において、医薬組成物(例えば、腫瘍溶解性ワクチン)は、医薬として許容
し得る担体との混合物中に、NDVに感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜
断片調製物を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、下の第5.6.4節に記載
されているような1以上の追加の予防剤又は治療剤をさらに含む。別の実施態様において
、医薬組成物(例えば、全細胞ワクチン)は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、
NDVに感染させた癌細胞を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、下の第5.6
.4節に記載されているような1以上の追加の予防剤又は治療剤をさらに含む。
本明細書に提供される医薬組成物は、該組成物を対象に投与することを可能にする任意
の形態であることができる。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、動物及び/又
はヒトへの投与に好適である。本明細書で使用されるように、「医薬として許容し得る」
という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の
規制当局に承認されているか、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記
載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに医薬組成物が投与さ
れる、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクル体を指す。生理食塩水溶液及び水性
デキストロース溶液及びグリセロール溶液は、特に注射用溶液のための液体担体として利
用することもできる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スク
ロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム
、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセ
ロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の
例は、E. W. Martin著、「レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences
)」に記載されている。製剤は、投与様式に適するべきである。
具体的な実施態様において、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に適するよう
に製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、胸腔内、吸入、腹腔
内、経口、皮内、結腸直腸、腹腔内、頭蓋内、及び腫瘍内投与に適するように製剤化する
ことができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、静脈内、動脈内、経口、腹腔
内、鼻腔内、気管内、胸腔内、頭蓋内、皮下、筋肉内、局所、肺、又は腫瘍内投与用に製
剤化することができる。
(5.6 抗癌用途及び他の用途)
一態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV
)を癌の治療で使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは
、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラNDV(例
えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物を投与することを含む、方法であ
る。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって
、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節
に記載のキメラNDV)又はその組成物を投与することを含む、方法である。
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように
改変されたキメラNDV、又はその組成物を対象に投与して、癌を治療する。別の具体的な
実施態様において、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変され
たキメラNDV、又はその組成物を対象に投与して、癌を治療する。ある実施態様において
、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び突然変異Fタンパク質を発現するように改
変されたキメラNDV又はその組成物を対象に投与して、癌を治療する。ある実施態様にお
いて、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト及び突然変異Fタンパク質を発現するよ
うに改変されたキメラNDV又はその組成物を対象に投与して、癌を治療する。
癌を治療する方法で使用される本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記
載のキメラNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンを任意
の次数の治療(例えば、第一次、第二次、第三次、第四次、又は第五次治療)として使用す
ることができる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキ
メラNDV)は、癌を治療するために投与される唯一の活性成分である。具体的な実施態様に
おいて、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)は、癌を
治療するために投与される組成物中の唯一の活性成分である。
キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成物は、対象に、局所
又は全身投与することができる。例えば、キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメ
ラNDV)又はその組成物は、対象に、非経口的に(例えば、静脈内に、動脈内に、もしくは
皮下に)、腫瘍内に、胸腔内に、鼻腔内に、腹腔内に、頭蓋内に、経口的に、経直腸的に
、吸入により、筋肉内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態様
において、キメラNDVは、例えば、肝動脈注射により、肝動脈経由で投与され、これは、
画像下治療(interventional radiology)によるか又は動脈注入ポンプの留置によって行う
ことができる。別の具体的な実施態様において、キメラNDVは、外科手術中、腹腔鏡手術
下、又は内視鏡手術下で投与される。具体的な実施態様において、キメラNDVの腹腔内投
与は、直接的な注射、カテーテルによる注入、又は腹腔鏡手術中の注射によって行われる
。
ある実施態様において、本明細書に記載の方法は、治療法がない癌の治療を含む。いく
つかの実施態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキ
メラNDV)又はその組成物は、他の従来治療の代替法として癌を治療するために対象に投与
される。
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを
必要とする対象に、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV
)又はその組成物及び下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加の療法を投与す
ることを含む、方法である。特定の実施態様において、1以上の療法は、癌を治療するた
めに、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組
成物と組み合わせて対象に投与される。具体的な実施態様において、該追加の療法は、癌
の治療で使用現在使用されているものであるか、癌の治療で使用されてきたものであるか
、又は癌の治療において有用であることが知られているものである。別の実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)又はその組成
物は、支持療法、疼痛緩和療法、又は癌に対する治療効果を有しない他の療法と組み合わ
せて対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば
、上の第5.2節に記載のキメラNDV)と組み合わせて投与される1以上の追加の療法は、下の
第5.6.4.1節に記載の療法のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、本明細書
に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)及び1以上の追加の療法は、
同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、キメラNDV及び1以上の追加の療法は
、異なる組成物中で投与される。
ある実施態様において、2つ、3つ、又は多数のNDV(1つ、2つ、又はそれより多くの本明
細書に記載のキメラNDV、例えば、1つ、2つ、又はそれより多くの上の第5.2節に記載のキ
メラNDVを含む)は、癌を治療するために対象に投与される。癌を治療するために対象に2
つ、3つ、又は多数のNDVを投与することを含む本明細書に記載の方法に従って使用される
2以上のキメラNDVは、天然のキメラNDV又は異種アミノ酸配列(例えば、サイトカイン)を
発現するように改変されている改変キメラNDVであることができる。第一及び第二のキメ
ラNDVは、同じ医薬組成物又は異なる医薬組成物の部分であることができる。ある実施態
様において、第一のキメラNDV及び第二のキメラNDVは、同じ投与経路で投与される(例え
ば、どちらも腫瘍内又は静脈内に投与される)。他の実施態様において、第一のキメラNDV
及び第二のキメラNDVは、異なる投与経路で投与される(例えば、一方は腫瘍内に投与され
、もう一方は静脈内に投与される)。
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように
改変された第一のキメラNDVは、癌を治療するために、免疫細胞の抑制シグナルのアンタ
ゴニストを発現するように改変された第二のキメラNDVと組み合わせて患者に投与される
。他の具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免
疫の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変された第一のキメラNDVは、以
下のもの:サイトカイン(例えば、IL-2)、異種インターフェロンアンタゴニスト、腫瘍抗
原、アポトーシス促進分子、及び/又は抗アポトーシス分子うちの1つ、2つ、又はそれよ
り多くを発現するように改変された第二のキメラNDVと組み合わせて投与される。具体的
な実施態様において、該第一のキメラNDV、該第二のキメラNDV、又はその両方は、該キメ
ラNDVの融合活性を増大させる突然変異Fタンパク質を発現する。別の具体的な実施態様に
おいて、該第一のキメラNDV、該第二のキメラNDV、又はその両方は、切断部位に突然変異
(例えば、本明細書に記載されているもの)を有する突然変異Fタンパク質を発現する。
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストを発現するように
改変された第一のキメラNDVを含む第一の組成物(例えば、医薬組成物)は、癌を治療する
ために、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変された第二のキ
メラNDVを含む第二の組成物(例えば、医薬組成物)と組み合わせて患者に投与される。他
の具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫の
抑制シグナルのアンタゴニストを発現するように改変された第一のキメラNDVを含む第一
の組成物(例えば、医薬組成物)は、以下のもの:サイトカイン(例えば、IL-2)、異種イン
ターフェロンアンタゴニスト、腫瘍抗原、アポトーシス促進分子、及び/又は抗アポトー
シス分子のうちの1つ、2つ、又はそれより多くを発現するように改変された第二のキメラ
NDVを含む第二の組成物(例えば、医薬組成物)と組み合わせて投与される。具体的な実施
態様において、該第一のキメラNDV、該第二のキメラNDV、又はその両方は、該キメラNDV
の融合活性を増大させる突然変異Fタンパク質を発現する。別の具体的な実施態様におい
て、該第一のキメラNDV、該第二のキメラNDV、又はその両方は、切断部位中の突然変異(
例えば、本明細書に記載されているもの)を有する突然変異Fタンパク質を発現する。
別の態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)を、癌の
治療において、本明細書中、下の第5.6.4節(例えば、下の第5.6.4.1節)に記載されている
ような1以上の追加の療法と組み合わせて使用することができる。一実施態様において、
本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明
細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)又はその組成物及び本明細書中、下
の第5.6.4節(例えば、第5.6.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法を投与す
ることを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌
を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載のNDV(例え
ば、上の第5.1節に記載のNDV)又はその組成物及び有効量の下の第5.6.4節(例えば、第5.6
.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法を投与することを含む、方法である。
ある実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)及び下
の第5.6.4節(例えば、第5.6.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法は、同じ
組成物中で投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)
及び1以上の追加の療法は、異なる組成物中で投与される。
1以上の追加の療法と組み合わせて使用されるNDVは、全身又は局所投与することができ
る。例えば、該NDV又はその組成物は、対象に、非経口的に(例えば、静脈内に、動脈内に
、もしくは皮下に)、腫瘍内に、胸腔内に、鼻腔内に、腹腔内に、頭蓋内に、経口的に、
経直腸的に、吸入により、筋肉内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的
な実施態様において、該NDVは、例えば、肝動脈注射により、肝動脈経由で投与され、こ
れは、画像下治療(interventional radiology)によるか又は動脈注入ポンプの留置によっ
て行うことができる。別の具体的な実施態様において、該NDVは、外科手術中、腹腔鏡手
術下、又は内視鏡手術下で投与される。具体的な実施態様において、該NDVの腹腔内投与
は、直接的な注射、カテーテルによる注入、又は腹腔鏡手術中の注射によって行われる。
本明細書中、下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加の療法と組み合わせた
、本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶
解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、本明細書に記載の方法に従って癌を治療するた
めの任意の次数の治療(例えば、第一次、第二次、第三次、第四次、又は第五次治療)とし
て使用することができる。
別の態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラN
DV)に感染させた全癌細胞を用いて、癌を治療することができる。具体的な実施態様にお
いて、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)を癌細胞又
は癌細胞の集団と接触させることができ、感染させた癌細胞又は癌細胞の集団を対象に投
与して、癌を治療することができる。一実施態様において、癌細胞は、本明細書に記載の
キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)に感染させる前に、γ線照射を受け
る。別の実施態様において、癌細胞は、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2
節に記載のキメラNDV)に感染させた後に、γ線照射を受ける。特定の実施態様において、
癌細胞が対象中で増殖することができないように、癌細胞は対象に投与される前に処理さ
れる。具体的な実施態様において、癌細胞は対象中で増殖することができず、ウイルスは
対象に感染することができない。一実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に
γ線照射を受ける。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に超音波処理
される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、マイトマイシンCで
処理される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、凍結及び解凍に
よって処理される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、熱処理で
処理される。癌細胞は、対象に、局所又は全身投与することができる。例えば、癌細胞は
、対象に、非経口的に(例えば、静脈内にもしくは皮下に)、腫瘍内に、鼻腔内に、経口的
に、吸入により、胸腔内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態
様において、癌細胞は、腫瘍内に又は対象の皮膚(例えば、皮内)に投与される。使用され
る癌細胞は、自己のもの又は同種異系のものであることができる。具体的な実施態様にお
いて、キメラNDVの骨格は、非溶解性株である。癌細胞は、単独で又は追加の療法と組み
合わせて、対象に投与することができる。癌細胞は、医薬組成物中にあることが好ましい
。ある実施態様において、癌細胞は、下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加
の療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、癌細胞及び1以上の追加の療
法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、癌細胞及び1以上の追加の療
法は、異なる組成物中で投与される。
別の態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)に感染さ
せた全癌細胞は、癌の治療において、本明細書中、下の第5.6.4節に記載の1以上の追加の
療法と組み合わせて使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供される
のは、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のNDV(例え
ば、上の第5.1節に記載のNDV)に感染させた全癌細胞を、本明細書中、下の第5.6.4節に記
載の1以上の追加の療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要とす
る対象に、有効量の本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)に感染させ
た全癌細胞を、下の第5.6.4節に記載の有効量の1以上の追加の療法と組み合わせて投与す
ることを含む、方法である。ある実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、上の
第5.1節に記載のNDV)に感染させた全癌細胞及び下の第5.6.4節に記載の1以上の追加の療
法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば
、上の第5.1節に記載のNDV)に感染させた全癌細胞及び1以上の追加の療法は、異なる組成
物中で投与される。
別の態様において、キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)に感染させた
溶解した癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物を用いて、癌を治療することが
できる。一実施態様において、本明細書に記載のキメラNDVに感染させた癌細胞由来の断
片を含む形質膜調製物を用いて、癌を治療することができる。別の実施態様において、本
明細書に記載のキメラNDVに感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物を用いて、癌を治
療することができる。当業者に公知の技術を用いて、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製
物を産生することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例
えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)を癌細胞又は癌細胞の集団と接触させることがで
き、感染させた癌細胞又は癌細胞の集団を、当業者に公知の技術を用いて溶解させて、ND
Vに感染させた癌細胞のタンパク質濃縮物又は形質膜断片を得ることができ、該NDVに感染
させた癌細胞のタンパク質濃縮物又は形質膜断片を対象に投与して、癌を治療することが
できる。該タンパク質濃縮物又は形質膜断片は、対象に、局所又は全身投与することがで
きる。例えば、該タンパク質濃縮物又は形質膜断片は、対象に、非経口的に、腫瘍内に、
鼻腔内に、胸腔内に、経口的に、吸入により、局所に、又は皮内に投与することができる
。具体的な実施態様において、そのようなタンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、腫瘍内
に又は対象の皮膚(例えば、皮内)に投与される。該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物を
産生するために使用される癌細胞は、自己のもの又は同種異系のものであることができる
。具体的な実施態様において、キメラNDVの骨格は、溶解性株である。該タンパク質濃縮
物又は形質膜調製物は、単独で又は追加の療法と組み合わせて対象に投与することができ
る。該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、医薬組成物中にあることが好ましい。ある
実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、下の第5.6.4節(例えば、第
5.6.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法と組み合わせて投与される。ある
実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び1以上の追加の療法は、同
じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物
及び1以上の追加の療法は、異なる組成物中で投与される。
別の態様において、NDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)に感染させた溶解した癌細
胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、癌の治療において、本明細書中、下の第
5.6.4節(例えば、第5.6.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法と組み合わせ
て使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療す
る方法であって、それを必要とする対象に、NDV(例えば、上の第5.1節に記載のNDV)に感
染させた溶解した癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物を、本明細書中、下の
第5.6.4節(例えば、第5.6.4.1節)に記載されているような1以上の追加の療法と組み合わ
せて投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、NDV(例えば、上の第5.1
節に記載のNDV)に感染させた溶解した癌細胞由来の有効量のタンパク質濃縮物又は形質膜
調製物を、有効量の下の第5.6.4節(例えば、第5.6.4.1節)に記載されているような1以上
の追加の療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。ある実施態様において、
該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び下の第5.6.4節に記載されているような1以上の
追加の療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該タンパク質濃縮物
又は形質膜調製物及び1以上の追加の療法は、異なる組成物中で投与される。
別の態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキメラN
DV)を用いて、診断的免疫アッセイ、受動免疫療法、及び抗イデオタイプ抗体の作製で使
用することができる抗体を産生することができる。例えば、本明細書に記載のキメラNDV(
例えば、上の第5.2節に記載のキメラNDV)を、対象(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウマ
、ロバ、鳥、又はヒト)に投与して、抗体を作製することができ、その後、これを単離し
、例えば、診断アッセイ、受動免疫療法、及び抗イデオタイプ抗体の作製で使用すること
ができる。ある実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1節又は第5.2
節に記載のNDV)を、対象(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ロバ、鳥、又はヒト)に
、下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加の療法と組み合わせて投与して、抗
体を作製することができ、その後、これを単離し、例えば、診断アッセイ、受動免疫療法
、及び抗イデオタイプ抗体の作製で使用することができる。作製された抗体を、当技術分
野で公知の標準的な技術(例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿など)
により単離し、診断的免疫アッセイ、受動免疫療法、及び抗イデオタイプ抗体の作製で使
用することができる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載のキ
メラNDV)を投与された対象から単離された又は本明細書に記載のNDV(例えば、上の第5.1
節もしくは第5.2節に記載のNDV)を下の第5.6.4節に記載されているような1以上の追加の
療法と組み合わせて投与された対象から単離された抗体を用いて、NDVタンパク質、キメ
ラNDVによって発現される異種ペプチドもしくはタンパク質、又はその両方の発現を評価
することができる。この目的のために、限定されないが、少し例を挙げれば、放射性免疫
アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、沈降反
応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射
線測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ、及び免疫電気泳動アッ
セイなどの技術を用いる、競合的及び非競合的アッセイ系を含む、当技術分野で公知の任
意の免疫アッセイ系を使用することができる。
(5.6.1.患者集団)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその
組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、
又は本明細書に記載の併用療法は、癌に罹患している対象に投与される。他の実施態様に
おいて、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載
の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併
用療法は、癌の素因を有するか又は癌になりやすい対象に投与される。いくつかの実施態
様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物
ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、癌
と診断された対象に投与される。癌の種類の具体的な例は、本明細書に記載されている。
一実施態様において、該対象は、転移性癌を有する。別の実施態様において、該対象は、
ステージ1、ステージ2、ステージ3、又はステージ4の癌を有する。別の実施態様において
、該対象は、寛解期にある。また別の実施態様において、該対象は、癌の再発を有する。
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載
の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併
用療法は、0〜6カ月、6〜12カ月、6〜18カ月、18〜36カ月、1〜5歳、5〜10歳、10〜15歳
、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳
、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳
、又は95〜100歳であるヒトに投与される。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、
キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に
記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、ヒト乳児に投与される。他の
実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍
溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法
は、ヒト幼児に投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはそ
の組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン
、又は本明細書に記載の併用療法は、ヒト小児に投与される。他の実施態様において、ND
V(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は
本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、ヒト成人に投与さ
れる。また他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細
書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に
記載の併用療法は、ヒト高齢者に投与される。
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載
の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併
用療法は、免疫不全状態もしくは免疫抑制状態にあるか、又は免疫不全状態もしくは免疫
抑制状態になるリスクのある対象に投与される。ある実施態様において、NDV(例えば、キ
メラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記
載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、免疫抑制療法を受けているか又
は免疫抑制療法から回復しつつある対象に投与される。ある実施態様において、NDV(例え
ば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細
書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、癌を有しているか又は癌
になるリスクのある対象に投与される。ある実施態様において、該対象は、外科手術、化
学療法、及び/又は放射線療法を受けているか、これらを受ける予定であるか、又はこれ
らを受けたことがある。ある実施態様において、患者は、外科手術を受けて、腫瘍又は新
生物を除去したことがある。具体的な実施態様において、外科手術を施して、腫瘍又は新
生物を除去した後に、患者に、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に
記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載
の併用療法を投与する。他の実施態様において、外科手術を施して、腫瘍又は新生物を除
去する前に、患者に、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫
瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療
法を投与する。ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本
明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細
書に記載の併用療法は、組織移植、臓器移植、又は輸血を受けているか、これらを受ける
予定であるか、又はこれらを受けた対象に投与される。
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書
に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記
載の併用療法は、該キメラNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物、全細胞ワクチン、又は
併用療法以外の療法に不応性であることが分かっているが、これらの療法をもはや受けて
いない患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくは
その組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチ
ン、又は本明細書に記載の併用療法は、化学療法に不応性であることが分かっている患者
に投与される。一実施態様において、癌が療法に不応性であるということは、癌細胞の少
なくともいくつかの重要な部分が死滅しないか又はその細胞分裂が停止しないことを意味
する。癌細胞が不応性であるかどうかの決定は、当技術分野で許容される「不応性」の意
味をそのような文脈で用いて、癌細胞に対する療法の効果をアッセイする当技術分野で公
知の任意の方法により、インビボ又はインビトロのどちらかで行うことができる。ある実
施態様において、不応性患者は、標準療法に不応性の患者である。ある実施態様において
、癌を有する患者は、腫瘍又は新生物がそれほど根絶されない場合及び/又は症状がそれ
ほど緩和されない場合、療法に不応性である。患者が不応性であるかどうかの決定は、当
技術分野で許容される「不応性」の意味をそのような文脈で用いて、癌の治療の有効性を
アッセイする当技術分野で公知の任意の方法により、インビボ又はインビトロのどちらか
で行うことができる。
ある実施態様において、本明細書に記載の方法に従って治療されるべき患者は、抗生物
質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、又は他の生物療法/免疫療法もしくは抗癌療法で既に治療
されている患者である。これらの患者の中に、不応性患者、及び従来の療法を施すには若
すぎる患者がいる。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)、本明細書に
記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載
の併用療法を投与されている対象は、該キメラNDVもしくはその組成物、該腫瘍溶解物ワ
クチン、又は該全細胞ワクチン、又は該併用療法の投与前に、療法を受けたことがない。
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書
に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記
載の併用療法は、癌を発症するリスクのある患者で癌の発生を予防するために、患者に投
与される。いくつかの実施態様において、化合物は、従来の療法に対する有害反応を起こ
しやすい患者に投与される。
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書
に記載の腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記
載の併用療法を投与されている対象は、先行治療を受けたことがない。他の実施態様にお
いて、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチ
ン、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、該NDV(例
えば、キメラNDV)もしくは組成物、該腫瘍溶解物ワクチン、該全細胞ワクチン、又は該併
用療法の投与前に治療を受けたことがある対象に投与される。いくつかの実施態様におい
て、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン
、又は本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法を投与される対
象は、先行治療に対する有害な副作用を経験したか、又は先行治療は、該対象に対する許
容されないレベルの毒性が原因で中止された。
(5.6.2.投薬量及び頻度)
癌の治療において有効であるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細
胞ワクチンの量は、癌の性質、投与経路、対象の全体的な健康などによって決まり、医師
の判断に従って決定されるべきである。最適な投薬量範囲の特定を助けるために、インビ
トロアッセイなどの標準的な臨床技術を任意に利用することができる。しかしながら、投
与用のNDVの好適な投薬量範囲は、通常、約102、5×102、103、5×103、104、5×104、10
5、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×10
10、1×1011、5×1011、又は1012pfu、最も好ましくは、約104〜約1012、106〜1012、108
〜1012、109〜1012、又は109〜1011であり、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、4回、
又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。投与用の腫瘍溶解物ワクチンの
投薬量範囲は、0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1.0mg、2.0 mg、3.0
mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg〜10.0mg、0.01mg〜1.0mg、0.1mg〜1mg、及び0.1mg
〜5.0mgを含むことができ、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回
数、対象に投与することができる。投与用の全細胞ワクチンの投薬量範囲は、102、5×10
2、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108
、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、又は1012細胞を含むことがで
き、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回数、対象に投与するこ
とができる。ある実施態様において、NDV、腫瘍溶解物ワクチン、又は全細胞ワクチンの
臨床試験で現在使用されているのと同様の投薬量が対象に投与される。有効用量は、イン
ビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から推定することができる。
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)又はその組成物は、単一用量として、
次いで、1〜6週間後、1〜5週間後、1〜4週間後、1〜3週間後、1〜2週間後に第二の用量と
して、対象に投与される。これらの実施態様に従って、追加免疫接種物を、2回目の接種
後6〜12カ月の間隔で、対象に投与することができる。ある実施態様において、腫瘍溶解
性ワクチン又は全細胞ワクチンは、単一用量として、次いで、1〜6週間後、1〜5週間後、
1〜4週間後、1〜3週間後、1〜2週間後に第二の用量として、対象に投与される。
ある実施態様において、同じNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解物
ワクチン、又は全細胞ワクチンの投与を繰り返すことができ、該投与は、少なくとも1日
、2日、3日、5日、6日、7日、10日、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日
、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。他の実施態様において、同
じNDV(例えば、NDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、又は全細胞ワクチンの投
与を繰り返すことができ、該投与は、1〜14日、1〜7日、7〜14日、1〜30日、15〜30日、1
5〜45日、15〜75日、15〜90日、1〜3カ月、3〜6カ月、3〜12カ月、又は6〜12カ月の間隔
を空けることができる。いくつかの実施態様において、第一のNDV(例えば、第一のキメラ
NDV)又はその組成物を対象に投与し、次いで、第二のNDV(例えば、第二のキメラNDV)又は
その組成物を投与する。ある実施態様において、第一及び第二のNDV(例えば、第一及び第
二のキメラNDV)又はそれらの組成物は、少なくとも1日、2日、3日、5日、6日、7日、10日
、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の
間隔を空けることができる。他の実施態様において、第一及び第二のNDV(例えば、第一及
び第二のキメラNDV)又はそれらの組成物は、1〜14日、1〜7日、7〜14日、1〜30日、15〜3
0日、15〜45日、15〜75日、15〜90日、1〜3カ月、3〜6カ月、3〜12カ月、又は6〜12カ月
の間隔を空けることができる。
ある実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワ
クチンは、1以上の追加の療法、例えば、下の第5.6.4節に記載の療法と組み合わせて、対
象に投与される。他の1以上の追加の療法の投薬量は、例えば、療法、癌の性質、投与経
路、対象の全体的な健康などを含む、様々な因子によって決まり、医師の判断に従って決
定されるべきである。具体的な実施態様において、他の療法の用量は、本明細書に開示さ
れる方法に従って使用される単剤として使用するための療法に推奨される療法の用量及び
/又は投与頻度である。他の実施態様において、他の療法の用量は、本明細書に開示され
る方法に従って使用される単剤として使用するための療法に推奨されるよりも低用量及び
/又は低頻度の療法の投与である。認可された療法の推奨用量は、医師用卓上参考書(Phys
ician's Desk Reference)に見出すことができる。
ある実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワ
クチンは、1以上の追加の療法の投与と同時に対象に投与される。他の実施態様において
、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、3〜7日毎、1〜
6週間毎、1〜5週間毎、1〜4週間毎、2〜4週間毎、1〜3週間毎、又は1〜2週間毎に対象に
投与され、1以上の追加の療法(例えば、下の第5.6.4節に記載されているもの)は、3〜7日
毎、1〜6週間毎、1〜5週間毎、1〜4週間毎、1〜3週間毎、又は1〜2週間毎に投与される。
ある実施態様において毎、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワ
クチンは、1〜2週間毎に対象に投与され、1以上の追加の療法(例えば、下の第5.6.4節に
記載されているもの)は、2〜4週間毎に投与される。いくつかの実施態様において、NDVも
しくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、毎週対象に投与され、
1以上の追加の療法(例えば、下の第5.6.4節に記載されているもの)は、2週間毎に投与さ
れる。
(5.6.3.癌の種類)
本明細書に記載の方法に従って治療することができる癌の具体的な例としては:白血病
、例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、
例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病性白血病、並びに
骨髄異形成症候群;慢性白血病、例えば、限定されないが、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血
病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病;真性赤血球増加症;リンパ腫、例えば、限定
されないが、ホジキン病、非ホジキン病;多発性骨髄腫、例えば、限定されないが、くす
ぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞(placancer cell)白血
病、孤立性形質細胞腫(placancercytoma)、及び髄外性形質細胞腫(placancercytoma);ワ
ルデンストレームマクログロブリン血症;意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症;
良性単クローン性ガンマグロブリン血症;重鎖病;骨肉腫及び結合組織肉腫、例えば、限定
されないが、骨肉腫(bone sarcoma)、骨肉腫(osteosarcoma)、軟骨肉腫、ユーイング肉腫
、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫(angiosarc
oma)(血管肉腫(hemangiosarcoma))、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リ
ンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫;脳腫瘍、例えば、限定されないが、神経
膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、希突起膠腫、非神経膠腫、多形性膠芽腫、聴神
経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫;
限定されないが、腺管癌、腺癌、小葉(癌細胞)癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管
状腺乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、及び炎症性乳癌を含む、乳癌;副腎癌、例えば、
限定されないが、褐色細胞腫(pheochromocytom)及び副腎皮質癌;甲状腺癌、例えば、限定
されないが、乳頭状又は濾胞状甲状腺癌、髄様甲状腺癌、及び未分化甲状腺癌;膵癌、例
えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、
ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド又は島細胞腫瘍;下垂体癌、例えば、限定さ
れないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、及び尿崩症;眼癌、例え
ば、限定されないが、眼メラノーマ、例えば、虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ、及び
毛様体メラノーマ(cilliary body melanoma)、並びに網膜芽腫;膣癌、例えば、扁平上皮
細胞癌、腺癌、及びメラノーマ;外陰癌、例えば、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、
基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病;子宮頸癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細
胞癌及び腺癌;子宮癌、例えば、限定されないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫;卵巣癌、例え
ば、限定されないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、及び間質性腫瘍;食道癌、
例えば、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮
癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫(placancercytoma)、疣状癌、及び燕麦細胞(癌細胞)
癌;胃癌、例えば、限定されないが、腺癌、歯状(ポリープ状)、潰瘍性、表在拡大型、び
まん性拡大型、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫;結腸癌;直腸癌;肝臓
癌、例えば、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽腫;胆嚢癌、例えば、腺癌;胆管癌、例え
ば、限定されないが、乳頭状、結節性、及びびまん性;肺癌、例えば、非小細胞肺癌、扁
平上皮細胞癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌、及び癌細胞肺癌;精巣癌、例えば、限定され
ないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(典型的)、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期
癌、奇形腫癌、絨毛腫(卵黄嚢腫瘍)、前立腺癌、例えば、限定されないが、前立腺上皮内
腫瘍、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫;陰茎癌(penal cancer);口腔癌、例えば、限定
されないが、扁平上皮細胞癌;基底癌;唾液腺癌、例えば、限定されないが、腺癌、粘液性
類表皮癌、及び腺様嚢胞癌;咽頭癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌、及び疣
状;皮膚癌、例えば、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、及びメラノーマ、
表在拡大型メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノ
ーマ;腎臓癌、例えば、限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞
癌(腎盂及び/又は尿管(uterer));ウィルムス腫瘍;膀胱癌、例えば、限定されないが、移
行細胞癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。さら
に、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫(osteogenic sarcoma)、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫
、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、
及び乳頭腺癌が挙げられる(そのような障害の総説については、Fishmanらの文献、1985、
Medicine、第2版、J.B. Lippincott社, Philadelphia、及びMurphyらの文献、1997、イン
フォームド・ディシジョン:癌の診断、治療、及び回復の完全本(Informed Decisions: Th
e Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery)、Viking Penguin, P
enguin Books U.S.A.社, United States of Americaを参照されたい)。
具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラNDVもしくはその組成物、本明細
書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、本明細書中の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併
用療法は、(限定されないが)以下のもの:膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵
臓、胃、頸部、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌;扁平上皮細胞癌を含む;白血病、急性リン
パ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリ
ンパ腫を含むリンパ球系統の造血系腫瘍;急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白
血病を含む骨髄球系統の造血系腫瘍;線維肉腫及び横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含む
間葉起源の腫瘍;メラノーマ、精上皮腫、奇形腫、神経芽腫、及び神経膠腫を含む他の腫
瘍;星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む、中枢及び末梢神経系の腫瘍;線
維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscarama)、及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍;並びにメラ
ノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫(keratoactanthoma)、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、
及び奇形腫を含む他の腫瘍を含む、種々の癌及び異常増殖性疾患の治療において有用であ
る。
いくつかの実施態様において、アポトーシスの異常と関連する癌を、本明細書に記載の
方法に従って治療する。そのような癌としては、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する
癌、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、並びに前癌病変、例えば、家族性腺
腫性ポリポーシス、並びに骨髄異形成症候群を挙げることができるが、これらに限定され
ない。具体的な実施態様において、悪性腫瘍もしくは異常増殖性変化(例えば、化生及び
異形成)、又は皮膚、肺、肝臓、骨、脳、胃、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、
卵巣、及び/もしくは子宮の過剰増殖性障害を、本明細書に記載の方法に従って治療する
。他の具体的な実施態様において、肉腫又はメラノーマを、本明細書に記載の方法に従っ
て治療する。
具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、白血病、
リンパ腫、又は骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)である。本明細書に記載の方法に従って治
療することができる白血病及び他の血行性癌の具体的な例としては、急性リンパ芽球性白
血病「ALL」、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、急性骨髄
芽球性白血病「AML」、急性前骨髄球性白血病「APL」、急性単芽球性白血病、急性赤白血
病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ球性(nonlymp
hocyctic)白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄球性白血病「CML」、慢性リンパ球性白血
病「CLL」、及び有毛細胞白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法に従って治療することができるリンパ腫の具体的な例としては、
ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン
血症、重鎖病、及び真性赤血球増加症が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施態様において、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、固形腫瘍であ
る。本明細書に記載の方法に従って治療することができる固形腫瘍の例としては、線維肉
腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉
腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結
腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔
癌、鼻腔癌、咽喉癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳
頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎
生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、癌細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮
癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管
芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽腫が
挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、本明細書に記載の方法に
従って治療される癌は、転移性である。別の実施態様において、本明細書に記載の方法に
従って治療される癌は、悪性である。
具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、予後が悪
い、並びに/又は化学療法及び放射線などの従来の療法に対する応答が悪い癌である。別
の具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、悪性メラ
ノーマ、悪性神経膠腫、腎細胞癌、膵腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁
平上皮細胞癌、未分化甲状腺癌、及び頭頸部扁平上皮細胞癌である。別の具体的な実施態
様において、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、下の第6節及び/又は第7節
に記載されている種類の癌である。
(5.6.4.追加療法)
癌の治療のために本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又
は全細胞ワクチンと組み合わせて使用することができる追加療法としては、小分子、合成
薬物、ペプチド(環状ペプチドを含む)、ポリペプチド、タンパク質、核酸(例えば、限定
されないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん、RNAi、及び生体活性のあるタ
ンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、DNA及びR
NAヌクレオチド)、抗体、合成又は天然無機分子、模倣剤、並びに合成又は天然有機分子
が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、該追加療法は、化
学療法剤である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性
ワクチン、又は全細胞ワクチンは、x線、γ線、及び癌細胞を破壊する他の放射線源の使
用を含む放射線療法と組み合わせて使用される。具体的な実施態様において、該放射線療
法は、外照射放射線又は遠隔療法として投与され、ここで、放射線は、遠隔源から向けら
れる。他の実施態様において、該放射線療法は、内科療法又は近接照射療法として投与さ
れ、ここで、放射能源は、体内で癌細胞及び/又は腫瘍塊の近くに置かれる。
ある実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチ
ン、又は全細胞癌ワクチンは、養子T細胞療法と組み合わせて使用される。具体的な実施
態様において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、対象から単離され、特定のT細胞又
はクローンがその用途のために拡大された腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの実施態様
において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、患者が癌ワクチンを受けた後に患者の血
液から採取され、使用前にインビトロで拡大されたT細胞である。別の具体的な実施態様
において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、腫瘍を強く認識し、攻撃するように影響
を受けたT細胞である。別の具体的な実施態様において、養子T細胞療法で利用されるT細
胞は、腫瘍抗原特異的T細胞受容体又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子修
飾されている。具体的な実施態様において、利用される養子T細胞療法は、下の第7節に記
載されているものと類似している。
ある実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチ
ン、又は全細胞癌ワクチンは、サイトカインと組み合わせて使用される。具体的な実施態
様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細
胞癌ワクチンは、インターフェロン(例えば、IFN-γ)と組み合わせて使用される。
現在利用可能な癌療法、並びにその投薬量、投与経路、及び推奨使用量は当技術分野で
公知であり、医師用卓上参考書(Physician's Desk Reference)(第67版、2013年)のような
文献に記載されている。
本明細書に記載のNDV又はその組成物と組み合わせて使用し得る抗癌剤の具体的な例と
しては:ホルモン剤(例えば、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体調節因子(S
ERM)、及びエストロゲン受容体アンタゴニスト)、化学療法剤(例えば、微小管分解遮断薬
、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、及びDNA架橋剤又は損傷剤)、抗血管新生剤(例
えば、VEGFアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、血管
標的化剤(VTA)/血管破壊剤(VDA))、放射線療法、並びに従来の外科手術が挙げられる。
本明細書に記載のNDV又はその組成物と組み合わせて使用し得るホルモン剤の非限定的
な例としてはアロマターゼ阻害剤、SERM、及びエストロゲン受容体アンタゴニストが挙げ
られる。アロマターゼ阻害剤であるホルモン剤は、ステロイド性であっても、非ステロイ
ド性であってもよい。非ステロイド性ホルモン剤の非限定的な例としては、レトロゾール
、アナストロゾール、アミノグルテチミド、ファドロゾール、及びボロゾールが挙げられ
る。ステロイド性ホルモン剤の非限定的な例としては、アロマシン(エキセメスタン)、ホ
ルメスタン、及びテストラクトンが挙げられる。SERMであるホルモン剤の非限定的な例と
しては、タモキシフェン(Nolvadex(登録商標)として商標化/市販されている)、アフィモ
キシフェン、アルゾキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレル(femarel
le)、ラソフォキシフェン、オルメロキシフェン、ラロキシフェン、及びトレミフェンが
挙げられる。エストロゲン受容体アンタゴニストであるホルモン剤の非限定的な例として
は、フルベストラントが挙げられる。他のホルモン剤としては、アビラテロン及びロナプ
リサンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチン
と組み合わせて使用し得る化学療法剤の非限定的な例としては、微小管分解遮断薬、代謝
拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、及びDNA架橋剤又は損傷剤が挙げられる。微小管分解
遮断薬である化学療法剤としては、タキセン(taxene)(例えば、パクリタキセル(タキソー
ル(登録商標)として商標化/市販されている)、ドセタキセル、アブサキサン、ラロタキセ
ル、オルタタキセル、及びテセタキセル);エポチロン(例えば、イキサベピロン);並びに
ビンカアルカロイド(例えば、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビンク
リスチン(オンコビン(登録商標))として商標化/市販されている)が挙げられるが、これら
に限定されない。
代謝拮抗薬である化学療法剤としては、葉酸代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、
アミノプテリン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド);プリン代謝拮抗薬(例えば、クラ
ドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグ
アニン);ピリミジン代謝拮抗薬(例えば、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタ
ビン(GEMZAR(登録商標))、シタラビン、デシタビン、フロクスウリジン、テガフール);及
びデオキシリボヌクレオチド代謝拮抗薬(例えば、ヒドロキシウレア)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
トポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤としては、クラスI(カンプトテカ)トポイソ
メラーゼ阻害剤(例えば、トポテカン(HYCAMTIN(登録商標)として商標化/市販されている)
イリノテカン、ルビテカン、及びベロテカン);クラスII(ポドフィルム)トポイソメラーゼ
阻害剤(例えば、エトポシド又はVP-16、及びテニポシド);アントラサイクリン(例えば、
ドキソルビシン、エピルビシン、ドキシル、アクラルビシン、アムルビシン、ダウノルビ
シン、イダルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、及びゾルビシン);並びにアントラセ
ンジオン(例えば、ミトキサントロン及びピクサントロン)が挙げられるが、これらに限定
されない。
DNA架橋剤(又はDNA損傷剤)である化学療法剤としては、アルキル化剤(例えば、シクロ
ホスファミド、メクロレタミン、イホスファミド(IFEX(登録商標)として商標化/市販され
ている)、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベン
ダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン(BiCNU(登録商標)として商
標化/市販されている)、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムス
チン、ストレプトゾシン、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、カルボ
コン、N,N'N'-トリエチレンチオホスホラミド、トリアジコン、トリエチレンメラミン);
アルキル化様剤(例えば、カルボプラチン(PARAPLATIN(登録商標)として商標化/市販され
ている)、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、サト
ラプラチン、ピコプラチン);非古典的DNA架橋剤(例えば、プロカルバジン、ダカルバジン
、テモゾロミド(テモダール(登録商標)として商標化/市販されている)、アルトレタミン
、ミトブロニトール);並びにインターカレート剤(例えば、アクチノマイシン、ブレオマ
イシン、マイトマイシン、及びプリカマイシン)が挙げられるが、これらに限定されない
。
(5.6.4.1 免疫調節因子)
具体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組
成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、以下のもの:当業者に公知の、免疫
細胞(例えば、T-リンパ球、NK細胞、又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロ
ファージ)など)の共刺激シグナルの任意のアゴニスト及び/又は免疫細胞(例えば、T-リン
パ球、NK細胞、又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)など)の抑
制シグナルの任意のアンタゴニストのうちの1つ又は複数と組み合わせて対象に投与され
る。特定の実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組
成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、上の第5.2.1節に記載の免疫細胞の
共刺激シグナルのアゴニストのうちの1つ又は複数と組み合わせて対象に投与される。い
くつかの実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成
物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、上の第5.2.1節に記載の免疫細胞の抑
制シグナルのアンタゴニストのうちの1つ又は複数と組み合わせて対象に投与される。あ
る実施態様において、本明細書に記載のNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、腫
瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、下の第6節及び/又は第7節に記載されている
、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストのうちの1つもしくは複数及び/又は免疫細胞の
抑制シグナルのアンタゴニストのうちの1つもしくは複数(例えば、抗CTLA-4抗体、ICOS-L
、抗PD-1抗体、又は抗PD-L1抗体)と組み合わせて対象に投与される。
(5.7 生物学的アッセイ)
(インビトロウイルスアッセイ)
ウイルスアッセイには、ウイルス複製の変化(例えば、プラーク形成により決定される)
又はウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により決定される)又は
ウイルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を
、当技術分野で周知の方法を用いて、インビトロで、培養細胞で測定するアッセイが含ま
れる。
本明細書に記載のNDVの成長は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の方法
により(例えば、細胞培養(例えば、ニワトリ胚腎臓細胞の培養又はニワトリ胚線維芽細胞
(CEF)の培養)で)評価することができる。ウイルス力価は、本明細書に記載のNDVの段階希
釈液を、細胞培養物(例えば、CEF、MDCK、EFK-2細胞、Vero細胞、初代ヒト臍静脈内皮細
胞(HUVEC)、H292ヒト上皮細胞株、もしくはHeLa細胞)、ニワトリ胚、又は生きた動物(例
えば、鳥)に接種することにより決定することができる。ウイルスを規定の時間インキュ
ベートした後、標準的な方法を用いて、該ウイルスを単離する。ウイルス力価の物理的定
量は、ウイルス上清に適用されるPCR(Quinn & Trevorの文献、1997; Morganらの文献、19
90)、血球凝集アッセイ、組織培養感染用量(TCID50)、又は卵感染用量(EID50)を用いて実
施することができる。ウイルス力価を評価する例示的な方法は、下の第6節及び第7節に記
載されている。
本明細書に記載のキメラNDVのゲノムへの異種ペプチド又はタンパク質(例えば、サイト
カイン、突然変異Fタンパク質、突然変異Vタンパク質、又はmiRNA標的部位)をコードする
ヌクレオチド配列の組込みは、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の方法によ
り(例えば、細胞培養、動物モデル、又は孵化卵中のウイルス培養で)評価することができ
る。例えば、孵化卵の尿膜腔液の細胞培養物由来のウイルス粒子を、スクロースクッショ
ンに通す遠心分離により精製し、その後、当技術分野で周知の方法を用いて、ウェスタン
ブロッティングにより、融合タンパク質発現について解析することができる。
免疫蛍光に基づく手法を用いて、ウイルスを検出し、ウイルス成長を評価することもで
きる。そのような手法は当業者に周知であり、例えば、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメ
トリーがある(下の第6節及び第7節を参照されたい)。
(抗体アッセイ)
本明細書に記載のNDVにより作製される抗体は、当業者に周知の種々の方法(例えば、EL
ISA、表面プラズモン共鳴ディスプレイ(BIAcore)、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫
染色、及び/又は微量中和アッセイ)で特徴付けることができる。特に、本明細書に記載の
キメラNDVにより作製される抗体は、ウイルス抗原又は異種ペプチドもしくはタンパク質
に特異的に結合する能力についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、溶
液中で(例えば、Houghtenの文献、1992, Bio/Techniques 13:412 421)、ビーズ表面で(La
mの文献、1991, Nature 354:82 84)、チップ表面で(Fodorの文献、1993, Nature 364:555
556)、細菌を用いて(米国特許第5,223,409号)、胞子を用いて(米国特許第5,571,698号;
第5,403,484号;及び第5,223,409号)、プラスミドを用いて(Cullらの文献、1992, Proc Na
tl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869)、又はファージを用いて(Scott及びSmithの文献、199
0, Science 249:386 390; Cwirlaらの文献、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378
6382;及びFeliciの文献、1991, J. Mol. Biol. 222:301 310)実施することができる(こ
れらの参考文献の各々は、引用により完全に本明細書中に組み込まれている)。
ウイルス抗原又は異種ペプチドもしくはタンパク質に特異的に結合することが確認され
た本明細書に記載のキメラNDVにより作製される抗体は、該ウイルス抗原又は異種ペプチ
ド又はタンパク質に特異的に結合するその能力についてアッセイすることができる。該抗
体は、ウイルス抗原又は異種ペプチドもしくはタンパク質への特異的結合について及び他
の抗原とのその交差反応性について、当技術分野で公知の任意の方法によりアッセイする
ことができる。特異的結合及び交差反応性を解析するために使用することができる免疫ア
ッセイには、少し例を挙げれば、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ELISA(酵素
結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応
、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線
測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイなどの技術を用いる、競合
的及び非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは
ルーチンであり、かつ当技術分野で周知である(例えば、引用により完全に本明細書中に
組み込まれる、Ausubelら編、1994、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in
Molecular Biology)、第1巻、John Wiley & Sons社, New Yorkを参照されたい)。
抗原に対する抗体の結合親和性及び抗体-抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッ
セイにより決定することができる。或いは、表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIAco
re動態解析)又はKinExAアッセイ(Blake,らの文献、Analytical Biochem., 1999, 272:123
-134)を用いて、本明細書に記載のキメラNDVの抗原に対する抗体の結合速度及び解離速度
を決定することができる。
(IFNアッセイ)
本明細書に記載のNDVによるIFN誘導及び放出は、当業者に公知の又は本明細書に記載の
技術を用いて決定することができる。例えば、本明細書に記載のNDVへの感染後に細胞で
誘導されるIFNの量を、免疫アッセイ(例えば、ELISA又はウェスタンブロットアッセイ)を
用いて決定して、IFN発現を測定し、又はその発現がIFNにより誘導されるタンパク質の発
現を測定することができる。或いは、誘導されるIFNの量は、当業者に公知のアッセイ、
例えば、ノーザンブロット及び定量的RT-PCRにより、RNAレベルで測定することができる
。具体的な実施態様において、放出されるIFNの量は、ELISPOTアッセイを用いて測定する
ことができる。(例えば、下の第6節及び第7節に記載の方法を参照されたい)。さらに、サ
イトカインの誘導及び放出は、例えば、免疫アッセイ又はELISPOTアッセイにより、タン
パク質レベルで、及び/又は定量的RT-PCRもしくはノーザンブロットにより、RNAレベルで
決定することができる。サイトカイン誘導及び放出を測定するためのアッセイに関しては
、下の第6節及び/又は第7節を参照されたい。
(活性化マーカーアッセイ)
免疫細胞による活性化マーカー、共刺激分子、リガンド、又は抑制性分子の発現を評価
するための技術は、当業者に公知である。例えば、免疫細胞(例えば、Tリンパ球又はNK細
胞)による活性化マーカー、共刺激分子、リガンド、又は抑制性分子の発現は、フローサ
イトメトリーにより評価することができる。具体的な実施態様において、下の第6節及び/
又は第7節に記載の技術を用いて、免疫細胞による活性化マーカー、共刺激分子、リガン
ド、又は抑制性分子の発現を評価する。
(免疫細胞浸潤アッセイ)
免疫細胞浸潤を評価するための技術は、当業者に公知である。具体的な実施態様におい
て、下の第6節及び/又は第7節に記載の技術を用いて、免疫細胞浸潤を評価する。
(毒性研究)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、本明細書に
記載の腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併
用療法を、細胞傷害性について、哺乳動物、好ましくは、ヒト細胞株で試験する(例えば
、下の第6節及び/又は第7節に記載の細胞傷害性アッセイを参照されたい)。ある実施態様
において、細胞傷害性を、1以上の以下の非限定的な細胞株例で評価する:U937、ヒト単球
細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC);Huh7、ヒト肝芽腫細胞株;HL60細胞、HT1080、HEK 293
T、及び293H、MLPC細胞、ヒト胚性腎臓細胞株;ヒトメラノーマ細胞株、例えば、SkMel2、
SkMel-119、及びSkMel-197;THP-1、単球細胞;HeLa細胞株;並びに神経芽腫細胞株、例えば
、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、及びBE(2)-C。ある実施態様において
、細胞傷害性を様々な癌細胞で評価する。いくつかの実施態様において、ToxLiteアッセ
イを用いて、細胞傷害性を評価する。
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、本明細書に記載のNDVもしくはその組成
物への感染、又は本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載の全細胞ワクチ
ン、もしくは本明細書に記載の併用療法による処理の後の細胞又は細胞株の生存を評価し
、それにより、該NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は
併用療法の細胞傷害性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウ
リジン(BrdU)の取込み、(3H)チミジンの取込みを測定することによるか、直接的な細胞カ
ウントによるか、又は既知の遺伝子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細
胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活
性の変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmR
NA及び活性のレベルは、当技術分野で周知の任意の方法により決定することができる。例
えば、市販の抗体を含む抗体を用いる公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタン
ブロッティング、又は免疫沈降により、タンパク質を定量することができる。当技術分野
で周知かつルーチンの方法を用いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写
と関連するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞の生存は
、トリパンブルー染色又は当技術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価するこ
とができる。具体的な実施態様において、細胞のATPレベルを測定して、細胞の生存を決
定する。好ましい実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶
解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法は、癌細胞を死滅させるが、健常(すなわ
ち、非癌)細胞を死滅させない。一実施態様において、本明細書に記載のNDVもしくはその
組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法は、癌細胞を優先的に死滅
させるが、健常(すなわち、非癌)細胞を死滅させない。
具体的な実施態様において、細胞の生存は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野
で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及
び7日の期間で測定される。細胞ATPの低下は、細胞毒性効果を示すものである。別の具体
的な実施態様において、細胞の生存は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定するこ
とができる。他の実施態様において、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザ
の縁を有する細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含ま
れ得る。
本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又
は併用療法を、インビボ毒性について、動物モデルで試験することができる(例えば、下
の第6節及び/又は第7節に記載の動物モデルを参照されたい)。例えば、癌に対する化合物
の効果を試験するために使用される、本明細書に記載の動物モデル及び/又は当技術分野
で公知の他のものを用いて、本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワク
チン、全細胞ワクチン、又は併用療法のインビボ毒性を決定することもできる。例えば、
動物に、様々なpfuの本明細書に記載のNDV(例えば、下の第5.2節に記載のキメラNDV)を投
与する。その後、該動物を、致死率、体重減少もしくは体重増加失敗、及び/又は組織損
傷を示し得る血清マーカーのレベル(例えば、全般的な組織損傷の指標としてのクレアチ
ンホスホキナーゼレベル、肝損傷の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランス
アミナーゼ又はピルビン酸トランスアミナーゼのレベル)について経時的にモニタリング
する。これらのインビボアッセイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメン
の毒性を試験するために適合させることができる。
本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、本
明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法の毒性及び/又は効力は
、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED50(集団の50％で治療的に有効な用量)
を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定する
ことができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED5
0と表すことができる。大きい治療指数を示す療法が好ましい。毒性のある副作用を示す
療法を使用してもよいが、非癌細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより、
副作用を軽減するために、そのような療法を罹患組織の部位にターゲッティングする送達
系を設計するよう、注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、対象で使用される療法の投薬量
の範囲を定める際に使用することができる。そのような薬剤の投薬量は、循環濃度の範囲
内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が含まれる。
投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異なり得る。
本明細書に記載の任意の療法について、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に推
定することができる。用量を動物モデルで定めて、循環血漿濃度範囲を得ることができ、
この循環血漿濃度範囲には、細胞培養で決定されるIC50(すなわち、症状の半最大阻害を
達成するキメラNDVの濃度)が含まれる。そのような情報を用いて、対象での有用な用量を
より正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフ
ィーにより測定することができる。
(抗癌研究)
本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、本
明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法は、癌の動物モデルを用
いて、生物学的活性について試験することができる。そのような動物モデル系としては、
ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これ
らに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載のNDV又は併用療法の抗
癌活性は、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く使用され、当業者に
周知であり、例えば、SCIDマウスモデル又はトランスジェニックマウスがある。
本明細書に記載のNDVもしくはその組成物、本明細書に記載の腫瘍溶解物ワクチン、本
明細書に記載の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載の併用療法の抗癌活性は、該NDVも
しくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法を動物モデルに
投与し、該NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療
法が、癌の重症度の軽減、癌の症状の軽減、癌転移の減少、及び/又は該動物モデルの腫
瘍サイズの減少に効果的であることを立証することにより決定することができる(例えば
、下の第6節及び/又は第7節を参照されたい)。一般的な癌の動物モデルの例としては、コ
ンパニオン動物の自然発生腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Vail &
MacEwenの文献、2000, Cancer Invest 18(8):781-92を参照されたい)。肺癌の動物モデル
の例としては、Zhang & Rothらの文献(1994, In-vivo 8(5):755-69)に記載の肺癌動物モ
デル及びp53機能が破壊されたトランスジェニックマウスモデル(例えば、Morrisらの文献
、1998, J La State Med Soc 150(4):179-85参照)が挙げられるが、これらに限定されな
い。乳癌の動物モデルの例としては、サイクリンD1を過剰発現するトランスジェニックマ
ウスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Hosokawaらの文献、2001, Transge
nic Res 10(5):471-8を参照されたい)。結腸癌の動物モデルの例としては、TCR b及びp53
の二重ノックアウトマウスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Kadoらの文
献、2001, Cancer Res. 61(6):2395-8を参照されたい)。膵癌の動物モデルの例としては
、PancO2マウス膵腺癌の転移モデル(例えば、Wangらの文献、2001, Int. J. Pancreatol.
29(1):37-46参照)及び皮下膵臓腫瘍で作製されたnu-nuマウス(例えば、Ghanehらの文献
、2001, Gene Ther. 8(3):199-208参照)が挙げられるが、これらに限定されない。非ホジ
キンリンパ腫の動物モデルの例としては、重症複合免疫不全(「SCID」)マウス(例えば、B
ryantらの文献、2000, Lab Invest 80(4):553-73参照)及びIgHmu-HOX11トランスジェニッ
クマウス(例えば、Houghらの文献、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23):13853-8
参照)が挙げられるが、これらに限定されない。食道癌の動物モデルの例としては、ヒト
パピローマウイルス16型E7癌遺伝子が遺伝子導入されたマウスが挙げられるが、これらに
限定されない(例えば、Herberらの文献、1996, J. Virol. 70(3):1873-81を参照されたい
)。結腸直腸癌の動物モデルの例としては、Apcマウスモデルが挙げられるが、これらに限
定されない(例えば、Fodde & Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8):369 73及びKuraguchi
らの文献、2000を参照されたい)。具体的な実施態様において、下の第6節及び/又は第7節
に記載の癌の動物モデルを用いて、NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物、全細胞ワクチ
ン、又は併用療法の有効性を評価する。
(6.実施例1)
本実施例は、癌の治療において免疫賦活作用がある免疫チェックポイント調節因子と組
み合わせたNDV療法の治療効果を示している。
(6.1 材料及び方法)
(マウス)
BALB/cマウス(6〜8週齢)及びWT C57BL/6マウスは、Jackson Laboratoryから購入した。
全てのマウスをマイクロアイソレーターケージで維持し、NIH及び米国実験動物管理協会(
American Association of Laboratory Animal Care)の規制に従って処置した。本研究の
ための全てのマウス処置及び実験は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター施設
動物管理及び使用委員会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Anim
al Care and Use Committee)による承認を受けた。
(細胞株)
メラノーマのマウス癌細胞株(B16-F10)並びに結腸癌のマウス癌細胞株(CT26及びMC38)
を、10％胎仔ウシ血清及びペニシリンがストレプトマイシンとともに補充されたRPMI培地
中で維持した。マウス前立腺癌細胞株TRAMP-C2を、5％胎仔ウシ血清(FCS; Mediatech社)
、5％Nu血清IV(BD Biosciences)、HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5μg/mLインスリン
(Sigma)、及び10nmol/L DHT(Sigma)が補充されたDMEM培地中で維持した。
(抗体)
治療用の抗CTLA-4(クローン9H10)、抗PD-1(クローンRMP1-14)、及び抗PD-L1モノクロー
ナル抗体は、BioXcellにより産生された。フローサイトメトリーに使用される抗体は、eB
ioscience、Biolegend、Invitrogen、及びBD Pharmingenから購入した。
(ウイルス及びクローニング)
組換え長潜伏期性NDV LaSota株を全ての実験に使用した。マウスICOSLを発現するNDVウ
イルスを作製するために、適当なNDV特異的RNA転写シグナルが両側に配置されたマウスIC
OSLをコードするDNA断片を、pT7NDV/LSのP遺伝子とM遺伝子の間に作出されたSacII部位に
挿入した。ウイルスを、先に記載されている方法を用いてcDNAからレスキューし、インサ
ートの忠実度について逆転写PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を段階希釈
及びVero細胞における免疫蛍光により決定した。組換えICOSL-F融合コンストラクトを、
細胞外ドメイン(アミノ酸1〜277)をコードし、EcoRI及びMluI制限部位を両側に有するICO
SL DNA、並びにF膜貫通及び細胞内ドメイン(アミノ酸501〜554)をコードし、MluI及びXho
I制限部位を両側に有するNDV F DNAのPCR増幅により作製した。得られたDNA断片を、3部
分ライゲーションを用いて、pCAGGSベクター中で組み合わせた。
(インビトロ感染実験)
NDVによる表面MHC-I、MHC-II、及びICAM-1の上方調節の評価のために、並びにNDV-ICOS
LウイルスからのICOSL導入遺伝子の表面発現の評価のために、B16-F10細胞を、6ウェルデ
ィッシュ中、MOI 2で、3連で感染させた。24時間後、細胞を機械的剥離により回収し、表
面標識及びフローサイトメトリーによる定量用に処理した。ウイルス成長曲線実験のため
に、B16-F10細胞を、室温で、ウイルスとともに、6ウェル培養デュッシュ中、表示された
MOIで、100μlの全容量でインキュベートした。インキュベーションから1時間後、感染培
地を吸引し、細胞を、10％ニワトリ尿膜腔液を含む1mlのDMEM中、37℃でインキュベート
した。24、48、及び72時間後、上清を回収し、ウイルス力価を上記のように決定した。イ
ンビトロ細胞傷害実験のために、感染を同様の様式で実施した。感染から24、48、72、及
び96時間後、細胞を洗浄し、1％Triton X-100とともに、37℃で30分間インキュベートし
た。溶解物中のLDH活性を、製造元の指示に従って、Promega CytoTox 96アッセイキット
を用いて決定した。
(腫瘍投与生存実験)
注射を受けた腫瘍と全身腫瘍の両方における治療効果についてモニタリングするために
、両側腹腫瘍モデルを樹立した。単剤としてのNDV又は抗CTLA-4/抗PD-1による10〜20％の
腫瘍クリアランスを達成するために、処置スケジュール及び細胞用量を各々の腫瘍モデル
について確立した。野生型NDV(NDV-WT)と免疫チェックポイント遮断との併用療法を評価
する実験については、0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に5×1
04個の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、10、13、及び16
日目に、PBS中の2×107pfuのNDVを100μlの全容量で4回腫瘍内注射することにより、マウ
スを処置した。同時に、7、10、13、及び16日目に、マウスに、抗CTLA-4抗体(100μg)又
は抗PD-1抗体(250μg)の腹腔内注射を4回受けさせた。対照群には、対応する用量のアイ
ソタイプ抗体の腹腔内注射及びPBSの腫瘍内注射を受けさせた。腫瘍サイズ及び発生率を
、キャリパーを用いた測定により、経時的にモニタリングした。
TRAMP-C2モデルについては、0日目に5×105個の細胞を右側腹に移植し、8日目に5×105
個の細胞を左側腹に移植した。処置を、上記と同様の様式で、11、14、17、及び20日目に
実施した。
ICOSLを発現する組換えNDV(NDV-ICOSL)を評価する実験については、0日目に2×105個の
B16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に1×105個の細胞を左側腹に注射することによ
り、B16F10腫瘍を移植した。処置を上記の通りに実施した。
CT26モデルについては、0日目に1×106個のCT26細胞を右側腹に皮内注射し、2日目に1
×106個の細胞を左側腹に注射することにより、腫瘍を移植した。処置を、上記の通りに
、6、9、及び12日目に実施した。
(腫瘍浸潤リンパ球の単離)
0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に2×105個の細胞を左側腹
に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、10、及び13日目に、マウスを、2×10
7pfuのNDVの3回の腫瘍内注射、及び指定されている場合、100μgの抗CTLA-4抗体の腹腔内
注射又は250μgの抗PD-1抗体の腹腔内注射で処置した。15日目に、マウスをCO2吸入によ
り屠殺した。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節を、鉗子及び手術鋏を用いて摘出し、計量し
た。各々の群由来の腫瘍を鋏で細かく刻んだ後、1.67 Wunsch U/mLのリベラーゼ及び0.2m
g/mLのDNアーゼとともに、37℃で30分間インキュベートした。腫瘍をピペッティングの繰
り返しによりホモジナイズし、70-μmナイロンフィルターに通して濾過した。細胞懸濁液
をコンプリートRPMIで1回洗浄し、Ficoll勾配で純化して、死細胞を除去した。腫瘍流入
領域リンパ節由来の細胞は、該リンパ節を70-μmナイロンフィルターに通してすり潰すこ
とにより単離した。
(フローサイトメトリー)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節から単離された細胞を、CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、P
D-1、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C、及びLy6Gを染色するいくつかの
抗体パネルによる表面標識用に処理した。固定可能な生死判定色素eFluor780(eBioscienc
e)を用いて、生細胞を識別した。細胞を、FoxP3固定及び透過処理キット(eBioscience)を
用いてさらに透過処理し、Ki-67、FoxP3、グランザイムB、CTLA-4、及びIFNγについて染
色した。データを、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて取得し、FlowJ
oソフトウェア(Treestar)を用いて解析した。
(DC純化及びローディング)
未感作マウス由来の脾臓を単離し、37℃で30分間、1.67 Wunsch U/mLのリベラーゼ及び
0.2mg/mLのDNアーゼで消化した。得られた細胞懸濁液を70umナイロンフィルターに通して
濾過し、コンプリートRPMIで1回洗浄した。CD11c+樹状細胞を、Miltenyi磁気ビーズを用
いる陽性選択により純化した。単離された樹状細胞を組換えGM-CSF及びB16-F10腫瘍溶解
物とともに一晩培養し、Ficoll勾配で純化した。
(サイトカイン産生の解析)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞懸濁液をプールし、Miltenyi T細胞純化キッ
トを用いて、T細胞について濃縮した。単離されたT細胞を計数し、B16-F10腫瘍細胞溶解
物をロードした樹状細胞と、20U/ml IL-2(R and D)＋ブレフェルジンA(BD Bioscience)の
存在下で、8時間共培養した。再刺激後、リンパ球を、上記のように、フローサイトメト
リー用に処理した。
(統計)
データを両側スチューデントt検定により解析し、P＜0.05を統計的有意とみなした。
(6.2 結果)
ニューカッスル病ウイルス(NDV)感染により誘導される抗腫瘍免疫応答を特徴付けるた
めに、インビトロ感染細胞の表面でのMHC I及びMHC II分子並びにICAM-1の発現を評価し
た。図1に示すように、B16メラノーマ細胞へのNDV感染は、MHCクラスI及びII分子並びに
接着分子ICAM-1の上方調節を誘導する。これらの分子は全て、腫瘍特異的リンパ球の動員
及び抗腫瘍免疫応答の活性化に重要であると考えられている。次に、インビボでのNDV感
染により誘導される抗腫瘍免疫応答をマウスメラノーマモデルで評価し、ウイルス注射を
受けた腫瘍とウイルスを受容していない遠位腫瘍の両方における応答のモニタリングを可
能にする2側腹モデルを樹立した。図2に示すように、ウイルス感染腫瘍は、NK細胞、マク
ロファージ、並びにCD8及びCD4細胞などの免疫細胞の劇的な浸潤を示すが、調節性T細胞
の浸潤は示さない。この免疫応答の一部は、腫瘍ではなく、ウイルスに対する応答であり
得るので、対側腫瘍に対する免疫応答を評価した(図3)。興味深いことに、これらの腫瘍
は、同程度のCD8及びCD4エフェクターの増加を示したが、T reg浸潤物の増加は示さなか
った。これらの細胞の解析により、それらが、活性化、増殖、及び溶解マーカーを上方調
節することが明らかになった(図4)。NDV単剤療法は、処置を受けた腫瘍の制御に効果的で
あったが(図5A)、対側腫瘍の成長をごくわずかしか減速させなかった(図5B)。しかしなが
ら、腫瘍を排除したマウスは、さらなる腫瘍投与に対するある程度の防御を示し(図5D)、
NDV療法が持続的免疫を誘導し得ることを示唆した。
次に、さらなるメカニズムを標的にして、NDVが生じさせる抗腫瘍効果を増強すること
ができるかどうかを評価した。NDVを注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方に由
来する腫瘍浸潤リンパ球の特徴付けにより、リンパ球上の抑制受容体CTLA-4の上方調節が
明らかになった(図6)。その後、CTLA-4受容体の阻害がNDVのより良好な治療効果をもたら
し得るかどうかを評価した。注目すべきことに、併用療法は、大多数の動物で両側腫瘍の
拒絶をもたらし、これは、どちらかの処置だけでは見られない効果であった(図7)。この
効果は、ウイルス感染を起こしにくい前立腺腺癌TRAMPモデルを用いた場合にも存在し(図
8)、最小限のウイルス複製及び結果として生じる炎症応答が防御的抗腫瘍免疫の生成に十
分であることを示唆した。
NDV療法と組み合わせた他の免疫チェックポイントの標的化が有益であり得るかどうか
を明らかにするために、NDV感染後のPD-1−PD-L1経路に対する効果を評価した。図9に示
すように、インビトロとインビボの両方におけるNDV感染腫瘍細胞は、該細胞の表面での
抑制性PD-L1リガンドの発現を上方調節していた。この効果は、直接的なウイルス感染の
結果であっただけでなく、非感染細胞をウイルス感染細胞由来のUV不活化上清で処理した
場合にも(図9B)、対側非感染腫瘍でも(図9C)見られた。これにより、NDVと抗PD-1抗体に
よる併用療法を検討することになった。CTLA-4遮断と同様、侵襲性B16メラノーマモデル
における抗PD-1と組み合わせたNDV療法は、大多数の動物に治癒をもたらし、これは、エ
フェクターリンパ球の活性化とともに腫瘍浸潤の増大を伴う効果であった(図10)。
実施された研究の全体を通して、併用療法の治療効果は、より大きな腫瘍投与を使用し
た場合に減少した。次に、より良好な応答を予測し得る及び治療効果のさらなる改善のた
めに標的とし得る活性化マーカーを評価した。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節から単離さ
れたリンパ球の解析により、共刺激分子ICOSの上方調節が処置を受けた動物における活性
化マーカーの1つであると確認された(図11)。ICOS上方調節は、悪性メラノーマに対する
抗CTLA-4療法で処置された患者のより持続的な治療応答及び生存の増加と関連することが
以前に示されている。ICOSリガンド(ICOSL)の腫瘍内発現が併用療法の治療応答をさらに
強化し得るかどうかを評価した。NDVに対してリバースジェネティックスシステムを用い
て、マウスICOSLを発現するNDV(NDV-ICOSL)を作製した。該ウイルスのインビトロでの特
徴付けにより、それが、親NDV株と同様の複製及び溶解特性を有することが明らかになっ
た(図12)。しかしながら、より大きなB16腫瘍投与を用いて、インビボで試験したとき、N
DV-ICOSLは、大多数の処置を受けた動物の長期生存とともに、CTLA-4遮断と組み合わせて
使用したときの親NDVウイルスに優る重大な利点を示した(図13)。この効果は、B16メラノ
ーマに限定されるものではなく、Balb/Cマウス系統のCT26結腸癌についても示され、この
治療戦略が様々な腫瘍型に転用可能であり得ることが示唆された(図14)。処置を受けた動
物由来のB16腫瘍の解析により、活性化マーカーの上方調節を伴う様々な免疫細胞亜型の
顕著な浸潤が示された(図15及び16)。これらのリンパ球は腫瘍特異的であり、腫瘍溶解物
をロードした樹状細胞による刺激に応答したIFNγの分泌を示した(図17)。最後に、そのB
16又はCT26腫瘍が治癒した動物に腫瘍細胞を再投与すると、腫瘍再投与に対する完全な防
御を示した(図18)。
腫瘍内でのICOSLの発現をさらに向上させるために、及び該リガンドをビリオンに取り
込ませるために、ICOSLの細胞外ドメイン(アミノ酸1〜277)並びにNDV Fタンパク質の膜貫
通及び細胞内ドメイン(アミノ酸501〜554)からなるキメラタンパク質を作製した(図19A)
。得られたコンストラクトのB16-F10細胞へのトランスフェクションは、トランスフェク
トされた天然ICOSLと比較して、トランスフェクトされた細胞の表面でのキメラICOSL-Fリ
ガンドの発現を増大させ、表面へのNDV Fタンパク質の輸送を支配する調節メカニズムを
利用して、免疫刺激リガンドの表面発現を増大させることができることが示唆された(図1
9B)。
全体的に見て、これらの研究は、1) NDVと免疫チェックポイント調節抗体との組合せを
、腫瘍溶解性ウイルス療法と抗体療法の両方の限界を回避する戦略として使用することが
できること;及び2)特に、免疫調節抗体と組み合わせて使用した場合、NDVによる免疫刺激
リガンドの発現が該ウイルスの治療効果をさらに向上させることを示している。これらの
研究結果には臨床応用性がある。
(7.実施例2)
本実施例は、CTLA-4遮断と組み合わせた腫瘍溶解性NDVにより誘導される抗腫瘍免疫応
答及びNDVにより誘導される抗腫瘍応答を示している。
(7.1 材料及び方法)
(マウス)
C57BL/6Jマウス及びBalb/Cマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。C57BL/6Jバッ
クグラウンドのIFNAR-/-マウスは、Eric Pamer博士の好意による寄贈品であった。Pmel-1
及びTrp-1 TCRトランスジェニックマウスは報告されており(Overwijkらの文献、2003, J.
Exp. Med, 198:568, Muranskyらの文献、2008, Blood 112:362)、N. Restifo(National
Cancer Institute, Bethesda, MD)により提供された。Trp1マウスを、MD Anderson Cance
r Center(Houston, TX)のPatrick Hwuにより提供されたCD2:ルシフェラーゼマウスと交配
させ、Trp1ルシフェラーゼ+(Trp1-Fluc)マウスを作出した。全てのマウスをマイクロアイ
ソレーターケージで維持し、NIH及び米国実験動物管理協会(American Association of La
boratory Animal Care)の規制に従って処置した。本研究のための全てのマウス処置及び
実験は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター施設動物管理及び使用委員会(Mem
orial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)
による承認を受けた。
(細胞株)
メラノーマのマウス癌細胞株(B16-F10)、並びに結腸癌のマウス癌細胞株(CT26及びMC38
)を、10％胎仔ウシ血清及びペニシリンがストレプトマイシンとともに補充されたRPMI培
地中で維持した。マウス前立腺癌細胞株TRAMP-C2を、5％胎仔ウシ血清(FCS; Mediatech社
)、5％Nu血清IV(BD Biosciences)、HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5μg/mLインスリ
ン(Sigma)、及び10nmol/L DHT(Sigma)が補充されたDMEM培地中で維持した。
(抗体)
治療用の抗CTLA-4(クローン9H10)、抗PD-1(クローンRMP1-14)、抗PD-L1(クローン9G2)
、抗CD8(クローン2.43)、抗CD4(クローンGK1.5)、抗IFN-γ(クローンXMG1.2)、及び抗NK1
.1(クローンPK136)モノクローナル抗体は、BioXcellにより産生された。フローサイトメ
トリーに使用される抗体は、eBioscience、Biolegend、Invitrogen、及びBD Pharmingen
から購入した。
(ウイルス及びクローニング)
組換え長潜伏期性NDV LaSota株を全ての実験に使用した。マウスICOSLを発現するNDVウ
イルスを作製するために、適当なNDV特異的RNA転写シグナルが両側に配置されたマウスIC
OSLをコードするDNA断片を、pT7NDV/LSのP遺伝子とM遺伝子の間に作出されたSacII部位に
挿入した。ウイルスを、先に記載されている方法を用いてcDNAからレスキューし、インサ
ートの忠実度について逆転写PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を段階希釈
及びVero細胞における免疫蛍光により決定した。組換えICOSL-F融合コンストラクトを、E
coRI及びMluI制限部位を両側に有する、細胞外ドメイン(アミノ酸1〜277)をコードするIC
OSL DNA、並びにMluI及びXhoI制限部位を両側に有する、F膜貫通及び細胞内ドメイン(ア
ミノ酸501〜554)をコードするNDV F DNAのPCR増幅により作製した。得られたDNA断片を、
3部分ライゲーションを用いて、pCAGGSベクター中で組み合わせた。組換え抗マウスCD28s
cfv-F融合コンストラクトを、ハムスター抗CD28scfvをコードし、EcoRI及びMluI制限部位
を両側に有するcDNA、並びにF膜貫通及び細胞内ドメイン(アミノ酸501〜554)をコードし
、MluI及びXhoI制限部位を両側に有するNDV F DNAのPCR増幅により作製した。得られたDN
A断片を、3部分ライゲーションを用いて、pCAGGSベクター中で組み合わせ、その後、P遺
伝子とM遺伝子の間でpNDVベクターにサブクローニングした。他のキメラタンパク質(HN-G
ITRL、HN-4-1BBL、HN-CD40L、HN-OX40L)を発現する組換えウイルスを作製するために、各
々の遺伝子の細胞外ドメイン(図44)をコードするcDNAを、EcoRI及びMluI制限部位を両側
に有する遺伝子特異的プライマーで増幅させ、HNタンパク質の膜貫通及び細胞内ドメイン
を、MluI及びXhoI制限部位を両側に有する特異的プライマーで増幅させた。全長キメラ遺
伝子を、3部分ライゲーションを用いて、pCAGGSベクター中で組み合わせ、その後、P遺伝
子とM遺伝子の間でNDVベクターにサブクローニングした。各々のキメラコンストラクトの
詳細を図44に示す。マウスIL-2、IL-15、及びIL-21をコードする組換えNDVを作製するた
めに、各々の遺伝子のcDNAを、SacII制限部位を両側に有する遺伝子特異的プライマーで
増幅させ、その後、P遺伝子とM遺伝子の間でpNDVにクローニングした。ウイルスを、先に
記載されている方法を用いてcDNAからレスキューし、インサートの忠実度について逆転写
PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を段階希釈及びVero細胞における免疫蛍
光により決定した。
(インビトロ感染実験)
細胞表面標識のために、細胞を、6ウェルディッシュ中、MOI 2(B16-F10)又はMOI 5(TRA
MP C2)で、3連で感染させた。24時間後、細胞を剥離により回収し、表面標識及びフロー
サイトメトリーによる定量用に処理した。インビトロ細胞傷害実験のために、細胞を表示
されたMOIで感染させ、250ng/ml TPCKトリプシンの存在下、無血清培地中、37℃でインキ
ュベートした。感染から24、48、72、及び96時間後、細胞を洗浄し、1％Triton X-100と
ともに、37℃で30分間インキュベートした。溶解物中のLDH活性を、製造元の指示に従っ
て、Promega CytoTox 96アッセイキットを用いて決定した。
(腫瘍投与生存実験)
注射を受けた腫瘍と全身腫瘍の両方における治療効果についてモニタリングするために
、両側腹腫瘍モデルを樹立した。単剤としてのNDV又は抗CTLA-4による10〜20％の腫瘍ク
リアランスを達成するために、処置スケジュール及び細胞用量を各々の腫瘍モデルについ
て確立した。NDVと抗CTLA-4抗体との併用療法を評価する実験については、0日目に2×105
個のB16-F10F10細胞を右側腹に皮内(i.d.)注射し、4日目に5×104個の細胞を左側腹に注
射することにより、B16-F10腫瘍を移植した。7、9、11、及び13日目に、PBS中の2×107pf
uのNDVを100μlの全容量で腫瘍内注射することにより、マウスを処置した。同時に、7、9
、11、及び13日目に、マウスに、抗CTLA-4抗体(100μg)、抗PD-1抗体(250μg)、又は抗PD
-L1抗体(250μg)の腹腔内(i.p.)注射を受けさせた。対照群には、対応する用量のアイソ
タイプ抗体の腹腔内注射及びPBSの腫瘍内注射を受けさせた。苦痛の兆候があるか又は全
腫瘍容積が1000mm3に達した場合、動物を安楽死させた。免疫細胞の除去のために、マウ
スに、腫瘍投与の1日前及び2日後に、500μgのCD8+、CD4+、NK1.1、又はIFNγに対するモ
ノクローナル抗体を腹腔内注射し、その後、実験の全体を通して5日おきに、250μgを注
射した。TRAMP-C2モデルについては、0日目に1×106個の細胞を右側腹に移植し、4日目に
5×105個の細胞を左側腹に移植した。処置を、上記と同様の様式で、7、10、13、及び16
日目に実施した。CT26モデルについては、0日目に1×106個のCT26細胞を右側腹に皮内注
射し、2日目に1×106個の細胞を左側腹に注射することにより、腫瘍を移植した。処置を
、上記の通りに、6、9、及び12日目に実施した。ICOSL、4-1BBL、OX40L、CD40L、GITRL、
抗CD28scfv、IL-2、IL-15、及びIL-21を発現する組換えNDV(NDV-導入遺伝子)を評価する
実験については、0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹の皮内注射し、4日目に1×105個
の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植する。7、9、11、及び13日目に
、PBS中の2×107pfuのNDVを100μlの全容量で腫瘍内注射することにより、マウスを処置
する。同時に、7、9、11、及び13日目に、マウスに、抗CTLA-4抗体(100μg)、抗PD-1抗体
(250μg)、又は抗PD-L1抗体(250μg)の腹腔内(i.p.)注射を受けさせる。
(Trp1リンパ球及びPmelリンパ球の単離及び養子移植)
トランスジェニックマウス由来の脾臓及びリンパ節を単離し、70-umナイロンフィルタ
ーに通してすり潰した。CD4+及びCD8+細胞を、Miltenyi磁気ビーズを用いる陽性選択によ
り純化した。
単離されたTrp1細胞又はPmel細胞を、それぞれ、マウス1匹当たり2.5×104細胞及びマ
ウス1匹当たり1×106細胞で、表示されたスケジュールで、尾静脈経由でレシピエント動
物に注射した。
(血清移植実験)
腫瘍担持マウスの群をNDV又はPBSの単回注射で腫瘍内処置した。4日目に、血液を終末
採血により回収し、血清を遠心分離により単離した。血清を各々の群からプールし、Stra
talinker 1800にて300mJ/cm2のUV光の6回のパルスでUV処理して、存在する可能性がある
全てのウイルスを不活化した。1日おきに施される合計3回の注射については、100μlの未
希釈の血清を未感作B16-F10腫瘍担持マウスに腫瘍内注射した。最後の注射から3日後に腫
瘍を摘出し、下記の通りに、腫瘍浸潤リンパ球の単離用に処理した。
(生体発光イメージング)
6日目から2〜3日おきに、マウスをイメージングした。マウスに、PBS中の50μlの40mg/
ml D-ルシフェリン(Caliper Life Sciences)を後眼窩から注射し、IVISイメージングシス
テム(Caliper Life Sciences)を用いてすぐにイメージングした。グレースケール画像と
生体発光カラー画像を、The Living Image、バージョン4.0(Caliper Life Sciences)ソフ
トウェアオーバーレイを用いて重ね合せた。対象領域(ROI)を腫瘍にわたって手動で選択
し、ROIの面積を一定にした。
(腫瘍浸潤リンパ球の単離)
0日目に2×105個のB16-F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に2×105個の細胞を左側
腹に注射することにより、B16-F10腫瘍を移植した。7、9、及び11日目に、マウスを、2×
107pfuのNDVの腫瘍内注射、及び指定されている場合、抗CTLA-4抗体又は抗PD-1抗体の腹
腔内注射で処置した。腫瘍負荷が原因で死んだ数少ない動物(常に未処置対照群に含まれ
る)又は腫瘍を完全に除去した動物(常に処置群に含まれる)は、解析に使用しなかった。1
5日目に、マウスを屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節を、鉗子及び手術鋏を用いて
摘出し、計量した。各々の群由来の腫瘍を鋏で細かく刻んだ後、1.67 Wunsch U/mLのリベ
ラーゼ及び0.2mg/mLのDNアーゼとともに、37℃で30分間インキュベートした。腫瘍をピペ
ッティングの繰り返しによりホモジナイズし、70-μmナイロンフィルターに通して濾過し
た。細胞懸濁液をコンプリートRPMIで1回洗浄し、Ficoll勾配で純化して、死細胞を除去
した。腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞は、該リンパ節を70-μmナイロンフィルターに通
してすり潰すことにより単離した。
(フローサイトメトリー)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節から単離された細胞を、CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、I
COS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C、及びLy6Gを染色するいくつかの抗体パ
ネルによる表面標識用に処理した。固定可能な生死判定色素eFluor506(eBioscience)を用
いて、生細胞を識別した。細胞を、FoxP3固定及び透過処理キット(eBioscience)を用いて
さらに透過処理し、Ki-67、FoxP3、グランザイムB、CTLA-4、及びIFNγについて染色した
。データは、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して取得し、FlowJoソ
フトウェア(Treestar)を使用して分析した。
(DC純化及びローディング)
未感作マウス由来の脾臓を単離し、37℃で30分間、1.67 Wunsch U/mLのリベラーゼ及び
0.2mg/mLのDNアーゼで消化した。得られた細胞懸濁液を70umナイロンフィルターに通して
濾過し、コンプリートRPMIで1回洗浄した。CD11c+ DCを、Miltenyi磁気ビーズを用いる陽
性選択により純化した。単離されたDCを組換えGM-CSF及びB16-F10腫瘍溶解物とともに一
晩培養し、Ficoll勾配で純化した。
(サイトカイン産生の解析)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞懸濁液をプールし、Miltenyi T細胞純化キッ
トを用いて、T細胞について濃縮した。単離されたT細胞を計数し、B16-F10腫瘍細胞溶解
物をロードしたDCと、20U/ml IL-2(R and D)＋ブレフェルジンA(BD Bioscience)の存在下
で、8時間共培養した。再刺激後、リンパ球を、上記の通りに、フローサイトメトリー用
に処理した。
(免疫蛍光及び顕微鏡観察)
腫瘍をマウスから切断し、PBS中で洗浄し、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、以前
に記載されているプロトコルに従って、パラフィン包埋用に処理した。切片をミクロトー
ムを用いて切り出し、スライドに載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)による又は抗C
D3抗体及び抗FoxP3抗体による染色用に処理した。スライドを、Zeiss Axio 2広視野顕微
鏡で、10倍及び20倍の対物レンズを用いて解析した。
(統計)
データを両側スチューデントt検定(2群比較用)及び必要に応じてANOVAにより解析した
。生存に関するデータをログ-ランク(マンテル-コックス)検定により解析した。両側p＜0
.05を統計的有意とみなした(P≦0.05(*)、P≦0.01(**)、P＜0.001(***)、P＜0.0001(****
))。
(7.2 結果)
(NDV複製は注射を受けた腫瘍部位に限定される)
NDVの腫瘍内及び全身投与によるウイルス分布動態を特徴付けた。ホタルルシフェラー
ゼレポーターを発現する組換えNDV(NDV-Fluc)の腫瘍内注射は、注射を受けた側腹腫瘍内
でのルシフェラーゼシグナルの持続をもたらしたが、該ウイルスの全身投与は、腫瘍内で
の検出可能なルシフェラーゼシグナルを生じさせなかった(図20A)。限定された全身ウイ
ルス送達は十分な腫瘍溶解及び免疫応答を誘導する可能性が低かったので、腫瘍内NDV注
射を、全身OV療法の限界を克服する可能性がある抗腫瘍免疫応答を誘発する手段として検
討した。したがって、さらなる研究のために、モデル化された転移性疾患を、両側腹B16-
F10腫瘍モデルを用いることによりモデル化した(図22A)。右側腹腫瘍へのNDV-Fluc投与は
、注射を受けた腫瘍内でのウイルス複製をもたらし、ルシフェラーゼシグナルは、最大96
時間検出可能であった(図20B〜D)。対側(左側腹)腫瘍では、発光イメージング(図20B〜D)
、孵化卵での継代、又はRT-PCRにより、ウイルスが検出されなかった。したがって、この
システムにより、ウイルス注射を受けた腫瘍とNDVによる直接的な影響を受けない遠位腫
瘍の両方における免疫応答の特徴付けが可能になった。
(NDV療法は局所及び遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させ、腫瘍成長を遅延させる)
ウイルス注射を受けた腫瘍の解析により、白血球共通抗原CD45を発現する細胞の浸潤の
増大によって明白に示される炎症応答が示された(図21A〜B)。免疫浸潤物は、骨髄細胞、
NK細胞、及びNKT細胞を含む自然免疫コンパートメント(図21C)、並びにCD8+及び従来型CD
4+FoxP3-(Tconv) T細胞を含む適応コンパートメントの増加を特徴としており、CD8及びTc
onv対調節性(Treg) T細胞比の有意な増加を生じさせた(それぞれ、p＝0.0131及びp＝0.00
06)(図21D〜21F)。注目すべきことに、対側腫瘍の解析により、自然免疫細胞(図22D)とエ
フェクターT細胞(図22E、G)の両方の数の増加を特徴とする、炎症性浸潤物の同様の増加
が明らかになった(図22B、C)。注目すべきことに、Tregの絶対数には大きな変化がなかっ
たが(図22G)、その相対的パーセンテージは実質的に減少し(図22E、F、H)、CD8及びTconv
対Treg比の有意な増大が見られた(それぞれ、p＝0.002及びp＝0.0021)(図22I)。遠位腫瘍
から単離されたエフェクターT細胞は、それぞれ、活性化、増殖、溶解のマーカーであるI
COS、Ki-67、及びグランザイムBの発現の増大を示した(図1J、K)。先述のように、ウイル
ス又はウイルスRNAは遠位腫瘍から単離することができなかったが、これは、遠位腫瘍微
小環境の観察された変化が直接的なウイルス感染によるものではなかったことを示唆して
いる。検出できない局所ウイルス拡散の可能性をさらに排除するために、腫瘍を両側後足
蹠などの他の遠位部位に移植し、これにより、同様の研究結果が得られた(図23)。
観察された炎症効果と一致して、NDVの腫瘍内投与は、注射を受けた腫瘍の成長遅延だ
けでなく、対側腫瘍の成長遅延ももたらし、長期の動物生存をもたらした(図1L、M)。こ
の効果が一過性であるかどうか、及び持続的な抗腫瘍防御が可能であるかどうかを明らか
にするために、単側腹B16-F10腫瘍担持マウスをNDVで腫瘍内処置し、長期生存マウスの反
対の側腹にB16-F10細胞を注射した。大多数の動物は腫瘍成長遅延を示し、該動物の30％
は、再投与された細胞を完全に拒絶し、NDVによる腫瘍内療法が防御的抗腫瘍記憶応答を
実際に誘導することができることを示唆した(図25)。
(NDVは腫瘍浸潤及び腫瘍特異的リンパ球の増殖を誘導する)
抗腫瘍免疫応答が、NDVを注射された腫瘍型に依存するのか、それともNDV感染により生
じた非特異的炎症の結果であるのかを明らかにするために、異種腫瘍(MC38結腸癌及びB16
-F10メラノーマ)を反対の側腹に移植して、実験を行った(図24A)。腫瘍特異的リンパ球を
追跡するために、メラノーマ分化抗原gp100(Pmel)及びTrp1(Trp1)を認識する、T細胞受容
体が遺伝子導入されたコンジェニック標識CD8+(Pmel)細胞又はルシフェラーゼ標識CD4+(T
rp1)細胞を養子移植した(Muranskiらの文献、2008, Blood, 112: 362; Overwijkらの文献
、2003, J Exp Med, 198: 569)。生体発光イメージングを用いて、養子移植されたTrp1細
胞の分布及び増殖動態を測定した。PBS処置した腫瘍担持動物へのTrp1細胞の移植は、腫
瘍内でのTrp1蓄積を生じさせることができず、このモデルにおける腫瘍微小環境の免疫抑
制性の高い性質を強調した(図24B〜D)。B16-F10腫瘍へのNDV注射は、Trp1 T細胞増殖を示
す、注射を受けた腫瘍内でのルシフェラーゼシグナルの有意な増加(曲線下面積(AUC) p＝
0.0084)をもたらした(図24B〜D)。注目すべきことに、同様の増殖は、遅れてではあった
が、対側腫瘍でも見られた(p＝0.0009)(図24B〜D)。対照的に、MC38腫瘍へのNDV注射は、
注射を受けたMC38腫瘍又は遠位B16-F10腫瘍への実質的なTrp1浸潤を誘導することができ
ず(図24B〜D)、遠位腫瘍特異的リンパ球浸潤が、注入された腫瘍の抗原の素性に依存する
可能性が高いことを示唆した。同様に、NDVの腫瘍内注射は、遠位腫瘍へのPmel細胞の浸
潤の増大をもたらしたが、これは、注入された腫瘍が、MC38ではなくB16-F10であるとき
に、より顕著であった(図24E)。
興味深いことに、養子移植されたリンパ球による遠位B16-F10腫瘍の浸潤は、注入され
た腫瘍の素性に依存するが、遠位腫瘍は、注入された主要な腫瘍がMC38である場合でも、
免疫浸潤の増大を確かに示し(図24F)、これは、非特異的炎症応答成分も役割を果たし得
ることを示唆している。実際、潜在的ウイルスを不活化するためにUV照射で処置したNDV
処置動物由来の血清は、未感作B16-F10腫瘍担持マウスに腫瘍内注射したとき、腫瘍白血
球浸潤を誘導し(図24G、H)、この増加の大部分は、NK及びCD8+コンパートメントで見られ
た(それぞれ、p＝0.0089及びp＝0.0443)(図24I)。
(NDV及びCTLA-4遮断は相乗的に作用して、局所腫瘍及び遠位腫瘍を拒絶する)
顕著な炎症応答及び成長遅延が遠位腫瘍で見られたにもかかわらず、長期生存を伴う完
全な対側腫瘍拒絶は、動物の約10％でしか見られず(図22M)、これは、腫瘍微小環境にお
ける活発な免疫抑制機構を示唆するものであった。NDV注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の
特徴付けにより、腫瘍浸潤T細胞上のCTLA-4の上方調節が明らかになり(図26)、これによ
り、NDV誘導性腫瘍炎症がCTLA-4遮断による全身療法に対して腫瘍を感受性にすることが
示唆された。注目すべきことに、NDVと抗CTLA-4抗体との併用療法(図27A)は、大多数の動
物で両側腫瘍の拒絶と長期生存とをもたらし、これは、どちらかの処置だけでは見られな
い効果であった(図27B〜D)。観察された防御の持続性を明らかにするために、生き残った
動物の右側腹に、90日目に、B16-F10細胞を注射し、それ以上の治療を施さなかった。NDV
及び抗CTLA-4併用療法で処置された動物は、単剤の抗CTLA-4抗体で処置された動物におけ
る40％の防御と比較して、腫瘍再投与に対する80％を超える防御を示した(図27E)。
(NDV及びCTLA-4遮断による併用療法はウイルス非許容性腫瘍に対して効果的である)
この治療戦略を他の腫瘍型に拡大することができるかどうかを明らかにするために、こ
の戦略を、免疫原性が低いTRAMP C2前立腺腺癌モデルで評価した。B16-F10モデルと同様
、併用療法は、注射を受けた腫瘍の退縮を引き起こし(図27F)、遠位腫瘍の増殖を遅延さ
せるか、又は持続的な長期生存を伴う完全な遠位腫瘍退縮をもたらした(図27F、G)。興味
深いことに、B16-F10細胞がインビトロでのNDV媒介性溶解を起こしやすいのに対し、TRAM
P C2細胞は強く抵抗性であり、最大10の感染多重度(MOI)でわずかな細胞傷害性しか観察
されなかった(図27H)。両方の細胞株において、インビトロでのNDV感染は、MHC及び共刺
激分子の表面上方調節をもたらした(図27I〜K)。全ての細胞が、1のMOIでNDVに感染した
わけではないにもかかわらず、MHCクラスIは、全ての細胞で均一に上方調節された。過去
の研究により、NDVはB16-F10細胞でI型IFN発現を誘導することが示された(Zamarinらの文
献、2009, Mol Ther 17:697)。両方のI型IFN(Dezfouliらの文献、2003, Immunol. Cell.
Biol., 81:459, Seligerらの文献、2001, Cancer Res., 61:1095)は、B16-F10細胞上のMH
CクラスIを上方調節することが知られており、感染腫瘍との関連において、これらの機構
は、腫瘍免疫原性の増強において付加的な役割を果たし得ることが示唆される。したがっ
て、これらの結果は、ウイルス媒介性溶解に対するインビトロ感受性がインビボでのNDV
療法に対する感受性に必要ではないことを示唆するものであり、観察された抗腫瘍効果に
おける、直接的な溶解ではなく、ウイルスが生じさせる炎症応答の重要性をさらに強調す
るものである。
(全身抗腫瘍効果は注入される腫瘍型に対して抗原拘束性である)
遠位腫瘍における観察された抗腫瘍効果が注射された腫瘍型に特異的であるかどうかを
明らかにするために、片側性遠位B16-F10腫瘍を担持する動物並びに異種腫瘍型(MC38結腸
癌及びB16-F10メラノーマ)が反対の側腹に移植された動物における併用療法を評価した(
図28A)。腫瘍を担持していない右側腹へのウイルスの皮内投与は、左側腹腫瘍増殖の遅延
を生じさせたが、これは、両側B16-F10腫瘍を担持する動物で見られる長期防御及び腫瘍
拒絶を生じさせることができなかった(図28B、C)。同様に、左側腹B16-F10腫瘍を担持す
る動物の右側腹MC38腫瘍へのNDVの注射は、B16-F10腫瘍拒絶を誘導することができず(図2
8D、E)、NDV誘導性抗腫瘍免疫応答は、注入される腫瘍に対して抗原拘束性である可能性
が高いことが示唆された。
(NDV及び抗CTLA-4による併用療法は活性化リンパ球の腫瘍浸潤を誘導する)
処置を受けた動物におけるB16-F10腫瘍微小環境を調べるために、両側腫瘍を回収し、
浸潤細胞の解析用に処理した。処置を受けた動物由来の注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の
解析により、併用療法で処置した動物における顕著な炎症性浸潤物及び広い面積の腫瘍壊
死が明らかになった(図30A、図29)。これは、併用療法群におけるCD45+細胞及びT細胞の
数の増加と相関した(図30A〜C、図29A〜C)。先述の通り、観察されたTILの増加は主に、T
reg細胞ではなく、CD8+及びTconvの浸潤によるものであり、これにより、エフェクター対
Treg比が増大した(図30D〜F、図29C〜E)。併用治療を受けた動物由来のCD4+及びCD8+ TIL
の表現型特徴付けにより、未処置動物及び抗CTLA-4処置動物を上回るICOS、グランザイム
B、及びKi-67の上方調節(図30G〜I)並びにB16-F10腫瘍溶解物がパルスされた樹状細胞(DC
)による再刺激に応答したIFNγ発現CD8+細胞のパーセンテージの増大(図30J)が示された
。
(NDV併用療法の抗腫瘍活性は、CD8+細胞、NK細胞、I型及びII型インターフェロンに依存
する)
細胞性免疫のどの成分が観察された治療効果の原因となるのかを明らかにするために、
CD4+細胞、CD8+細胞、又はNK細胞に対する除去抗体の存在下で、処置を繰り返した。各々
の細胞サブセットの十分な細胞除去を末梢血のフローサイトメトリーにより確認した(図3
1)。CD8+細胞又はNK細胞のどちらかの除去は、ウイルス注射を受けた腫瘍と遠位腫瘍の両
方における治療効果の消失をもたらし(図32A、B)、長期生存を有意に低下させた(CD8につ
いて、p＜0.0001及びNK除去について、p＝0.0011)(図32C)。これらの研究結果と一致して
、抗IFNγ中和抗体による動物の処置も治療効果を低下させた。対照的に、CD4+細胞の除
去は、感知できるほどの抗腫瘍効果の変化をもたらさなかったが、抗CD4+除去はTregの除
去も同時に生じさせるので、これらの結果は、慎重に解釈されなければならない。
I型IFNは、抗腫瘍免疫応答のためのCD8+細胞のプライミングにおいて重要な役割を果た
すことが以前に示されている(Fuertesらの文献、2011, J Exp Med, 208: 2005; Diamond
らの文献、2011, J Exp Med, 208: 1989)。NDVによる腫瘍拒絶におけるI型IFNの役割を調
べるために、I型IFN受容体ノックアウト(IFNAR-/-)マウスで実験を繰り返した。IFNAR-/-
マウスは、注射を受けた腫瘍と対側腫瘍の両方の急速な進行を示し、併用療法に対して完
全に抵抗性であった(図32D〜F)。全体的に見て、これらの研究結果は、本研究で観察され
たウイルスの全身治療効果に対する自然免疫応答と適応免疫応答の両方の重要な役割を強
調している。
(NDV療法は腫瘍細胞上及び腫瘍浸潤白血球上のPD-L1の上方調節をもたらす)
NDV療法と組み合わせて他の免疫チェックポイントを標的とすることが有益であり得る
かどうかを明らかにするために、NDV感染後のPD-1−PD-L1経路に対する効果を評価した。
図33に示すように、インビボとインビトロの両方におけるNDV感染腫瘍細胞は、該細胞の
表面での抑制性PD-L1リガンドの発現を上方調節させており(図33A)、これは、遠位の非感
染腫瘍でも見られた。PD-L1の上方調節は、腫瘍細胞に限られたものではなく、自然免疫
系統と適応免疫系統の両方の腫瘍浸潤白血球でも見られた(図33B)。
(NDVとPD-1及びPD-L1遮断抗体との併用療法は抗腫瘍免疫の向上及び長期の動物生存をも
たらす)
NDVとPD-1を遮断する抗体との組合せ及びNDVとPD-L1を遮断する抗体との組合せを上記
の両側腹メラノーマモデルで評価した。注目すべきことに、CTLA-4遮断と同様、抗PD-1又
は抗PD-L1抗体のどちらかと組み合わせたNDV療法は、動物生存の向上をもたらした(図34
及び35)。NDVと抗PD-1抗体の組合せで処置した動物由来の遠位腫瘍を特徴付けた。図36を
見て分かるように、腫瘍内NDVと全身PD-1遮断との組合せは、免疫細胞による顕著な遠位
腫瘍浸潤をもたらし、腫瘍浸潤CD8細胞の増加が最も顕著な所見であった。浸潤細胞は、
それぞれ、増殖及び溶解のマーカーであるKi67及びグランザイムBを上方調節した(図37)
。
(NDVは、ウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍並びに腫瘍流入領域リンパ節(TDLN)にお
けるCD4細胞及びCD8細胞上でのICOSの腫瘍免疫浸潤上方調節を誘導する)
上記の研究結果は、腫瘍内NDVと全身免疫チェックポイント遮断との組合せが2つの治療
的手法の間で著しい相乗効果を生むことを示した。これらの研究結果をさらに深めるため
に、関連のある共刺激経路を介した腫瘍微小環境内でのT細胞エフェクター機能の増強が
より良好な抗腫瘍免疫応答を誘導し得ることを調べた。過去の研究により、T細胞上での
誘導性共刺激因子(ICOS)の持続的な上方調節が患者のCTLA-4遮断に対する応答の強力な指
標であることが確認された(Carthonらの文献、2010, Clin. Canc. Res., 16:2861)。ICOS
は、T細胞依存性Bリンパ球応答及び全Tヘルパーサブセットの発生に極めて重要であるこ
とが示されている、活性化T細胞の表面で上方調節されるCD28ホモログである(Simpsonら
の文献、2010 Curr Opin Immunol. 22:326)。CTLA-4遮断の抗腫瘍性腫瘍効果におけるICO
Sの役割がマウス研究により最近確認された。この研究において、ICOS欠損マウスは、CTL
A-4遮断により、抗腫瘍応答の発生が重度に障害された(Fuらの文献、2011, Cancer Res.,
71:5445)。
NDVで処置した両側腹腫瘍モデルにおけるICOSの発現を特徴付け、該受容体がこの治療
的手法における標的としての役割を果たし得るかどうかを明らかにした。腫瘍内NDV療法
の局所及び遠達効果を特徴付けるために、両側腹B16-F10メラノーマモデルを利用し、該
ウイルスを片側の腫瘍に投与した(図38A)。より良好な応答を予測することができ、かつ
治療効果のさらなる改善を求めて標的とすることができる活性化マーカーを評価した。持
続的なICOS上方調節は、悪性メラノーマに対する抗CTLA-4療法で処置された患者における
より持続的な治療応答及び生存の増加と関連することが以前に示されているので、実施例
の重点をICOSに置いた。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節から単離されたリンパ球の解析に
より、共刺激分子ICOSの上方調節が、処置を受けた動物における活性化マーカーのうちの
1つであることが確認された(図38B、C)。
(NDV-ICOSLウイルスの作製及びインビトロ評価)
NDVに対してリバースジェネティックスシステムを用いて、マウスICOSLを発現するNDV(
NDV-ICOSL)を作製した(図39A)。感染B16-F10細胞の表面でのICOSLの発現を、フローサイ
トメトリーにより、感染から24時間後に確認した(図39B)。該ウイルスのインビトロでの
特徴付けにより、該ウイルスが、親NDV株と同様の複製特性(図39D)及び溶解特性(図39C)
を有することが明らかになった。
(NDV-ICOSLは遠位腫瘍の成長を遅延させ、腫瘍リンパ球浸潤の増強を誘導する)
ウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍における治療効果についてNDV-ICOSLを評価す
るために、両側B16-F10腫瘍を担持する動物を、該ウイルスの4回の腫瘍内注射を片側腹腫
瘍に施して処置した。NDV-ICOSLと野生型NDVはどちらも、これらのウイルスが直接注射さ
れた腫瘍内で腫瘍退縮を引き起こす能力について同程度であった(図40A)。しかしながら
、野生型NDVと比較したとき、NDV-ICOSLは、遠位腫瘍の顕著な腫瘍成長遅延をもたらし、
数匹の動物は、無腫瘍状態を長期間維持した(図40B〜C)。ウイルス注射を受けた腫瘍の解
析により、野生型NDV及びNDV-ICOSLで処置した動物におけるCD4及びCD8エフェクター細胞
による腫瘍浸潤の増強が明らかになったが、2つのウイルスの違いは統計的に有意なもの
ではなく、右側腹腫瘍に対するこの2つのウイルスのよく似た活性を反映するものであっ
た(図40A及び40D)。対照的に、左側腹腫瘍の解析により、NDV-ICOSL処置群における腫瘍
浸潤CD8細胞及びTconv細胞のより顕著な増加が明らかになった(図40E)。興味深いことに
、調節性T細胞の絶対数も増加し、最大の増加はNDV-ICOSL群で見られたが(図40E)、調節
性T細胞の相対的パーセンテージは、NDV処置動物で有意により低かった(図40F)。
(NDV-ICOSLとCTLA-4遮断との併用療法は注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の拒絶をもたらす
)
全体的に見て、上記の研究結果は、NDV-ICOSLの腫瘍内投与によって顕著な炎症応答が
遠位腫瘍で見られたにもかかわらず、大多数の動物は依然として腫瘍のために死亡したこ
とを示しており、腫瘍微小環境内で活発な抑制機構が浸潤免疫細胞による腫瘍拒絶を妨げ
ることが示唆された。したがって、限局性NDV-ICOSLと全身性CTLA-4遮断との併用療法の
効果を評価した。これらの実験のために、腫瘍投与用量を、単剤としてのNDV又は抗CTLA-
4による顕著な治療効果が観察されないレベルにまで増大させた。先述のように、動物を
、4用量のNDVを片側の腫瘍に投与して処置し、同時に、抗CTLA-4抗体を全身投与した(図4
1A)。B16-F10モデルにおいて、NDV-ICOSLと抗CTLA-4による併用療法は、長期の動物生存
を伴う大多数の注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の退縮をもたらし、これは、NDV-WTと抗CT
LA-4との組合せよりも顕著に優れていた(図41B〜D)。これらの研究結果を他の腫瘍モデル
に拡大することができるかどうかを明らかにするために、両側腹CT26結腸癌モデルで同じ
実験を行った。インビトロでのNDV媒介性溶解に対するCT26細胞の低い感受性にもかかわ
らず、ウイルス注射を受けた腫瘍と遠位腫瘍の両方に対するNDVと抗CTLA-4の併用療法の
顕著な治療効果が観察され、優れた効果は、この場合もやはり、NDV-ICOSLと抗CTLA-4と
の組合せを用いた群で見られた(図42A〜D)。両方の腫瘍モデルにおいて、腫瘍を完全に除
去した動物に、それ以上の治療を施すことなく、90日目に、致死用量の腫瘍細胞を再投与
すると、再投与に対する防御が大多数の動物で示された(図41E及び図42E)。興味深いこと
に、CT26モデルでは、治癒した動物の全てが再投与から防御されたが、B16-F10モデルで
は、抗CTLA-4のみで治癒した動物と比較したとき、併用療法で処置した動物が優れた防御
を示し(図41E)、これにより、併用アプローチがより有効な防御的記憶応答をもたらすこ
とが示された。
(併用療法は自然免疫細胞及び適応免疫細胞による腫瘍浸潤の増強をもたらす)
NDVと抗CTLA-4療法の組合せで処置した動物由来の遠位B16腫瘍の解析により、様々な免
疫細胞亜型による顕著な腫瘍浸潤が示された(図43A、B)。浸潤の増加は、自然免疫コンパ
ートメント(図43C、D)と適応免疫コンパートメント(図43E)の両方で明らかであり、最大
の増加は、NDV-ICOSLと抗CTLA-4の組合せで処置した群で見られた。興味深いことに、こ
の群が最大の浸潤CD8+リンパ球数を示した一方、調節性T細胞の統計的に有意な増加もこ
の群で見られたが(図43E)、Tregの全体的なパーセンテージは、未処置動物又は単剤の抗C
TLA-4で処置した動物と比較したとき、有意に減少し(図43F)、結果としてエフェクター対
Treg比が増大した(図43G)。TILの詳細な解析により、NDV-ICOSLと抗CTLA-4の組合せで処
置した動物から単離されたTILは、それぞれ、活性化、溶解、及び増殖のマーカーであるI
COS、グランザイムB、及びKi67を最大レベルで発現することが示された(図43H〜J)。
(他の共刺激分子を発現する組換えNDVの作製)
上に述べたように、本実施例は、NDVによる共刺激リガンドの発現が、より強い免疫応
答の活性化をもたらすことができ、それが、特に、免疫チェックポイント遮断との併用療
法の状況において、より効果的な抗腫瘍免疫を生じさせることができることを示している
。さらなる共刺激分子を評価するために、免疫グロブリンスーパーファミリーの受容体(I
COS及びCD28)並びにTNF受容体スーパーファミリー(GITR、4-1BB、OX40、及びCD40)を標的
とするリガンドを検討した。CD28を標的とするために、NDV F糖タンパク質の細胞質及び
膜貫通ドメインとCD28に対する単鎖抗体から構成された細胞外ドメインとを有するキメラ
タンパク質から構成された人工リガンド(aCD28-scfv)を人為的に作製した(図44A、B)。TN
F受容体スーパーファミリーを標的とするリガンドについては、感染細胞の表面でのリガ
ンドの発現の増強を確実にするために、各々のリガンドの細胞外ドメインをNDV HN糖タン
パク質の膜貫通及び細胞内ドメインに融合させた(図44A、B)。さらに、共通γ鎖受容体フ
ァミリーのサイトカイン(IL-2、IL-15、及びIL-21)を発現する組換えウイルスを作製した
。得られたコンストラクトを図44Cの略図に示す。組換えウイルスをリバースジェネティ
クスにより作製し、ウイルスの存在を血球凝集アッセイにより確認した(図45A)。挿入さ
れた遺伝子の忠実度を保証するために、RNAを各々のウイルスから単離し、クローニング
された遺伝子領域の外側でアニールするプライマーを用いてRT-PCRを行った(図45B、C)。
各々の遺伝子の配列をサンガーシークエンシングによりさらに確認した。感染細胞の表面
での共刺激リガンドの発現を確認するために、培養B16-F10細胞を2のMOIで感染させ、24
時間後、各々の遺伝子に特異的な抗体を用いるフローサイトメトリーにより解析した(図4
6)。
(NDV-4-1BBLは遠位腫瘍におけるリンパ球による腫瘍浸潤の増加を誘導する)
改変されたウイルスが免疫応答の増強の何らかの証拠を示す能力を、NDV-4-1BBLを一例
として用いて評価した。両側腹B16-F10メラノーマを担持するマウスを、先に記載されて
いる通りに、右腫瘍への対照NDV又はNDV-4-1BBLの腫瘍内注射で処置し、遠位腫瘍を15日
目に回収した。図47を見て分かるように、NDV-4-1BBLによる療法は、対側腫瘍への自然免
疫細胞と適応免疫細胞の両方の浸潤の増強を示し、ICOSLを発現するNDVと同様の結果を示
した先の研究結果と一致した(図40)。全体的に見て、これらの研究結果は、腫瘍微小環境
の状況でのNDVによる免疫刺激性分子の発現が、抗腫瘍免疫の増強をもたらすことができ
ることを示唆している。
作製されたウイルスNDV-4-1BBL、NDV-GITRL、NDV-OX40L、NDV-CD40L、NDV-IL-2、NDV-I
L-15、NDV-IL-21を、この第7節に記載されているのと同様のアッセイを用いて、腫瘍免疫
浸潤を誘導する能力について評価する。さらに、治療的評価のために、該ウイルスの各々
を、該ウイルスを抑制性チェックポイントPD-1、PD-L1、及び/又はCTLA-4を標的とする全
身性抗体と組み合わせて単側腹腫瘍に投与する両側腹腫瘍モデルで評価する。
(結論)
免疫原性腫瘍細胞死及び炎症応答を誘発するために、非病原性NDVを利用した。非病原
性NDVは、その比較的弱い溶解活性にもかかわらず、I型IFN及びDC成熟の強力な誘導因子
であることが示されている(Wildenらの文献、2009, Int J Oncol 34: 971; Katoらの文献
、2005, Immunity 23: 19)。同時免疫による影響を受けないことが以前に示されたスケジ
ュールで腫瘍を交互に移植する両側腹メラノーマモデルを利用した(Turkらの文献、2004,
J Exp Med 200: 771)。本実施例は、NDVの腫瘍内注射が、遠位ウイルス拡散の非存在下
で遠位腫瘍免疫浸潤をもたらすことを示している。特に、この効果は、Tregの数の相対的
減少とCD4及びCD8エフェクター対Treg比の顕著な増大とを伴っていたが、これらは、免疫
療法に対する望ましい免疫応答のマーカーであることが以前に示されている(Quezadaらの
文献、2006, J Clin Invest 116: 1935; Curranらの文献、2010, Proc Natl Acad Sci U
S A 107: 4275)。
本実施例のデータは、NDVが腫瘍特異的リンパ球による腫瘍浸潤を増強することを示し
ており、これは、ウイルス注射を受けた腫瘍の素性に依存した効果であった。腫瘍浸潤の
増強及び養子移植リンパ球の増殖は、腫瘍溶解性ウイルス療法と養子T細胞移植を利用す
る治療的手法との間の相乗作用をさらに示唆している。腫瘍特異的リンパ球が、初期ウイ
ルス感染の部位で活性化及び増殖を経た後、他の腫瘍部位に移動するというのがもっとも
らしいが、これは、ケモカイン及びリンパ球ホーミング受容体に依存的である可能性が高
い(Franciszkiewiczらの文献、2012, Cancer Res 72: 6325)。本実施例のデータは、遠位
腫瘍免疫浸潤が一部非特異的であり、異種腫瘍のNDV感染によって、又は処置を受けた動
物から未感作腫瘍担持マウスへの血清の移植によって誘導され得ることも示している。IL
-6などの炎症性サイトカインによって誘導される血管透過性の増大は、腫瘍血管系の活性
化及び腫瘍内へのリンパ球動員に強く寄与し得る(Fisherらの文献、2011, The Journal o
f clinical investigation 121: 3846)。
TILの顕著な増加にもかかわらず、遠位腫瘍における治療効果は、NDV単剤療法の場合、
かなり低く、これらの腫瘍の微小環境の免疫抑制的な性質を強調している(Sprangerらの
文献、2013, Sci Transl Med 5)。注目すべきことに、全身性抗CTLA-4抗体と腫瘍内NDVと
の組合せは、長期の動物生存を伴う遠位B16-F10腫瘍の拒絶をもたらした。動物は、さら
なる腫瘍再投与からも防御され、これは、長期記憶の確立を示唆するものであった。興味
深いことに、治療効果は、インビトロでのNDV媒介性細胞溶解に対して低い感受性を示すT
RAMP C2及びCT26腫瘍モデルでも見られた。これらの研究結果は、このモデルにおいて抗
腫瘍効果を誘導する一次機構として、直接的な溶解ではなく、NDV誘導性抗腫瘍免疫/炎症
応答の重要性を強調するものである。実際、併用療法で処置されたNDV注射を受けた腫瘍
及び遠位腫瘍は、自然免疫細胞並びに活性化CD8+及びCD4+エフェクター細胞による顕著な
浸潤を示したが、CD8+細胞及びNK細胞の除去は、治療効果を消失させた。さらに、組合せ
戦略は、IFNAR-/-マウスでは完全に無効であり、このことは、このシステムでの抗腫瘍免
疫の誘導におけるI型IFN経路の役割を裏付けている(Fuertesらの文献、2011, J Exp Med
208, 2005; Diamondらの文献、2011, J Exp Med 208: 1989; Swannらの文献、2007, J Im
munol 178: 7540)。
まとめると、本実施例は、NDVによるB16メラノーマの限局性腫瘍内療法が、炎症応答を
誘導し、遠位ウイルス拡散を伴わずに、遠位(ウイルス注射を受けていない)腫瘍における
リンパ球性浸潤物及び抗腫瘍効果をもたらすことを示している。炎症効果は、腫瘍特異的
CD4+及びCD8+ T細胞による遠位腫瘍浸潤と同時に発生し、これは、ウイルス注射を受けた
腫瘍の素性に依存する。限局性NDVと全身性CTLA-4遮断による併用療法は、NDV媒介性溶解
に対する腫瘍細胞株の感受性に関係なく、免疫原性が低い腫瘍モデルで、予め樹立された
遠位腫瘍の拒絶と腫瘍再投与からの防御とをもたらした。治療効果は、調節性T細胞では
なく、活性化されたCD8+及びCD4+エフェクターによる顕著な遠位腫瘍浸潤を伴い、CD8+細
胞、NK細胞、及びI型インターフェロンに依存的であった。本実施例は、腫瘍溶解性NDVに
よる限局性療法が遠位腫瘍において炎症性免疫浸潤物を誘導し、該遠位腫瘍を免疫調節抗
体による全身療法に対して感受性にすることを示している。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではな
い。実際、記載されているものの他に、本発明の様々な変更が、前述の説明及び付随する
図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範
囲内に含まれることが意図される。
本明細書に引用される全ての参考文献は、各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が
、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個
別的に示される場合と同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細
書中に組み込まれる。
本明細書に引用される全ての参考文献は、各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別的に示される場合と同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該アゴニストが該ウイルスによって発現される、前記ウイルス。
（構成２）
免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該アンタゴニストが該ウイルスによって発現される、前記キメラNDV。
（構成３）
前記パッケージングされたゲノムが、突然変異Fタンパク質をコードし、該突然変異Fタンパク質が該ウイルスによって発現される、構成1又は2記載のキメラNDV。
（構成４）
前記免疫細胞が、Tリンパ球又はナチュラルキラー(NK)細胞である、構成1又は2記載のキメラNDV。
（構成５）
前記共刺激受容体が、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40である、構成1記載のキメラNDV。
（構成６）
前記抑制受容体が、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、又はT細胞膜タンパク質3(TIM3)である、構成2記載のキメラNDV。
（構成７）
前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合する抗体である、構成1記載のキメラNDV。
（構成８）
前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合するリガンドである、構成1記載のキメラNDV。
（構成９）
前記アゴニストが、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40に特異的に結合する抗体である、構成1記載のキメラNDV。
（構成１０）
前記抗体が、モノクローナル抗体又は単鎖Fvである、構成7又は9記載のキメラNDV。
（構成１１）
前記リガンドが、GITRL、CD40L、CD137L、OX40L、CD70、又はICOSLである、構成8記載のキメラNDV。
（構成１２）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体に特異的に結合する抗体である、構成2記載のキメラNDV。
（構成１３）
前記アンタゴニストが、CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3に特異的に結合する抗体である、構成2記載のキメラNDV。
（構成１４）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドの可溶性受容体である、構成2記載のキメラNDV。
（構成１５）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドに特異的に結合する抗体である、構成2記載のキメラNDV。
（構成１６）
前記アンタゴニストが、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、又はGal9に特異的に結合する抗体である、構成2記載のキメラNDV。
（構成１７）
前記可溶性受容体が、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3の細胞外ドメインである、構成14記載のキメラNDV。
（構成１８）
前記抗体が、モノクローナル抗体又はsc-Fvである、構成12、13、15、又は16記載のキメラNDV。
（構成１９）
構成1、5、7、8、9、又は11記載のキメラNDV及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（構成２０）
構成2、6、12、13、14、15、16、又は17記載のキメラNDV及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（構成２１）
医薬組成物を製造する方法であって:
a.構成1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか１記載のキメラNDVを、NDV感染を起こしやすい細胞株で増殖させること;及び
b.子孫ウイルスを回収すること
を含み、
ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するように、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長させられる、前記方法。
（構成２２）
医薬組成物を製造する方法であって:
a.構成1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか１記載のキメラNDVを孵化卵で増殖させること;及び
b.子孫ウイルスを回収すること
を含み、
ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するように、該ウイルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長させられる、前記方法。
（構成２３）
構成1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか１記載のキメラNDVを含む細胞株。
（構成２４）
構成1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか１記載のキメラNDVを含む孵化卵。
（構成２５）
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、構成1、5、7、8、9、又は11のいずれか１記載のキメラNDVを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（構成２６）
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、構成2、6、12、13、14、15、16、又は17のいずれか１記載のキメラNDVを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（構成２７）
前記キメラNDVのパッケージングされたゲノムが、突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードしており、そのため、該突然変異Fタンパク質が該ウイルスによって発現される、構成25記載の方法。
（構成２８）
前記キメラNDVのパッケージングされたゲノムが、突然変異した切断部位を有する突然変異Fタンパク質をコードしており、そのため、該突然変異Fタンパク質が該ウイルスによって発現される、構成26記載の方法。
（構成２９）
前記対象に、免疫細胞の共刺激受容体の第二のアゴニストを投与することをさらに含む、構成25記載の方法。
（構成３０）
前記対象に、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストを投与することをさらに含む、構成26記載の方法。
（構成３１）
前記対象に、免疫細胞の抑制受容体の第二のアンタゴニストを投与することをさらに含む、構成26記載の方法。
（構成３２）
前記対象に、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項25記載の方法。
（請求項３３）
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、NDVと免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストとを投与することを含む、前記方法。
（構成３４）
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、NDVと免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストとを投与することを含む、前記方法。
（構成３５）
前記NDVがキメラNDVであり、該キメラNDVが、該ウイルスによって発現されるサイトカインをコードするパッケージングされたゲノムを含む、構成33記載の方法。
（構成３６）
前記NDVが、サイトカインをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、該サイトカインが該ウイルスによって発現される、構成34記載の方法。
（構成３７）
前記NDVが、免疫細胞の共刺激受容体の第二のアゴニスト又は免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、該第二のアゴニスト又はアンタゴニストが該ウイルスによって発現される、構成33記載の方法。
（構成３８）
前記NDVが、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト又は免疫細胞の抑制受容体の第二のアンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、該アゴニスト又は第二のアンタゴニストが該ウイルスによって発現される、構成34記載の方法。
（構成３９）
前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-15、又はIL-21である、構成35又は36記載の方法。
（構成４０）
前記共刺激受容体が、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40である、構成33記載の方法。
（構成４１）
前記抑制受容体が、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3である、構成34記載の方法。
（構成４２）
前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合する抗体である、構成33記載の方法。
（構成４３）
前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合するリガンドである、構成33記載の方法。
（構成４４）
前記アゴニストが、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40に特異的に結合する抗体である、構成33記載の方法。
（構成４５）
前記抗体が、モノクローナル抗体又は単鎖Fvである、構成42又は44記載の方法。
（構成４６）
前記リガンドが、CD137L、OX40L、CD40L、GITRL、CD70、又はICOSLである、構成43記載の方法。
（構成４７）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体に特異的に結合する抗体である、構成34記載の方法。
（構成４８）
前記アンタゴニストが、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3に特異的に結合する抗体である、構成34記載の方法。
（構成４９）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドの可溶性受容体である、構成34記載の方法。
（構成５０）
前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドに特異的に結合する抗体である、構成34記載の方法。
（構成５１）
前記アンタゴニストが、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、又はGal9に特異的に結合する抗体である、構成34記載の方法。
（構成５２）
前記可溶性受容体が、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3の細胞外ドメインである、構成51記載の方法。
（構成５３）
前記抗体が、モノクローナル抗体又はscFvである、構成47、48、50、又は51記載の方法。
（構成５４）
養子Tリンパ球を投与することをさらに含む、構成33又は34記載の方法。
（構成５５）
前記癌が、メラノーマ、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、又は腎細胞癌である、構成33〜38、40〜44、又は46〜52のいずれか１記載の方法。
（構成５６）
前記癌が、悪性メラノーマ、悪性神経膠腫、腎細胞癌、膵腺癌、悪性中皮腫、肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、未分化甲状腺癌、又は頭頸部扁平上皮細胞癌である、構成33〜38、40〜44、又は46〜52のいずれか１記載の方法。
（構成５７）
前記対象がヒトである、構成33〜38、40〜44、又は46〜52のいずれか１記載の方法。

Claims (57)

  1. 免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含む
    キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該アゴニストが該ウイルスによって発
    現される、前記ウイルス。
  2. 免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含
    むキメラNDVであって、該アンタゴニストが該ウイルスによって発現される、前記キメラN
    DV。
  3. 前記パッケージングされたゲノムが、突然変異Fタンパク質をコードし、該突然変異Fタ
    ンパク質が該ウイルスによって発現される、請求項1又は2記載のキメラNDV。
  4. 前記免疫細胞が、Tリンパ球又はナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項1又は2記載
    のキメラNDV。
  5. 前記共刺激受容体が、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、OX40、CD
    27、CD28、4-1BB、又はCD40である、請求項1記載のキメラNDV。
  6. 前記抑制受容体が、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパ
    ク質1(PD1)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、キラー細胞免疫グロブリン様受容
    体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、又はT細胞膜タンパク質3(TIM3)である、請求項
    2記載のキメラNDV。
  7. 前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合する抗体である、請求項1記載の
    キメラNDV。
  8. 前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合するリガンドである、請求項1記
    載のキメラNDV。
  9. 前記アゴニストが、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40に特異的に結合する抗
    体である、請求項1記載のキメラNDV。
  10. 前記抗体が、モノクローナル抗体又は単鎖Fvである、請求項7又は9記載のキメラNDV。
  11. 前記リガンドが、GITRL、CD40L、CD137L、OX40L、CD70、又はICOSLである、請求項8記
    載のキメラNDV。
  12. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体に特異的に結合する抗体である、請求項2記載
    のキメラNDV。
  13. 前記アンタゴニストが、CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3に特異的に結合す
    る抗体である、請求項2記載のキメラNDV。
  14. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドの可溶性受容体である、請求項2記
    載のキメラNDV。
  15. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドに特異的に結合する抗体である、請
    求項2記載のキメラNDV。
  16. 前記アンタゴニストが、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、又はGal9に特異的に結合す
    る抗体である、請求項2記載のキメラNDV。
  17. 前記可溶性受容体が、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3の細胞外ドメインである、請求
    項14記載のキメラNDV。
  18. 前記抗体が、モノクローナル抗体又はsc-Fvである、請求項12、13、15、又は16記載の
    キメラNDV。
  19. 請求項1、5、7、8、9、又は11記載のキメラNDV及び医薬として許容し得る担体を含む、
    医薬組成物。
  20. 請求項2、6、12、13、14、15、16、又は17記載のキメラNDV及び医薬として許容し得る
    担体を含む、医薬組成物。
  21. 医薬組成物を製造する方法であって:
    a.請求項1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか一項記載のキメラNDVを、NDV感染を起こし
    やすい細胞株で増殖させること;及び
    b.子孫ウイルスを回収すること
    を含み、
    ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するように、該ウ
    イルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長させられる
    、前記方法。
  22. 医薬組成物を製造する方法であって:
    a.請求項1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか一項記載のキメラNDVを孵化卵で増殖させ
    ること;及び
    b.子孫ウイルスを回収すること
    を含み、
    ここで、該ウイルスは、該子孫ウイルスが医薬組成物への製剤化に適するように、該ウ
    イルスが夾雑物質を含まない十分な量まで及びそのような十分な条件下で成長させられる
    、前記方法。
  23. 請求項1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか一項記載のキメラNDVを含む細胞株。
  24. 請求項1、2、5〜9、又は11〜17のいずれか一項記載のキメラNDVを含む孵化卵。
  25. 癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1、5、7、8、9、又は11
    のいずれか一項記載のキメラNDVを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  26. 癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項2、6、12、13、14、15、
    16、又は17のいずれか一項記載のキメラNDVを含む医薬組成物を投与することを含む、前
    記方法。
  27. 前記キメラNDVのパッケージングされたゲノムが、突然変異した切断部位を有する突然
    変異Fタンパク質をコードしており、そのため、該突然変異Fタンパク質が該ウイルスによ
    って発現される、請求項25記載の方法。
  28. 前記キメラNDVのパッケージングされたゲノムが、突然変異した切断部位を有する突然
    変異Fタンパク質をコードしており、そのため、該突然変異Fタンパク質が該ウイルスによ
    って発現される、請求項26記載の方法。
  29. 前記対象に、免疫細胞の共刺激受容体の第二のアゴニストを投与することをさらに含む
    、請求項25記載の方法。
  30. 前記対象に、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストを投与することをさらに含む、請求
    項26記載の方法。
  31. 前記対象に、免疫細胞の抑制受容体の第二のアンタゴニストを投与することをさらに含
    む、請求項26記載の方法。
  32. 前記対象に、免疫細胞の抑制受容体のアンタゴニストを投与することをさらに含む、請
    求項25記載の方法。
  33. 癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、NDVと免疫細胞の共刺激受容体
    のアゴニストとを投与することを含む、前記方法。
  34. 癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、NDVと免疫細胞の抑制受容体の
    アンタゴニストとを投与することを含む、前記方法。
  35. 前記NDVがキメラNDVであり、該キメラNDVが、該ウイルスによって発現されるサイトカ
    インをコードするパッケージングされたゲノムを含む、請求項33記載の方法。
  36. 前記NDVが、サイトカインをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVで
    あり、該サイトカインが該ウイルスによって発現される、請求項34記載の方法。
  37. 前記NDVが、免疫細胞の共刺激受容体の第二のアゴニスト又は免疫細胞の抑制受容体の
    アンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、該第
    二のアゴニスト又はアンタゴニストが該ウイルスによって発現される、請求項33記載の方
    法。
  38. 前記NDVが、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニスト又は免疫細胞の抑制受容体の第二の
    アンタゴニストをコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、該ア
    ゴニスト又は第二のアンタゴニストが該ウイルスによって発現される、請求項34記載の方
    法。
  39. 前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-15、又はIL-21である、請求項35又は36記載の方
    法。
  40. 前記共刺激受容体が、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40である、請求項33記
    載の方法。
  41. 前記抑制受容体が、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3である、請求項34記載の
    方法。
  42. 前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合する抗体である、請求項33記載の
    方法。
  43. 前記アゴニストが、前記共刺激受容体に特異的に結合するリガンドである、請求項33記
    載の方法。
  44. 前記アゴニストが、GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB、又はCD40に特異的に結合する抗
    体である、請求項33記載の方法。
  45. 前記抗体が、モノクローナル抗体又は単鎖Fvである、請求項42又は44記載の方法。
  46. 前記リガンドが、CD137L、OX40L、CD40L、GITRL、CD70、又はICOSLである、請求項43記
    載の方法。
  47. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体に特異的に結合する抗体である、請求項34記載
    の方法。
  48. 前記アンタゴニストが、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3に特異的に結合する
    抗体である、請求項34記載の方法。
  49. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドの可溶性受容体である、請求項34記
    載の方法。
  50. 前記アンタゴニストが、前記抑制受容体のリガンドに特異的に結合する抗体である、請
    求項34記載の方法。
  51. 前記アンタゴニストが、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、又はGal9に特異的に結合す
    る抗体である、請求項34記載の方法。
  52. 前記可溶性受容体が、PD1、BTLA、KIR、LAG3、又はTIM3の細胞外ドメインである、請求
    項51記載の方法。
  53. 前記抗体が、モノクローナル抗体又はscFvである、請求項47、48、50、又は51記載の方
    法。
  54. 養子Tリンパ球を投与することをさらに含む、請求項33又は34記載の方法。
  55. 前記癌が、メラノーマ、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、又は腎細胞癌である、請求項33〜
    38、40〜44、又は46〜52のいずれか一項記載の方法。
  56. 前記癌が、悪性メラノーマ、悪性神経膠腫、腎細胞癌、膵腺癌、悪性中皮腫、肺腺癌、
    肺小細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、未分化甲状腺癌、又は頭頸部扁平上皮細胞癌である、請
    求項33〜38、40〜44、又は46〜52のいずれか一項記載の方法。
  57. 前記対象がヒトである、請求項33〜38、40〜44、又は46〜52のいずれか一項記載の方法
    。
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