KR20150127164A - 뉴캐슬병 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 및 이러한 바이러스를 포함하는 조성물이 본원에 기재되어 있다. 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스 및 이러한 바이러스를 포함하는 조성물도 본원에 기재되어 있다. 상기 키메라 뉴캐슬병 바이러스 및 조성물은 암의 치료에 유용하다. 추가로, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제와 함께 뉴캐슬병 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다.

Description

뉴캐슬병 바이러스 및 이의 용도{NEWCASTLE DISEASE VIRUSES AND USES THEREOF}
본원은 전체로서 본원에 참고로 도입되는, 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/782,994호를 우선권 주장한다.
본원은 부분적으로 국립보건원으로부터 승인 번호 제5T32CA009207-35호 및 제HHSN26620070010C호 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일부 권리를 갖는다.
면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스 및 이러한 바이러스를 포함하는 조성물이 본원에 기재되어 있다. 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스 및 이러한 바이러스를 포함하는 조성물도 본원에 기재되어 있다. 상기 키메라 뉴캐슬병 바이러스 및 조성물은 암의 치료에 유용하다. 추가로, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제와 함께 뉴캐슬병 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 다수의 조류 종들을 감염시키는 것으로 밝혀진 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 패밀리 내의 아불라바이러스(Avulavirus) 속의 구성원이다(Alexander, DJ (1988), Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22). NDV는 음성 센스로 단일 가닥 RNA 게놈을 보유하고 숙주 게놈 또는 다른 바이러스와 재조합되지 않는다(Alexander, DJ (1988), Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22). 게놈 RNA는 이하에 더 상세히 기재된 3'-NP-P-M-F-HN-L-5'의 순서로 유전자를 함유한다. 2개의 추가 단백질인 V 및 W는 RNA 에디팅(editing)에 의해 생성되는 대안적 mRNA에 의해 P 유전자로부터 NDV에 의해 생성된다. 게놈 RNA는 3' 말단에서 리더(leader) 서열도 함유한다.
비리온의 구조적 구성요소는 세포 원형질막으로부터 유래된 지질 이중층인 바이러스 외피(envelope)를 포함한다. 당단백질인 혈구응집소-뉴라미니다제(hemagglutinin-neuraminidase)(HN)는 바이러스가 혈구응집소 활성(예를 들면, 수용체 결합/융합유도성) 및 뉴라미니다제 활성 둘다를 함유할 수 있도록 외피로부터 돌출되어 있다. 바이러스 막과도 상호작용하는 융합 당단백질(F)은 먼저 불활성 전구체로서 생성된 후, 번역 후 절단되어 2개의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드들을 생성한다. 활성 F 단백질은 바이러스 외피와 숙주 세포 원형질막의 융합을 용이하게 하여 숙주 세포 내로의 NDV의 침투에 관여한다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스 조립에 관여하고 바이러스 막 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 둘다와 상호작용한다.
뉴클레오캡시드의 주요 단백질 서브유닛은 나선형 대칭을 캡시드에 부여하는 뉴클레오캡시드 단백질(NP)이다. P 및 L 단백질이 뉴클레오캡시드와 관련되어 있다. 인산화되는 인단백질(P)은 전사에 있어서 조절 역할을 수행하는 것으로 생각되고, 메틸화, 인산화 및 폴리아데닐화에도 관여할 수 있다. RNA 의존성 RNA 중합효소를 코딩하는 L 유전자는 P 단백질과 함께 바이러스 RNA 합성을 위해 요구된다. 바이러스 게놈의 코딩 성능의 거의 절반을 차지하는 L 단백질은 바이러스 단백질들 중 가장 큰 바이러스 단백질이고 전사 및 복제 둘다에 있어서 중요한 역할을 수행한다. V 단백질은 인터페론-알파를 억제하고 NDV의 병원성에 기여하는 것으로 밝혀졌다(Huang et al. (2003). Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an-α Interferon Antagonist. Journal of Virology 77: 8676-8685).
천연 NDV는 다양한 동물 종양 모델들에서 효과적인 종양용해제인 것으로 보고되어 있다(Sinkovics, JG, and Horvath, JC (2000). Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. J Clin Virol 16: 1-15; Zamarin et al., 2009; Mol Ther 17: 697; Elankumaran et al., 2010; J Virol 84: 3835; Schirrmacher et al., 2009; Methods Mol Biol 542: 565; Bart et al., 1973; Nat New Biol 245: 229). NDV의 천연 균주는 진행된 인간 암에 대한 다수의 임상 시험에서 사용되고 있다(Sinkovics, JG, and Horvath, JC (2000). Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. J Clin Virol 16: 1-15; Lorence et al. (2007). Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. Curr Cancer Drug Targets 7: 157-167; Hotte et al. (2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin Cancer Res 13: 977-985; Freeman et al. (2006). Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol Ther 13: 221-228; Pecora et al. (2002). Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol 20: 2251-2266; Csatary et al. (2004). MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas. J Neurooncol 67: 83-93). 그러나, 진행된 인간 암에 대한 이들 임상 시험에서 NDV의 천연 균주의 성공은 단지 미미하였다(Hotte et al. (2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin Cancer Res 13: 977-985; Freeman et al. (2006). Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol Ther 13: 221-228; Pecora et al. (2002). Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol 20: 2251-2266). 따라서, 암, 특히 진행된 암의 치료에 유용한 NDV-기저 요법에 대한 필요성이 남아있다.
한 양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스(NDV)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제는 발현된다. 특정 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제는 발현된다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제, 및 NDV가 고도의 융합유도성을 갖게 하는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 키메라 NDV는 절단 부위에 대한 돌연변이를 갖지 않는 상응하는 F 단백질을 발현하는 상응하는 바이러스에 비해 증가된 융합유도 활성을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 변경된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제, 및 NDV가 고도의 융합유도성을 갖게 하는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제 및 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 키메라 NDV는 절단 부위에 대한 돌연변이를 갖지 않는 상응하는 F 단백질을 발현하는 상응하는 바이러스에 비해 증가된 융합유도 활성을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 변경된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 사이토카인(예를 들면, 인터류킨(IL)-2)을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제 및 사이토카인은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제, 사이토카인(예를 들면, IL-2), 및 NDV가 고도의 융합유도성을 갖게 하는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제, 사이토카인 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제, 사이토카인(예를 들면, IL-2), 및 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제, 사이토카인 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 키메라 NDV는 고도의 융합유도성을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제 및 사이토카인(예를 들면, IL-2)을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제 및 사이토카인은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제, 사이토카인(예를 들면, IL-2), 및 NDV가 고도의 융합유도성을 갖게 하는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제, 사이토카인 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제, 사이토카인(예를 들면, IL-2), 및 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제, 사이토카인 및 돌연변이된 F 단백질은 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 키메라 NDV는 고도의 융합유도성을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제는 면역 세포에 의해 발현되는 보조자극 수용체의 작용제이다. 보조자극 수용체의 구체적인 예에는 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), 유도성 T 세포 보조자극제(ICOS 또는 CD278), OX40(CD134), CD27, CD28, 4-1BB(CD137), CD40, CD226, 세포독성 및 조절 T 세포 분자(CRTAM), 사멸 수용체 3(DR3), 림프독소-베타 수용체(LTBR), 경막 활성화제 및 CAML 상호작용제(TACI), B 세포 활성화 인자 수용체(BAFFR) 및 B 세포 성숙 단백질(BCMA)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 면역 세포에 의해 발현된 보조자극 수용체의 작용제는 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편) 또는 리간드이다. 한 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항체는 면역 세포 상의 2개의 수용체들에 결합하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 면역 세포 상의 수용체 및 암세포 상의 또 다른 수용체에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 리간드 또는 항체는 NDV F 단백질 또는 이의 단편, 또는 NDV HN 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 키메라 단백질이다. 이러한 키메라 단백질을 생성하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 개시내용이 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0122185호를 참조한다. 개시내용이 전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Park et al., PNAS 2006; 103:8203-8 and Murawski et al., J Virol 2010; 84:1110-23)도 참조한다. 일부 실시양태에서, 리간드 또는 항체는 키메라 F 단백질 또는 NDV F 융합 단백질로서 발현되고, 이때 상기 키메라 F 단백질 또는 NDV F 융합 단백질은 NDV F 당단백질의 세포질 및 경막 도메인 또는 이의 단편을 포함하고 세포외 도메인은 리간드 또는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 키메라 HN 단백질 또는 NDV HN 융합 단백질로서 발현되고, 이때 키메라 HN 단백질 또는 NDV HN 융합 단백질은 NDV HN 당단백질의 경막 및 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 세포외 도메인은 리간드 또는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 또는 항체는 예컨대, 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 키메라 단백질로서 발현된다.
특정 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 면역 세포에 의해 발현된 억제 수용체의 길항제이다. 억제 수용체의 구체적인 예에는 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4 또는 CD52), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1 또는 CD279), B 및 T 림프구 약화제(BTLA), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 막 단백질 3(TIM3), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 면역글로불린 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1) 및 CD160이 포함된다. 구체적인 실시양태에서, 면역 세포에 의해 발현된 억제 수용체의 길항제는 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다. 한 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 가용성 수용체 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 NDV F 단백질 또는 이의 단편, 또는 NDV HN 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 각각 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0122185호, 문헌(Park et al., PNAS 2006; 103: 8203-8) 및 문헌(Murawski et al., J. Virol 2010; 84:1110-23)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 F 단백질 또는 NDV F 융합 단백질로서 발현되고, 이때 키메라 F 단백질 또는 NDV F 융합 단백질은 NDV F 당단백질의 세포질 및 경막 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 세포외 도메인은 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 HN 단백질 또는 NDV HN 융합 단백질로서 발현되고, 이때 키메라 HN 단백질 또는 NDV HN 융합 단백질은 NDV HN 당단백질의 경막 및 세포내 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 세포외 도메인은 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 NDV에 감염되기 쉬운 임의의 세포, 대상체, 조직 또는 장기에서 증식될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 세포주에서 증식될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 암세포에서 증식될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 부화란(embryonated egg)에서 증식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 단리된 세포, 조직 또는 장기를 제공한다. 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염시킬 세포, 동물 및 알의 예에 대해서는 예를 들면, 하기 단락 4를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 단리된 암세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 세포주를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 부화란을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암세포는 약학 조성물 내로 도입되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 특정 실시양태에서, 암세포는 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)로 감염되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 다른 특정 실시양태에서, 암세포는 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)로 감염된 후 감마 방사선으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 용해된 NDV-감염된 암세포(예를 들면, 키메라 NDV-감염된 암세포)로부터의 단백질 농축물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물을 제조하는 방법은 (a) NDV에 감염되기 쉬운 세포주에서 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 단계; 및 (b) 자손(progeny) 바이러스를 수집하는 단계를 포함하고, 이때 상기 바이러스는 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 생장된다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물을 제조하는 방법은 (a) 부화란에서 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 단계; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 단계를 포함하고, 이때 상기 바이러스는 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 생장된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이러한 키메라 NDV를 포함하는 조성물을 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 대상체 내의 암세포를 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물로 감염시키는 단계를 포함하는 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유효량의 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV), 또는 유효량의 본원에 기재된 키메라 NDV를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 치료한다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 돌연변이된 F 단백질도 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 키메라 NDV들을 대상체에게 투여하여 암을 치료한다.
또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 암세포는 대상체에게 투여되거나 조성물 내로 도입되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 단편, 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 돌연변이된 F 단백질도 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이러한 NDV를 포함하는 조성물을 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 하기 단락 2.1에 기재된 키메라 NDV) 및 하나 이상의 다른 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 유효량의 본원에 기재된 NDV, 또는 유효량의 본원에 기재된 NDV를 포함하는 조성물, 및 하나 이상의 다른 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 상이한 조성물로 투여된다. NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
천연 균주, 변이체 또는 돌연변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류 또는 균주의 NDV가 본원에 개시된 조합요법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용되는 NDV는 천연 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용되는 NDV는 키메라 NDV이다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17 또는 IL-21)을 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 종양 항원을 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 전구-아폽토시스 분자 또는 항-아폽토시스 분자를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전구-아폽토시스 분자 또는 항-아폽토시스 분자는 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 작용제 및/또는 길항제는 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 돌연변이된 F 단백질도 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV와 함께 사용되는 하나 이상의 요법은 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 다른 요법이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV와 함께 사용되는 하나 이상의 요법은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제이다(예를 들면, 하기 단락 6.4.1 참조). 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 면역 세포의 억제 신호의 길항제의 예에 대해서는 예를 들면, 하기 단락 2.1을 참조한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 하기 실시예 1 및 2에 기재된 항-CTLA-4 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 하기 실시예 2에 기재된 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제는 하기 실시예 1 및 2에 기재된 ICOS 리간드이다.
용어
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 수와 함께 사용될 때 언급된 수의 1%, 5% 또는 10% 이내의 임의의 수를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작용제(들)"는 또 다른 분자에 결합하여 생물학적 반응을 유도하는 분자(들)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 세포 상의 수용체에 결합하여 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유발하는 분자이다. 예를 들면, 작용제는 세포 상의 수용체에 결합하여 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도하는 항체 또는 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 리간드는 세포 상의 수용체에 결합하고 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 천연 리간드와 천연 수용체의 상호작용을 용이하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "길항제(들)"는 그 자체가 생물학적 반응을 유발하지 않으면서 또 다른 분자의 작용을 억제하는 분자(들)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 세포 상의 수용체에 결합하여 작용제의 생물학적 활성을 차단하거나 약화시키는 분자이다. 예를 들면, 길항제는 세포 상의 수용체에 결합하여 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도하지 않으면서 천연 리간드와 세포의 결합을 차단하거나 약화시키는 항체 또는 리간드를 포함한다. 길항제의 또 다른 예는 천연 리간드와의 결합에 대해 세포 상의 천연 수용체와 경쟁함으로써, 천연 수용체가 천연 리간드에 결합할 때 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 차단하거나 약화시키는 항체 또는 가용성 수용체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 예를 들면, 면역글로불린을 지칭한다. 항체는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다중클론 항체, 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-연결된 이중특이적 Fv(sdFv), 인트라바디 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들면, 항체에 대한 항-Id 항체 및 항-항-Id 항체를 포함함), 및 이들 중 임의의 항체의 에피토프 결합 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로, 항체는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 단일클론 항체 또는 scFv이다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 면역 세포의 보조자극 수용체 또는 면역 세포의 억제 수용체, 및 암세포 상의 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 면역 세포 상의 2개의 수용체들, 예를 들면, 면역 세포 상의 2개의 보조자극 수용체들, 면역 세포 상의 2개의 억제 수용체들, 또는 면역 세포 상의 1개의 보조자극 수용체 및 면역 세포 상의 1개의 억제 수용체에 특이적으로 결합한다.
본원에서 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 "유도체"는 (a) 천연 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 40% 내지 65%, 50% 내지 90%, 65% 내지 90%, 70% 내지 90%, 75% 내지 95%, 80% 내지 95%, 또는 85% 내지 99% 동일한 폴리펩티드; (b) 천연 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 40% 내지 65%, 50% 내지 90%, 65% 내지 90%, 70% 내지 90%, 75% 내지 95%, 80% 내지 95%, 또는 85% 내지 99% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드; (c) 천연 폴리펩티드에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상, 또는 2개 내지 5개, 2개 내지 10개, 5개 내지 10개, 5개 내지 15개, 5개 내지 20개, 10개 내지 15개, 또는 15개 내지 20개의 아미노산 돌연변이(즉, 추가, 결실 및/또는 치환)를 함유하는 폴리펩티드; (d) 높은, 중간 또는 전형적인 엄격도 혼성화 조건 하에 천연 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드; (e) 높은, 중간 또는 전형적인 엄격도 혼성화 조건 하에 10개 이상의 연속 아미노산, 12개 이상의 연속 아미노산, 15개 이상의 연속 아미노산, 20개 이상의 연속 아미노산, 30개 이상의 연속 아미노산, 40개 이상의 연속 아미노산, 50개 이상의 연속 아미노산, 75개 이상의 연속 아미노산, 100개 이상의 연속 아미노산, 125개 이상의 연속 아미노산, 150개 이상의 연속 아미노산, 또는 10개 내지 20개, 20개 내지 50개, 25개 내지 75개, 25개 내지 100개, 25개 내지 150개, 50개 내지 75개, 50개 내지 100개, 75개 내지 100개, 50개 내지 150개, 75개 내지 150개, 100개 내지 150개, 또는 100개 내지 200개의 연속 아미노산으로 구성된 천연 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드; 또는 (f) 천연 폴리펩티드의 단편을 지칭한다. 유도체는 천연 성숙 형태의 포유동물 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이종 신호 펩티드 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드도 포함한다. 추가로, 유도체는 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 페길화(pegylation), 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질용해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 모이어티(moiety)와의 연결 등에 의해 화학적으로 변경된 폴리펩티드를 포함한다. 추가로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 유도체는 단리된다. 특정 실시양태에서, 유도체는 그 자신의 기원이 되는 천연 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 보유한다.
% 동일성은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, % 동일성은 서열 분석 소프트웨어 팩키지(버전 10; 제네틱스 컴퓨터 그룹 인코포레이티드(Genetics Computer Group, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 위스콘신 대학 생물공학 센터 소재)의 "베스트 핏(Best Fit)" 또는 "갭(Gap)" 프로그램을 사용함으로써 측정된다. 혼성화 조건(예를 들면, 높은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건 및 전형적인 엄격도 조건)에 대한 정보는 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2005-0048549호(예를 들면, 단락 72 및 73)에 기재되어 있다.
본원에서 단백질성 물질(예를 들면, 단백질)과 관련하여 사용된 용어 "단편"은 8개 이상의 연속 아미노산, 10개 이상의 연속 아미노산, 15개 이상의 연속 아미노산, 20개 이상의 연속 아미노산, 25개 이상의 연속 아미노산, 50개 이상의 연속 아미노산, 75개 이상의 연속 아미노산, 100개 이상의 연속 아미노산, 150개 이상의 연속 아미노산, 200개 이상의 연속 아미노산, 또는 10개 내지 300개의 연속 아미노산, 10개 내지 200개의 연속 아미노산, 10개 내지 250개의 연속 아미노산, 10개 내지 150개의 연속 아미노산, 10개 내지 100개의 연속 아미노산, 10개 내지 50개의 연속 아미노산, 50개 내지 100개의 연속 아미노산, 50개 내지 150개의 연속 아미노산, 50개 내지 200개의 연속 아미노산, 50개 내지 250개의 연속 아미노산, 50개 내지 300개의 연속 아미노산, 25개 내지 50개의 연속 아미노산, 25개 내지 75개의 연속 아미노산, 25개 내지 100개의 연속 아미노산, 또는 75개 내지 100개의 연속 아미노산의 단백질성 물질인 단편을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 단백질성 물질의 단편은 단백질성 물질의 하나 이상의 기능을 보유한다. 즉, 상기 단편은 기능성 단편이다. 예를 들면, 단백질성 물질의 단편은 또 다른 단백질과 상호작용하고/하거나 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도하거나, 향상시키거나 활성화시키는 능력을 보유한다.
본원에서 단백질성 물질과 관련하여 사용된 용어 "기능성 단편"은 단백질성 물질의 하나 이상의 활성 또는 기능을 보유하는 단백질성 물질의 부분을 지칭한다. 예를 들면, 억제 수용체의 기능성 단편은 하나 이상의 그의 리간드에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 보조자극 수용체의 리간드의 기능성 단편은 상기 수용체에 결합하고/하거나, 그의 보조자극 수용체에 결합하는 리간드에 의해 매개된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도하거나, 향상시키거나 활성화시키는 능력을 보유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "이종"은 천연 상태에서 천연 NDV와 관련되어 있는(예를 들면, 천연 NDV의 게놈에 의해 코딩되고/되거나 발현되는) 것으로 발견되지 않은 물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "노인"은 65세 이상의 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "성인"은 18세 이상의 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 소아"는 1세 내지 18세의 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 유아"는 1세 내지 3세의 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 영아"는 신생아 내지 1세의 인간을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "고도의 융합유도성" 및 "증가된 융합유도 활성" 등은 다수의 세포들을 포함하는 세포융합체(syncytia)를 형성하는 NDV의 능력의 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 본원에 기재된 NDV로 감염된 세포는 이 바이러스의 기원이 되는 모바이러스(돌연변이되지 않은 F 단백질을 가짐)로 감염된 세포에 비해 세포융합체를 형성하는 증가된 능력을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 키메라 바이러스의 기원이 되는 모바이러스(돌연변이되지 않은 F 단백질을 가짐)로 감염된 세포융합체 형성 세포들의 수와 비교될 때 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 본원에 기재된 NDV로 감염된 세포들 중 약 10% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 95% 또는 약 75% 내지 약 99%, 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 세포들이 세포융합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 세포융합체는 일정 시간(예를 들면, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간) 후 세포융합체 당 핵의 수를 카운팅함으로써 현미경관찰에 의해 정량된다.
본원에서 사용된 용어 "인터페론 길항제"는 세포 인터페론 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 물질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 인터페론 길항제는 세포 인터페론 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 단백질성 물질이다. 특정 실시양태에서, 인터페론 길항제는 세포 인터페론 반응을 감소시키거나 억제하는 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드이다.
특정 실시양태에서, 인터페론 길항제는 인터페론 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제하는 물질이다. 한 실시양태에서, 인터페론 길항제는 I형 IFN의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 인터페론 길항제는 II형 IFN의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 인터페론 길항제는 III형 IFN의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 인터페론 길항제는 IFN-α, IFN-β, 또는 이들 둘다의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 인터페론 길항제는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 인터페론 길항제는 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ 중 1개, 2개 또는 전부의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다.
일부 실시양태에서, 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성은 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 측정되었을 때 이러한 인터페론 길항제를 발현하지 않거나 이러한 인터페론 길항제와 접촉하지 않은 대조군 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성에 비해 인터페론 길항제에 의해 약 1배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 80배, 약 20배 내지 약 80배, 약 1배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 5배, 약 40배 내지 약 80배, 또는 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 7배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배 또는 100배 감소된다. 다른 실시양태에서, 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성은 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 측정되었을 때 이러한 인터페론 길항제를 발현하지 않거나 이러한 인터페론 길항제와 접촉하지 않은 대조군 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성에 비해 인터페론 길항제에 의해 20% 내지 25% 이상, 25% 내지 30% 이상, 30% 내지 35% 이상, 35% 내지 40% 이상, 40% 내지 45% 이상, 45% 내지 50% 이상, 50% 내지 55% 이상, 55% 내지 60% 이상, 60% 내지 65% 이상, 65% 내지 70% 이상, 70% 내지 75% 이상, 75% 내지 80% 이상, 80% 내지 85% 이상, 85% 내지 90% 이상, 90% 내지 95% 이상, 95% 내지 99% 이상, 또는 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 감소된다.
본원에서 사용된 어구 "IFN 결핍 시스템" 또는 "IFN 결핍 기질"은 1종 또는 2종 이상의 IFN을 생성하지 않거나 어떠한 종류의 IFN도 생성하지 않거나, 낮은 수준의 1종 또는 2종 이상의 IFN을 생성하거나, 낮은 수준의 임의의 IFN을 생성하거나(즉, 동일한 조건 하에 IFN 생성가능 시스템에 비해 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 또는 80% 내지 90% 이상의 임의의 INF 발현 감소), 1종 또는 2종 이상의 IFN에 반응하지 않거나 덜 효율적으로 반응하거나, 어떠한 종류의 IFN에도 반응하지 않거나, 1종 또는 2종 이상의 IFN에 대한 지연된 반응을 갖고/갖거나, 또는 1종 또는 2종 이상의 IFN에 의해 유도되거나 임의의 종류의 IFN에 의해 유도된 항-바이러스 유전자의 활성에서 결핍되어 있는 시스템, 예를 들면, 세포, 세포주 및 동물, 예컨대, 마우스, 닭, 타조, 토끼, 래트, 말 등을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 인식한다"는 항체와 관련하여 유사한 용어들이고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 항원(예를 들면, 에피토프 또는 면역 복합체)에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 예를 들면, 면역분석(예를 들면, ELISA), 표면 플라스몬 공명(예를 들면, BIAcore®), (예를 들면, KinExA 3000 기계(사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments), 미국 아이다호주 보이스 소재)를 사용하는 KinEx 분석, 또는 당분야에서 공지된 다른 분석에 의해 측정될 때 보다 더 낮은 친화성으로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 이 분자가 또 다른 항원에 결합할 때의 Ka보다 2 로그, 2.5 로그, 3 로그, 3.5 로그 또는 4 로그 이상 더 큰 해리 상수(즉, Ka)로 항원에 결합한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차반응하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 당분야의 용어이고 일반적으로 균질한 또는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 각각의 단일클론 항체는 전형적으로 항원 상의 단일 에피토프(예를 들면, 단일 입체구조형 에피토프)를 인식할 것이다.
본원에서 사용된 어구 "감염 다중도" 또는 "MOI"는 감염된 세포 당 평균 바이러스 수이다. MOI는 첨가된 바이러스의 수(첨가된 ㎖ x Pfu)를 첨가된 세포의 수(첨가된 ㎖ x 세포/㎖)로 나눔으로써 측정된다.
본원에서 사용된 용어 "천연 리간드"는 천연 수용체에 결합하는 임의의 천연 리간드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 포유동물 리간드이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 리간드는 인간 리간드이다.
본원에서 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 "천연 폴리펩티드(들)"는 미성숙 또는 전구체 형태의 단백질 및 성숙 형태의 단백질을 비롯한 임의의 천연 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 천연 폴리펩티드는 인간 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 용어 "천연 수용체"는 천연 리간드에 결합하는 임의의 천연 수용체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 수용체는 포유동물 수용체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 수용체는 인간 수용체이다.
본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용된 용어 "대상체" 및 "대상체들"은 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-영장류(예를 들면, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류(예를 들면, 원숭이, 침팬지 및 인간)을 비롯한 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 애완동물(예를 들면, 개 또는 고양이) 또는 가축(예를 들면, 말, 돼지 또는 소)이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물(예를 들면, 인간)은 0개월 내지 6개월, 6개월 내지 12개월, 1세 내지 5세, 5세 내지 10세, 10세 내지 15세, 15세 내지 20세, 20세 내지 25세, 25세 내지 30세, 30세 내지 35세, 35세 내지 40세, 40세 내지 45세, 45세 내지 50세, 50세 내지 55세, 55세 내지 60세, 60세 내지 65세, 65세 내지 70세, 70세 내지 75세, 75세 내지 80세, 80세 내지 85세, 85세 내지 90세, 90세 내지 95세, 또는 95세 내지 100세이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 조류가 아닌 동물이다.
본원에서 요법의 투여와 관련하여 사용된 용어 "치료한다" 및 "치료하는"은 대상체에게 유리한 효과, 예컨대, 암 또는 이의 증상의 발생 또는 진행의 경감, 감소, 약화, 완화, 안정화, 관해, 억제, 저해 또는 정지를 제공하는 치료/요법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체가 제공받는 치료/요법은 하기 효과들 중 하나 이상의 효과를 발생시킨다: (i) 암 및/또는 이와 관련된 증상의 중증도의 감소 또는 완화; (ii) 암과 관련된 증상의 지속시간의 감소; (iii) 암과 관련된 증상의 재발의 예방; (iv) 암 및/또는 이와 관련된 증상의 퇴행; (v) 대상체의 입원의 감소; (vi) 입원 기간의 감소; (vii) 대상체의 생존의 증가; (viii) 암 및/또는 이와 관련된 증상의 진행의 억제; (ix) 또 다른 요법의 치료 효과의 향상 또는 개선; (x) 암세포 집단의 감소 또는 제거; (xi) 종양 또는 신생물의 성장의 감소; (xii) 종양 크기의 감소; (xiii) 종양 형성의 감소; (xiv) 일차, 국부적 및/또는 전이성 암의 박멸, 제거 또는 제어; (xv) 전이의 수 또는 크기의 감소; (xvi) 사망률의 감소; (xvii) 환자의 암 부재 생존률의 증가; (xviii) 재발 부재 생존의 증가; (xix) 관해된 환자의 수의 증가; (xx) 입원률의 감소; (xxi) 당업자에 의해 이용가능한 통상적인 방법, 예컨대, MRI, X-선 및 CAT 스캔에 의해 측정될 때 요법의 투여 후 유지되고 증가하지 않는 종양의 크기 또는 5% 또는 10% 미만의 종양 크기의 증가; (xxii) 암 및/또는 이와 관련된 증상의 발생 또는 발병의 예방; (xxiii) 환자의 관해 시간의 증가; (xxiv) 암과 관련된 증상의 수의 감소; (xxv) 암 환자의 증상 부재 생존의 증가; 및/또는 (xxvi) 전이의 제한 또는 감소. 일부 실시양태에서, 대상체가 제공받는 치료/요법은 암을 치유하지 않으나 질환의 진행 또는 악화를 예방한다. 일부 실시양태에서, 대상체가 제공받는 치료/요법은 암의 발병/발생을 예방하지 않으나 암 증상의 발병을 예방할 수 있다.
본원에서 대상체에게의 요법(들)의 투여와 관련하여 사용된 용어 "조합"은 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다. 용어 "조합"의 사용은 요법들이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 요법은 제2 요법을 대상체에게 투여하기 전(예를 들면, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전)에, 제2 요법을 대상체에게 투여함과 동시에, 또는 제2 요법을 대상체에게 투여한 후(예를 들면, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후)에 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "요법들" 및 "요법"은 암의 치료에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜(들), 방법(들) 및/또는 물질(들)을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "요법들" 및 "요법"은 암의 치료에 유용한 생물학적 요법, 지지요법, 호르몬요법, 화학요법, 면역요법 및/또는 다른 요법을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 요법은 보조요법을 포함한다. 예를 들면, 요법은 약물요법, 생물학적 요법, 수술 및/또는 지지요법과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "요법"은 본원에 기재된 키메라 NDV를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "요법"은 키메라 NDV가 아닌 물질을 지칭한다.
도 1: NDV 감염은 시험관내 감염된 B16-F10 세포(감염 후 24시간)의 표면 상에서의 MHC I, MHC II 및 ICAM-1의 발현을 상향조절한다.
도 2a 및 2b: 종양내 NDV 치료는 대식세포, NK 세포, CD8 및 CD4 이펙터 세포에 의한 침윤을 유발하고 Treg의 빈도를 감소시킨다. A) 전체 연구 개요. B) 총 CD45+ 침윤물. C) 총 면역 세포 침윤물. D) 상대적인 CD4 FoxP3+ 및 FoxP3- 서브세트의 대표적인 유동 세포측정 산점도. E) Teff/Treg 및 CD8/Treg 비.
도 3a 및 3b: NDV를 사용한 요법은 원거리 종양의 종양 미세환경에 대한 유리한 효과를 나타낸다. A) 상대적인 CD4 FoxP3+ 및 FoxP3- 서브세트의 대표적인 유동 세포측정 산점도. B) 종양 g 당 CD4 이펙터, Treg 및 CD8 세포의 절대적인 수. C) Teff/Treg 및 CD8/Treg 비.
도 4a 내지 4c: 원거리 종양을 침윤하는 림프구는 활성화 마커, 용해 마커 및 증식 마커를 상향조절한다. CD4 이펙터 세포에 대한 대표적인 발현도(좌측), 및 CD4 이펙터, CD8 및 Treg의 상응하는 백분율(우측)이 CD44(도 4a), 그랜자임 B(도 4b) 및 Ki-67(도 4c)에 대해 제시되어 있다.
도 5a 및 5b: NDV 단일요법은 원거리 종양의 성장을 지연시키고 종양 재챌린지(rechallenge)에 대한 일부 보호를 제공한다. 양쪽 옆구리 종양을 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 확립하였고, 동물을 치료하고 생존에 대해 추적조사하였다. A) 우측 옆구리 (치료받은) 종양의 성장. B) 좌측 옆구리(치료받지 않은) 종양의 성장. C) 전체 생존. 상자 내의 숫자는 종양을 갖지 않는 동물의 %를 표시한다. D) 75일째 날 B16-F10 흑색종 세포로 재챌린지된, NDV에 의한 B16-F10 흑색종을 치유받은 동물에서의 생존. 군 당 10마리의 마우스들을 사용한 2회 상이한 실험의 대표적인 결과.
도 6a 및 6b: 치료받은 종양 및 치료받지 않은 종양 둘다로부터의 종양 침윤 림프구는 NDV 요법에 반응하여 CTLA-4를 상향조절한다. 도 6a) 우측 (치료받은) 종양에서 CD8, CD4 이펙터 및 Treg에서의 CTLA-4 발현의 대표적인 산점도. 도 6b) 좌측 (치료받지 않은) 종양에서 CD8, CD4 이펙터 및 Treg에서의 CTLA-4 발현의 대표적인 산점도.
도 7a 내지 7c: NDV 및 CTLA-4 차단을 사용한 조합요법은 주입된 종양 및 원거리 종양에서 항-종양 효과를 향상시킨다. 양쪽 B16 옆구리 종양을 확립하고 항-CTLA-4 항체 9H10을 사용하거나 사용하지 않으면서 동물을 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 치료하였다. 도 7a) 치료받은 종양의 성장. 도 7b) 원거리 종양의 성장. 상자 내의 숫자는 종양을 갖지 않는 마우스의 백분율을 나타낸다. 도 7c) 장기간 생존. 군 당 10마리의 마우스들을 사용한 2회 상이한 실험의 대표적인 결과.
도 8: NDV 및 항-CTLA-4를 사용한 조합요법은 비-바이러스-허용 전립선 TRAMP 종양에 대해 전신적으로 효과적이다. 우측 (12일째 날) 및 좌측 (3일째 날) 옆구리 TRAMP 종양을 확립하였고, 전신 항-CTLA-4 항체를 사용하거나 사용하지 않으면서 동물을 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 NDV로 치료하였다. 좌측 옆구리 (비-주입된) 종양의 성장이 제시되어 있다. 상자 내의 숫자는 종양을 갖지 않는 동물의 %를 표시한다.
도 9a 및 9b: NDV 감염은 B16-F10 종양에서 PL-L1의 발현을 상향조절한다. A) NDV로 감염된 B16-F10 세포 상에서 24시간 동안 표면 PD-L1 발현. B) 감염된 B16-F10 세포로부터의 UV-불활성화된 상청액으로 처리된 B16-F10 세포 상에서의 표면 PD-L1 발현. C) 도 2a의 A에서와 같이 치료받은 동물로부터의 주입된 종양 및 원거리 종양으로부터 단리된 종양 세포의 표면 상에서의 PD-L1의 상향조절(2개의 좌측 패널 - 대표적인 유동 세포측정 도면, 우측 패널 - 군 당 5마리의 마우스들의 계산된 평균).
도 10a 및 10b: NDV 및 항-PD-1을 사용한 조합요법은 B16 흑색종에 대해 전신적으로 효과적이고 활성화 마커의 상향조절과 함께 증가된 T 세포 침윤을 야기한다. A) 전체 생존. 항-PD-1 항체를 사용하거나 사용하지 않으면서 동물을 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 치료하였다. B) 종양에서 CD45, CD3, CD8 및 CD4 이펙터 세포의 절대적인 수. C) 종양 침윤 림프구에서 조절 T 세포의 상대적인 백분율. D 및 E) 원거리 종양으로부터 종양 침윤 림프구를 단리하고 ICOS(D) 및 그랜자임 B(E)의 발현에 대해 염색하였다. F) 종양 침윤 림프구를 종양 용해물로 적재된 수지상세포로 재자극하고 세포내 사이토카인 염색으로 IFN-γ의 발현에 대해 평가하였다.
도 11: NDV 및 CTLA-4를 사용한 조합요법은 원거리 종양 및 종양 배액 림프절(TDLN)에서 ICOS 및 CD4 이펙터 세포의 상향조절을 유도한다.
도 12: NDV-ICOSL 바이러스의 발생 및 시험관내 평가. A) 바이러스 게놈 구축 개요. B) 감염된 B16-F10 세포의 표면 상에서 24시간 동안 ICOSL의 발현(대표적인 막대그래프, 좌측; 및 군 당 3개 샘플의 평균, 우측). C) LDH 분석에 의해 측정된, 감염된 B16-F10 세포에서의 NDV의 세포용해 활성. D) B16-F10 세포에서의 재조합 NDV의 복제.
도 13 및 13b: NDV-mICOSL 및 항-CTLA-4를 사용한 조합요법은 반대쪽 종양 챌린지로부터 마우스를 보호하고 동물이 장기간 생존하게 한다. 동물을 보다 더 큰 종양 용량으로 챌린지하고, 전신 항-CTLA-4 항체를 사용하거나 사용하지 않으면서 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 NDV로 치료하였다. 좌측 옆구리 (비-주입된) 종양의 성장이 제시되어 있다. B) 장기간 생존. 상자 내의 숫자는 종양으로부터 보호된 동물의 %를 표시한다. 군 당 5마리 내지 10마리의 마우스들의 3회 상이한 실험의 수집된 데이터. C) 조합요법으로 치료받은 마우스는 전신적으로는 아니지만 이전 종양 부위에서 백반증을 발생시켰다.
도 14a 및 14b: NDV-mICOSL 및 항-CTLA-4를 사용한 조합요법은 반대쪽 종양 챌린지로부터 마우스를 보호하고 CT26 결장암종 모델에서 동물이 장기간 생존하게 한다. 동물을 더 큰 종양 용량으로 챌린지하고 전신 항-CTLA-4 항체를 사용하거나 사용하지 않으면서 도 2a의 A에 기재된 바와 같이 NDV로 치료하였다. 좌측 옆구리 (비-주입된) 종양의 성장이 제시되어 있다. 상자 내의 숫자는 종양으로부터 보호된 동물의 %를 표시한다. 도 14b) 장기간 생존. 군 당 5마리 내지 10마리의 마우스들을 사용한 대표적인 실험(도 14a) 및 군 당 5마리 내지 10마리의 마우스들의 2회 상이한 실험의 수집된 데이터.
도 15a 내지 15c: NDV 치료는 대식세포, NK 세포, CD8 및 CD4 이펙터 세포에 의한 원거리 B16 종양 침윤을 유발하고, Treg의 빈도를 감소시킨다. 도 15a) 총 CD45+, CD3+, CD8+, CD4+FoxP3-(Teff) 및 CD4+FoxP3+(Treg) 침윤물. 도 15b) Teff/Treg 및 CD8/Treg 비. 도 15c) 총 대식세포, NK 및 NKT 세포 침윤물.
도 16a 및 16b: 원거리 B16 종양을 침윤하는 림프구는 활성화 마커, 용해 마커 및 증식 마커를 상향조절한다. 대표적인 Ki-67, 그랜자임 B(GrB) 및 ICOS 발현도(도 16a), 및 CD4 이펙터 및 CD8 세포에서의 상응하는 백분율(도 16b).
도 17: 치료받은 동물로부터의 종양 침윤 림프구는 B16-F10 용해물로 적재된 DC를 사용한 자극에 반응하여 IFN-γ를 분비한다. 대표적인 산점도가 제시되어 있다.
도 18: 조합요법에 의해 치유된 동물은 추가 종양 챌린지로부터 보호된다. A) B16-F10 흑색종, 120일째 날 1 x 105개의 세포를 사용한 재챌린지. B) CT26 결장암종, 90일째 날 1 x 106개의 세포를 사용한 재챌린지. 군 당 10마리의 마우스들을 사용한 2회 상이한 실험의 대표적인 결과.
도 19: 재조합 ICOSL-F 키메라 단백질은 표면 상에서 효율적으로 발현된다. A) 상기 키메라 단백질의 개략도. B) 형질감염된 세포의 표면 상에서 키메라 ICOSL-Ftm 융합 단백질의 발현.
도 20: NDV 감염은 주입된 종양으로 제한된다. A) 재조합 NDV-Fluc를, CT26 종양을 보유하는 Balb/C 동물 내로 종양내(IT)로 또는 정맥내(IV)로 투여하고 영상을 다음 72시간에 걸쳐 획득하였다. B) NDV-Fluc를, 양쪽 B16-F10 흑색종 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에게 투여하고, 동물을 120시간 동안 모니터링하였다. 대표적인 발광 영상이 제시되어 있다. C) 배경 발광으로 표준화된 종양 부위로부터의 발광의 정량. D) 패널(C)에서의 데이터로부터 계산된 곡선 하의 면적(AUC). 데이터는 군 당 3마리 내지 5마리의 마우스들을 사용한 3회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 대표적인 결과를 보여준다. ***p<0.001.
도 21: NDV 감염은 바이러스-주입된 종양에서 종양 백혈구 침윤을 증가시킨다. 동물들을 도 22a의 A에 기재된 개요에 따라 치료하였다. 종양을 15일째 날 절개하고, TIL을 표지하고 유동 세포측정으로 분석하였다. A) 종양 침윤 CD45+ 및 CD3+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. B) 종양 g 당 CD45+ 세포의 절대적인 수. C) 종양 g 당 천연 면역 세포의 절대적인 수. D) CD4+FoxP3+(Treg) 및 CD4+FoxP3-(T conv) 세포의 백분율의 대표적인 도면. E) 종양 g 당 통상적인 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포, 및 조절 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 절대적인 수. F) 계산된 종양으로부터의 Tconv/Treg 및 CD8+/Treg 비. 데이터는 군 당 3마리 내지 5마리의 마우스들을 사용한 3회 독립적인 실험들로부터의 누적 결과를 나타낸다. 평균 +/- SEM이 제시되어 있다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 22 및 22b: NDV는 원거리 종양 림프구 침윤을 증가시키고 종양 성장을 지연시킨다. A) 치료 개요. B) 종양 침윤 CD45+ 및 CD3+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. C) 종양 g 당 CD45+ 세포의 절대적인 수. D) 종양 g 당 천연 면역 세포의 절대적인 수. E) 원거리 종양으로부터의 종양 박편을 H&E로 염색하거나(상부 패널) CD3 및 FoxP3에 대해 표지하고(하부 패널) 현미경관찰로 분석하였다. 화살표로 표시된 영역은 괴사 및 염증 침윤물의 영역을 표시한다. 축적 막대는 200 ㎛를 나타낸다. F) CD4+FoxP3+(Treg) 및 CD4+FoxP3-(Tconv) 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. G) 유동 세포측정으로부터 계산된 종양 g 당 통상적인 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포, 및 조절 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 절대적인 수. H) CD45+ 세포들 중에서 Treg의 상대적인 백분율. I) 계산된 Tconv/Treg 및 CD8+/Treg 비. J 및 K) 종양 침윤 Tconv(J) 및 CD8+ 세포(K) 상에서의 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki-67의 상향조절. L) NDV-주입된 종양 및 원거리 종양의 성장. M) 전체 동물 생존. 데이터는 군 당 n=3 내지 5를 사용한 3회(B 내지 K) 또는 2회(L 및 M)으로부터의 누적 결과를 나타낸다. 평균 +/- SEM이 제시되어 있다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 23: NDV 요법은 양쪽 발바닥 흑색종 모델에서 원거리 종양 림프구 침윤을 증가시킨다. 양쪽 발바닥 흑색종 종양을 보유하는 동물들을 도 22a의 A에 기재된 일정에 따라 치료하였다. 원거리 종양을 15일째 날 절개하고 TIL을 표지하고 유동 세포측정으로 분석하였다. A) 종양 침윤 CD45+ 및 CD3+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. B) CD4+FoxP3+ 및 CD4+FoxP3- 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. C) 종양 g 당 통상적인 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포, 및 조절 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 절대적인 수. D 및 E) 종양 침윤 CD8+(D) 및 Tconv(E) 림프구 상에서의 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki-67의 상향조절. 데이터는 군 당 5마리의 마우스들을 사용한 2회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 대표적인 결과를 보여준다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 24a 및 24b: NDV는 양자적으로 전달된 종양 특이적 림프구의 침윤을 유도하고 종양 염증을 촉진한다. A) 치료 개요. B) NDV 및 양자적으로 전달된 Trp1-Fluc 림프구로 치료받은 동물로부터의 대표적인 발광 영상. C) 종양 부위로부터의 평균 발광의 정량. D) 패널(C)에서의 데이터로부터 계산된 곡선 하의 면적(AUC). E) 유동 세포측정으로부터 계산된 원거리 종양으로부터의 Pmel 림프구의 절대적인 수. F) 패널(A)에 기재된 치료 개요에 따라 치료받은 동물의 원거리 종양을 침윤하는 CD45+ 및 CD3+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. G) NDV 또는 PBS의 단회 종양내 주입으로 치료받은 동물로부터의 혈청 전달에 대한 실험 개요. H) 혈청-주입된 종양을 침윤하는 CD45+ 및 CD3+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. I) 유동 세포측정으로부터 계산된 혈청-주입된 종양에서 표시된 세포 서브세트의 절대적인 수. 패널들(B 내지 E)에 대한 데이터는 군 당 n=4 또는 5를 사용한 3회 실험들 중 1회 실험을 나타낸다. 패널들(G 내지 I)에 대한 데이터는 군 당 n=5를 사용한 2회 독립적인 실험들로부터 수집된 데이터를 나타낸다. 평균 +/- SEM이 제시되어 있다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 25: 종양내 NDV는 종양 재챌린지로부터의 보호를 제공한다. NDV에 의해 B16-F10 흑색종을 치유받은 동물에게 75일째 날 1 x 105개의 B16-F10 흑색종 세포를 주입하고 상기 동물을 종양 성장에 대해 모니터링하고 종양이 1000 mm3에 도달하였을 때 안락사시켰다. 전체 동물 생존이 제시되어 있다. 데이터는 군 당 10마리의 마우스들을 사용한 2회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 누적 결과를 보여준다. ****p<0.0001.
도 26: 종양 침윤 CD8+ 림프구는 NDV 요법에 반응하여 CTLA-4를 상향조절한다. NDV로 치료받은 종양(A) 및 원거리 종양(B)에서 CD8+ 세포에서의 CTLA-4 발현의 대표적인 산점도(좌측) 및 누적 결과(우측). 군 당 3마리의 마우스들을 사용한 3회 실험들 중 1회 실험으로부터의 대표적인 결과. *p<0.05.
도 27a 내지 27c: NDV와 CTLA-4 차단은 상승작용하여 근거리 종양 및 원거리 종양을 제거한다. A) 치료 개요. B) 바이러스로 치료받은 (우측 옆구리) B16-F10 종양의 성장. C) 원거리 (좌측 옆구리) B16-F10 종양의 성장. D) B16-F10 모델에서의 장기간 생존. E) 90일째 날 우측 옆구리에서 1 x 105개의 B16-F10 세포를 생존 동물에게 주입하고 상기 동물을 생존에 대해 추적조사하였다. 데이터는 군 당 n=6 내지 11을 사용한 3회 실험들로부터의 누적 결과를 나타낸다. F) 바이러스로 치료받은 (우측 옆구리) TRAMP C2 종양 및 원거리 (좌측 옆구리) TRAMP C2 종양의 성장. G) TRAMP C2 모델에서의 장기간 생존. H) 상이한 감염 다중도(MOI)에서 NDV-매개된 용해에 대한 B16-F10 및 TRAMP C2 세포의 시험관내 민감성. I 내지 K) NDV로 감염된 B16-F10 및 TRAMP C2 세포에서 MHC I, MHC II, CD80 및 CD86의 상향조절. B16-F10 세포로부터의 대표적인 유동 세포측정 도면(I), 및 B16-F10(J) 및 TRAMP C2(K)에 대한 계산된 평균 중간 형광 강도(MFI)가 제시되어 있다. 평균 +/- SEM이 제시되어 있다. 데이터는 군 당 n=5 내지 10을 사용한 3회(B 내지 E) 독립적인 실험들 중 1회 실험, 또는 2회(F 및 G) 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 결과를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 28a 및 28b: 전신 항-종양 효과는 주입된 종양 종류로 제한된다. A) 우측 옆구리에서 B16-F10 흑색종, MC38 결장암종 또는 PBS를 동물에게 피내 주입하고 좌측 옆구리에서 B16-F10 세포를 주입하고 개요에 요약된 바와 같이 치료하였다. B 및 C) 우측 B16-F10을 제공받았거나 우측 옆구리 종양을 제공받지 않은 동물의 원거리 종양의 성장(B) 및 전체 생존(C). 데이터는 군 당 5마리 내지 10마리의 마우스들을 사용한 2회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 대표적인 결과를 보여준다. D 및 E) 우측 B16-F10 또는 MC38 종양을 제공받은 동물의 원거리 종양의 성장(D) 및 전체 생존(E). 데이터는 군 당 n=10을 사용한 2회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터 결과를 나타낸다. **p<0.01, ****p<0.0001.
도 29a 및 29b: NDV 및 항-CTLA-4를 사용한 조합요법은 선천성 면역 세포 및 후천성 면역 세포에 의한 종양 침윤을 향상시킨다. 동물을 도 27a의 A에 기재된 바와 같이 조합요법으로 치료하였다. 15일째 날, 종양을 수거하고 유동 세포측정으로 침윤 면역 세포에 대해 분석하였다. A) 종양 g 당 CD45+ 세포의 절대적인 수. B) 종양 g 당 CD11b+ 및 NK 1.1+ 세포의 절대적인 수. C) 종양 g 당 통상적인 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포, 및 조절 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 절대적인 수. D) CD45+ 세포들 중 Treg의 상대적인 백분율. E) 계산된 Tconv/Treg 및 CD8+/Treg 비. 데이터는 군 당 3마리 내지 5마리의 마우스들을 사용한 4회 독립적인 실험들로부터의 누적 결과를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 30a 내지 30c: NDV 및 CTLA-4 차단을 사용한 조합요법은 원거리 종양에서 염증 변화를 유도한다. 동물을 도 27a의 A에 기재된 개요에 따라 치료하였다. 15일째 날, 종양을 수거하고 침윤 면역 세포에 대해 분석하였다. A) 원거리 종양으로부터의 종양 박편을 H&E로 염색하거나(상부 패널) CD3 및 FoxP3에 대해 염색하고(하부 패널) 각각 광학 현미경관찰 및 형광 현미경관찰로 분석하였다. 화살표로 표시된 영역은 괴사 및 염증 침윤물을 표시한다. 축적 막대는 200 ㎛를 나타낸다. B) 유동 세포측정으로부터 계산된 종양 g 당 종양 침윤 CD45+ 및 CD3+ 세포의 절대적인 수. C) CD45+ 집단에 대해 게이팅된 종양 침윤 CD4+ 및 CD8+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. D) 종양 g 당 Tconv, Treg 및 CD8+ 세포의 절대적인 수. E) CD45+ 세포들 중 종양 침윤 Treg의 상대적인 백분율. F) 계산된 Tconv/Treg 및 CD8+/Treg 비. G 내지 I) 종양 침윤 CD8+ 및 Tconv 림프구 상에서의 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki-67의 상향조절. 대표적인 유동 세포측정 도면(상부 패널) 및 누적 결과(하부 패널)가 제시되어 있다. J) TIL을 B16-F10 종양 용해물로 펄싱된 DC로 재자극하고 IFN-γ 생성을 세포내 사이토카인 염색으로 측정하였다. 대표적인 유동 세포측정 도면(좌측 패널) 및 누적 결과(우측 패널)가 제시되어 있다. 데이터는 군 당 n=3 내지 5를 사용한 5회(A 내지 I) 또는 2회(J) 독립적인 실험들로부터의 누적 결과를 나타낸다. 평균 +/- SEM이 제시되어 있다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 31: CD8, CD4 및 NK1.1에 대한 항체는 생체내에서 관심있는 세포를 고갈시킨다. 고갈 항체를 하기 실시예 2의 단락 1(재료 및 방법 단락)에서 논의된 바와 같이 주입하였다. 5일째 날, 혈액 샘플을 수집하고 비-교차반응성 항체로 CD4+, CD8+ 및 NK 세포에 대해 유동 세포측정으로 프로세싱하였다. 양성 염색은 수평 막대로 표시되어 있다. 군 당 5마리의 마우스들을 사용한 2회 독립적인 실험들 중 1회 실험으로부터의 대표적인 도면이 제시되어 있다.
도 32a 및 32b: NDV 조합요법의 항-종양 활성은 CD8+ 세포 및 NK 세포, 및 I형 인터페론 및 II형 인터페론에 의해 좌우된다. A 내지 C) CD4+, CD8+, NK 세포 또는 IFN-γ에 대한 고갈 항체를 사용하거나 사용하지 않으면서 동물을 도 27a의 A에 기재된 바와 같이 치료하였다. A) 주입된 종양의 성장. B) 원거리 종양의 성장. C) 장기간 생존. D 내지 F) IFNAR-/- 또는 연령-일치된 C57BL/6 마우스(BL/6)를 도 3a의 A에 기재된 바와 같이 치료하고 종양 성장에 대해 모니터링하였다. D) 주입된 종양의 성장. E) 원거리 종양의 성장. F) 장기간 생존. 모든 패널들에 대한 데이터는 군 당 n=3 내지 10을 사용한 2회 독립적인 실험들로부터의 누적 결과를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 33a 내지 33b: NDV 요법은 종양 및 종양 침윤 백혈구 상에서의 PD-L1의 상향조절을 유발한다. 도 33a) 시험관내에서 감염된 B16-F10 세포(좌측 패널), 및 생체내 바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양에서의 PD-L1 발현. 좌측: 대표적인 유동 세포측정 막대그래프; 우측: 종양으로부터의 B16-F10 세포 상에서의 PD-L1 발현의 평균 중간 형광 강도(MFI). 도 33b) 원거리 종양으로부터 단리된 종양 침윤 백혈구의 표면 상에서의 PD-L1 발현. 좌측: 대표적인 유동 세포측정 막대그래프; 우측: 각각의 세포 서브세트에 대한 계산된 평균 MFI.
도 34a 내지 34c: NDV와 PD-1 차단 항체의 조합요법은 양쪽 옆구리 B16 흑색종 모델에서 향상된 항-종양 효과를 유발한다. A) 치료 개요. B) 우측 옆구리 (NDV-주입된) 종양 성장. C) 좌측 옆구리 (원거리) 종양 성장. D) 전체 생존.
도 35a 내지 35c: NDV와 PD-L1 차단 항체의 조합요법은 양쪽 옆구리 B16 흑색종 모델에서 향상된 항-종양 효과를 유발한다. A) 치료 개요. B) 우측 옆구리 (NDV-주입된) 종양 성장. C) 좌측 옆구리 (원거리) 종양 성장. D) 전체 생존.
도 36a 내지 36b: NDV 및 항-PD-1 요법을 사용한 조합요법은 이펙터에 의한 원거리 종양 침윤을 증가시키나 조절 T 세포에 의한 원거리 종양 침윤을 증가시키지 않는다. A) 종양에서 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. B) Tconv(CD4+FoxP3-) 세포 및 Treg(CD4+FoxP3+) 세포의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. C) 유동 세포측정으로부터 계산된 종양 g 당 T 세포 서브세트의 절대적인 수. D) CD4+ T 세포들 중 Treg의 상대적인 백분율. E) 계산된 Tconv/Treg 및 CD8/Treg 비.
도 37a 및 37b: NDV 및 항-PD-1을 사용한 조합요법으로 치료받은 동물에서 원거리 종양으로부터의 TIL은 용해 마커 및 증식 마커를 상향조절한다. 도 37a) 그랜자임 B 및 Ki67에 대한 양성을 나타내는 Tconv 및 CD8 림프구의 백분율의 대표적인 유동 세포측정 도면. 도 37b) 그랜자임 B 및 Ki67에 대한 양성을 나타내는 Tconv 및 CD8+ T 세포의 백분율.
도 38a 및 38b: NDV는 바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양에서 종양 면역 침윤, 및 CD4 및 CD8 세포 상에서의 ICOS의 상향조절을 유도한다. A) 치료 개요. B) NDV-주입된 (우측 옆구리) 종양으로부터 단리된 종양 침윤 CD4+FoxP3- 및 CD8+ 세포 상에서의 ICOS의 발현. 대표적인 유동 세포측정 도면(상부) 및 중간 형광 강도(MFI)(하부)가 제시되어 있다. C) 원거리 (좌측 옆구리) 종양으로부터 단리된 종양 침윤 CD4+FoxP3- 및 CD8+ 세포 상에서의 ICOS의 발현. 대표적인 유동 세포측정 도면(상부) 및 중간 형광 강도(MFI)(하부)가 제시되어 있다.
도 39a 및 39b: NDV-ICOSL 바이러스의 발생 및 시험관내 평가. A) 바이러스 게놈 구축 개요. B) 감염된 B16-F10 세포의 표면 상에서 24시간 동안 ICOSL의 발현(좌측: 대표적인 막대그래프, 및 우측: 군 당 3개의 샘플들의 평균). C) LDH 분석에 의해 측정된, 감염된 B16-F10 세포에서의 NDV의 세포용해 활성. D) B16-F10 세포에서의 재조합 NDV의 복제.
도 40a 및 40b: NDV-ICOSL은 원거리 종양의 성장 지연을 야기하고 향상된 종양 림프구 침윤을 유도한다. 양쪽 옆구리 B16-F10 종양을 전술된 바와 같이 확립하고 표시된 바이러스를 우측 종양 내로 4회 종양내 주입함으로써 동물을 치료하였다. A) 바이러스-주입된 종양의 성장. B) 원거리 종양의 성장. C) 전체 생존. D) 우측(바이러스-주입된 종양)에서 종양 침윤 백혈구의 절대적인 수. E) 좌측(원거리 종양)에서 종양 침윤 백혈구의 절대적인 수. F) 원거리 종양에서 Treg의 상대적인 백분율.
도 41a 내지 41c: NDV-ICOSL과 CTLA-4 차단의 조합요법은 B16-F10 모델에서 주입된 종양 및 원거리 종양을 제거하고 종양 재챌린지로부터 보호한다. A) 치료 개요. B) 바이러스-주입된 (우측) 종양의 성장. C) 원거리 (좌측) 종양의 성장. D) 전체 생존. E) 90일째 날 생존 동물을 우측 옆구리에서 2 x 105개의 B16-F10 세포로 재챌린지하고 생존에 대해 추적조사하였다.
도 42a 내지 42c: NDV-ICOSL과 CTLA-4 차단의 조합요법은 CT26 모델에서 주입된 종양 및 원거리 종양을 제거한다. A) 치료 개요. B) 바이러스-주입된 (우측) 종양의 성장. C) 원거리 (좌측) 종양의 성장. D) 전체 생존. E) 90일째 날 생존 동물을 우측 옆구리에서 1 x 106개의 CT26 세포로 재챌린지하고 생존에 대해 추적조사하였다.
도 43a 및 43b: NDV-ICOSL과 항-CTLA-4의 조합요법은 선천성 면역 세포 및 후천성 면역 세포에 의한 향상된 종양 침윤을 유발한다. 양쪽 옆구리 B16-F10 종양을 보유하는 동물을 도 41a의 A에 기재된 일정에 따라 치료하였다. 15일째 날 동물을 희생시키고, TIL의 분석을 위해 원거리 종양을 프로세싱하였다. A) 전체 종양 세포 집단에 대한 CD45+ 및 CD3+ 세포 게이팅의 대표적인 유동 세포측정 도면. 종양 g 당 종양 침윤 CD45+ 세포(B), CD11b+ 세포(C) 및 NK1.1+ 세포(D)의 절대적인 수를 유동 세포측정으로부터 계산하였다. E) 종양 g 당 종양 침윤 CD3+, CD8+, CD4+FoxP3-(CD4eff) 및 CD4+FoxP3+(Treg)의 절대적인 수. F) 모든 CD45+ 세포들 중 Treg의 상대적인 백분율. G) 계산된 이펙터/Treg 비. H, I 및 J) 각각 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki67에 대한 양성을 나타내는 종양 침윤 CD8+ 및 CD4+ 이펙터 세포의 상대적인 백분율.
도 44: 키메라 면역자극 단백질 및 천연 면역자극 단백질을 발현하는 추가 발생된 재조합 NDV 바이러스들에 대한 개략도. A) N 말단에서 HN의 NDV HN 세포내 및 경막 영역에 융합된 TNF 수용체 수퍼패밀리(GITRL, OX40L, 4-1BBL, CD40L)의 키메라 단백질의 도식(상부 패널). 하부 패널은 C 말단에서 F의 세포내 및 경막 영역에 융합된 항-CD28scfv 및 ICOSL 세포외 도메인을 갖는, 면역글로불린 수용체 수퍼패밀리의 키메라 단백질의 도식을 보여준다. B) 기재된 키메라 단백질들 각각의 세포내-경막(HN 및 F) 및 세포외 도메인의 길이. C) 이 방식에 의해 발생된, 면역자극 리간드를 발현하는 모든 재조합 NDV들의 형질전환유전자(transgene)의 삽입 부위 및 목록의 개략도.
도 45a 및 45b: 재조합 NDV의 레스큐(rescue)의 확인. A) 웰에서 NDV-HN-GITRL, NDV-aCD28scfv-F, NDV-HN-OX40L, NDV-HN-CD40L, NDV-IL-15 및 NDV-IL-21에 대한 양성 혈구응집 활성을 입증하는 혈구응집 분석. B) RT-PCR에 의한 레스큐된 바이러스 내의 유전자 삽입물의 확인을 위한 프라이머 위치. C) 레스큐된 바이러스로부터 단리된 RNA에 대한 RT-PCR.
도 46: 재조합 NDV로 감염된 B16-F10 세포는 표면 상에서 리간드를 발현한다. B16-F10 세포를 2의 MOI에서 표시된 재조합 NDV로 감염시키고 18시간 후 유동 세포측정으로 표면 리간드 발현에 대해 분석하였다. 대표적인 유동 세포측정 도면이 제시되어 있다.
도 47: NDV-HN-4-1BBL은 증가된 원거리 종양 면역 침윤을 유도한다. 표시된 바이러스를 전술된 바와 같이 단일 옆구리 내에 종양내 주입하여 양쪽 옆구리 B16 흑색종 종양을 보유하는 동물을 치료하였다. 3회 치료 후, 동물을 안락사시키고 원거리 종양으로부터의 종양 침윤 림프구를 유동 세포측정으로 분석하였다. 종양 g 당 종양 침윤 CD3, CD4+FoxP3+(Treg), CD4+FoxP3-(Tconv), CD8, NK 및 CD11b+ 세포의 총 수가 제시되어 있다.
한 양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스(NDV)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 작용제는 발현된다. 특정 실시양태에서, 본원은 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공하는데, 이때 상기 길항제는 발현된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 NDV에 감염되기 쉬운 임의의 세포, 대상체, 조직, 장기 또는 동물에서 증식될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 용해된 NDV-감염된 암세포(예를 들면, 키메라 NDV-감염된 암세포)로부터의 단백질 농축물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물을 제조하는 방법은 (a) NDV에 감염되기 쉬운 세포주에서 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 단계; 및 (b) 자손(progeny) 바이러스를 수집하는 단계를 포함하고, 이때 상기 바이러스는 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 생장된다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물을 제조하는 방법은 (a) 부화란에서 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)를 증식시키는 단계; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 단계를 포함하고, 이때 상기 바이러스는 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 생장된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이러한 키메라 NDV를 포함하는 조성물을 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 대상체 내의 암세포를 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물로 감염시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유효량의 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV), 또는 유효량의 본원에 기재된 키메라 NDV를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 치료한다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함하는데, 이때 상기 작용제 및/또는 길항제는 NDV에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 돌연변이된 F 단백질도 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 키메라 NDV들을 대상체에게 투여하여 암을 치료한다.
또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 암세포는 대상체에게 투여되거나 조성물 내로 도입되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 단편, 또는 이의 조성물을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함하는데, 이때 상기 작용제 및/또는 길항제는 NDV에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 NDV에 의해 발현되는 돌연변이된 F 단백질도 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV, 예컨대, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이러한 NDV를 포함하는 조성물을 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV, 예컨대, 하기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 및 하나 이상의 다른 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 유효량의 본원에 기재된 NDV, 또는 유효량의 본원에 기재된 NDV를 포함하는 조성물, 및 하나 이상의 다른 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 상이한 조성물로 투여된다. NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
천연 균주, 변이체 또는 돌연변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류 또는 균주의 NDV가 본원에 개시된 조합요법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용되는 NDV는 천연 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 다른 요법과 함께 사용되는 NDV는 키메라 NDV이다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17 또는 IL-21)을 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 종양 항원을 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 전구-아폽토시스 분자(예를 들면, Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxa, Puma, AIF, FasL 및 TRAIL) 또는 항-아폽토시스 분자(예를 들면, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 및 XIAP)를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전구-아폽토시스 분자 또는 항-아폽토시스 분자는 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제) 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제(예를 들면, 면역 세포의 억제 수용체의 길항제)를 포함하는 팩키징된 게놈을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 작용제 및/또는 길항제는 키메라 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, NDV의 게놈은 돌연변이된 F 단백질, 종양 항원, 이종 인터페론 길항제, 전구-아폽토시스 분자 및/또는 항-아폽토시스 분자도 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV와 함께 사용되는 하나 이상의 요법은 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 다른 요법이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV와 함께 사용되는 하나 이상의 요법은 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제이다. 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 면역 세포의 억제 신호의 길항제의 예에 대해서는 예를 들면, 하기 단락 2.1을 참조한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 하기 실시예 1에 기재된 항-CTLA-4 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제는 하기 실시예 1에 기재된 ICOS 리간드이다.
1. 뉴캐슬병 바이러스
천연 균주, 변이체 또는 돌연변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류 또는 균주의 NDV가 본원에 개시된 조합요법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 천연 균주이다. 일부 실시양태에서, NDV는 용해성 균주이다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 비-용해성 균주이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 약독성(lentogenic) 균주이다. 일부 실시양태에서, NDV는 중간독성(mesogenic) 균주이다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 강독성(velogenic) 균주이다. NDV 균주의 구체적인 예에는 73-T 균주, NDV HUJ 균주, 울스터(Ulster) 균주, MTH-68 균주, 이탈리언(Italien) 균주, 히크만(Hickman) 균주, PV701 균주, 히츠너(Hitchner) B1 균주(예를 들면, 진뱅크 제AF309418호 또는 제NC_002617호 참조), 라 소타(La Sota) 균주(예를 들면, 진뱅크 제AY845400호 참조), YG97 균주, MET95 균주, 로아킨(Roakin) 균주 및 F48E9 균주가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 히츠너 B1 균주이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 진뱅크 제AF309418호 또는 제NC_002617호로 확인된 B1 균주이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 ATCC 제VR2239호로 확인된 NDV이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 라 소타 균주이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 당업자에게 공지된 기법에 의해 평가될 때 병원성 조류가 아니다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 바이러스를 사용한 1일령 병아리의 두개내 주입, 및 8일 동안 점수화된 질환 발생 및 사망에 의해 평가될 때 병원성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만 또는 0.1 미만의 두개내 병원성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 0의 두개내 병원성 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 당업자에게 공지된 기법에 의해 평가될 때 조류에서 병원성을 갖는 것으로 간주되지 않을 정도로 유전적으로 조작된 중간독성 균주이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 당업자에게 공지된 기법에 의해 평가될 때 조류에서 병원성을 갖는 것으로 간주되지 않을 정도로 유전적으로 조작된 강독성 균주이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 조합요법에서 사용되는 NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현하고 고도의 융합유도성을 갖고 세포융합체를 형성할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV의 게놈은 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작되는데, 이때 상기 F 단백질의 절단 부위는 단백질이 세포내 프로테아제(protease)에 의해 절단될 수 있게 함으로써 바이러스가 보다 더 효과적으로 세포 내로 들어가 세포융합체를 형성하게 하는 다중염기성 아미노산 서열을 생성하도록 돌연변이된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작되는데, 이때 상기 F 단백질의 절단 부위는 돌연변이체 절단 부위가 푸린(furin) 패밀리의 편재적으로 발현된 프로테아제에 의해 활성화될 수 있게 하는 1개 또는 2개의 추가 아르기닌 잔기를 함유하는 절단 부위로 교체된다. 이러한 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 NDV의 구체적인 예에는 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 생성하기 위해 NDV F 단백질 내로 도입되는 돌연변이의 설명에 대해서는 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Park et al. (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203-2808)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 아미노산 돌연변이 L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, L289A 돌연변이를 갖는 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 NDV가 적어도 부분적으로 감염성을 유지하고 생체내에서 복제할 수 있되, 단지 낮은 역가를 발생시켜 비-병원성을 나타내는 임상 수준 미만의 감염을 야기하도록 약독화된다(예를 들면, 문헌(Khattar et al., 2009, J. Virol. 83:7779-7782) 참조). 특정 실시양태에서, NDV는 V 단백질의 결실에 의해 약독화된다. 이러한 약독화된 NDV는 바이러스가 면역원, 예를 들면, 생백신으로서 작용하기 위해 대상체에게 투여되는 실시양태에 특히 적합할 수 있다. 상기 바이러스는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 약독화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 NDV V 단백질 코딩 서열을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 돌연변이된 V 단백질을 발현한다. 돌연변이된 V 단백질의 예에 대해서는 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌(Elankumaran et al., 2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 중간독성 또는 강독성 NDV는 예컨대, 문헌(Elankumaran et al., 2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844)에 개시된 바와 같은 돌연변이된 V 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제7,442,379호, 제6,451,323호 또는 제6,146,642호에 개시된 NDV이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 이종 펩티드 또는 단백질을 코딩하고 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 당업자에게 공지된 키메라 NDV 또는 본원에 개시된 키메라 NDV(예를 들면, 하기 단락 2 참조)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 종양 항원을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이다(종양 항원의 예에 대해서는 하기 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이다(이종 인터페론 길항제의 예에 대해서는 하기 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0058141호에 개시된 키메라 NDV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0122185호에 개시된 키메라 NDV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IFN-γ, GM-CSF 및 TNF-α를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 IL-2, IL-15 또는 IL-21을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 사이토카인을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이다.
2. 키메라 뉴캐슬병 바이러스
한 양태에서, 면역 세포, 예컨대, T 림프구 또는 천연 살해(NK) 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제 및/또는 길항제는 비리온 내로 도입된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된다. 또 다른 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된다. 즉, NDV는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 천연 살해(NK) 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 "골격"으로서 사용된다. 보조자극 신호의 작용제의 구체적인 예 및 억제 신호의 길항제의 구체적인 예는 이하에 제공되어 있다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 또 다른 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제 및 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖고 세포융합체를 형성할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 NDV의 게놈은 NDV V 단백질 코딩 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작되는데, 이때 상기 F 단백질의 절단 부위는 상기 단백질이 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있게 함으로써 바이러스가 보다 더 효과적으로 세포 내로 들어가 세포융합체를 형성하게 하는 다중염기성 아미노산 서열을 생성하도록 돌연변이된다. 또 다른 특정 실시양태에서, NDV는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작되는데, 이때 상기 F 단백질의 절단 부위는 돌연변이체 절단 부위가 푸린 패밀리의 편재적으로 발현된 프로테아제에 의해 활성화될 수 있게 하는 1개 또는 2개의 추가 아르기닌 잔기를 함유하는 절단 부위로 교체된다. 이러한 돌연변이된 F 단백질을 발현하는 NDV의 구체적인 예에는 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 생성하기 위해 NDV F 단백질 내로 도입되는 돌연변이의 설명에 대해서는 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Park et al. (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203-2808)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 NDV의 게놈은 예컨대, 문헌(Elankumaran et al., 2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844)에 개시된 바와 같은 돌연변이된 NDV V 단백질 코딩 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 NDV의 게놈은 NDV V 단백질 코딩 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV의 모골격은 예컨대, 문헌(Elankumaran et al., 2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844)에 개시된 바와 같은 돌연변이된 V 단백질을 발현하도록 조작된 중간독성 또는 강독성 NDV이다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 사이토카인을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제, 및 사이토카인을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제, 및 사이토카인을 발현하도록 조작된다. 사이토카인의 구체적인 예에는 인터류킨(IL)-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, 인터페론(IFN)-γ, GM-CSF 및 종양 괴사 인자(TNF)-α가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 돌연변이된 F 단백질, 및 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IFN-γ, GM-CSF 및 TNF-α)을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같이) 돌연변이체 절단 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 아미노산 돌연변이 L289A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
일부 양태에서, 본원은 사이토카인, 예를 들면, IL-7, IL-15, IL-21, 또는 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 공지된 또 다른 사이토카인을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 사이토카인을 발현하도록 조작된 키메라 NDV 및 이러한 키메라 NDV를 제조하는 방법의 예에 대해서는 예를 들면, 실시예 2를 참조한다.
또 다른 양태에서, (i) 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 (ii) 종양 항원을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제, 및 종양 항원을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제, 및 종양 항원을 발현하도록 조작된다.
종양 항원은 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원을 포함한다. 종양 항원의 구체적인 예에는 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제(acetylglucosaminyltransferase)-V, p-15, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1(gp75), 티로시나제(Tyrosinase), 사이클린 의존성 키나제(kinase) 4, β-카테닌(catenin), MUM-1, CDK4, HER-2/neu, 인간 유두종 바이러스(papillomavirus)-E6, 인간 유두종 바이러스 E7, CD20, 암배아 항원(CEA), 표피 성장인자 수용체, MUC-1, 캐스파제(caspase)-8, CD5, 뮤신(mucin)-1, Lewisx, CA-125, p185HER2, IL-2R, Fap-α, 테나신(tenascin), 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)와 관련된 항원, 및 CAMPATH-1이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 다른 예에는 하기 항원들이 포함되나 이들로 한정되지 않는다: KS 1/4 범(pan)-암종 항원, 난소암종 항원(CA125), 전립선 산 포스페이트, 전립선 특이적 항원, 흑색종 관련 항원 p97, 흑색종 항원 gp75, 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA), 전립선 특이적 막 항원, CEA, 다형성 상피 뮤신 항원, 유지방 소구체 항원, 대장 종양 관련 항원(예를 들면, CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA), 버킷 림프종 항원-38.13, CD19, B 림프종 항원-CD20, CD33, 흑색종 특이적 항원(예컨대, 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, 강글리오사이드 GM3), 종양 특이적 이식 종류의 세포 표면 항원(TSTA)(예컨대, T-항원 DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 외피 항원을 비롯한, 바이러스로부터 유래된 종양 항원), 종양태아 항원-α-태아단백질, 예컨대, 결장의 CEA, 방광 종양 종양태아 항원, 분화 항원(예컨대, 인간 폐암종 항원 L6 및 L20), 섬유육종의 항원, 백혈병 T 세포 항원-Gp37, 신생당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원(예컨대, EGFR(표피 성장인자 수용체), HER2 항원(p185HER2) 및 HER2 neu 에피토프), 다형성 상피 뮤신(PEM), 악성 인간 림프구 항원-APO-1, 분화 항원(예컨대, 태아 적혈구에서 발견된 I 항원, 일차 내배엽, 성인 적혈구에서 발견된 I 항원, 착상전 배아, 위 선암종에서 발견된 I(Ma), M18, 유방 상피에서 발견된 M39, 골수성 세포에서 발견된 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 대장암에서 발견된 D156-22, TRA-1-85(혈액군 H), 결장 선암종에서 발견된 C14, 폐 선암종에서 발견된 F3, 위암에서 발견된 AH6, Y 햅텐, 배아암종 세포에서 발견된 Ley, TL5(혈액군 A), A431 세포에서 발견된 EGF 수용체, 췌장암에서 발견된 E1 시리즈(혈액군 B), 배아암종 세포에서 발견된 FC10.2, 위 선암종 항원, 선암종에서 발견된 CO-514(혈액군 Lea), 선암종에서 발견된 NS-10, CO-43(혈액군 Leb), A431 세포의 EGF 수용체에서 발견된 G49, 결장 선암종에서 발견된 MH2(혈액군 ALeb/Ley), 결장암에서 발견된 19.9, 위암 뮤신, 골수성 세포에서 발견된 T5A7, 흑색종에서 발견된 R24, 배아암종 세포에서 발견된 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 및 M1:22:25:8, 및 4-세포 내지 8-세포 단계 배아에서 발견된 SSEA-3 및 SSEA-4), 피부 T 세포 림프종으로부터의 T 세포 수용체 유래의 펩티드, C-반응성 단백질(CRP), 암 항원-50(CA-50), 유방암과 관련된 암 항원 15-3(CA15-3), 위장암과 관련된 암 항원-19(CA-19) 및 암 항원-242, 암종 관련 항원(CAA), 크로모그래닌 A, 상피 뮤신 항원(MC5), 인간 상피 특이적 항원(E1A), 루이스(a) 항원, 흑색종 항원, 흑색종 관련 항원 100, 25 및 150, 뮤신 유사 암종 관련 항원, 다중약물 내성 관련 단백질(MRPm6), 다중약물 내성 관련 단백질(MRP41), Neu 발암유전자 단백질(C-erbB-2), 신경 특이적 에놀라제(NSE), P-당단백질(mdr1 유전자 생성물), 다중약물 내성 관련 항원, p170, 다중약물 내성 관련 항원, 전립선 특이적 항원(PSA), CD56 및 NCAM.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 돌연변이된 F 단백질, 및 종양 항원을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은) 돌연변이체 절단 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 아미노산 돌연변이 L289A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 양태에서, (i) 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 (ii) 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제 및 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된다. 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 NDV의 예에 대해서는 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0058141호를 참조한다.
인터페론 길항제는 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,635,416호, 제7,060,430호 및 제7,442,527호에 기재된 기법을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용함으로써 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종 인터페론 길항제는 바이러스 단백질이다. 이러한 바이러스 단백질은 임의의 바이러스로부터 수득될 수 있거나 유래될 수 있고, 바이러스는 임의의 종을 감염시킬 수 있다(예를 들면, 상기 바이러스는 인간 또는 비-인간 포유동물을 감염시킬 수 있다). 예시적 이종 인터페론 길항제는 니파(Nipah) 바이러스 W 단백질, 니파 V 단백질, 에볼라(Ebola) 바이러스 VP35 단백질, 백시니아 바이러스 E3L 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) NS2 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1형 ICP34.5 단백질, C형 간염 바이러스 NS3-4 프로테아제, 선천성 면역에 대한 유도 또는 반응을 차단하는 우성 음성 세포 단백질(예를 들면, STAT1, MyD88, IKK 및 TBK), 및 선천성 면역 반응의 세포 조절제(예를 들면, SOCS 단백질, PIAS 단백질, CYLD 단백질, IkB 단백질, Atg5 단백질, Pin1 단백질, IRAK-M 단백질 및 UBP43)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 이종 인터페론 길항제에 대한 추가 정보에 대해서는 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0058141호를 참조한다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 돌연변이된 F 단백질, 및 이종 인터페론 길항제를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은) 돌연변이체 절단 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 아미노산 돌연변이 L289A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 전구-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 전구-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제 및 전구-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된다. 전구-아폽토시스 분자의 구체적인 예에는 Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxa, Puma, AIF, FasL 및 TRAIL이 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 돌연변이된 F 단백질 및 전구-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은) 돌연변이체 절단 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 아미노산 돌연변이 L289A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 및 항-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제, 및 항-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, NDV의 게놈은 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제, 및 항-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된다. 항-아폽토시스 분자의 구체적인 예에는 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 및 XIAP가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제, 돌연변이된 F 단백질, 및 항-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV가 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 고도의 융합유도성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은) 돌연변이체 절단 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 아미노산 돌연변이 L289A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 아미노산 돌연변이 L298A를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV와 상이한 종류 또는 균주의 NDV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, L289A를 갖는 돌연변이된 F 단백질은 절단 부위에서 1개, 2개 또는 3개의 아르기닌 잔기를 보유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질 이외의 F 단백질이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 골격 NDV F 단백질을 교체한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이된 F 단백질은 비리온 내로 도입된다.
일부 양태에서, 본원은 전구-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 항-아폽토시스 분자를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 전구-아폽토시스 분자 및 항-아폽토시스 분자의 예는 본원에서 제공되어 있다.
천연 균주, 변이체 또는 돌연변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종류 또는 균주의 NDV가 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작되고 일부 실시양태에서 사이토카인, 종양 항원, 이종 인터페론 길항제, 전구-아폽토시스 분자, 항-아폽토시스 분자 및/또는 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 골격으로서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조합요법에서 사용되는 NDV는 천연 균주이다. 일부 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 용해성 균주이다. 다른 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 비-용해성 균주이다. 일부 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 약독성 균주이다. 일부 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 중간독성 균주이다. 다른 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 강독성 균주이다. NDV 균주의 구체적인 예에는 73-T 균주, NDV HUJ 균주, 울스터 균주, MTH-68 균주, 이탈리언 균주, 히크만 균주, PV701 균주, 히츠너 B1 균주, 라 소타 균주(예를 들면, 진뱅크 제AY845400호 참조), YG97 균주, MET95 균주, 로아킨 균주 및 F48E9 균주가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 히츠너 B1 균주이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 진뱅크 제AF309418호 또는 제NC_002617호로 확인된 B1 균주이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 ATCC 제VR2239호로 확인된 NDV이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 유전 조작을 위한 골격으로서 사용되는 NDV는 라 소타 균주이다.
일부 실시양태에서, 키메라 NDV의 약독화 또는 추가 약독화는 키메라 NDV가 적어도 부분적으로 감염성을 유지하고 생체내에서 복제할 수 있되, 단지 낮은 역가를 발생시켜 비-병원성을 나타내는 임상 수준 미만의 감염을 야기할 정도로 요구된다(예를 들면, 문헌(Khattar et al., 2009, J. Virol. 83:7779-7782) 참조). 특정 실시양태에서, NDV는 V 단백질의 결실에 의해 약독화된다. 이러한 약독화된 키메라 NDV는 바이러스가 면역원, 예를 들면, 생백신으로서 작용하기 위해 대상체에게 투여되는 실시양태에 특히 적합할 수 있다. 상기 바이러스는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 약독화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 하기 물질들 중 1개, 2개 또는 3개 이상, 또는 전부, 및 자살 유전자를 발현한다: (1) 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제; (2) 면역 세포의 억제 신호의 길항제; (3) 사이토카인; (4) 종양 항원; (5) 이종 인터페론 길항제; (6) 전구-아폽토시스 분자; (7) 항-아폽토시스 분자; 및/또는 (8) 돌연변이된 F 단백질. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제, 및 일부 실시양태에서 돌연변이된 F 단백질 및 사이토카인을 발현하는 것 이외에 자살 유전자(예를 들면, 타이미딘 키나제), 또는 NDV 복제 또는 기능을 억제하는 또 다른 분자(NDV가 항생제 또는 항-바이러스제에 민감하게 만드는 유전자)를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 키메라 NDV는 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포의 억제 신호의 길항제, 및 일부 실시양태에서 돌연변이된 F 단백질 및 사이토카인을 발현하는 것 이외에 조직 특이적 마이크로RNA(miRNA) 표적 부위(예를 들면, miR-21, miR-184, miR-133a/133b, miR-137 및/또는 miR-193a 마이크로RNA에 의해 표적화되는 부위)를 코딩하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 키메라 NDV의 친화성(tropism)이 변경된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스의 친화성이 조직 특이적 또는 종양 특이적 프로테아제, 예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 및 유로키나제(urokinase)에 의해 인식되는 F 단백질 절단 부위의 변경에 의해 변경된다. 다른 실시양태에서, 바이러스의 친화성은 조직 특이적 miRNA 표적 부위의 도입에 의해 변경된다. 일부 실시양태에서, NDV HN 단백질은 종양 특이적 수용체를 인식하도록 돌연변이된다.
일부 실시양태에서, 하기 물질들 중 하나 이상의 물질이 키메라 NDV에 의해 키메라 단백질 또는 융합 단백질로서 발현된다: (1) 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제; (2) 면역 세포의 억제 신호의 길항제; (3) 사이토카인; (4) 종양 항원; (5) 이종 인터페론 길항제; (6) 전구-아폽토시스 분자; (7) 항-아폽토시스 분자; 및/또는 (8) 돌연변이된 F 단백질. 특정 실시양태에서, 키메라 단백질 또는 융합 단백질은 NDV F 또는 NDV HN 단백질의 경막 및 세포질 도메인 또는 이의 단편, 및 앞 문장에서 언급된 분자들 중 한 분자를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 키메라 단백질 또는 융합 단백질의 설명에 대해서는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0122185호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2007/064802호를 참조한다.
본원의 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제는 2개의 전사 유닛들 사이의 골격 NDV의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제는 M 전사 유닛과 P 전사 유닛 사이의 또는 HN 전사 유닛과 L 전사 유닛 사이의 골격 NDV의 게놈 내로 삽입된다. 본원의 다른 실시양태에 따르면, 사이토카인, 종양 항원, 이종 인터페론 길항제, 전구-아폽토시스 분자, 항-아폽토시스 분자 및/또는 돌연변이된 F 단백질은 2개 이상의 전사 유닛들 사이(예를 들면, M 전사 유닛과 P 전사 유닛 사이, 또는 HM 전사 유닛과 L 전사 유닛 사이)의 골격 NDV의 게놈 내로 삽입된다.
2.1. 면역 세포 자극제
본원에 기재된 키메라 NDV는 당업자에게 공지된, 면역 세포, 예를 들면, T 림프구, NK 세포 또는 항원 제시 세포(예를 들면, 수지상세포 또는 대식세포)의 보조자극 신호의 임의의 작용제 및/또는 억제 신호의 임의의 길항제를 발현하도록 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 작용제 및/또는 길항제는 면역 세포의 인간 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 인간 억제 신호의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 보조자극 신호의 작용제는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구(예를 들면, CD4+ 또는 CD8+ T 림프구), NK 세포 및/또는 항원 제시 세포(예를 들면, 수지상세포 또는 대식세포) 상에서 발견된 보조자극 분자(예를 들면, 보조자극 수용체)의 작용제이다. 보조자극 분자의 구체적인 예에는 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), 유도성 T 세포 보조자극제(ICOS 또는 CD278), OX40(CD134), CD27, CD28, 4-1BB(CD137), CD40, 림프독소-α(LT-α), LIGHT(림프독소와 유사하고, 유도성 발현을 나타내고 T 림프구에 의해 발현된 수용체인 HVEM에 대해 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D와 경쟁함), CD226, 세포독성 및 조절 T 세포 분자(CRTAM), 사멸 수용체 3(R3), 림프독소-β 수용체(LTBR), 경막 활성화제 및 CAML 상호작용제(TACI), B 세포 활성화 인자 수용체(BAFFR) 및 B 세포 성숙 단백질(BCMA)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 작용제는 면역 세포의 인간 보조자극 수용체의 작용제이다. 일부 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 ICOS의 작용제가 아니다. 일부 실시양태에서, 길항제는 면역 세포, 예를 들면, T 림프구(예를 들면, CD4+ 또는 CD8+ T 림프구), NK 세포 및/또는 항원 제시 세포(예를 들면, 수지상세포 또는 대식세포) 상에서 발견되는 억제 분자(예를 들면, 억제 수용체)의 길항제이다. 억제 분자의 구체적인 예에는 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4 또는 CD52), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1 또는 CD279), B 및 T 림프구 약화제(BTLA), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 막 단백질 3(TIM3), CD160, 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 면역글로불린 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1) 및 CD160이 포함된다. 특정 실시양태에서, 길항제는 면역 세포의 인간 억제 수용체의 길항제이다.
특정 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 보조자극 수용체의 구체적인 예에는 GITR, ICOS, OX40, CD27, CD28, 4-1BB, CD40, LT-α, LIGHT, CD226, CRTAM, DR3, LTBR, TACI, BAFFR 및 BCMA가 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항체는 면역 세포 상의 2개의 수용체들에 결합하는 이중특이적 항체이다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 면역 세포 상의 수용체 및 암세포 상의 또 다른 수용체에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 NDV F 단백질 또는 이의 단편, 또는 NDV HN 단백질 또는 이의 단편을 갖는 키메라 단백질로서 발현된다. 키메라 F 또는 키메라 HN 단백질의 생성에 대한 설명에 대해서는 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2012-0122185호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 키메라 단백질은 하기 실시예 1 및/또는 2에 기재된 키메라 F 단백질이다. 키메라 ICOSL-F 단백질 및 키메라 CD28-F 단백질을 생성하는 후술된 기법들을 이용하여 다른 키메라 F 단백질 또는 키메라 HN 단백질을 생성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 보조자극 수용체의 리간드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 천연 리간드의 단편이다. 천연 리간드의 구체적인 예에는 ICOSL, B7RP1, CD137L, OX40L, CD70, 헤르페스 바이러스 도입 매개자(HVEM), CD80 및 CD86이 포함된다. 천연 리간드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 천연 리간드의 아미노산 서열도 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, B7RP1(ICOSL로서도 공지됨; 진뱅크 인간: NM_015259.4, NP_056074.1 뮤린: NM_015790.3, NP_056605.1), CD137L(진뱅크 인간: NM_003811.3, NP_003802.1, 뮤린: NM_009404.3, NP_033430.1), OX40L(진뱅크 인간: NM_003326.3, NP_003317.1, 뮤린: NM_009452.2, NP_033478.1), CD70(진뱅크 인간: NM_001252.3, NP_001243.1, 뮤린: NM_011617.2, AAD00274.1), CD80(진뱅크 인간: NM_005191.3, NP_005182.1, 뮤린: NM_009855.2, NP_033985.3) 및 CD86(진뱅크 인간: NM_005191.3, CAG46642.1, 뮤린: NM_019388.3, NP_062261.3)의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 진뱅크에서 발견될 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드는 천연 리간드의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 천연 리간드의 적어도 일부 또는 천연 리간드의 유도체, 및 이종 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 천연 리간드의 적어도 일부 또는 천연 리간드의 유도체, 및 면역글로불린의 Fc 부분 또는 이의 단편을 포함한다. 리간드 융합 단백질의 일례는 (문헌(Meseck M et al., J Immunother. 2011 34:175-82)에 기재된) 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 4-1BB 리간드이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 NDV F 단백질 또는 이의 단편, 또는 NDV HN 단백질 또는 이의 단편을 갖는 키메라 단백질로서 발현된다. 특정 실시양태에서, 단백질은 하기 실시예 2에 기재된 키메라 HN 단백질이다. 키메라 HN-GITRL, 키메라 HN-OX40-L, 키메라 HN-4-1BBL 및/또는 키메라 HN-CD40L을 생성하는 후술된 기법들을 이용하여 다른 키메라 F 단백질 또는 키메라 HN 단백질을 생성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체에 대한 천연 리간드에 특이적으로 결합하고 천연 리간드가 억제 수용체에 결합하여 억제 신호(들)를 전달도입하는 것을 차단하는 항체(또는 항원 결합 단편) 또는 가용성 수용체이다. 억제 수용체에 대한 천연 리간드의 구체적인 예에는 PDL-1, PDL-2, B7-H3, B7-H4, HVEM, Gal9 및 아데노신이 포함된다. 천연 리간드에 결합하는 억제 수용체의 구체적인 예에는 CTLA-4, PD-1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3 및 A2aR이 포함된다.
특정 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체에 대한 천연 리간드에 특이적으로 결합하고 천연 리간드가 억제 수용체에 결합하여 억제 신호(들)를 전달도입하는 것을 차단하는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 천연 리간드에 특이적으로 결합하는 천연 억제 수용체의 단편 또는 천연 억제 수용체의 유도체의 단편(예를 들면, 천연 억제 수용체 또는 억제 수용체의 유도체의 세포외 도메인)이다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 천연 억제 수용체 또는 천연 억제 수용체의 유도체의 적어도 일부(예를 들면, 천연 억제 수용체 또는 천연 억제 수용체의 유도체의 세포외 도메인), 및 이종 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 천연 억제 수용체 또는 천연 억제 수용체의 유도체의 적어도 일부, 및 면역글로불린의 Fc 부분 또는 이의 단편을 포함한다. 가용성 수용체 융합 단백질의 일례는 (문헌(Huard B et al., Eur J Immunol. 1995 25:2718-21)에 기재된) LAG3-Ig 융합 단백질이다.
특정 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체에 대한 천연 리간드에 특이적으로 결합하고 천연 리간드가 억제 수용체에 결합하여 억제 신호(들)를 전달도입하는 것을 차단하는 항체(또는 항원 결합 단편)이다. 일부 특정 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 억제 리간드에 대한 항체의 구체적인 예는 항-PD-L1 항체이다(Iwai Y, et al. PNAS 2002; 99:12293-12297).
또 다른 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체에 결합하되 억제 신호(들)를 전달도입하지 않는 항체(또는 항원 결합 단편) 또는 리간드이다. 억제 수용체의 구체적인 예에는 CTLA-4, PD1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3 및 A2aR이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 억제 수용체에 대한 항체의 구체적인 예는 항-CTLA-4 항체이다(Leach DR, et al. Science 1996; 271: 1734-1736). 억제 수용체에 대한 항체의 또 다른 예는 항-PD-1 항체이다(Topalian SL, NEJM 2012; 28:3167-75).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 CTLA-4의 길항제, 예컨대, 이필리무맙(Ipilimumab) 또는 트레멜리무맙(Tremelimumab)을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 PD1의 길항제, 예를 들면, MDX-1106(BMS-936558), MK3475, CT-011, AMP-224 또는 MDX-1105를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 LAG3의 길항제, 예를 들면, IMP321을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 B7-H3에 결합하는 항체(예를 들면, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv), 예를 들면, MGA271을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV는 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV는 항-CD28 scvFv, ICOSL, CD40L, OX40L, CD137L, GITRL 및/또는 CD70을 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제는 보조자극 수용체와 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도한다(예를 들면, 선택적으로 유도한다). 특정 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 보조자극 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 유도한다. 특정 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 (i) 보조자극 수용체와 1개의 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 유도하고; (ii) 보조자극 수용체와 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 유도하지 않거나, 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 이러한 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 20%, 15%, 10%, 5% 또는 2% 미만, 또는 2% 내지 5%, 2% 내지 10%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 10% 내지 15% 또는 15% 내지 20%의 수준으로 유도한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제는 보조자극 수용체와 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 활성화시키거나 향상시킨다(예를 들면, 선택적으로 활성화시키거나 향상시킨다). 특정 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 보조자극 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 활성화시키거나 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 보조자극 수용체의 작용제는 (i) 보조자극 수용체와 1개의 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 상기 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 활성화시키거나 향상시키고; (ii) 보조자극 수용체와 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 활성화시키지 않거나 향상시키지 않거나, 상기 작용제의 부재 하에 보조자극 수용체와 이러한 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 20%, 15%, 10%, 5% 또는 2% 미만, 또는 2% 내지 5%, 2% 내지 10%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 10% 내지 15% 또는 15% 내지 20%의 수준으로 활성화시키거나 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 억제 수용체와 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 (예를 들면, 선택적으로) 억제하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 억제 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 길항제의 부재 하에 억제 수용체와 하나 이상의 그의 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 억제하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 억제 수용체의 길항제는 (i) 억제 수용체와 1개의 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 상기 길항제의 부재 하에 억제 수용체와 상기 1개의 특정 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상, 또는 25% 내지 50%, 25% 내지 75%, 50% 내지 75%, 50% 내지 95%, 75% 내지 95% 또는 75% 내지 100%의 수준으로 억제하거나 감소시키고; (ii) 억제 수용체와 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로를 억제하지 않거나 감소시키지 않거나, 상기 길항제의 부재 하에 억제 수용체와 이러한 하나 이상의 다른 리간드의 결합에 의해 유도된 하나 이상의 신호 전달도입 경로에 비해 20%, 15%, 10%, 5% 또는 2% 미만, 또는 2% 내지 5%, 2% 내지 10%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 10% 내지 15% 또는 15% 내지 20%의 수준으로 억제하거나 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제는 하나 이상의 면역 활성, 기능 또는 반응을 유도하고/하거나, 활성화시키고/시키거나 향상시킨다. 하나 이상의 면역 활성, 기능 또는 반응은 예를 들면, 항체 반응(체액성 반응) 또는 세포성 면역 반응, 예를 들면, 사이토카인 분비(예를 들면, 인터페론-γ), 헬퍼 활성 또는 세포 매개 세포독성의 형태일 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 세포 상에서의 활성화 마커(예를 들면, CD44, 그랜자임 또는 Ki-67)의 발현, 면역 세포 상에서의 보조자극 수용체(예를 들면, ICOS, CD28, OX40 또는 CD27)의 발현, 보조자극 수용체에 대한 리간드(예를 들면, B7HRP1, CD80, CD86, OX40L 또는 CD70)의 발현, 사이토카인 분비, 종양으로의 면역 세포(예를 들면, T 림프구, B 림프구 및/또는 NK 세포)의 침윤, 항체 생성, 이펙터 기능, T 세포 활성화, T 세포 분화, T 세포 증식, B 세포 분화, B 세포 증식 및/또는 NK 세포 증식이 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제와의 접촉 후 유도되고/되거나, 활성화되고/되거나 향상된다. 또 다른 실시양태에서, 골수 유래의 억제제 세포(MDSC) 종양 침윤 및 증식, Treg 종양 침윤, 활성화 및 증식, 말초 혈액 MDSC 및 Treg 수가 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제와의 접촉 후 억제된다.
3. NDV의 구축
본원에 기재된 NDV는 역유전학 기법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 역유전학 기법은 바이러스 중합효소에 의한 인식 및 성숙 비리온을 생성하기 위해 필요한 신호의 팩키징에 필수적인 음성 가닥 바이러스 RNA의 비-코딩 영역을 함유하는 합성 재조합 바이러스 RNA의 제조를 포함한다. 재조합 RNA는 재조합 DNA 주형으로부터 합성되고 정제된 바이러스 중합효소 복합체와 시험관내에서 재구성되어 세포를 형질감염시키는 데에 사용될 수 있는 재조합 리보핵단백질(RNP)을 형성한다. 시험관내에서 또는 생체내에서 합성 RNA의 전사 동안 바이러스 중합효소 단백질이 존재하는 경우 보다 더 효율적인 형질감염이 달성된다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자 내로 레스큐될 수 있다. 상기 기법들은 1992년 11월 24일자로 등록된 미국 특허 제5,166,057호; 1998년 12월 29일자로 등록된 미국 특허 제5,854,037호; 2000년 11월 14일자로 등록된 미국 특허 제6,146,642호; 1996년 2월 20일자로 공개된 유럽 특허 공개 제0702085A1호; 미국 특허출원 제09/152,845호; 1997년 4월 3일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 97/12032호; 1996년 11월 7일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 96/34625호; 유럽 특허 공개 제A780475호; 1999년 1월 21일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 99/02657호; 1998년 11월 26일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 98/53078호; 1998년 1월 22일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 98/02530호; 1999년 4월 1일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 99/15672호; 1998년 4월 2일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 98/13501호; 1997년 2월 20일자로 공개된 국제 특허출원 공개 제WO 97/06270호; 및 1997년 1월 25일자로 공개된 유럽 특허 제780475A1호(이들 각각은 전체로서 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
헬퍼 부재 플라스미드 기술도 본원에 기재된 NDV를 조작하는 데에 이용될 수 있다. 요약하건대, NDV(예를 들면, 히츠너 B1 균주)의 완전한 cDNA를 구축하고 플라스미드 벡터 내로 삽입하고 2개의 전사 유닛들(예를 들면, NDV P 유전자와 M 유전자; 또는 NDV HN 유전자와 L 유전자) 사이에 유일한 제한 부위를 함유하도록 조작한다. 이종 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 상기 유일한 제한 부위에서 바이러스 게놈 내로 삽입할 수 있다. 대안적으로, 삽입이 바이러스의 감염 및 복제 능력에 영향을 미치지 않는 한, 이종 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 억제 신호의 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 NDV 전사 유닛 내로 삽입되도록 조작할 수 있다. 단일 분절을 T7 프로모터와 간염 델타 바이러스 리보자임 사이에 위치시켜 T7 중합효소의 정확한 음성 전사체를 생성한다. 필요한 바이러스 단백질을 포함하는 플라스미드 벡터 및 발현 벡터를 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 입자를 생성한다(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 01/04333호; 미국 특허 제7,442,379호, 제6,146,642호, 제6,649,372호, 제6,544,785호 및 제7,384,774호; 문헌(Swayne et al. (2003). Avian Dis. 47:1047-1050; 및 문헌(Swayne et al. (2001). J. Virol. 11868-11873)(이들 각각은 전체로서 참고로 도입됨) 참조).
항체를 발현하는 키메라 NDV의 제조 기법은 당분야에서 공지되어 있다. 2개의 형질전환유전자들로부터 완전한 IgG를 발현하는 재조합 NDV의 발생에 대해서는 예를 들면, 문헌(Puhler et al., Gene Ther. 15(5): 371-283 (2008))을 참조한다.
단일 mRNA로부터 다수의 단백질들을 생성하는 바이시스트론(Bicistronic) 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 바이시스트론 기법은 IRES 서열을 사용함으로써 다수의 단백질들의 코딩 서열들을 단일 mRNA로 조작할 수 있게 한다. IRES 서열은 RNA 분자로의 리보좀의 내부 동원을 유도하고 캡(cap) 독립적인 방식으로 다운스트림(downstream) 번역을 가능하게 한다. 요약하건대, 한 단백질의 코딩 영역을 제2 단백질의 ORF 내로 도입한다. 삽입물은 적절한 발현 및/또는 기능에 필요한 IRES 및 임의의 비-번역 신호 서열에 의해 플랭킹된다. 삽입물은 제2 단백질의 개방 판독 프레임, 폴리아데닐화 또는 전사 프로모터를 파괴하지 않아야 한다(예를 들면, 문헌(Garcia-Sastre et al., 1994, J. Virol. 68:6254-6261) 및 문헌(Garcia-Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246)(이들 각각은 전체로서 본원에 참고로 도입됨) 참조).
4. NDV의 증식
본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 바이러스가 본원에 기재된 바이러스의 사용을 허용하는 역가까지 생장할 수 있게 하는 임의의 기판에서 증식될 수 있다. 한 실시양태에서, 기판은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)가 상응하는 야생형 바이러스에 대해 측정된 역가에 필적할만한 역가까지 생장할 수 있게 한다.
본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 세포(예를 들면, 조류 세포, 닭 세포 등), 부화란(예를 들면, 계란 또는 메추라기 알) 또는 동물(예를 들면, 조류)에서 생장될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 암세포, 예를 들면, 암종 세포(예를 들면, 유방암세포 및 전립선암세포), 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포 및 생식 세포 종양 세포(예를 들면, 정소암세포 및 난소암세포)에서 증식될 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 세포주, 예를 들면, 암세포주, 예컨대, HeLa 세포, MCF7 세포, THP-1 세포, U87 세포, DU145 세포, Lncap 세포 및 T47D 세포에서 증식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포주(예를 들면, 암세포 또는 암세포주)는 인간(들)로부터 수득되고/되거나 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 닭 세포 또는 부화란에서 증식된다. 대표적인 닭 세포는 닭 배아 섬유모세포 및 닭 배아 신장 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 Vero 세포에서 증식된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 암세포에서 증식된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 계란 또는 메추라기 알에서 증식된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 바이러스(예를 들면, 키메라 NDV)는 부화란에서 먼저 증식된 후 세포(예를 들면, 세포주)에서 증식된다.
본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 예를 들면, 6일령 내지 14일령, 6일령 내지 12일령, 6일령 내지 10일령, 6일령 내지 9일령, 6일령 내지 8일령 또는 10일령 내지 12일령의 부화란에서 증식될 수 있다. 어린 또는 미성숙 부화란이 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)를 증식시키는 데에 사용될 수 있다. 미성숙 부화란은 IFN이 결핍된 10일령 미만의 알, 예를 들면, 6일령 내지 9일령 또는 6일령 내지 8일령의 알을 포함한다. 미성숙 부화란은 IFN 시스템이 10일령 내지 12일령의 알에 비해 완전히 발달되지 않도록 생장 조건의 변경, 예를 들면, 항온처리 온도의 변화; 약물을 사용한 처리; 또는 알의 발달을 지연시키는 임의의 다른 변경의 결과로서 10일령 미만의 미성숙 알과 인공적으로 유사하게 만들어진 알도 포함한다. 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 부화란의 상이한 위치, 예를 들면, 요막강에서 증식될 수 있다. 바이러스의 생장 및 증식에 대한 상세한 논의에 대해서는 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,852,522호 및 제7,494,808호를 참조한다.
바이러스 단리를 위해, 전형적으로 잘 공지된 정화 절차, 예컨대, 구배 원심분리 및 컬럼 크로마토그래피로 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)를 세포 배양물로부터 제거하고 세포 성분으로부터 분리할 수 있고, 원하는 경우 당업자에게 잘 공지된 절차, 예를 들면, 플라크 분석을 이용하여 더 정제할 수 있다.
5. 투여 조성물 및 경로
본원은 조성물에서 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)의 사용도 포괄한다. 본원은 조성물에서 NDV로 감염된 세포 또는 NDV로 감염된 전체 암세포로부터의 원형질막 단편의 사용도 포괄한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약학 조성물, 예컨대, 면역원성 제제(예를 들면, 백신 제제)이다. 조성물은 암의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV)를 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 유효량의 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 및 임의적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV)는 약학 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다.
또 다른 실시양태에서, 약학 조성물(예를 들면, 종양용해물 백신)은 NDV로 감염된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 단편 제제를 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물(예를 들면, 전체 세포 백신)은 NDV로 감염된 암세포를 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 더 포함한다.
본원에서 제공된 약학 조성물은 조성물이 대상체에게 투여될 수 있게 하는 임의의 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 수의학 및/또는 인간 투여에 적합하다. 본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서의 사용에 대해 연방정부 또는 주정부의 규제 관청에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열되어 있다는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin)에 기재되어 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 대상체에게 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 예를 들면, 약학 조성물은 비경구, 정맥내, 동맥내, 흉막내, 흡입, 복강내, 경구, 피내, 대장, 두개내 및 종양내 투여에 적합하도록 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 경구, 복강내, 코내, 기관내, 흉막내, 두개내, 피하, 근육내, 국소, 폐 또는 종양내 투여를 위해 제제화될 수 있다.
6. 항암 용도 및 다른 용도
한 양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 암의 치료에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 유효량의 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된 키메라 NDV 또는 이의 조성물이 암을 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 키메라 NDV 또는 이의 조성물이 암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 키메라 NDV 또는 이의 조성물이 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 억제 신호의 길항제 및 돌연변이된 F 단백질을 발현하도록 조작된 키메라 NDV 또는 이의 조성물이 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
암을 치료하는 방법에서 사용되는 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신 또는 전체 세포 암 백신은 임의의 요법(예를 들면, 제1차, 제2차, 제3차, 제4차 또는 제5차 요법)으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 암을 치료하기 위해 투여되는 유일한 활성 성분이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 암을 치료하기 위해 투여되는 조성물에서 유일한 활성 성분이다.
키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물은 대상체에게 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 예를 들면, 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물은 비경구로(예를 들면, 정맥내로, 동맥내로 또는 피하로), 종양내로, 흉막내로, 코내로, 복강내로, 두개내로, 경구로, 직장으로, 흡입으로, 근육내로, 국소로 또는 피내로 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 간 동맥, 예를 들면, 간 동맥 주입을 통해 투여되는데, 이것은 중재적 영상의학 또는 동맥 관류 펌프의 배치를 통해 수행될 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 키메라 NDV는 수술중에 투여되거나, 복강경으로 투여되거나 내시경으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV의 복강내 투여는 직접적인 주입, 카테터를 통한 관주, 또는 복강경 동안의 주입에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 치료가 이용될 수 없는 암의 치료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물은 다른 통상적인 요법에 대한 대안으로서 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물 및 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 요법은 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물과 함께 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 추가 요법은 암의 치료에 현재 사용되고 있거나, 사용되었거나 유용한 것으로 공지되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 또는 이의 조성물은 지지요법, 통증 경감 요법, 또는 암에 대한 치료 효과를 갖지 않는 다른 요법과 함께 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)와 함께 투여되는 하나 이상의 추가 요법은 하기 단락 6.4.1에 기재된 하나 이상의 요법이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV) 및 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, 키메라 NDV 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
일부 실시양태에서, 2개, 3개 또는 다수의 NDV(본원에 기재된 1개 또는 2개 이상의 키메라 NDV, 예컨대, 상기 단락 2에 기재된 1개 또는 2개 이상의 키메라 NDV)가 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 암을 치료하기 위해 2개, 3개 또는 다수의 NDV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 제2 이상의 키메라 NDV는 이종 아미노산 서열(예를 들면, 사이토카인)을 발현하도록 조작된 천연 키메라 NDV 또는 조작된 키메라 NDV일 수 있다. 제1 키메라 NDV 및 제2 키메라 NDV는 동일한 약학 조성물 또는 상이한 약학 조성물의 일부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 키메라 NDV 및 제2 키메라 NDV는 동일한 투여 경로로 투여된다(예를 들면, 둘다 종양내로 또는 정맥내로 투여된다). 다른 실시양태에서, 제1 키메라 NDV 및 제2 키메라 NDV는 상이한 투여 경로로 투여된다(예를 들면, 한 키메라 NDV는 종양내로 투여되고, 다른 키메라 NDV는 정맥내로 투여된다).
특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된 제1 키메라 NDV는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 제2 키메라 NDV와 함께 암을 치료하기 위해 환자에게 투여된다. 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 제1 키메라 NDV는 하기 물질들 중 1개 또는 2개 이상의 물질을 발현하도록 조작된 제2 키메라 NDV와 함께 투여된다: 사이토카인(예를 들면, IL-2), 이종 인터페론 길항제, 종양 항원, 전구-아폽토시스 분자 및/또는 항-아폽토시스 분자. 특정 실시양태에서, 제1 키메라 NDV, 제2 키메라 NDV 또는 이들 둘다가 키메라 NDV의 융합유도 활성을 증가시키는 돌연변이된 F 단백질을 발현한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 제1 키메라 NDV, 제2 키메라 NDV 또는 이들 둘다가 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같이) 절단 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현한다.
특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제를 발현하도록 조작된 제1 키메라 NDV를 포함하는 제1 조성물(예를 들면, 약학 조성물)은 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 제2 키메라 NDV를 포함하는 제2 조성물(예를 들면, 약학 조성물)과 함께 암을 치료하기 위해 환자에게 투여된다. 다른 특정 실시양태에서, 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제를 발현하도록 조작된 제1 키메라 NDV를 포함하는 제1 조성물(예를 들면, 약학 조성물)은 하기 물질들 중 1개 또는 2개 이상의 물질을 발현하도록 조작된 제2 키메라 NDV를 포함하는 제2 조성물(예를 들면, 약학 조성물)과 함께 투여된다: 사이토카인(예를 들면, IL-2), 이종 인터페론 길항제, 종양 항원, 전구-아폽토시스 분자 및/또는 항-아폽토시스 분자. 특정 실시양태에서, 제1 키메라 NDV, 제2 키메라 NDV, 또는 이들 둘다가 키메라 NDV의 융합유도 활성을 증가시키는 돌연변이된 F 단백질을 발현한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 제1 키메라 NDV, 제2 키메라 NDV, 또는 이들 둘다가 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같이) 절단 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 발현한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)는 암의 치료에서 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 하기 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV) 또는 이의 조성물, 및 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 유효량의 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV) 또는 이의 조성물, 및 유효량의 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV) 및 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV) 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
하나 이상의 추가 요법과 함께 사용되는 NDV는 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 예를 들면, NDV 또는 이의 조성물은 비경구로(예를 들면, 정맥내로, 동맥내로 또는 피하로), 종양내로, 흉막내로, 코내로, 복강내로, 두개내로, 경구로, 직장으로, 흡입으로, 근육내로, 국소로 또는 피내로 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, NDV는 간 동맥, 예를 들면, 간 동맥 주입을 통해 투여되는데, 이것은 중재적 영상의학 또는 동맥 관류 펌프의 배치를 통해 수행될 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, NDV는 수술중에 투여되거나, 복강경으로 투여되거나 내시경으로 투여된다. 특정 실시양태에서, NDV의 복강내 투여는 직접적인 주입, 카테터를 통한 관주, 또는 복강경 동안의 주입에 의해 수행된다.
본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신 또는 전체 세포 암 백신은 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 본원에 기재된 방법에 따라 암을 치료하기 위한 임의의 요법(예를 들면, 제1차, 제2차, 제3차, 제4차 또는 제5차 요법)으로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 전체 암세포는 암의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 암세포 또는 암세포 집단과 접촉할 수 있고, 감염된 암세포 또는 암세포 집단은 암의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 암세포는 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암세포는 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 후 감마 방사선으로 처리된다. 특정 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 암세포가 대상체에서 증식할 수 없도록 처리된다. 특정 실시양태에서, 암세포는 대상체에서 증식할 수 없고 바이러스는 대상체를 감염시킬 수 없다. 한 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 감마 방사선으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 초음파처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 미토마이신 C로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 동결 및 해동으로 처리된다. 또 다른 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 투여되기 전에 열 처리로 처리된다. 암세포는 대상체에게 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 예를 들면, 암세포는 비경구로(예를 들면, 정맥내로 또는 피하로), 종양내로, 코내로, 경구로, 흡입으로, 흉막내로, 국소로 또는 피내로 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암세포는 대상체에게 종양내로 투여되거나 대상체의 피부로(예를 들면, 피내로) 투여된다. 사용되는 암세포는 자가 또는 동종이계 암세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV의 골격은 비-용해성 균주이다. 암세포는 단독으로 또는 추가 요법과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 암세포는 바람직하게는 약학 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 암세포는 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 암세포 및 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, 암세포 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 전체 암세포는 본원의 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 암의 치료에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 전체 암세포를 본원의 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 유효량의 전체 암세포를 하기 단락 6.4에 기재된 유효량의 하나 이상의 추가 요법과 함께 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 전체 암세포 및 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 전체 암세포 및 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
또 다른 양태에서, 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 용해된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 제제가 암의 치료에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV로 감염된 암세포로부터의 단편을 포함하는 원형질막 제제가 암의 치료에 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV로 감염된 암세포로부터의 단백질 농축물이 암의 치료에 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 기법이 상기 단백질 농축물 또는 원형질막 제제를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)를 암세포 또는 암세포 집단과 접촉시킬 수 있고, 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 감염된 암세포 또는 암세포 집단을 용해시켜 NDV로 감염된 암세포의 단백질 농축물 또는 원형질막 단편을 수득할 수 있고, NDV로 감염된 암세포의 단백질 농축물 또는 원형질막 단편은 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 단백질 농축물 또는 원형질막 단편은 대상체에게 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 농축물 또는 원형질막 단편은 비경구로, 종양내로, 코내로, 흉막내로, 경구로, 흡입으로, 국소로 또는 피내로 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 단백질 농축물 또는 원형질막 제제는 대상체의 종양내로 또는 피부로(예를 들면, 피내로) 투여된다. 단백질 농축물 또는 원형질막 제제를 생성하는 데에 사용되는 암세포는 자가 또는 동종이계 암세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 키메라 NDV의 골격은 용해성 균주이다. 단백질 농축물 또는 원형질막 제제는 단독으로 또는 추가 요법과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 단백질 농축물 또는 원형질막 제제는 바람직하게는 약학 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 단백질 농축물 또는 원형질막 제제는 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 단백질 농축물 또는 원형질막 제제 및 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, 단백질 농축물 또는 원형질막 제제 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
또 다른 양태에서, NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 용해된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 제제는 암의 치료에서 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원은 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 용해된 암세포로부터의 단백질 농축물 또는 원형질막 제제를 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원은 NDV(예를 들면, 상기 단락 1에 기재된 NDV)로 감염된 용해된 암세포로부터의 유효량의 단백질 농축물 또는 원형질막 제제를 유효량의 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4(예를 들면, 단락 6.4.1)에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질 농축물 또는 원형질막 제제 및 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시양태에서, 상기 단백질 농축물 또는 원형질막 제제 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 진단 면역분석, 수동 면역요법 및 항-이디오타입 항체의 생성에 사용될 수 있는 항체를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)는 단리되어 예를 들면, 진단 분석, 수동 면역요법 및 항-이디오타입 항체의 생성에 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 대상체(예를 들면, 마우스, 래트, 돼지, 말, 당나귀, 새 또는 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1 또는 2에 기재된 NDV)는 단리되어 예를 들면, 진단 분석, 수동 면역요법 및 항-이디오타입 항체의 생성에 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 대상체(예를 들면, 마우스, 래트, 돼지, 말, 당나귀, 새 또는 인간)에게 투여된다. 생성된 항체는 당분야에서 공지된 표준 기법(예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)에 의해 단리될 수 있고 진단 면역분석, 수동 면역요법 및 항-이디오타입 항체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)를 투여받은 대상체로부터 단리된, 또는 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 1 또는 2에 기재된 NDV)를 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 하나 이상의 추가 요법과 함께 투여받은 대상체로부터 단리된 항체는 NDV 단백질, 키메라 NDV에 의해 발현된 이종 펩티드 또는 단백질, 또는 이들 둘다의 발현을 평가하는 데에 사용된다. 방사면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 및 면역전기영동 분석과 같은 기법들을 사용하는 경쟁 분석 시스템 및 비-경쟁 분석 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당분야에서 공지된 임의의 면역분석 시스템이 이 목적을 위해 사용될 수 있다.
6.1. 환자 집단
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암에 대한 소인을 갖거나 암에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암으로 진단받은 대상체에게 투여된다. 암의 종류의 구체적인 예는 본원에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 1기, 2기, 3기 또는 4기 암을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 관해중이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 암의 재발을 갖는다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 0개월 내지 6개월, 6개월 내지 12개월, 6개월 내지 18개월, 18개월 내지 36개월, 1세 내지 5세, 5세 내지 10세, 10세 내지 15세, 15세 내지 20세, 20세 내지 25세, 25세 내지 30세, 30세 내지 35세, 35세 내지 40세, 40세 내지 45세, 45세 내지 50세, 50세 내지 55세, 55세 내지 60세, 60세 내지 65세, 65세 내지 70세, 70세 내지 75세, 75세 내지 80세, 80세 내지 85세, 85세 내지 90세, 90세 내지 95세, 또는 95세 내지 100세의 연령을 갖는 인간에게 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 인간 영아에게 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 인간 유아에게 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 인간 소아에게 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 성인에게 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 노인에게 투여된다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 면역손상된 상태 또는 면억억제된 상태의 대상체, 또는 면역손상될 또는 면역억제될 위험을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 면역억제 요법을 제공받거나 면역억제 요법으로부터 회복되는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암을 갖거나 암을 가질 위험을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 수술, 화학요법 및/또는 방사선요법을 받거나, 받을 것이거나 받았다. 일부 실시양태에서, 환자는 종양 또는 신생물을 제거하기 위한 수술을 받았다. 특정 실시양태에서, 환자는 종양 또는 신생물을 제거하기 위한 수술 후 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법을 투여받는다. 다른 실시양태에서, 환자는 종양 또는 신생물을 제거하기 위한 수술을 받기 전에 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법을 투여받는다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 조직 이식, 장기 이식 또는 수혈을 받거나, 받을 것이거나 받은 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 키메라 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물, 전체 세포 백신, 또는 조합요법 이외의 요법에 대한 불응성을 갖는 것으로 입증되었으나 이들 요법들을 더 이상 받지 않는 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 화학요법에 대한 불응성을 갖는 것으로 입증된 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 암이 요법에 불응성을 갖는다는 것은 암세포들의 적어도 일부 상당한 부분이 사멸되지 않거나 그들의 세포 분열이 정지되지 않는다는 것을 의미한다. 이와 관련하여 당분야에서 받아들여지는 "불응성"의 의미를 사용할 때 암세포에 대한 요법의 효과를 분석하는 당분야에서 공지된 임의의 방법으로 생체내에서 또는 시험관내에서 암세포가 불응성을 갖는지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불응성 환자는 표준 요법에 대한 불응성을 갖는 환자이다. 일부 실시양태에서, 암을 갖는 환자는 종양 또는 신생물이 유의하게 박멸되지 않았고/않았거나 증상이 유의하게 호전되지 않았을 때 요법에 대한 불응성을 갖는다. 이와 관련하여 당분야에서 받아들여지는 "불응성"의 의미를 사용할 때 암의 치료의 효과를 분석하는 당분야에서 공지된 임의의 방법으로 생체내에서 또는 시험관내에서 환자가 불응성을 갖는지를 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 환자는 항생제, 항-바이러스제, 항-진균제, 또는 다른 생물학적 요법/면역요법 또는 항암 요법으로 이미 치료받은 환자이다. 이들 환자들 중에는 불응성 환자, 및 통상적인 요법으로 치료하기에는 너무 어린 환자가 있다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV), 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법을 투여받는 대상체는 키메라 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법의 투여 전에 요법을 제공받지 않았다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암을 발생시킬 위험을 갖는 환자에서 암의 발병을 예방하기 위해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 통상적인 요법에 대한 불리한 반응을 일으키기 쉬운 환자에게 투여된다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법을 투여받는 대상체는 선행 요법을 제공받지 않았다. 다른 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법의 투여 전에 요법을 제공받은 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법이 투여된 대상체는 선행 요법에 대한 불리한 부작용을 경험하였거나, 선행 요법이 대상체에게 허용불가능한 수준의 독성을 야기하였기 때문에 중단되었다.
6.2. 용량 및 빈도
암의 치료에 효과적일 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신 또는 전체 세포 백신의 양은 암의 성질, 투여 경로, 대상체의 일반적인 건강 등에 의해 좌우될 것이고, 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다. 표준 임상 기법, 예컨대, 시험관내 분석이 최적 용량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 임의적으로 사용될 수 있다. 그러나, 투여를 위한 NDV의 적합한 용량 범위는 일반적으로 약 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 또는 1012 pfu, 가장 바람직하게는 약 104 내지 약 1012, 106 내지 1012, 108 내지 1012, 109 내지 1012, 또는 109 내지 1011 pfu이고, 필요한 만큼 빈번한 간격으로 대상체에게 1회, 2회, 3회 또는 4회 이상 투여될 수 있다. 투여를 위한 종양용해물 백신의 용량 범위는 0.001 mg, 0.005 mg, 0.01 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.5 mg, 1.0 mg, 2.0 mg, 3.0 mg, 4.0 mg, 5.0 mg, 10.0 mg, 0.001 mg 내지 10.0 mg, 0.01 mg 내지 1.0 mg, 0.1 mg 내지 1 mg, 및 0.1 mg 내지 5.0 mg을 포함하고, 필요한 만큼 빈번한 간격으로 대상체에게 1회, 2회 또는 3회 이상 투여될 수 있다. 투여를 위한 전체 세포 백신의 용량 범위는 102개, 5 x 102개, 103개, 5 x 103개, 104개, 5 x 104개, 105개, 5 x 105개, 106개, 5 x 106개, 107개, 5 x 107개, 108개, 5 x 108개, 1 x 109개, 5 x 109개, 1 x 1010개, 5 x 1010개, 1 x 1011개, 5 x 1011개 또는 1012개 세포를 포함할 수 있고, 필요한 만큼 빈번한 간격으로 대상체에게 1회, 2회 또는 3회 이상 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, NDV, 종양용해물 백신 또는 전체 세포 백신에 대한 임상 시험에서 현재 사용되는 용량과 유사한 용량이 대상체에게 투여된다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량 반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
일부 실시양태에서, NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물은 단일 용량으로서 대상체에게 투여되고, 이어서 1주 내지 6주, 1주 내지 5주, 1주 내지 4주, 1주 내지 3주, 또는 1주 내지 2주 후에 제2 용량이 투여된다. 이 실시양태에 따르면, 제2 접종 후 부스터 접종이 6개월 내지 12개월 간격으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양용해물 백신 또는 전체 세포 백신은 단일 용량으로서 대상체에게 투여되고, 이어서 1주 내지 6주, 1주 내지 5주, 1주 내지 4주, 1주 내지 3주, 또는 1주 내지 2주 후에 제2 용량이 투여된다.
일부 실시양태에서, 동일한 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신의 투여는 반복될 수 있고, 상기 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 15일, 21일, 28일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 6개월 이상의 간격으로 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 동일한 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신의 투여는 반복될 수 있고, 상기 투여는 1일 내지 14일, 1일 내지 7일, 7일 내지 14일, 1일 내지 30일, 15일 내지 30일, 15일 내지 45일, 15일 내지 75일, 15일 내지 90일, 1개월 내지 3개월, 3개월 내지 6개월, 3개월 내지 12개월, 또는 6개월 내지 12개월의 간격으로 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 NDV(예를 들면, 제1 키메라 NDV) 또는 이의 조성물이 대상체에게 투여된 후, 제2 NDV(예를 들면, 제2 키메라 NDV) 또는 이의 조성물이 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 NDV 및 제2 NDV(예를 들면, 제1 키메라 NDV 및 제2 키메라 NDV) 또는 이들의 조성물의 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 15일, 21일, 28일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 6개월 이상의 간격으로 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 NDV 및 제2 NDV(예를 들면, 제1 키메라 NDV 및 제2 키메라 NDV) 또는 이들의 조성물의 투여는 1일 내지 14일, 1일 내지 7일, 7일 내지 14일, 1일 내지 30일, 15일 내지 30일, 15일 내지 45일, 15일 내지 75일, 15일 내지 90일, 1개월 내지 3개월, 3개월 내지 6개월, 3개월 내지 12개월, 또는 6개월 내지 12개월의 간격으로 분리될 수 있다.
일부 실시양태에서, NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 하나 이상의 추가 요법, 예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된 요법과 함께 대상체에게 투여된다. 다른 하나 이상의 추가 요법의 용량은 예를 들면, 요법, 암의 성질, 투여 경로, 대상체의 일반적인 건강 등을 포함하는 다양한 요인들에 의해 좌우될 것이고, 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다. 특정 실시양태에서, 상기 다른 요법의 용량은 본원에 개시된 방법에 따라 단일 약제로서 사용될 요법에 대한 권장된 요법의 용량 및/또는 투여 빈도이다. 다른 실시양태에서, 상기 다른 요법의 용량은 본원에 개시된 방법에 따라 단일 약제로서 사용될 요법에 대한 권장된 용량 및 투여 빈도보다 더 낮은 요법의 용량 및/또는 투여 빈도이다. 승인된 요법에 대한 권장된 용량은 문헌(Physician's Desk Reference)에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태에서, NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 하나 이상의 추가 요법의 투여와 동시에 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 3일 내지 7일마다, 1주 내지 6주마다, 1주 내지 5주마다, 1주 내지 4주마다, 2주 내지 4주마다, 1주 내지 3주마다, 또는 1주 내지 2주마다 대상체에게 투여되고, (예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된) 하나 이상의 추가 요법은 3일 내지 7일마다, 1주 내지 6주마다, 1주 내지 5주마다, 1주 내지 4주마다, 2주 내지 4주마다, 1주 내지 3주마다, 또는 1주 내지 2주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 1주 내지 2주마다 대상체에게 투여되고, (예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된) 하나 이상의 추가 요법은 2주 내지 4주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 매주 대상체에게 투여되고, (예컨대, 하기 단락 6.4에 기재된) 하나 이상의 추가 요법은 2주마다 투여된다.
6.3. 암의 종류
본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 암의 구체적인 예에는 하기 암들이 포함되나 이들로 한정되지 않는다: 백혈병, 예컨대, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수세포성 백혈병, 예컨대, 골수모세포성, 전구골수세포성, 골수단핵세포성, 단핵세포성 및 적백혈병성 백혈병, 및 골수형성이상 증후군(그러나, 이들로 한정되지 않음); 만성 백혈병, 예컨대, 만성 골수세포성 (과립세포성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 모발세포 백혈병(그러나, 이들로 한정되지 않음); 진성적혈구증가증; 림프종, 예컨대, 호지킨병 및 비-호지킨병(그러나, 이들로 한정되지 않음); 다발성 골수종, 예컨대, 무증상 다발성 골수종, 비-분비형 골수종, 골경화성 골수종, 플라캔서(placancer) 세포 백혈병, 고립 플라캔서세포종(placancercytoma) 및 골수외 플라캔서세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 의미미결정 단일클론 감마글로불린병증; 양성 단일클론 감마글로불린병증; 중쇄 질환; 골 및 결합 조직 육종, 예컨대, 골 육종, 골육종, 연골육종, 에윙 육종, 악성 거대세포 종양, 골의 섬유육종, 척삭종, 골막 육종, 연조직 육종, 맥관육종(혈관육종), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프혈관육종, 신경집종, 횡문근육종 및 활막 육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 뇌종양, 예컨대, 신경아교종, 성상세포종, 뇌간신경아교종, 뇌실막종, 희소돌기아교종, 비-신경아교 종양, 다형성 신경아교모세포종, 청신경집종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 송과체종, 송과체모세포종 및 일차 뇌 림프종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 관상암종, 선암종, 소엽(암세포)암종, 관내암종, 수질 유방암, 점액 유방암, 관형 유방암, 유두형 유방암, 파게트병 및 염증성 유방암을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유방암; 부신암, 예컨대, 크롬친화세포종 및 부신피질암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 갑상선암, 예컨대, 유두형 또는 소포형 갑상선암, 수질 갑상선암 및 역형성 갑상선암(그러나, 이들로 한정되지 않음); 췌장암, 예컨대, 인슐린암종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴 분비 종양, 및 카르시노이드 또는 췌도 세포 종양(그러나, 이들로 한정되지 않음); 뇌하수체암, 예컨대, 쿠싱병, 프로락틴 분비 종양, 말단비대증 및 요붕증(그러나, 이들로 한정되지 않음); 안암, 예컨대, 안구 흑색종, 예컨대, 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 섬모체 흑색종 및 망막모세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 질암, 예컨대, 편평세포암종, 선암종 및 흑색종; 음문암, 예컨대, 편평세포암종, 흑색종, 선암종, 기저세포암종, 육종 및 파게트병; 자궁경부암, 예컨대, 편평세포암종 및 선암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 자궁암, 예컨대, 자궁내막암종 및 자궁육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 난소암, 예컨대, 난소 상피암종, 경계선 종양, 생식 세포 종양 및 간질 종양(그러나, 이들로 한정되지 않음); 식도암, 예컨대, 편평암, 선암종, 아데노이드 낭성암종, 점막표피모양암종, 선편평상피암종, 육종, 흑색종, 플라캔서세포종, 사마귀모양암종 및 귀리세포(암세포)암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 위암, 예컨대, 돌출형(폴립모양), 궤양성, 표재 퍼짐 또는 확산 퍼짐 선암종, 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종 및 암육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 결장암; 직장암; 간암, 예컨대, 간세포암종 및 간모세포종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 담낭암, 예컨대, 선암종; 담관암종, 예컨대, 유두형, 결절형 및 확산형 담관암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 폐암, 예컨대, 비-암세포 폐암, 편평세포암종(표피모양암종), 선암종, 거대세포암종 및 암세포 폐암; 정소암, 예컨대, 배종양, 역형성, 고전적(전형적) 또는 정모세포성 고환종, 비-고환종, 배아암종, 기형종암종, 융모막암종(난황낭 종양)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 전립선암, 예컨대, 전립선 상피내 신생물, 선암종, 평활근육종 및 횡문근육종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 음경암; 구강암, 예컨대, 편평세포암종(그러나, 이것으로 한정되지 않음); 기저암; 타액선암, 예컨대, 선암종, 점막표피형암종 및 선양낭성암종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 인두암, 예컨대, 편평세포암 및 사마귀모양암(그러나, 이들로 한정되지 않음); 피부암, 예컨대, 기저세포암종, 편평세포암종 및 흑색종, 표재 퍼짐 흑색종, 결절형 흑색종, 흑색점 악성 흑색종 및 말단 흑색점 흑색종(그러나, 이들로 한정되지 않음); 신장암, 예컨대, 신장세포암종, 선암종, 콩팥세포암종, 섬유육종 및 전이세포암(신우 및/또는 요관)(그러나, 이들로 한정되지 않음); 윌름스 종양; 및 방광암, 예컨대, 전이세포암종, 편평세포암, 선암종 및 암육종(그러나, 이들로 한정되지 않음)이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 암은 점액육종, 골생성육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 활막종, 혈관모세포종, 상피암종, 낭선암종, 기관지원성암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두형 암종 및 유두형 선암종을 포함한다(이러한 장애의 검토를 위해서는 문헌(Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America) 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 NDV 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 하기 질환들을 포함하는(그러나, 이들로 한정되지 않는) 다양한 암들 및 비정상적 증식 질환의 치료에 유용하다: 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종을 포함하는 암종; 편평세포암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전구골수세포성 백혈병을 포함하는 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 유래의 종양; 흑색종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 슈반세포종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 유래의 종양; 및 흑색종, 색소성건피증, 각질가시세포종, 고환종, 소포성 갑상선암 및 기형암종을 포함하는 다른 종양.
일부 실시양태에서, 아폽토시스에서의 이상과 관련된 암이 본원에 기재된 방법에 따라 치료된다. 이러한 암은 소포성 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 전구암성 병변, 예컨대, 가족성 선종성 폴립증 및 골수형성이상 증후군을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 피부, 폐, 간, 골, 뇌, 위, 결장, 유방, 전립선, 방광, 신장, 췌장, 난소 및/또는 자궁의 악성 또는 이상증식성 변화(예컨대, 화생 및 형성이상), 또는 과다증식성 장애가 본원에 기재된 방법에 따라 치료된다. 다른 특정 실시양태에서, 육종 또는 흑색종이 본원에 기재된 방법에 따라 치료된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 백혈병, 림프종 또는 흑색종(예를 들면, 다발성 골수종)이다. 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 백혈병 및 다른 혈액 유래의 암의 구체적인 예에는 급성 림프모세포성 백혈병 "ALL", 급성 림프모세포성 B 세포 백혈병, 급성 림프모세포성 T 세포 백혈병, 급성 골수모세포성 백혈병 "AML", 급성 전구골수세포성 백혈병 "APL", 급성 단핵모세포성 백혈병, 급성 적백혈병성 백혈병, 급성 거핵모세포성 백혈병, 급성 골수단핵세포성 백혈병, 급성 비-림프세포성 백혈병, 급성 미분화된 백혈병, 만성 골수세포성 백혈병 "CML", 만성 림프구성 백혈병 "CLL" 및 모발세포 백혈병이 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 림프종의 구체적인 예에는 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환 및 진성적혈구증가증이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 고형 종양이다. 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 고형 종양의 예에는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골생성육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 에윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 대장암, 신장암, 췌장암, 골암, 유방암, 난소암, 전립선암, 식도암, 위암, 구강암, 코암, 목암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두형 암종, 유두형 선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지성암종, 신장세포암종, 간암, 담관암종, 융모막암종, 고환종, 배아암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 정소암, 암세포 폐암종, 방광암종, 폐암, 상피암종, 신경아교종, 다형성 신경아교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 피부암, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 전이성 암이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 악성 암이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 통상적인 요법, 예컨대, 화학요법 및 방사선에 대한 좋지 않은 예후 및/또는 좋지 않은 반응을 갖는 암이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 악성 흑색종, 악성 신경아교종, 신장세포암종, 췌장 선암종, 악성 흉막 중피종, 폐 선암종, 폐 소세포암종, 폐 편평세포암종, 역형성 갑상선암, 및 두경부 편평세포암종이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 암은 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 종류의 암이다.
6.4. 추가 요법
암의 치료를 위해 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신과 함께 사용될 수 있는 추가 요법은 소분자, 합성 약물, 펩티드(환형 펩티드를 포함함), 폴리펩티드, 단백질, 핵산(예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 삼중 나선, RNAi, 및 생물학적 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는 DNA 및 RNA 뉴클레오티드), 항체, 합성 또는 천연 무기 분자, 모방체(mimetic agent), 및 합성 또는 천연 유기 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 화학요법제이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 암세포를 파괴하기 위해 X-선, γ-선 및 다른 방사선 공급원의 사용을 포함하는 방사선요법과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, 방사선요법은 외부 광선 방사선 또는 원격요법(teletherapy)으로서 투여되는데, 이때 상기 방사선은 멀리 떨어진 공급원으로부터 유도된다. 다른 실시양태에서, 방사선요법은 내부요법 또는 근접요법으로서 투여되는데, 이때 방사성 공급원은 암세포 및/또는 종양 덩어리와 가깝게 신체 내부에 배치된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 암 백신은 양자 T 세포 요법과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, 양자 T 세포 요법에서 사용되는 T 세포는 대상체로부터 단리된 종양 침윤 림프구이고, 특정 T 세포 또는 클론이 이의 사용을 위해 증폭된다. 일부 실시양태에서, 양자 T 세포 요법에서 사용되는 T 세포는 암 백신을 제공받은 후 환자의 혈액으로부터 채취되고 사용 전에 시험관내에서 증폭된 T 세포이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 양자 T 세포 요법에서 사용되는 T 세포는 종양을 강력히 인식하고 공격하도록 영향을 받은 T 세포이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 양자 T 세포 요법에서 사용되는 T 세포는 종양 항원 특이적 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변경되어 있다. 특정 실시양태에서, 사용되는 양자 T 세포 요법은 하기 실시예 2에 기재된 것과 유사하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 암 백신은 사이토카인과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 암 백신은 인터페론(예를 들면, IFN-γ)과 함께 사용된다.
현재 사용될 수 있는 암 요법들, 및 이들의 용량, 투여 경로 및 권장된 용도는 당분야에서 공지되어 있고, 예컨대, 문헌(the Physician's Desk Reference (67th ed., 2013))에 기재되어 있다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물과 함께 사용될 수 있는 항암제의 구체적인 예에는 호르몬제(예를 들면, 아로마타제(aromatase) 억제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 및 에스트로겐 수용체 길항제), 화학요법제(예를 들면, 마이크로튜불 해체 차단제, 항-대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, 및 DNA 교차연결제 또는 손상제), 항-혈관신생제(예를 들면, VEGF 길항제, 수용체 길항제, 인테그린 길항제, 혈관 표적화제(VTA)/혈관 파괴제(VDA)), 방사선요법, 및 통상적인 수술이 포함된다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물과 함께 사용될 수 있는 호르몬제의 비-한정적인 예에는 아로마타제 억제제, SERM 및 에스트로겐 수용체 길항제가 포함된다. 아로마타제 억제제인 호르몬제는 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 호르몬제일 수 있다. 비-스테로이드성 호르몬제의 비-한정적인 예에는 레트로졸, 아나스트로졸, 아미노글루테티마이드, 파드로졸 및 보로졸이 포함된다. 스테로이드성 호르몬제의 비-한정적인 예에는 아로마신(aromasin)(엑세메스탄(exemestane)), 포르메스탄(formestane) 및 테스토락톤(testolactone)이 포함된다. SERM인 호르몬제의 비-한정적인 예에는 타목시펜(tamoxifene)(놀바덱스(Nolvadex)®로서 브랜드화/시판됨), 아피목시펜(afimoxifene), 아르족시펜(arzoxifene), 바제독시펜(bazedoxifene), 클로미펜(clomifene), 페마렐(femarelle), 라소폭시펜(lasofoxifene), 오르멜록시펜(ormeloxifene), 랄록시펜(raloxifene) 및 토레미펜(toremifene)이 포함된다. 에스트로겐 수용체 길항제인 호르몬제의 비-한정적인 예에는 풀베스트란트(fulvestrant)가 포함된다. 다른 호르몬제는 아비라테론(abiraterone) 및 로나프리산(lonaprisan)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신과 함께 사용될 수 있는 화학요법제의 비-한정적인 예에는 마이크로튜불 해체 차단제, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 및 DNA 가교연결제 또는 손상제가 포함된다. 마이크로튜불 해체 차단제인 화학요법제는 탁산(taxenes)(예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel)(탁솔(TAXOL)®로서 브랜드화/시판됨), 도세탁셀(docetaxel), 아브락산(abraxane), 라로탁셀(larotaxel), 오르타탁셀(ortataxel) 및 테세탁셀(tesetaxel)); 에포틸론(epothilones)(예를 들면, 익사베필론(ixabepilone)); 및 빈카 알칼로이드(예를 들면, 비노렐빈(vinorelbine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine) 및 빈크리스틴(vincristine)(온코빈(ONCOVIN)®으로서 브랜드화/시판됨)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
항-대사물질인 화학요법제는 폴레이트 항-대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate), 아미노프테린(aminopterin), 페메트렉세드(pemetrexed), 랄티트렉세드(raltitrexed)); 푸린 항-대사물질(예를 들면, 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 플루다라빈(fludarabine), 머캡토푸린(mercaptopurine), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine)); 피리미딘 항-대사물질(예를 들면, 5-플루오로우라실, 카페시타빈(capecitabine), 겜시타빈(gemcitabine)(겜자르(GEMZAR)®), 사이타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 플록수리딘(floxuridine), 테가푸르(tegafur)); 및 데옥시리보뉴클레오티드 항-대사물질(예를 들면, 하이드록시우레아)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
토포이소머라제 억제제인 화학요법제는 클래스 I(캄토테카(camptotheca)) 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 토포테칸(topotecan)(하이캄틴(HYCAMTIN)®으로서 브랜드화/시판됨), 이리노테칸(irinotecan), 루비테칸(rubitecan) 및 벨로테칸(belotecan)); 클래스 II (포도필룸(podophyllum)) 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 에토포사이드(etoposide) 또는 VP-16, 및 테니포사이드(teniposide)); 안쓰라사이클린(예를 들면, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 독실(Doxil), 아클라루비신(aclarubicin), 암루비신(amrubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 피라루비신(pirarubicin), 발루비신(valrubicin) 및 조루비신(zorubicin)); 및 안쓰라세네다이온(anthracenediones)(예를 들면, 미톡산트론(mitoxantrone) 및 픽산트론(pixantrone))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
DNA 가교연결제(또는 DNA 손상제)인 화학요법제는 알킬화제(예를 들면, 사이클로포스프아미드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 이포스프아미드(ifosfamide)(이펙스(IFEX)®로서 브랜드화/시판됨), 트로포스프아미드(trofosfamide), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 프레드니무스틴(prednimustine), 벤다무스틴(bendamustine), 우라무스틴(uramustine), 에스트라무스틴(estramustine), 카르무스틴(carmustine)(BiCNU®로서 브랜드화/시판됨), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 포테무스틴(fotemustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 만노설판(mannosulfan), 트레오설판(treosulfan), 카보쿠온(carboquone), N,N'N'-트라이에틸렌티오포스포르아미드, 트라이아지쿠온(triaziquone), 트라이에틸렌멜라민(triethylenemelamine)); 알킬화 유사 물질(예를 들면, 카보플라틴(carboplatin)(파라플라틴(PARAPLATIN)®으로서 브랜드화/시판됨), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 트라이플라틴 테트라니트레이트(triplatin tetranitrate), 사트라플라틴(satraplatin), 피코플라틴(picoplatin)); 비-고전적 DNA 가교연결제(예를 들면, 프로카바진(procarbazine), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide)(테모다르(TEMODAR)®로서 브랜드화/시판됨), 알트레타민(altretamine), 미토브로니톨(mitobronitol)); 및 인터칼레이팅제(예를 들면, 악티노마이신(actinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin) 및 플리카마이신(plicamycin))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
6.4.1. 면역 조절제
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 하기 물질들 중 하나 이상의 물질과 함께 대상체에게 투여된다: 당업자에게 공지된, 면역 세포(예컨대, T 림프구, NK 세포 또는 항원 제시 세포(예를 들면, 수지상세포 또는 대식세포))의 보조자극 신호의 임의의 작용제 및/또는 면역 세포(예컨대, T 림프구, NK 세포 또는 항원 제시 세포(예를 들면, 수지상세포 또는 대식세포))의 억제 신호의 임의의 길항제. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 상기 단락 2.1에 기재된 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제들 중 하나 이상의 작용제와 함께 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 상기 단락 2.1에 기재된 면역 세포의 억제 신호의 길항제들 중 하나 이상의 길항제와 함께 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 키메라 NDV) 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 또는 전체 세포 백신은 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 면역 세포의 보조자극 신호의 작용제들 중 하나 이상의 작용제 및/또는 면역 세포의 억제 신호의 길항제들 중 하나 이상의 길항제(예를 들면, 항-CTLA-4 항체, ICOS-L, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체)와 함께 대상체에게 투여된다.
7. 생물학적 분석
시험관내 바이러스 분석
바이러스 분석은 당분야에서 잘 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 배양된 세포에서 변경된 바이러스 복제(예를 들면, 플라크 형성에 의해 측정됨), 또는 바이러스 단백질의 생성(예를 들면, 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정됨) 또는 바이러스 RNA의 생성(예를 들면, RT-PCR 또는 노던 블롯 분석에 의해 측정됨)을 측정하는 바이러스 분석을 포함한다.
본원에 기재된 NDV의 생장은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 임의의 방법에 의해 (예를 들면, 세포 배양물(예를 들면, 닭 배아 신장 세포의 배양물 또는 닭 배아 섬유모세포(CEF)의 배양물)에서) 평가될 수 있다. 바이러스 역가는 본원에 기재된 NDV의 연속 희석물을 세포 배양물(예를 들면, CEF, MDCK, EFK-2 세포, Vero 세포, 일차 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC), H292 인간 상피 세포주 또는 HeLa 세포), 닭 배아 또는 살아있는 동물(예를 들면, 조류) 내로 접종함으로써 측정될 수 있다. 특정된 시간 동안 바이러스를 항온처리한 후, 표준 방법을 이용하여 바이러스를 단리한다. 바이러스 상청액에 적용된 PCR(Quinn & Trevor, 1997; Morgan et al., 1990), 혈구응집 분석, 조직 배양 감염성 용량(TCID50) 또는 알 감염성 용량(EID50)을 이용하여 바이러스 역가의 물리적 정량을 수행할 수 있다. 바이러스 역가를 평가하는 예시적인 방법은 하기 실시예 1 및 실시예 2에 기재되어 있다.
이종 펩티드 또는 단백질(예를 들면, 사이토카인, 돌연변이된 F 단백질, 돌연변이된 V 단백질)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 miRNA 표적 부위가 본원에 기재된 키메라 NDV의 게놈 내로 도입되었는지는 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 임의의 방법에 의해 (예를 들면, 세포 배양물, 동물 모델, 또는 부화란 내의 바이러스 배양물에서) 평가될 수 있다. 예를 들면, 부화란의 요막액의 세포 배양물로부터의 바이러스 입자는 수크로스 쿠션을 통한 원심분리에 의해 정제된 후, 당분야에서 잘 공지된 방법을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 융합 단백질 발현에 대해 분석될 수 있다.
면역형광-기저 방법도 바이러스의 검출 및 바이러스 생장의 평가에 이용될 수 있다. 이러한 방법, 예를 들면, 형광 현미경관찰 및 유동 세포측정(하기 실시예 1 및 실시예 2 참조)은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
항체 분석
본원에 기재된 NDV에 의해 생성된 항체는 당업자에게 잘 공지된 다수의 방법(예를 들면, ELISA, 표면 플라스몬 공명 표시(BIAcore), 웨스턴 블롯, 면역형광, 면역염색 및/또는 미세중화 분석)에 의해 특징규명될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 키메라 NDV에 의해 생성된 항체는 바이러스의 항원, 또는 이종 펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 이러한 분석은 용액 중에서(예를 들면, 문헌(Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421)), 비드 상에서(Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩 상에서(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 세균 상에서(미국 특허 제5,223,409호), 포자 상에서(미국 특허 제5,571,698호, 제5,403,484호 및 제5,223,409호), 플라스미드 상에서(Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) 또는 파지 상에서(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; and Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310) 수행될 수 있다(이들 참고문헌들은 전체로서 본원에 참고로 각각 도입됨).
바이러스의 항원, 또는 이종 펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로 확인된, 본원에 기재된 키메라 NDV에 의해 생성된 항체는 상기 바이러스의 항원, 또는 상기 이종 펩티드 또는 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 분석될 수 있다. 항체는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 바이러스의 항원, 또는 이종 펩티드 또는 단백질과의 특이적 결합 및 그와 다른 항원의 교차반응성에 대해 분석될 수 있다. 특이적 결합 및 교차반응성을 분석하는 데에 이용될 수 있는 면역분석은 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 등과 같은 기법을 이용한 경쟁 분석 시스템 및 비-경쟁 분석 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 분석들은 당분야에서 상용되고 있고 잘 공지되어 있다(예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 문헌(Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York) 참조).
항체와 항원의 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 해리속도는 경쟁 결합 분석에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 표면 플라스몬 공명 분석(예를 들면, BIAcore 동역학 분석) 또는 KinExA 분석(Blake, et al., Analytical Biochem., 1999, 272:123-134)이 본원에 기재된 키메라 NDV의 항원에 대한 항체의 결합속도 및 해리속도를 측정하는 데에 이용될 수 있다.
IFN 분석
본원에 기재된 NDV에 의한 IFN 유도 및 방출은 당업자에게 잘 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 기법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 면역분석(예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석)을 이용하여 IFN 발현을 측정하거나 발현이 IFN에 의해 유도되는 단백질의 발현을 측정함으로써 본원에 기재된 NDV를 사용한 감염 후 세포에서 유도된 IFN의 양을 측정할 수 있다. 대안적으로, 유도된 IFN의 양을 당업자에게 공지된 분석, 예컨대, 노던 블롯 및 정량 RT-PCR로 RNA 수준에서 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, ELISPOT 분석을 이용하여 방출된 IFN의 양을 측정할 수 있다(예를 들면, 하기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법 참조). 추가로, 사이토카인의 유도 및 방출을 예를 들면, 면역분석 또는 ELISPOT 분석으로 단백질 수준에서 측정할 수 있고/있거나 정량 RT-PCR 또는 노던 블롯으로 RNA 수준에서 측정할 수 있다. 사이토카인 유도 및 방출을 측정하는 분석에 대해서는 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2를 참조한다.
활성화 마커 분석
면역 세포에 의한 활성화 마커, 보조자극 분자, 리간드 또는 억제 분자의 발현을 평가하는 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 면역 세포(예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포)에 의한 활성화 마커, 보조자극 분자, 리간드 또는 억제 분자의 발현은 유동 세포측정에 의해 평가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 기법을 이용하여 면역 세포에 의한 활성화 마커, 보조자극 분자, 리간드 또는 억제 분자의 발현을 평가한다.
면역 세포 침윤 분석
면역 세포 침윤을 평가하는 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 기법을 이용하여 면역 세포 침윤을 평가한다.
독성 연구
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 포유동물, 바람직하게는 인간 세포주에서 세포독성에 대해 시험된다(예를 들면, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 세포독성 분석 참조). 일부 실시양태에서, 세포독성은 하기 비-한정적인 예시적 세포주들 중 하나 이상의 세포주에서 평가된다: U937, 인간 단핵세포 세포주; 일차 말초 혈액 단핵세포(PBMC); Huh7, 인간 간모세포종 세포주; HL60 세포, HT1080, HEK 293T 및 293H, MLPC 세포, 인간 배아 신장 세포주; 인간 흑색종 세포주, 예컨대, SkMel2, SkMel-119 및 SkMel-197; THP-1, 단핵세포; HeLa 세포주; 및 신경모세포종 세포주, 예컨대, MC-IXC, SK-N-MC, SK-N-MC, SK-N-DZ, SH-SY5Y 및 BE(2)-C. 일부 실시양태에서, 세포독성은 다양한 암세포들에서 평가된다. 일부 실시양태에서, 톡스라이트(ToxLite) 분석이 세포독성을 평가하는 데에 이용된다.
당분야에서 잘 공지된 많은 분석들이 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물을 사용한 감염, 또는 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신 또는 본원에 기재된 조합요법을 사용한 치료 후 세포 또는 세포주의 생존력을 평가하여 상기 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법의 세포독성을 측정하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 세포 증식은 브로모데옥시우리딘(BrdU) 도입 또는 (3H) 타이미딘 도입을 측정함으로써, 직접적으로 세포를 카운팅함으로써, 또는 공지된 유전자, 예컨대, 원발암유전자(예를 들면, fos, myc) 또는 세포 주기 마커(Rb, cdc2, 사이클린 A, D1, D2, D3, E 등)의 전사, 번역 또는 활성의 변화를 검출함으로써 분석될 수 있다. 이러한 단백질 및 mRNA의 수준 및 활성은 당분야에서 잘 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 상업적으로 입수가능한 항체를 비롯한 항체를 사용하는 공지된 면역진단 방법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯팅 또는 면역침전에 의해 정량될 수 있다. mRNA는 당분야에서 잘 공지되어 있고 상용되고 있는 방법을 이용함으로써, 예를 들면, 노던 분석, RNase 보호, 또는 역전사와 관련된 중합효소 연쇄 반응을 이용함으로써 정량될 수 있다. 세포 생존력은 트립판-블루(trypan-blue) 염색, 또는 당분야에서 공지된 다른 세포 사멸 또는 생존력 마커를 사용함으로써 평가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 생존력을 측정하기 위해 세포내 ATP의 수준을 측정한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법은 암세포를 사멸시키나 건강한(즉, 비-암성) 세포를 사멸시키지는 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법은 암세포를 우선적으로 사멸시키나 건강한(즉, 비-암성) 세포를 사멸시키지는 않는다.
특정 실시양태에서, 세포 생존력은 당분야의 표준 분석, 예컨대, 세포내 ATP의 수준을 측정하는 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 분석 키트(프로메가(Promega))를 사용함으로써 3일 내지 7일 동안 측정된다. 세포내 ATP의 감소는 세포독성 효과를 표시한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 세포 생존력은 중성 레드 흡수 분석에서 측정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 형태학적 변화의 시각적 관찰은 팽창, 입상(granularity), 울퉁불퉁한 가장자리를 갖는 세포, 막과 같은 외관, 환형화, 웰 표면으로부터의 탈착, 또는 다른 변화를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법은 동물 모델에서 생체내 독성에 대해 시험될 수 있다(예를 들면, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 동물 모델 참조). 예를 들면, 암에 대한 화합물의 효과를 시험하기 위해 사용되는, 본원에 기재된 동물 모델 또는 당분야에서 공지된 다른 동물 모델도 본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법의 생체내 독성을 측정하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일정 범위의 pfu의 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 상기 단락 2에 기재된 키메라 NDV)를 동물에게 투여한다. 그 후, 치사율, 체중 손실 또는 체중 획득의 실패, 및/또는 조직 손상을 표시할 수 있는 혈청 마커의 수준(예를 들면, 일반적인 조직 손상의 표시자로서 크레아틴 포스포키나제 수준, 또는 가능한 간 손상의 표시자로서 글루탐산 옥살산 트랜스아미나제 또는 피루브산 트랜스아미나제의 수준)에 대해 동물을 시간의 경과에 따라 모니터링한다. 이들 생체내 분석들은 용량 이외에 다양한 투여 방식 및/또는 섭생법의 독성을 시험하기 위해 개조될 수도 있다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법의 독성 및/또는 효과는 예를 들면, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 요법이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 요법이 사용될 수 있지만, 비-암성 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 요법을 영향받은 조직의 부위로 표적화하는 전달 시스템을 디자인하도록 관심을 기울여야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 대상체에서 사용될 요법의 용량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 약제의 용량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 사용된 제형 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 요법의 경우, 치료 유효 용량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 키메라 NDV의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 대상체에서 유용한 용량을 더 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
항암 연구
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법은 암에 대한 동물 모델을 사용함으로써 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 동물 모델 시스템은 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 개, 토끼 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 NDV 또는 조합요법의 항암 활성은 마우스 모델 시스템에서 시험된다. 이러한 모델 시스템, 예컨대, SCID 마우스 모델 또는 형질전환 마우스는 널리 사용되고 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본원에 기재된 NDV 또는 이의 조성물, 본원에 기재된 종양용해물 백신, 본원에 기재된 전체 세포 백신, 또는 본원에 기재된 조합요법의 항암 활성은 상기 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법을 동물 모델에게 투여하고 상기 동물 모델에서 상기 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물 백신, 전체 세포 백신, 또는 조합요법이 암의 중증도의 감소, 암의 증상의 감소, 암 전이의 감소 및/또는 종양 크기의 감소에 효과적이라는 것을 입증함으로써 확인될 수 있다(예를 들면, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2 참조). 암에 대한 동물 모델의 예에는 일반적으로 애완 동물의 자연발생 종양이 포함되나 이것으로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Vail & MacEwen, 2000, Cancer Invest 18(8):781-92) 참조). 폐암에 대한 동물 모델의 예에는 문헌(Zhang & Roth, 1994, In-vivo 8(5):755-69))에 기재된 폐암 동물 모델 및 p53 기능이 파괴된 형질전환 마우스 동물(예를 들면, 문헌(Morris et al., 1998, J La State Med Soc 150(4): 179-85) 참조)이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 유방암에 대한 동물 모델의 예에는 사이클린 D1을 과다발현하는 형질전환 마우스가 포함되나 이것으로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Hosokawa et al., 2001, Transgenic Res 10(5):471-8) 참조). 결장암에 대한 동물 모델의 예에는 TCR b 및 p53 이중 넉아웃 마우스가 포함되나 이것으로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Kado et al., 2001, Cancer Res. 61(6):2395-8) 참조). 췌장암에 대한 동물 모델의 예에는 PancO2 뮤린 췌장 선암종의 전이성 모델(예를 들면, 문헌(Wang et al., 2001, Int. J. Pancreatol. 29(1):37-46) 참조) 및 피하 췌장 종양을 발생시킨 nu-nu 마우스(예를 들면, 문헌(Ghaneh et al., 2001, Gene Ther. 8(3):199-208) 참조)가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 비-호지킨 림프종에 대한 동물 모델의 예에는 중증 복합 면역결핍증("SCID") 마우스(예를 들면, 문헌(Bryant et al., 2000, Lab Invest 80(4):553-73) 참조) 및 IgHmu-HOX11 형질전환 마우스(예를 들면, 문헌(Hough et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23):13853-8) 참조)가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 식도암에 대한 동물 모델의 예에는 인간 유두종 바이러스 16형 E7 발암유전자에 대한 형질전환 마우스가 포함되나 이것으로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Herber et al., 1996, J. Virol. 70(3):1873-81) 참조). 대장암종에 대한 동물 모델의 예에는 Apc 마우스 모델이 포함되나 이것으로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Fodde & Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8):369-73 and Kuraguchi et al., 2000) 참조). 특정 실시양태에서, 하기 실시예 1 및/또는 실시예 2에 기재된 암에 대한 동물 모델은 NDV 또는 이의 조성물, 종양용해물, 전체 세포 백신, 또는 조합요법의 효과를 평가하는 데에 사용된다.
실시예 1
본 실시예는 암의 치료에서 면역자극성을 갖는 면역 체크포인트(checkpoint) 조절제와 조합된 NDV 요법의 치료 효과를 입증한다.
1. 재료 및 방법
마우스
잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory)로부터 BALB/c 마우스(6주령 내지 8주령) 및 WT C57BL/6 마우스를 구입하였다. 모든 마우스들을 미세격리 우리 내에서 유지하고 NIH 및 미국 실험 동물 보호협회 규정에 따라 처리하였다. 이 연구를 위한 모든 마우스 절차 및 실험은 메모리얼 슬로안-케터링(Memorial Sloan-Kettering) 암센터 동물 보호 및 사용 조직위원회에 의해 승인받았다.
세포주
흑색종(B16-F10) 및 결장암종(CT26 및 MC38)에 대한 뮤린 암세포주를, 10% 태아소 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 뮤린 전립선암세포주 TRAMP-C2를 5% 태아소 혈청(FCS; 메디아텍 인코포레이티드(Mediatech, Inc.)), 5% Nu 혈청 IV(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) HEPES, 2-ME, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 5 ㎍/㎖ 인슐린(시그마(Sigma)) 및 10 nmol/ℓ DHT(시그마)로 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다.
항체
치료 항-CTLA-4(클론 9H10), 항-PD-1(클론 RMP1-14) 및 항-PD-L1 단일클론 항체는 바이오엑셀(BioXcell)에 의해 제조되었다. 유동 세포측정을 위해 사용된 항체는 이바이오사이언스(eBioscience), 바이오레전드(Biolegend), 인비트로겐(Invitrogen) 및 비디 파밍겐(BD Pharmingen)으로부터 구입되었다.
바이러스 및 클로닝
재조합 약독성 NDV 라 소타 균주가 모든 실험들을 위해 사용되었다. 뮤린 ICOSL을 발현하는 NDV 바이러스를 발생시키기 위해, 적절한 NDV 특이적 RNA 전사 신호에 의해 플랭킹된 뮤린 ICOSL을 코딩하는 DNA 단편을 pT7NDV/LS의 P 유전자와 M 유전자 사이에 생성된 SacII 부위 내로 삽입하였다. 전술된 방법을 이용하여 cDNA로부터 바이러스를 레스큐하고 삽입물 신뢰성을 위해 역전사 PCR로 서열결정하였다. 바이러스 역가를 Vero 세포에서 연속 희석 및 면역형광으로 측정하였다. 플랭킹 EcoRI 및 MluI 제한 부위를 갖는 세포외 도메인(아미노산 1-277)을 코딩하는 ICOSL DNA, 및 플랭킹 MluI 및 XhoI 제한 부위를 갖는 F 경막 도메인 및 세포내 도메인(아미노산 501-554)을 코딩하는 NDV F DNA를 PCR로 증폭하여 재조합 ICOSL-F 융합 구축물을 생성하였다. 3-부(part) 라이게이션(ligation)을 이용하여 수득된 DNA 단편을 pCAGGS 벡터 내에 조립하였다.
시험관내 감염 실험
NDV에 의한 표면 MHC-I, MHC-II 및 ICAM-1의 상향조절을 평가하고 NDV-ICOSL 바이러스로부터의 ICOSL 형질전환유전자의 표면 발현을 평가하기 위해, B16-F10 세포를 6-웰 접시에서 삼중으로 2의 MOI에서 감염시켰다. 24시간 후, 상기 세포를 기계적 스크래핑으로 회수하고 표면 표지 부착 및 유동 세포측정에 의한 정량을 위해 프로세싱하였다. 바이러스 생장 곡선 실험을 위해, B16-F10 세포를 100 ㎕의 총 부피로 표시된 MOI에서 6-웰 배양 접시 내에서 상기 바이러스와 함께 실온에서 항온처리하였다. 항온처리한지 1시간 후, 감염 배지를 흡입하고 37℃에서 10% 닭 요막액을 갖는 1 ㎖의 DMEM에서 세포를 항온처리하였다. 24시간, 48시간 및 72시간 후, 상청액을 수집하고 바이러스 역가를 전술된 바와 같이 측정하였다. 시험관내 세포독성 실험을 위해, 감염을 유사한 방식으로 수행하였다. 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에서, 세포를 세척하고 30분 동안 37℃에서 1% 트라이톤 X-100과 함께 항온처리하였다. 프로메가 사이토톡스(Promega CytoTox) 96 분석 키트를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 용해물에서 LDH 활성을 측정하였다.
종양 챌린지 생존 실험
주입된 종양 및 전신 종양 둘다에서 치료 효과에 대해 모니터링하기 위해 양쪽 옆구리 종양 모델을 확립하였다. 단일 약제로서 NDV 또는 항-CTLA-4/항-PD-1에 의한 10% 내지 20%의 종양 제거를 달성하기 위해 각각의 종양 모델에 대한 치료 일정 및 세포 용량을 확립하였다. 야생형 NDV(NDV-WT)와 면역 체크포인트 차단의 조합요법을 평가하는 실험을 위해, 0일째 날 2 x 105개의 B16-F10 세포를 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 4일째 날 5 x 104개의 세포를 좌측 옆구리 내에 주입함으로써 B16-F10 종양을 이식하였다. 7일째 날, 10일째 날, 13일째 날 및 16일째 날, 100 ㎕의 총 부피로 PBS 중의 2 x 107 pfu의 NDV를 종양내로 4회 주입함으로써 마우스를 치료하였다. 동시에, 7일째 날, 10일째 날, 13일째 날 및 16일째 날, 항-CTLA-4 항체(100 ㎍) 또는 항-PD-1 항체(250 ㎍)를 마우스에게 복강내로 4회 주입하였다. 대조군은 상응하는 용량의 동종형 항체 복강내 주입 및 PBS의 종양내 주입을 제공받았다. 종양 크기 및 발생률을 칼리퍼로 측정함으로써 시간의 경과에 따라 모니터링하였다.
TRAMP-C2 모델의 경우, 5 x 105개의 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 이식하고 5 x 105개의 세포를 8일째 날 좌측 옆구리 내에 이식하였다. 치료를 전술된 방식과 유사한 방식으로 11일째 날, 14일째 날, 17일째 날 및 20일째 날 수행하였다.
ICOSL을 발현하는 재조합 NDV(NDV-ICOSL)를 평가하는 실험을 위해, 2 x 105개의 B16-F10 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 1 x 105개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 주입함으로써 B16-F10 종양을 이식하였다. 치료를 전술된 바와 같이 수행하였다.
CT26 모델을 위해, 1 x 106개의 CT26 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 1 x 106개의 세포를 2일째 날 좌측 옆구리 내에 주입함으로써 종양을 이식하였다. 6일째 날, 9일째 날 및 12일째 날, 치료를 전술된 바와 같이 수행하였다.
종양 침윤 림프구의 단리
2 x 105개의 B16-F10 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 2 x 105개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 주입하여 B16-F10 종양을 이식하였다. 7일째 날, 10일째 날 및 13일째 날, 2 x 107 pfu의 NDV를 사용한 3회 종양내 주입 및 100 ㎍의 항-CTLA-4 항체 또는 250 ㎍의 항-PD-1 항체를 사용한 3회 복강내 주입(특정된 경우)으로 마우스를 치료하였다. 15일째 날, 마우스를 CO2 흡입으로 희생시켰다. 겸자 및 수술용 가위를 이용하여 종양 및 종양 배액 림프절을 제거하고 중량을 측정하였다. 각각의 군으로부터 수득된 종양을 가위로 잘게 자른 후 37℃에서 30분 동안 1.67 분슈(Wunsch) U/㎖ 리버라제(Liberase) 및 0.2 mg/㎖ DNase와 함께 항온처리하였다. 종양을 반복된 피펫팅으로 균질화하고 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 완전한 RPMI로 1회 세척하고 피콜(Ficoll) 구배 상에서 정제하여 사멸된 세포를 제거하였다. 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 림프절을 분쇄하여 종양 배액 림프절로부터 세포를 단리하였다.
유동 세포측정
CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, PD-1, ICOS, CD11c, CD19, NK1.1, CD11b, F4/80, Ly6C 및 Ly6G를 염색하는 여러 항체 패널들을 사용한 표면 표지 부착을 위해 종양 또는 종양 배액 림프절로부터 단리된 세포를 프로세싱하였다. 고정가능한 생존력 염료 eFluor780(이바이오사이언스)을 사용하여 생존 세포를 구별하였다. FoxP3 고정 및 투과가능화 키트(이바이오사이언스)를 사용하여 세포를 더 투과가능하게 만들고 Ki-67, FoxP3, 그랜자임 B, CTLA-4 및 IFN-γ에 대해 염색하였다. LSRII 유동 세포측정기(비디 바이오사이언시스)를 이용하여 데이터를 획득하고 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Treestar))를 이용하여 분석하였다.
DC 정제 및 적재
무자극(naive) 마우스로부터 비장을 단리하고 37℃에서 30분 동안 1.67 분슈 U/㎖ 리버라제 및 0.2 mg/㎖ DNase로 절단하였다. 수득된 세포 현탁액을 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과하고 완전한 RPMI로 1회 세척하였다. 밀테니이(Miltenyi) 자성 비드를 사용한 양성 선택으로 CD11c+ 수지상세포를 정제하였다. 단리된 수지상세포를 재조합 GM-CSF 및 B16-F10 종양 용해물과 함께 밤새 배양하고 피콜 구배 상에서 정제하였다.
사이토카인 생성의 분석
밀테니이 T 세포 정제 키트를 사용하여 종양 또는 종양 배액 림프절로부터 세포 현탁액을 모으고 T 세포를 풍부하게 하였다. 단리된 T 세포를 카운팅하고 20 U/㎖의 IL-2(R 및 D) 및 브레펠딘(Brefeldin) A(비디 바이오사이언스)의 존재 하에 B16-F10 종양 세포 용해물로 적재된 수지상세포와 함께 8시간 동안 공-배양하였다. 재자극 후, 유동 세포측정을 위해 림프구를 전술된 바와 같이 프로세싱하였다.
통계학
데이터를 2-꼬리 스튜던트 t 검정으로 분석하였고 P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 결과
뉴캐슬병 바이러스(NDV) 감염에 의해 유도된 항-종양 면역 반응을 특징규명하기 위해, 시험관내 감염된 세포의 표면 상에서의 MHC I 분자, MHC II 분자 및 ICAM-1의 발현을 평가하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, B16 흑색종 세포에서의 NDV 감염은 MHC 클래스 I 분자 및 II 분자의 상향조절뿐만 아니라 접착 분자 ICAM-1의 상향조절도 유도하는데, 이들 모두가 종양 특이적 림프구의 동원 및 항-종양 면역 반응의 활성화에 중요한 것으로 생각된다. 다음으로, 생체내 NDV 감염에 의해 유도된 항-종양 면역 반응을 뮤린 흑색종 모델 및 확립된 2-옆구리 모델(바이러스-주입된 종양 및 바이러스를 제공받지 않은 원거리 종양 둘다에서의 반응을 모니터링할 수 있게 함)에서 평가하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스-감염된 종양은 면역 세포, 예컨대, NK 세포, 대식세포, CD8 세포 및 CD4 세포에 의한 현저한 침윤을 보이지만, 조절 T 세포에 의한 침윤을 보이지는 않는다. 이 면역 반응의 일부가 종양보다는 오히려 바이러스에 대한 반응일 수 있기 때문에, 반대쪽 종양들에 대한 면역 반응을 평가하였다(도 3). 흥미롭게도, 이 종양들은 유사한 정도의 증가된 CD8 및 CD4 이펙터를 나타내었으나, Treg 침윤물을 나타내지 않았다. 이 세포들의 분석은 이들이 활성화 마커, 증식 마커 및 용해 마커를 상향조절한다는 것을 보여주었다(도 4). NDV 단일요법은 치료받은 종양을 제어하는 데에 효과적이었으나(도 5a의 A), 반대쪽 종양의 성장을 단지 미미하게 늦추었다(도 5a의 B). 그러나, 종양이 제거된 마우스는 추가 종양 챌린지에 대한 어느 정도의 보호를 나타내었는데(도 5b의 D), 이 결과는 NDV 요법이 지속적인 면역을 유도할 수 있다는 것을 암시한다.
다음으로, 추가 기작이 NDV에 의해 발생된 항-종양 효과를 향상시키도록 표적화될 수 있는지를 평가하였다. NDV-주입된 종양 및 주입되지 않은 종양 둘다로부터의 종양 침윤 림프구의 특징규명은 림프구 상의 억제 수용체 CTLA-4의 상향조절을 보여주었다(도 6). 그 다음, CTLA-4 수용체의 억제가 NDV의 보다 더 우수한 치료 효과를 발생시킬 수 있는지를 평가하였다. 놀랍게도, 조합요법은 대다수의 동물들에서 양쪽 종양들을 제거하였는데, 이 효과는 단독 치료에서는 관찰되지 않은 효과이었다(도 7). 이 효과는 바이러스에 감염되기 쉽지 않은 전립선 선암종 TRAMP 모델을 사용하였을 때조차도 존재하였는데, 이 결과는 최소한의 바이러스 복제 및 그로 인한 염증 반응이 보호성 항-종양 면역의 발생을 위해 충분하였다는 것을 암시한다.
NDV 요법과 조합된 다른 면역 체크포인트의 표적화가 유리할 수 있는지를 확인하기 위해, NDV 감염 후 PD-1 - PD-L1 경로에 대한 효과를 평가하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, NDV-감염된 종양 세포는 시험관내 및 생체내 둘다에서 세포 표면 상에서의 억제 PD-L1 리간드의 발현을 상향조절하였다. 이 효과는 직접적인 바이러스 감염의 결과일 뿐만 아니라, 감염되지 않은 세포가 바이러스-감염된 세포(도 9a의 B) 및 감염되지 않은 반대쪽 종양(도 9b의 C)으로부터의 UV-불활성화된 상청액으로 처리되었을 때에도 관찰되었다. 이것은 NDV 및 항-PD-1 항체를 사용한 조합요법의 시험을 촉구하였다. CTLA-4 차단과 유사하게, 공격성 B16 흑색종 모델에서 항-PD-1과 조합된 NDV 요법은 대다수의 동물들에서 치유를 유발하였는데, 이 효과는 활성화된 이펙터 림프구에 의한 증가된 종양 침윤과 관련된 효과이었다(도 10).
수행된 연구 전체에서, 조합요법의 치료 효과는 보다 더 큰 종양 챌린지가 사용되었을 때 감소되었다. 다음으로, 보다 더 우수한 반응을 예측할 수 있고 치료 효과의 추가 개선을 위해 표적화될 수 있는 활성화 마커를 평가하였다. 종양 및 종양 배액 림프절로부터 단리된 림프구의 분석은 치료받은 동물에서 상기 활성화 마커들 중 하나로서 보조자극 분자 ICOS의 상향조절을 확인시켜주었다(도 11). ICOS 상향조절은 악성 흑색종에 대한 항-CTLA-4 요법으로 치료받은 환자들에서 보다 더 지속가능한 치료 반응 및 증가된 생존과 관련되어 있는 것으로 이미 밝혀졌다. ICOS 리간드(ICOSL)의 종양내 발현이 조합요법의 치료 반응을 더 증강시킬 수 있는지를 평가하였다. NDV에 대한 역유전학 시스템을 이용하여 뮤린 ICOSL을 발현하는 NDV(NDV-ICOSL)를 발생시켰다. 상기 바이러스의 시험관내 특징규명은 상기 바이러스가 모 NDV 균주와 유사한 복제 및 용해 성질을 갖는다는 것을 보여주었다(도 12). 그러나, 보다 더 큰 B16 종양 챌린지를 사용하여 생체내에서 시험하였을 때, NDV-ICOSL은 CTLA-4 차단과 함께 사용되었을 때 대다수의 치료받은 동물들에서 장기간 생존과 함께 모 NDV 바이러스에 비해 유의한 장점을 나타내었다(도 13). 이 효과는 B16 흑색종으로 한정되지 않았고 Balb/C 마우스 품종에서 CT26 결장암종에 대해 입증되었는데, 이 결과는 이 치료 방법이 상이한 종류의 종양들에 적용될 수 있다는 것을 암시한다(도 14). 치료받은 동물들로부터 수득된 B16 종양의 분석은 활성화 마커의 상향조절과 함께 상이한 하위종의 면역 세포들에 의한 유의한 침윤을 입증하였다(도 15 및 16). 이 림프구들은 종양 특이적이었고 종양 용해물로 적재된 수지상세포를 사용한 자극에 반응하여 IFN-γ의 분비를 나타내었다(도 17). 마지막으로, 그들의 B16 또는 CT26 종양을 치유받은 동물들을 종양 세포로 재챌린지하였는데, 이 동물들은 종양 재챌린지에 대한 완전한 보호를 나타내었다(도 18).
종양에서의 ICOSL의 발현을 더 개선하고 이 리간드를 비리온 내로 도입하기 위해, ICOSL의 세포외 도메인(아미노산 1-277), 및 NDV F 단백질의 경막 도메인 및 세포내 도메인(아미노산 501-554)으로 구성된 키메라 단백질을 생성하였다(도 19의 A). B16-F10 세포 내로의 수득된 구축물의 형질감염은 형질감염된 천연 ICOSL과 비교될 때 형질감염된 세포 표면 상에서의 키메라 ICOSL-F 리간드의 발현을 증가시켰는데, 이 결과는 NDV F 단백질을 표면으로 수송하는 것을 좌우하는 조절 기작을 이용하여 면역 자극 리간드의 표면 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 암시한다(도 19의 B).
종합하건대, 이 연구들은 1) NDV와 면역 체크포인트 조절 항체의 조합이 종양용해 바이러스 요법 및 항체 요법 둘다의 한계를 피하기 위한 전략으로서 사용될 수 있다는 것; 및 2) NDV에 의한 면역자극 리간드의 발현이 특히 면역조절 항체와 함께 사용되었을 때 바이러스의 치료 효과를 더 개선할 수 있다는 것을 입증한다. 이 발견들은 임상에서 응용될 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 종양용해 NDV에 의해 유도된 항-종양 면역 반응, 및 CTLA-4 차단과 조합된 NDV에 의해 유도된 항-종양 반응을 입증한다.
1. 재료 및 방법
마우스
C57BL/6J 마우스 및 Balb/C 마우스를 잭슨 라보라토리로부터 구입하였다. C57BL/6J 배경을 갖는 IFNAR-/- 마우스는 에릭 파머(Eric Pamer) 박사로부터 제공받았다. Pmel-1 및 Trp-1 TCR 형질전환 마우스는 보고되어 있고(Overwijk et al., 2003, J. Exp. Med, 198:568, Muransky et al., 2008, Blood 112:362) 레스티포 박사(N. Restifo)(국립암연구소, 미국 메릴랜드주 베테스다 소재)에 의해 제공되었다. Trp1 마우스를 패트릭 하우(Patrick Hwu) 박사(엠디 앤더슨 암센터(MD Anderson Cancer Center)(미국 텍사스주 휴스턴 소재))에 의해 제공된 CD2:루시퍼라제 마우스와 교배하여 Trp1 루시퍼라제+(Trp1-Fluc) 마우스를 생성하였다. 모든 마우스들을 미세격리 우리 내에서 유지하고 NIH 및 미국 실험 동물 보호협회 규정에 따라 처리하였다. 이 연구에 대한 모든 마우스 절차 및 실험은 메모리얼 슬로안-케터링 암센터 동물 보호 및 사용 조직위원회에 의해 승인받았다.
세포주
흑색종(B16-F10) 및 결장암종(CT26 및 MC38)에 대한 뮤린 암세포주를, 10% 태아소 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 뮤린 전립선암세포주 TRAMP-C2를 5% 태아소 혈청(FCS; 메디아텍 인코포레이티드), 5% Nu 혈청 IV(비디 바이오사이언시스) HEPES, 2-ME, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 5 ㎍/㎖ 인슐린(시그마) 및 10 nmol/ℓ DHT(시그마)로 보충된 DMEM 배지에서 유지하였다.
항체
치료 항-CTLA-4(클론 9H10), 항-PD-1(클론 RMP1-14), 항-PD-L1(클론 9G2), 항-CD8(클론 2.43), 항-CD4(클론 GK1.5), 항-IFN-γ(클론 XMG1.2) 및 항-NK1.1(클론 PK136) 단일클론 항체는 바이오엑셀에 의해 제조되었다. 유동 세포측정을 위해 사용된 항체는 이바이오사이언스, 바이오레전드, 인비트로겐 및 비디 파밍겐으로부터 구입되었다.
바이러스 및 클로닝
재조합 약독성 NDV 라 소타 균주가 모든 실험들을 위해 사용되었다. 뮤린 ICOSL을 발현하는 NDV 바이러스를 발생시키기 위해, 적절한 NDV 특이적 RNA 전사 신호에 의해 플랭킹된 뮤린 ICOSL을 코딩하는 DNA 단편을 pT7NDV/LS의 P 유전자와 M 유전자 사이에 생성된 SacII 부위 내로 삽입하였다. 전술된 방법을 이용하여 cDNA로부터 바이러스를 레스큐하고 삽입물 신뢰성을 위해 역전사 PCR로 서열결정하였다. 바이러스 역가를 Vero 세포에서 연속 희석 및 면역형광으로 측정하였다. 플랭킹 EcoRI 및 MluI 제한 부위를 갖는 세포외 도메인(아미노산 1-277)을 코딩하는 ICOSL DNA, 및 플랭킹 MluI 및 XhoI 제한 부위를 갖는 F 경막 도메인 및 세포내 도메인(아미노산 501-554)을 코딩하는 NDV F DNA를 PCR로 증폭하여 재조합 ICOSL-F 융합 구축물을 생성하였다. 3-부 라이게이션을 이용하여 수득된 DNA 단편을 pCAGGS 벡터 내에 조립하였다. 플랭킹 EcoRI 및 MluI 제한 부위를 갖는 햄스터 항-CD28scfv를 코딩하는 cDNA, 및 플랭킹 MluI 및 XhoI 제한 부위를 갖는 F 경막 도메인 및 세포내 도메인(아미노산 501-554)을 코딩하는 NDV F DNA를 PCR로 증폭하여 재조합 항-마우스 CD28scfv-F 융합 구축물을 생성하였다. 3-부 라이게이션을 이용하여 수득된 DNA 단편을 pCAGGS 벡터 내에 조립한 후 P 유전자와 M 유전자 사이에서 pNDV 벡터 내로 서브클로닝하였다. 다른 키메라 단백질(HN-GITRL, HN-4-1BBL, HN-CD40L, HN-OX40L)을 발현하는 재조합 바이러스를 발생시키기 위해, 플랭킹 EcoRI 및 MluI 제한 부위를 갖는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각각의 유전자의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA(도 44)를 증폭하고, 플랭킹 MluI 및 XhoI 제한 부위를 갖는 특이적 프라이머를 사용하여 HN 단백질의 경막 도메인 및 세포내 도메인을 증폭하였다. 3-부 라이게이션을 이용하여 전체 키메라 유전자를 pCAGGS 벡터 내에 조립한 후 P 유전자와 M 유전자 사이에서 NDV 벡터 내로 서브클로닝하였다. 각각의 키메라 구축물의 세부사항은 도 44에 나타나 있다. 뮤린 IL-2, IL-15 및 IL-21을 코딩하는 재조합 NDV를 발생시키기 위해, 플랭킹 SacII 제한 부위를 갖는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각각의 유전자에 대한 cDNA를 증폭한 후 P 유전자와 M 유전자 사이에서 pNDV 내로 클로닝하였다. 전술된 방법을 이용하여 cDNA로부터 바이러스를 레스큐하고 삽입물 신뢰성을 위해 역전사 PCR로 서열결정하였다. 바이러스 역가를 Vero 세포에서 연속 희석 및 면역형광으로 측정하였다.
시험관내 감염 실험
세포 표면 표지 부착을 위해, 세포를 6-웰 접시 내에서 삼중으로 2의 MOI((B16-F10) 또는 5의 MOI(TRAMP C2)에서 감염시켰다. 24시간 후, 세포를 스크래핑으로 회수하고 표면 표지 부착 및 유동 세포측정에 의한 정량을 위해 프로세싱하였다. 시험관내 세포독성 실험을 위해, 세포를 표시된 MOI에서 감염시키고 250 ng/㎖ TPCK 트립신의 존재 하에 37℃의 무혈청 배지에서 항온처리하였다. 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에서 세포를 세척하고 37℃에서 30분 동안 1% 트라이톤 X-100과 함께 항온처리하였다. 프로메가 사이토톡스 96 분석 키트를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 용해물에서 LDH 활성을 측정하였다.
종양 챌린지 생존 실험
주입된 종양 및 전신 종양 둘다에서 치료 효과에 대해 모니터링하기 위해 양쪽 옆구리 종양 모델을 확립하였다. 단일 약제로서 NDV 또는 항-CTLA-4에 의한 10% 내지 20%의 종양 제거를 달성하기 위해 각각의 종양 모델에 대한 치료 일정 및 세포 용량을 확립하였다. NDV와 항-CTLA-4 항체의 조합요법을 평가하는 실험을 위해, 2 x 105개의 B16-F10 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로(i.d.) 주입하고 5 x 104개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 주입함으로써 B16-F10 종양을 이식하였다. 7일째 날, 9일째 날, 11일째 날 및 13일째 날, 100 ㎕의 총 부피로 PBS 중의 2 x 107 pfu의 NDV를 종양내로 주입함으로써 마우스를 치료하였다. 동시에, 7일째 날, 9일째 날, 11일째 날 및 13일째 날, 항-CTLA-4 항체(100 ㎍), 항-PD-1 항체(250 ㎍) 또는 항-PD-L1 항체(250 ㎍)를 마우스에게 복강내로(i.p.) 주입하였다. 대조군은 상응하는 용량의 동종형 항체 복강내 주입 및 PBS의 종양내 주입을 제공받았다. 고통의 징후가 나타났을 때 또는 총 종양 부피가 1000 mm3에 도달하였을 때 동물을 안락사시켰다. 면역 세포를 고갈시키기 위해, 종양 챌린지 1일 전 및 2일 후 CD8+, CD4+, NK1.1 또는 IFN-γ에 대한 500 ㎍의 단일클론 항체를 마우스에게 복강내로 주입한 후, 실험 전체에서 5일마다 250 ㎍씩 주입하였다. TRAMP-C2 모델의 경우, 1 x 106개의 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 이식하고 5 x 105개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 이식하였다. 7일째 날, 10일째 날, 13일째 날 및 16일째 날, 전술된 방식과 유사한 방식으로 치료를 수행하였다. CT26 모델의 경우, 1 x 106개의 CT26 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 1 x 106개의 세포를 2일째 날 좌측 옆구리 내에 주입하여 종양을 이식하였다. 6일째 날, 9일째 날 및 12일째 날, 치료를 전술된 바와 같이 수행하였다. ICOSL, 4-1BBL, OX40L, CD40L, GITRL, 항-CD28scfv, IL-2, IL-15 및 IL-21을 발현하는 재조합 NDV(NDV-형질전환유전자)를 평가하는 실험을 위해, 2 x 105개의 B16-F10 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 1 x 105개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 주입하여 B16-F10 종양을 이식하였다. 7일째 날, 9일째 날, 11일째 날 및 13일째 날, 100 ㎕의 총 부피로 PBS 중의 2 x 107 pfu의 NDV를 종양내로 주입함으로써 마우스를 치료하였다. 동시에, 7일째 날, 9일째 날, 11일째 날 및 13일째 날, 항-CTLA-4 항체(100 ㎍), 항-PD-1 항체(250 ㎍) 또는 항-PD-L1 항체(250 ㎍)를 마우스에게 복강내로(i.p.) 주입하였다.
Trp1 및 Pmel 림프구의 단리 및 양자 전달
형질전환 마우스로부터 비장 및 림프절을 단리하고 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 분쇄하였다. 밀테니이 자성 비드를 사용한 양성 선택으로 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포를 정제하였다.
단리된 Trp1 또는 Pmel 세포를 각각 마우스 당 2.5 x 104개 세포 및 1 x 106개 세포의 양으로 표시된 일정에 따라 꼬리 정맥을 통해 수용자 동물 내로 주입하였다.
혈청 전달 실험
NDV 또는 PBS의 종양내 단회 주입을 이용하여 종양 보유 마우스의 군을 치료하였다. 4일째 날, 혈액을 말단 채혈로 채취하고 혈청을 원심분리로 단리하였다. 혈청을 각각의 군으로부터 모으고 300 mJ/cm2 UV 광의 6회 펄스로 스트라타링커(Stratalinker) 1800에서 UV로 처리하여 잠재적으로 존재할 수 있는 임의의 바이러스를 불활성화시켰다. 이틀마다 제공된 총 3회 주입을 위해 희석되지 않은 100 ㎕의 혈청을 무자극 B16-F10 종양 보유 마우스의 종양내로 주입하였다. 마지막 주입으로부터 3일 후 종양을 제거하고 하기 기재된 종양 침윤 림프구의 단리를 위해 프로세싱하였다.
생체발광 영상화
6일째 날부터 시작하여 2일 또는 3일마다 마우스의 영상을 획득하였다. PBS 중의 40 mg/㎖ D-루시페린(luciferin)(칼리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences)) 50 ㎕를 마우스의 안구뒤에 주입하고, IVIS 영상화 시스템(칼리퍼 라이프 사이언시스)을 이용하여 즉시 영상화하였다. 리빙 이미지(Living Image) 버전 4.0(칼리퍼 라이프 사이언시스) 소프트웨어 오버레이를 이용하여 회색 톤 사진 영상과 생체발광 칼러 영상을 겹쳐놓았다. 종양에 대한 관심있는 영역(ROI)을 수동으로 선택하고 ROI의 면적을 일정하게 유지하였다.
종양 침윤 림프구의 단리
2 x 105개의 B16-F10 세포를 0일째 날 우측 옆구리 내에 피내로 주입하고 2 x 105개의 세포를 4일째 날 좌측 옆구리 내에 주입함으로써 B16-F10 종양을 이식하였다. 7일째 날, 9일째 날 및 11일째 날, 2 x 107 pfu의 NDV를 종양내로 주입하고 항-CTLA-4 또는 항-PD-1 항체(특정된 경우)를 복강내로 주입함으로써 마우스를 치료하였다. 종양 부하로 인해 사망한 드문 동물(치료받지 않은 대조군에 항상 존재함) 또는 종양이 완전히 제거된 동물(치료군에 항상 존재함)은 분석에 사용되지 않았다. 15일째 날, 마우스를 희생시키고, 겸자 및 수술용 가위를 이용하여 종양 및 종양 배액 림프절을 제거하고 중량을 측정하였다. 각각의 군으로부터 수득된 종양을 가위로 잘게 자른 후, 37℃에서 30분 동안 1.67 분슈 U/㎖ 리버라제 및 0.2 mg/㎖ DNase와 함께 항온처리하였다. 종양을 반복된 피펫팅으로 균질화하고 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 완전한 RPMI로 1회 세척하고 피콜 구배 상에서 정제하여 사멸된 세포를 제거하였다. 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 림프절을 분쇄하여 종양 배액 림프절로부터 세포를 단리하였다.
유동 세포측정
CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, ICOS, CD11c, CD19, NK1.1, CD11b, F4/80, Ly6C 및 Ly6G를 염색하는 여러 항체 패널들을 사용한 표면 표지 부착을 위해 종양 또는 종양 배액 림프절로부터 단리된 세포를 프로세싱하였다. 고정가능한 생존력 염료 eFluor506(이바이오사이언스)을 사용하여 생존 세포를 구별하였다. FoxP3 고정 및 투과가능화 키트(이바이오사이언스)를 사용하여 세포를 더 투과가능하게 만들고 Ki-67, FoxP3, 그랜자임 B, CTLA-4 및 IFN-γ에 대해 염색하였다. LSRII 유동 세포측정기(비디 바이오사이언시스)를 이용하여 데이터를 획득하고 플로우조 소프트웨어(트리스타)를 이용하여 분석하였다.
DC 정제 및 적재
무자극 마우스로부터 비장을 단리하고 37℃에서 30분 동안 1.67 분슈 U/㎖ 리버라제 및 0.2 mg/㎖ DNase로 절단하였다. 수득된 세포 현탁액을 70 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과하고 완전한 RPMI로 1회 세척하였다. 밀테니이 자성 비드를 사용한 양성 선택으로 CD11c+ DC를 정제하였다. 단리된 DC를 재조합 GM-CSF 및 B16-F10 종양 용해물과 함께 밤새 배양하고 피콜 구배 상에서 정제하였다.
사이토카인 생성의 분석
밀테니이 T 세포 정제 키트를 사용하여 종양 또는 종양 배액 림프절로부터 세포 현탁액을 모으고 T 세포를 풍부하게 하였다. 단리된 T 세포를 카운팅하고 20 U/㎖의 IL-2(R 및 D) 및 브레펠딘 A(비디 바이오사이언스)의 존재 하에 B16-F10 종양 세포 용해물로 적재된 DC와 함께 8시간 동안 공-배양하였다. 재자극 후, 유동 세포측정을 위해 림프구를 전술된 바와 같이 프로세싱하였다.
면역형광 및 현미경관찰
마우스로부터 종양을 절개하고 PBS에서 세척하고 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고 전술된 프로토콜에 따라 파라핀 포매를 위해 프로세싱하였다. 마이크로톰(microtome)을 이용하여 박편을 절단하고 슬라이드 상에 탑재하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 항-CD3 및 항-FoxP3 항체를 사용한 염색을 위해 프로세싱하였다. 10x 대물렌즈 및 20x 대물렌즈를 사용하여 제이스 악시오(Zeiss Axio) 2 광시야 현미경 상에서 슬라이드를 분석하였다.
통계학
데이터를 (2개의 군의 비교를 위한) 2-꼬리 스튜던트 t 검정 및 적절한 경우 ANOVA로 분석하였다. 생존에 대한 데이터를 로그-랭크(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 검정으로 분석하였다. 양쪽 p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(p≤0.05(*), p≤0.01(**), p<0.001(***), p<0.0001(****)).
2. 결과
NDV 복제는 주입된 종양 부위로 제한된다.
NDV의 종양내 투여 및 전신 투여를 이용하여 바이러스 분포 동역학을 특징규명하였다. 초파리 루시퍼라제 레포터를 발현하는 재조합 NDV(NDV-Fluc)의 종양내 주입은 주입된 옆구리 종양에서 지속된 루시퍼라제 신호를 발생시켰으나, 상기 바이러스의 전신 투여는 종양에서 검출가능한 루시퍼라제 신호를 발생시키지 않았다(도 20의 A). 제한된 전신 바이러스 전달이 충분한 종양 용해 및 면역 반응을 유도할 가능성이 없기 때문에, 종양내 NDV 주입은 전신 OV 요법의 한계를 잠재적으로 극복할 수 있는 항-종양 면역 반응을 이끌어내는 수단으로서 연구되었다. 따라서, 모델링된 추가 연구를 위해 양쪽 옆구리 B16-F10 종양 모델을 사용하여 전이성 질환을 모델링하였다(도 22a의 A). 우측 옆구리 종양 내로의 NDV-Fluc 투여는 최대 96시간 동안 루시퍼라제 신호가 검출될 수 있게 하면서 주입된 종양 내에서 바이러스 복제를 유발하였다(도 20의 B 내지 D). 바이러스는 발광 영상화(도 20의 B 내지 D), 부화란에서의 계대배양 또는 RT-PCR에 의해 반대쪽 (좌측 옆구리) 종양에서 검출되지 않았다. 따라서, 이 시스템은 바이러스-주입된 종양 및 NDV에 의해 직접적으로 영향받지 않은 원거리 종양 둘다에서의 면역 반응을 특징규명할 수 있게 하였다.
NDV 요법은 국소 종양 림프구 및 원거리 종양 림프구 침윤을 증가시키고 종양 성장을 지연시킨다.
바이러스-주입된 종양의 분석은 백혈구 공통 항원 CD45를 발현하는 세포에 의한 증가된 침윤에 의해 입증된 바와 같이 염증 반응을 보여주었다(도 21의 A 및 B). 면역 침윤물은 골수성 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하는 선천성 면역 성분(도 21의 C), 및 CD8+ 및 통상적인 CD4+FoxP3-(Tconv) T 세포를 포함하는 후천성 면역 성분의 증가(CD8 및 Tconv 대 조절(Treg) T 세포 비의 유의한 증가(각각 p=0.0131 및 p=0.0006)를 유발함)(도 21의 D 내지 F)를 특징으로 하였다. 특히, 반대쪽 종양의 분석은 선천성 면역 세포(도 22a의 D) 및 이펙터 T 세포(도 22a 및22b의 E 및 G) 둘다의 증가된 수를 특징으로 하는, 염증성 침윤물의 유사한 증가(도 22a의 B 및 C)를 보여주었다. 특히, Treg의 절대적인 수의 큰 변화는 없었지만(도 22b의 G), CD8 및 Tconv 대 Treg 비의 상당한 향상(각각 p=0.002 및 p=0.0021)(도 22b의 I)과 함께 그들의 상대적인 백분율의 상당한 감소가 있었다(도 22a 및 22b의 E, F 및 H). 원거리 종양으로부터 단리된 이펙터 T 세포는 증가된 활성화 마커, 증식 마커 및 용해 마커(각각 ICOS, Ki-67 및 그랜자임 B)를 발현하였다(도 22b의 J 및 K). 전술된 바와 같이, 바이러스 또는 바이러스 RNA는 원거리 종양으로부터 단리될 수 없었는데, 이 결과는 원거리 종양 미세환경에서 관찰된 변화가 직접적인 바이러스 감염으로 인한 것이 아니라는 것을 암시한다. 검출불가능한 국소 바이러스 퍼짐의 가능성을 더 배제하기 위해, 종양을 다른 원거리 부위, 예컨대, 양쪽 뒷다리 발바닥에 이식하였는데, 이것은 유사한 발견을 제공하였다(도 23).
관찰된 염증 효과와 일치하여, NDV의 종양내 투여는 주입된 종양의 성장뿐만 아니라 반대쪽 종양의 성장도 지연시켜 동물 생존을 연장시켰다(도 22b의 L 및 M). 이 효과가 일시적인지, 및 지속가능한 항-종양 보호가 가능한지를 확인하기 위해, NDV를 사용하여 단일 옆구리 B16-F10 종양 보유 마우스를 종양내로 치료하고 B16-F10 세포를 장기간 생존자들에게 반대쪽 옆구리 상에서 주입하였다. 대다수의 동물들이 종양 성장 지연을 나타내었고, 30%의 동물들이 재챌린지된 세포를 완전히 제거하였는데, 이 결과는 NDV를 사용한 종양내 요법이 실제로 보호성 항-종양 기억 반응을 유도할 수 있다는 것을 암시한다(도 25).
NDV는 종양 특이적 림프구의 종양 침윤 및 증폭을 유도한다.
항-종양 면역 반응이 NDV-주입된 종양 종류 또는 NDV 감염에 의해 발생된 비-특이적 염증의 결과에 의해 좌우되는지를 확인하기 위해, 반대쪽 옆구리에서 이식된 이종 종양(MC38 결장암종 및 B16-F10 흑색종)을 사용하여 실험을 수행하였다(도 24a의 A). 종양 특이적 림프구를 추적하기 위해, 흑색종 분화 항원 gp100(Pmel) 및 Trp1(Trp1)을 인식하는 T 세포 수용체 형질전환 유사유전적으로(congenically)-표지된 CD8+(Pmel) 세포 또는 루시퍼라제-표지된 CD4+(Trp1) 세포를 양자적으로 전달하였다(Muranski et al., 2008, Blood, 112: 362; Overwijk et al., 2003, J Exp Med, 198: 569). 생체발광 영상화를 이용하여 양자적으로 전달된 Trp1 세포의 분포 및 증폭 동역학을 측정하였다. PBS로 치료받은 종양 보유 동물 내로의 Trp1 세포의 전달은 종양에서 Trp1을 축적시키지 못하였는데, 이 결과는 이 모델에서 종양 미세환경의 고도 면역억제 성질을 강조한다(도 24a 및 24b의 B 내지 D). B16-F10 종양 내로의 NDV 주입은 주입된 종양 내에서 루시퍼라제 신호를 유의하게 증가시켰는데(도 24a 및 24b의 B 내지 D), 이 결과는 Trp1 T 세포 증폭(곡선 하의 면적(AUC) p=0.0084)을 시사한다. 특히, 지연되었지만 유사한 증폭이 반대쪽 종양에서 관찰되었다(p=0.0009)(도 24a 및 24b의 B 내지 D). 대조적으로, MC38 종양 내로의 NDV 주입은 주입된 MC38 종양 또는 원거리 B16-F10 종양 내로의 실질적인 Trp1 침윤을 유도하지 못하였는데(도 24a 및 24b의 B 내지 D), 이 결과는 원거리 종양 특이적 림프구 침윤이 주입된 종양의 항원 본질에 의해 좌우될 가능성이 있다는 것을 암시한다. 유사하게, NDV의 종양내 주입은 원거리 종양에서 Pmel 세포의 침윤을 증가시켰는데, 이 효과는 주입된 종양이 MC38보다는 오히려 B16-F10일 때 더 현저하였다(도 24b의 E).
흥미롭게도, 양자적으로 전달된 림프구에 의한 원거리 B16-F10 종양의 침윤이 주입된 종양 본질에 의해 좌우되었지만, 원거리 종양은 일차 주입된 종양이 MC38일 때조차도 증가된 면역 침윤을 나타내었는데(도 24b의 F), 이 결과는 비-특이적 염증 반응 성분도 역할을 수행할 수 있다는 것을 암시한다. 실제로, 임의의 잠재적 바이러스를 불활성화시키기 위해 UV 방사선조사로 처리된, NDV로 치료받은 동물로부터 수득된 혈청은 무자극 B16-F10 종양 보유 마우스 내에 종양내 주입되었을 때 종양 백혈구 침윤을 유도하였는데(도 24b의 G 및 H), 이때 증가의 대부분은 NK 및 CD8+ 구획에서 관찰되었다(각각 p=0.0089 및 p=0.0443)(도 24b의 I).
NDV와 CTLA -4 차단은 상승작용하여 국소 종양 및 원거리 종양을 제거한다.
원거리 종양에서 관찰된 현저한 염증 반응 및 성장 지연에도 불구하고, 장기간 생존과 함께 완전한 반대쪽 종양 제거는 약 10%의 동물들에서만 관찰되었는데(도 22b의 M), 이 결과는 종양 미세환경에서의 능동 면역억제 기작을 암시한다. NDV-주입된 종양 및 원거리 종양의 특징규명은 종양 침윤 T 세포 상의 CTLA-4의 상향조절을 보여주었는데(도 26), 이 결과는 NDV-주입된 종양 염증이 종양으로 하여금 CTLA-4 차단을 사용한 전신 요법에 민감하게 만들 것임을 암시한다. 특히, NDV와 항-CTLA-4 항체의 조합요법(도 27a의 A)은 대다수의 동물들에서 양쪽 종양의 제거 및 장기간 생존을 유발하였는데, 이 효과는 단독 치료에서 관찰되지 않은 효과이었다(도 27a의 B 내지 D). 관찰된 보호의 지속가능성을 확인하기 위해, 임의의 추가 요법 없이 B16-F10 세포를 90일째 날 생존 동물의 우측 옆구리 내에 주입하였다. NDV 및 항-CTLA-4 조합요법으로 치료받은 동물들은 단일 약제 항-CTLA-4 항체로 치료받은 동물들에서 관찰된 40% 보호에 비해 종양 재챌린지에 대한 80% 이상의 보호를 나타내었다(도 27b의 E).
NDV 및 CTLA -4 차단을 사용한 조합요법은 바이러스 비-허용 종양에 대해 효과적이다.
이 치료 방법이 다른 종류의 종양으로 확장될 수 있는지를 확인하기 위해, 상기 방법을 약한 면역원성 TRAMP C2 전립선 선암종 모델에서 평가하였다. B16-F10 모델과 유사하게, 조합요법은 주입된 종양의 퇴행을 야기하였고(도 27b의 F), 원거리 종양의 과다성장을 지연시켰거나 장기간 생존을 연장시키면서 완전한 원거리 종양 퇴행을 유발하였다(도 27b의 F 및 G). 흥미롭게도, B16-F10 세포는 시험관내에서 NDV-매개된 용해에 민감한 반면, TRAMP C2 세포는 최대 10의 감염 다중도(MOI)에서 관찰된 낮은 세포독성과 함께 강한 내성을 나타내었다(도 27b의 H). 상기 세포주들 둘다에서, 시험관내 NDV 감염은 MHC 및 보조자극 분자의 표면 상향조절을 야기하였다(도 27c의 I 내지 K). 모든 세포들이 1의 MOI에서 NDV로 감염되지는 않았지만, MHC 클래스 I은 모든 세포들에서 균일하게 상향조절되었다. 종래 연구는 NDV가 B16-F10 세포에서 I형 IFN 발현을 유도한다는 것을 입증하였다(Zamarin et al., 2009, Mol Ther 17:697). I형 IFN(Dezfouli et al., 2003, Immunol. Cell. Biol., 81:459, Seliger et al., 2001, Cancer Res., 61:1095)은 B16-F10 세포 상의 MHC 클래스 I을 상향조절하는 것으로 공지되어 있는데, 이것은 감염된 종양과 관련하여 이 기작들이 종양 면역원성의 향상에 있어서 추가 역할을 수행할 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, 이 결과들은 바이러스-매개된 용해에 대한 시험관내 민감성이 NDV 요법에 대한 생체내 민감성을 위해 필요하지 않다는 것을 암시하고, 관찰된 항-종양 효과에서 직접적인 종양용해보다는 오히려 바이러스에 의해 발생된 염증 반응의 중요성도 강조한다.
전신 항-종양 효과는 주입된 종양 종류로 항원-제한된다.
원거리 종양에서 관찰된 항-종양 효과가 주입된 종양 종류에 대해 특이적인지를 확인하기 위해, 한쪽 원거리 B16-F10 종양을 보유하는 동물 및 반대쪽 옆구리에서 이식된 이종 종류의 종양(MC38 결장암종 및 B16-F10 흑색종)을 갖는 동물에서 조합요법을 평가하였다(도 28a의 A). 종양을 보유하지 않은 우측 옆구리 내로의 바이러스의 피내 투여가 좌측 옆구리 종양 과다성장을 지연시켰지만, 양쪽 B16-F10 종양을 보유하는 동물에서 관찰된 장기간 보호 및 종양 제거를 야기하지 못하였다(도 28a 및 28b의 B 및 C). 유사하게, 좌측 옆구리 B16-F10 종양을 보유하는 동물의 우측 옆구리 MC38 종양 내로의 NDV의 주입은 B16-F10 종양 제거를 유도하지 못하였는데(도 28b의 D 및 E), 이 결과는 NDV에 의해 유도된 항-종양 면역 반응이 주입된 종양으로 항원-제한될 가능성이 있다는 것을 암시한다.
NDV 및 항- CTLA -4를 사용한 조합요법은 활성화된 림프구에 의한 종양 침윤을 유도한다.
치료받은 동물에서 B16-F10 종양 미세환경을 조사하기 위해, 양쪽 종양들을 채취하고 침윤 세포의 분석을 위해 프로세싱하였다. 치료받은 동물로부터의 주입된 종양 및 원거리 종양의 분석은 조합요법으로 치료받은 동물에서 현저한 염증 침윤물 및 큰 면적의 종양 괴사를 보여주었다(도 30a의 A 및 도 29). 이것은 조합요법 군에서 CD45+ 세포 및 T 세포의 증가된 수와 상관관계를 가졌다(도 30a의 A 내지 C 및 도 29a 및 29b의 A 내지 C). 전술된 바와 같이, TIL의 관찰된 증가는 주로 Treg 세포의 침윤에 기인한 것이 아니라 CD8+ 및 Tconv의 침윤에 기인하였는데, 이것은 향상된 이펙터 대 Treg 비를 유발하였다(도 30a의 D 내지 F 및 도 29b의 C 내지 E). 조합요법을 제공받은 동물로부터의 CD4+ 및 CD8+ TIL의 표현형적 특징규명은 치료받지 않은 동물 및 항-CTLA-4로 치료받은 동물에 비해 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki-67의 상향조절(도 30b의 G 내지 I), 및 B16-F10 종양 용해물로 펄싱된 수지상세포(DC)를 사용한 재자극에 반응한 보다 더 큰 백분율의 IFN-γ 발현 CD8+ 세포(도 30c의 J)를 입증하였다.
NDV 조합요법의 항-종양 활성은 CD8+ 세포, NK 세포, I형 인터페론 및 II형 인터페론에 의해 좌우된다.
세포성 면역의 어떤 성분이 관찰된 치료 효과의 원인이 되는지를 확인하기 위해, CD4+, CD8+ 또는 NK 세포에 대한 고갈 항체의 존재 하에 치료를 반복하였다. 각각의 세포 서브세트의 적절한 세포 고갈을 말초 혈액의 유동 세포측정으로 확인하였다(도 31). CD8+ 또는 NK 세포의 고갈은 장기간 생존을 유의하게 감소시키면서(CD8 고갈의 경우 p<0.0001, NK 고갈의 경우 p=0.0011)(도 32b의 C) 바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양 둘다에서 치료 효과를 제거하였다(도 32a의 A 및 B). 이 발견들과 일치하여, 항-IFN-γ 중화 항체를 사용한 동물의 치료도 치료 효과를 감소시켰다. 대조적으로, CD4+ 세포의 고갈은 항-종양 효과의 인지가능한 변화를 야기하지 않았지만, 이 결과는 항-CD4+ 고갈이 Treg의 동시적 고갈도 야기하기 때문에 신중히 해석되어야 한다.
I형 IFN이 항-종양 면역 반응을 위한 CD8+ 세포의 프라이밍에 있어서 중요한 역할을 수행한다는 것은 이미 입증되었다(Fuertes et al., 2011, J Exp Med, 208: 2005; Diamond et al, 2011, J Exp Med, 208: 1989). NDV에 의한 종양 제거에 있어서 I형 IFN의 역할을 조사하기 위해, I형 IFN 수용체 넉아웃(IFNAR-/-) 마우스에서 실험을 반복하였다. IFNAR-/- 마우스는 주입된 종양 및 반대쪽 종양 둘다의 급속한 진행을 나타내었고 조합요법에 대한 완전한 내성을 나타내었다(도 32b의 D 내지 F). 종합하건대, 이 발견들은 본 연구에서 관찰된 상기 바이러스의 전신 치료 효과를 위한 선천성 면역 반응 및 후천성 면역 반응 둘다의 중요한 역할을 강조한다.
NDV 요법은 종양 세포 및 종양 침윤 백혈구 상의 PD-L1의 상향조절을 유발한다.
NDV 요법과 조합된 다른 면역 체크포인트 표적화가 유리할 수 있는지를 확인하기 위해, NDV 감염 후 PD-1 - PD-L1 경로에 대한 효과를 평가하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, NDV로 감염된 종양 세포는 시험관내 및 생체내 둘다에서 세포 표면 상에서의 억제 PD-L1 리간드의 발현을 상향조절하였는데(도 33a), 이 결과는 감염되지 않은 원거리 종양에서도 관찰되었다. PD-L1의 상향조절은 종양 세포로만 제한되지 않았고, 선천성 면역 계통 및 후천성 면역 계통 둘다의 종양 침윤 백혈구 상에서도 관찰되었다(도 33b).
NDV와 PD-1 및 PD-L1 차단 항체의 조합요법은 개선된 항-종양 면역 및 장기간 동물 생존을 유발한다.
NDV와 PD-1 차단 항체의 조합, 및 NDV와 PD-L1 차단 항체의 조합을 전술된 양쪽 옆구리 흑색종 모델에서 평가하였다. 특히, CTLA-4 차단과 유사하게, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 조합된 NDV 요법은 개선된 동물 생존을 유발하였다(도 34 및 35). NDV와 항-PD-1 항체의 조합요법으로 치료받은 동물로부터의 원거리 종양을 특징규명하였다. 도 36으로부터 알 수 있는 바와 같이, 종양내 NDV와 전신 PD-1 차단의 조합요법은 면역 세포에 의한 현저한 원거리 종양 침윤을 유발하였는데, 이때 종양 침윤 CD8 세포의 증가는 가장 현저한 발견이다. 상기 침윤 세포는 증식 마커 및 용해 마커(각각 Ki67 및 그랜자임 B)를 상향조절하였다(도 37).
NDV는 바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양, 및 종양 배액 림프절( TDLN )에서 CD4 세포 및 CD8 세포 상의 ICOS의 종양 면역 침윤 상향조절을 유도한다.
상기 발견들은 종양내 NDV와 전신 면역 체크포인트 차단의 조합이 이들 두 치료 방법들 사이에 상당한 상승작용을 유발한다는 것을 입증하였다. 이 발견들을 더 확증하기 위해, 관련 보조자극 경로를 통한 종양 미세환경 내에서의 T 세포 이펙터 기능의 향상이 보다 더 우수한 항-종양 면역 반응을 유발할 수 있는지를 조사하였다. 종래 연구는 환자에서 CTLA-4 차단에 대한 반응의 강한 표시자로서 T 세포 상의 유도성 보조자극제(ICOS)의 지속된 상향조절을 확인하였다(Carthon et al., 2010, Clin. Canc. Res., 16:2861). ICOS는 T 세포 의존성 B 림프구 반응 및 모든 T 헬퍼 서브세트들의 발생에 매우 중요한 것으로 밝혀진 활성화된 T 세포의 표면 상에서 상향조절된 CD28 상동체이다(Simpson et al., 2010 Curr Opin Immunol. 22:326). CTLA-4 차단의 항-종양 효과에 있어서 ICOS의 역할은 최근에 마우스 연구에 의해 확인되었는데, 이때 ICOS 결핍 마우스는 CTLA-4 차단을 사용한 항-종양 반응의 발생에서 심각하게 손상되었다(Fu et al., 2011, Cancer Res., 71:5445).
NDV로 치료받은 양쪽 옆구리 종양 모델에서 ICOS의 발현을 특징규명하여 상기 수용체가 이 치료 방법에서 표적으로서 사용될 수 있는지를 확인하였다. 종양내 NDV 요법의 국소 효과 및 어브스코팔(abscopal) 효과를 특징규명하기 위해, 양쪽 옆구리 B16-F10 흑색종 모델을 사용하였는데, 이때 바이러스는 한쪽 종양에 투여되었다(도 38a의 A). 보다 더 우수한 반응을 예측할 수 있고 치료 효과의 추가 개선을 위해 표적화될 수 있는 활성화 마커를 평가하였다. 지속된 ICOS 상향조절이 악성 흑색종에 대해 항-CTLA-4 요법으로 치료받은 환자에서 보다 더 지속가능한 치료 반응 및 증가된 생존과 관련되어 있는 것으로 이미 밝혀져 있기 때문에, 본 실시예는 ICOS에 초점을 맞추었다. 종양 및 종양 배액 림프절로부터 단리된 림프구의 분석은 치료받은 동물들에서 활성화 마커들 중 하나로서 보조자극 분자 ICOS의 상향조절을 확인시켜주었다(도 38b의 B 및 C).
NDV-ICOSL 바이러스의 발생 및 시험관내 평가
NDV에 대한 역유전학 시스템을 사용하여 뮤린 ICOSL을 발현하는 NDV(NDV-ICOSL)를 발생시켰다(도 39a의 A). 감염된 B16-F10 세포의 표면 상에서의 ICOSL의 발현을 감염으로부터 24시간 후 유동 세포측정으로 확인하였다(도 39a의 B). 상기 바이러스의 시험관내 특징규명은 상기 바이러스가 모 NDV 균주와 유사한 복제(도 39b의 D) 및 용해(도 39b의 C) 성질을 갖는다는 것을 보여주었다.
NDV - ICOSL은 원거리 종양의 성장을 지연시키고 향상된 종양 림프구 침윤을 유도한다.
바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양에서 치료 효과에 대해 NDV-ICOSL을 평가하기 위해, 양쪽 B16-F10 종양을 보유하는 동물을 한쪽 옆구리 종양에게 제공된 상기 바이러스의 4회 종양내 주입으로 치료하였다. NDV-ICOSL 및 야생형 NDV는 바이러스를 직접 주입받은 종양 내에서 종양 퇴행을 야기하는 그들의 능력에서 필적할만하였다(도 40a의 A). 그러나, NDV-ICOSL은 야생형 NDV와 비교되었을 때 여러 동물들을 장기간 동안 종양 부재 상태로 유지하면서 원거리 종양의 유의한 종양 성장 지연을 유발하였다(도 40a 및 40b의 B 및 C). 상기 두 바이러스들 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았지만, 바이러스-주입된 종양의 분석은 야생형 NDV로 치료받은 동물 및 NDV-ICOSL로 치료받은 동물에서 CD4 및 CD8 이펙터 세포에 의한 향상된 종양 침윤을 보여주었고, 이 결과는 우측 옆구리 종양에 대한 상기 두 바이러스들의 유사한 활성을 반영한다(도 40a 및 40b의 A 및 D). 대조적으로, 좌측 옆구리 종양의 분석은 NDV-ICOSL로 치료받은 군에서 종양 침윤 CD8 및 Tconv 세포의 보다 더 현저한 증가를 보여주었다(도 40b의 E). 흥미롭게도, 조절 T 세포의 상대적인 백분율이 NDV로 치료받은 동물에서 유의하게 더 낮았지만(도 40b의 F), 조절 T 세포의 절대적인 수의 증가도 있었는데, 이때 가장 높은 증가는 NDV-ICOSL 군에서 관찰되었다(도 40b의 E).
NDV - ICOSL과 CTLA -4 차단의 조합요법은 주입된 종양 및 원거리 종양을 제거한다.
종합하건대, 상기 발견들은 NDV-ICOSL가 종양내로 투여된 원거리 종양에서 관찰된 유의한 염증 반응에도 불구하고, 대다수의 동물들이 여전히 종양에 굴복하였는데, 이 결과는 종양 미세환경 내에서 작용하는 억제 기작이 침윤 면역 세포에 의한 종양 제거를 방해한다는 것을 암시한다. 따라서, 국소 NDV-ICOSL과 전신 CTLA-4 차단의 조합요법의 효능을 평가하였다. 이 실험을 위해, NDV 또는 항-CTLA-4를 단일 약제로서 사용하였을 때 유의한 치료 효과가 관찰되지 않는 수준까지 종양 챌린지 용량을 증가시켰다. 전술된 바와 같이, 4회 용량의 NDV를 한쪽 종양에 투여하고 동시에 전신 항-CTLA-4 항체를 제공함으로써 동물을 치료하였다(도 41a의 A). B16-F10 모델에서, NDV-ICOSL 및 항-CTLA-4를 사용한 조합요법은 장기간 동물 생존과 함께 대다수의 주입된 종양 및 원거리 종양의 퇴행을 유발하였는데, 이 효과는 NDV-WT와 항-CTLA-4의 조합요법보다 유의하게 더 우수하였다(도 41b 및 41c의 B 내지 D). 이 발견들을 다른 종양 모델로 확장할 수 있는지를 확인하기 위해, 동일한 실험을 양쪽 옆구리 CT26 결장암종 모델에서 수행하였다. 시험관내에서 NDV-매개된 용해에 대한 CT26 세포의 약한 민감성에도 불구하고, 바이러스-주입된 종양 및 원거리 종양 둘다에 대한 NDV와 항-CTLA-4의 조합요법의 유의한 치료 효과를 관찰하였고, 이때 NDV-ICOSL와 항-CTLA-4의 조합요법을 사용한 군에서 보다 더 우수한 효과가 다시 관찰되었다(도 42a 내지 42c의 A 내지 D). 상기 두 종양 모델들에서, 종양이 완전히 제거된 동물들을 추가 요법 없이 90일째 날 치사량의 종양 세포로 재챌린지하였고 대다수의 동물들에서 재챌린지에 대한 보호를 입증하였다(도 41c의 E 및 42c의 E). 흥미롭게도, CT26 모델에서 모든 치유된 동물들이 재챌린지로부터 보호되었지만, B16-F10 모델에서 조합요법으로 치료받은 동물들은 항-CTLA-4 단독에 의해 치유된 동물에 비해 더 우수한 보호를 나타내었는데(도 41c의 E), 이 결과는 상기 조합요법이 보다 더 효과적인 보호 기억 반응을 유발한다는 것을 시사한다.
조합요법은 선천성 면역 세포 및 후천성 면역 세포에 의한 향상된 종양 침윤을 유발한다.
NDV와 항-CTLA-4의 조합요법으로 치료받은 동물로부터의 원거리 B16 종양의 분석은 상이한 하위종의 면역 세포들에 의한 유의한 종양 침윤을 입증하였다(도 43a의 A 및 B). 선천성 면역 성분(도 43a의 C 및 D) 및 후천성 면역 성분(도 43a의 E) 둘다에서 증가된 침윤이 분명하였는데, 이때 가장 높은 증가는 NDV-ICOSL과 항-CTLA-4의 조합요법으로 치료받은 군에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 이 군이 가장 높은 수의 침윤 CD8+ 림프구를 나타내었지만, 치료받지 않은 동물 또는 단일 약제 항-CTLA-4로 치료받은 동물(도 43a의 F)과 비교될 때 Treg의 전체 백분율이 유의하게 감소됨으로써 이펙터 대 Treg 비가 증가되었음(도 43b의 G)에도 불구하고 이 군에서 조절 T 세포의 통계적으로 유의한 증가도 관찰되었다(도 43a의 E). TIL의 상세한 분석은 NDV-ICOSL과 항-CTLA-4의 조합요법으로 치료받은 동물로부터 단리된 TIL이 가장 높은 수준의 활성화 마커, 용해 마커 및 증식 마커(각각 ICOS, 그랜자임 B 및 Ki67)를 발현하였다는 것을 입증하였다(도 43b의 H 내지 J).
다른 보조자극 분자를 발현하는 재조합 NDV의 발생
따라서, 본 실시예는 NDV에 의한 보조자극 리간드의 발현이 특히 면역 체크포인트 차단을 사용한 조합요법의 사용 시 보다 더 효과적인 항-종양 면역을 유발할 수 있는 보다 더 강한 면역 반응의 활성화를 유발할 수 있다는 것을 입증한다. 추가 보조자극 분자를 평가하기 위해, 면역글로불린 수용체 수퍼패밀리(ICOS 및 CD28) 및 TNF 수용체 수퍼패밀리(GITR, 4-1BB, OX40 및 CD40)를 표적화하는 리간드를 연구하였다. CD28을 표적화하기 위해, NDV F 당단백질의 세포질 도메인 및 경막 도메인, 및 CD28에 대한 단일 쇄 항체(aCD28-scfv)로 구성된 세포외 도메인을 갖는 키메라 단백질로 구성된 인공 리간드를 조작하였다(도 44의 A 및 B). TNF 수용체 수퍼패밀리를 표적화하는 리간드의 경우 감염된 세포의 표면 상에서의 상기 리간드의 향상된 발현을 보장하기 위해, 각각의 리간드의 세포외 도메인을 NDV HN 당단백질의 경막 도메인 및 세포내 도메인에 융합시켰다(도 44의 A 및 B). 추가로, 공통 감마 쇄 수용체 패밀리의 사이토카인(IL-2, IL-15 및 IL-21)을 발현하는 재조합 바이러스를 발생시켰다. 수득된 구축물은 도 44의 C에 도식으로 묘사되어 있다. 재조합 바이러스를 역유전학으로 발생시키고, 바이러스의 존재를 혈구응집 분석으로 확인하였다(도 45a의 A). 삽입된 유전자의 신뢰성을 보장하기 위해, RNA를 각각의 바이러스로부터 단리하고 클로닝된 유전자 영역의 외부에서 어닐링하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 45b의 B 및 C). 각각의 유전자의 서열을 생거(Sanger) 서열결정으로 더 확인하였다. 감염된 세포의 표면 상에서의 보조자극 리간드의 발현을 확인하기 위해, 배양된 B16-F10 세포를 2의 MOI에서 감염시키고 24시간 후 각각의 유전자에 대해 특이적인 항체를 사용하여 유동 세포측정으로 분석하였다(도 46).
NDV-4-1BBL은 원거리 종양에서 림프구에 의한 증가된 종양 침윤을 유도한다.
향상된 면역 반응의 임의의 증거를 나타내는 조작된 바이러스의 능력을 예를 들면, NDV-4-1BBL을 사용하여 평가하였다. 전술된 바와 같이 대조군 NDV 또는 NDV-4-1BBL을 우측 종양 내에 종양내 주입하여 양쪽 옆구리 B16-F10 흑색종을 보유하는 마우스를 치료하고, 15일째 날 원거리 종양을 채취하였다. 도 47로부터 알 수 있는 바와 같이, NDV-4-1BBL을 사용한 요법은 반대쪽 종양 내로의 선천성 면역 세포 및 후천성 면역 세포 둘다의 향상된 침윤을 나타내었는데, 이 발견은 ICOSL을 발현하는 NDV를 사용하여 유사한 결과를 나타내는 이전 발견과 일치한다(도 40). 종합하건대, 이 발견들은 종양 미세환경 내에서 NDV에 의한 면역자극 분자의 발현이 향상된 항-종양 면역을 유발할 수 있다는 것을 암시한다.
이 실시예 2에 기재된 분석과 유사한 분석을 이용하여 종양 면역 침윤을 유도하는 능력에 대해 발생된 바이러스 NDV-4-1BBL, NDV-GITRL, NDV-OX40L, NDV-CD40L, NDV-IL-2, NDV-IL-15 및 NDV-IL-21을 평가한다. 추가로, 치료 평가를 위해, 각각의 바이러스를 양쪽 옆구리 종양 모델에서 평가하는데, 이때 바이러스는 억제 체크포인트 PD-1, PD-L1 및/또는 CTLA-4를 표적화하는 전신 항체와 함께 단일 옆구리 종양에 투여된다.
결론
면역원성 종양 세포 사멸 및 염증 반응을 유발하기 위해, 상대적으로 약한 용해 활성에도 불구하고 I형 IFN 및 DC 성숙의 강력한 유도자인 것으로 입증된 비-병원성 NDV를 사용하였다(Wilden et al., 2009, Int J Oncol 34: 971; Kato et al., 2005, Immunity 23: 19). 수반되는 면역에 의해 영향을 받지 않는 것으로 이미 입증된 일정으로 시차를 두고 종양을 이식받은 양쪽 옆구리 흑색종 모델을 사용하였다(Turk et al., 2004, J Exp Med 200: 771). 본 실시예는 NDV의 종양내 주입이 원거리 바이러스 퍼짐의 부재 하에 원거리 종양 면역 침윤을 유발한다는 것을 입증한다. 특히, 이 효과는 면역요법에 대한 유리한 면역 반응의 마커인 것으로 이미 입증된 Treg 수의 상대적 감소 및 CD4 및 CD8 이펙터 대 Treg 비의 현저한 향상과 관련되어 있었다(Quezada et al., 2006, J Clin Invest 116: 1935; Curran et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107: 4275).
본 실시예의 데이터는 NDV가 종양 특이적 림프구에 의한 종양 침윤을 향상시킨다는 것을 입증하는데, 이 효과는 바이러스-주입된 종양의 본질에 의해 좌우되는 효과이었다. 양자적으로 전달된 림프구의 향상된 종양 침윤 및 증폭은 종양용해 바이러스 요법과 양자 T 세포 전달을 이용하는 치료 방법 사이의 상승작용도 암시한다. 종양 특이적 림프구가 초기 바이러스 감염 부위에서 활성화되고 증폭된 후 다른 종양 부위로 이동하는 듯한데, 이 이동은 케모카인 및 림프구 귀소 수용체에 의존할 가능성이 높다(Franciszkiewicz et al., 2012, Cancer Res 72: 6325). 본 실시예의 데이터는 원거리 종양 면역 침윤이 부분적으로 비-특이적이고 이종 종양의 NDV 감염 또는 치료받은 동물로부터 무자극 종양 보유 마우스로의 혈청 전달에 의해 유도될 수 있다는 것도 입증한다. 염증 사이토카인, 예컨대, IL-6에 의해 유도된 증가된 혈관 투과성은 종양 혈관구조의 활성화 및 종양 내로의 림프구 동원에 강력히 기여할 수 있다(Fisher et al., 2011, The Journal of clinical investigation 121: 3846).
TIL의 현저한 증가에도 불구하고, NDV 단일요법에 의한 원거리 종양의 치료 효과는 다소 약한데, 이 결과는 이 종양의 미세환경의 면역억제 성질을 강조한다(Spranger et al., 2013, Sci Transl Med 5). 특히, 전신 항-CTLA-4 항체와 종양내 NDV의 조합은 장기간 동물 생존과 함께 원거리 B16-F10 종양의 제거를 유발하였다. 동물들은 추가 종양 재챌린지로부터도 보호되었는데, 이것은 장기간 기억의 확립을 암시한다. 흥미롭게도, 시험관내에서 NDV-매개된 세포 용해에 대한 약한 민감성을 나타내는 TRAMP C2 및 CT26 종양 모델을 사용하였을 때에도 치료 효과가 관찰되었다. 이 발견들은 이 모델에서 직접적인 용해보다는 오히려 항-종양 효과를 유발하는 일차 기작으로서의 NDV-유도된 항-종양 면역/염증 반응의 중요성을 강조한다. 실제로, 조합요법으로 치료받은 NDV-주입된 종양 및 원거리 종양의 분석은 선천성 면역 세포, 및 활성화된 CD8+ 및 CD4+ 이펙터 세포에 의한 현저한 침윤을 입증한 반면, CD8+ 및 NK 세포의 고갈은 치료 효과를 제거하였다. 나아가, 조합요법은 IFNAR-/- 마우스에서 완전히 비-효과적이었는데, 이 결과는 이 시스템에서 항-종양 면역의 유도에 있어서 I형 IFN 경로의 역할을 뒷받침한다(Fuertes et al., 2011, J Exp Med 208, 2005; Diamond et al., 2011, J Exp Med 208: 1989; Swann et al., 2007, J Immunol 178: 7540).
요약하건대, 본 실시예는 NDV를 사용한 B16 흑색종의 국소 종양내 요법이 원거리 바이러스 퍼짐 없이 원거리(바이러스가 주입되지 않은) 종양에서 림프구 침윤 및 항-종양 효과를 유발하는 염증 반응을 유도한다는 것을 입증한다. 염증 효과는 바이러스-주입된 종양의 본질에 의해 좌우되는, 종양 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 원거리 종양 침윤과 일치하였다. 국소 NDV 및 전신 CTLA-4 차단을 사용한 조합요법은 NDV-매개된 용해에 대한 종양 세포주의 민감성과 관계없이 약한 면역원성 종양 모델에서 이미 확립된 원거리 종양의 제거 및 종양 재챌린지로부터의 보호를 유발하였다. 치료 효과는 활성화된 CD8+ 및 CD4+ 이펙터 세포에 의한 현저한 원거리 종양 침윤과 관련되어 있었으나 조절 T 세포와는 관련되어 있지 않았고, CD8+ 세포, NK 세포 및 I형 인터페론에 의해 좌우되었다. 본 실시예는 종양용해 NDV를 사용한 국소 요법이 원거리 종양에서 염증 면역 침윤물을 유도하여 이 종양이 면역조절 항체를 사용한 전신 요법에 민감하게 만든다는 것을 입증한다.
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Claims (57)

  1. 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 이때 상기 작용제가 상기 바이러스에 의해 발현되는, 키메라 NDV.
  2. 면역 세포의 억제 수용체의 길항제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV로서, 이때 상기 길항제가 상기 바이러스에 의해 발현되는, 키메라 NDV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    팩키징된 게놈이 돌연변이된 F 단백질을 코딩하고, 상기 돌연변이된 F 단백질이 상기 바이러스에 의해 발현되는, 키메라 NDV.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    면역 세포가 T 림프구 또는 천연 살해(NK) 세포인, 키메라 NDV.
  5. 제1항에 있어서,
    보조자극 수용체가 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), OX40, CD27, CD28, 4-1BB 또는 CD40인, 키메라 NDV.
  6. 제2항에 있어서,
    억제 수용체가 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1), B 및 T 림프구 약화제(BTLA), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3) 또는 T 세포 막 단백질 3(TIM3)인, 키메라 NDV.
  7. 제1항에 있어서,
    작용제가 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  8. 제1항에 있어서,
    작용제가 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드인, 키메라 NDV.
  9. 제1항에 있어서,
    작용제가 GITR, OX40, CD27, CD28, 4-1BB 또는 CD40에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  10. 제7항 또는 제9항에 있어서,
    항체가 단일클론 항체 또는 단일 쇄 Fv인, 키메라 NDV.
  11. 제8항에 있어서,
    리간드가 GITRL, CD40L, CD137L, OX40L, CD70 또는 ICOSL인, 키메라 NDV.
  12. 제2항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  13. 제2항에 있어서,
    길항제가 CTLA-4, PD-1, BTLA, KIR, LAG3 또는 TIM3에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  14. 제2항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체의 리간드의 가용성 수용체인, 키메라 NDV.
  15. 제2항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  16. 제2항에 있어서,
    길항제가 PDL1, PDL2, B7-H3, B7-H4, HVEM 또는 Gal9에 특이적으로 결합하는 항체인, 키메라 NDV.
  17. 제14항에 있어서,
    가용성 수용체가 PD1, BTLA, KIR, LAG3 또는 TIM3의 세포외 도메인인, 키메라 NDV.
  18. 제12항, 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 단일클론 항체 또는 scFv인, 키메라 NDV.
  19. 제1항, 제5항, 제7항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 한 항의 키메라 NDV 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  20. 제2항, 제6항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  21. a. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제9항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 NDV에 감염되기 쉬운 세포주에서 증식시키는 단계; 및
    b. 자손(progeny) 바이러스를 수집하는 단계
    를 포함하는, 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이때 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 상기 바이러스가 생장되는, 방법.
  22. a. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제9항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 부화란(embryonated egg)에서 증식시키는 단계; 및
    b. 자손 바이러스를 수집하는 단계
    를 포함하는, 약학 조성물을 제조하는 방법으로서, 이때 자손 바이러스가 약학 조성물로 제제화되기에 적합하도록 바이러스가 오염되지 않는 충분한 조건 하에 충분한 양으로 상기 바이러스가 생장되는, 방법.
  23. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제9항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 포함하는 세포주.
  24. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제9항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 포함하는 부화란.
  25. 제1항, 제5항, 제7항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 포함하는 약학 조성물을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  26. 제2항, 제6항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 포함하는 약학 조성물을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    키메라 NDV의 팩키징된 게놈이, 돌연변이된 F 단백질이 상기 바이러스에 의해 발현되도록 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    키메라 NDV의 팩키징된 게놈이, 돌연변이된 F 단백질이 상기 바이러스에 의해 발현되도록 돌연변이된 절단 부위를 갖는 돌연변이된 F 단백질을 코딩하는, 방법.
  29. 제25항에 있어서,
    면역 세포의 보조자극 수용체의 제2 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제26항에 있어서,
    면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제26항에 있어서,
    면역 세포의 억제 수용체의 제2 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제25항에 있어서,
    면역 세포의 억제 수용체의 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. NDV 및 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제를 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  34. NDV 및 면역 세포의 억제 수용체의 길항제를 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  35. 제33항에 있어서,
    NDV가 키메라 NDV이고, 이때 키메라 NDV가 이 바이러스에 의해 발현되는 사이토카인을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    NDV가 사이토카인을 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이고, 이때 상기 사이토카인이 이 바이러스에 의해 발현되는, 방법.
  37. 제33항에 있어서,
    NDV가 면역 세포의 보조자극 수용체의 제2 작용제 또는 면역 세포의 억제 수용체의 길항제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이고, 이때 상기 제2 작용제 또는 길항제가 이 바이러스에 의해 발현되는, 방법.
  38. 제34항에 있어서,
    NDV가 면역 세포의 보조자극 수용체의 작용제 또는 면역 세포의 억제 수용체의 제2 길항제를 코딩하는 팩키징된 게놈을 포함하는 키메라 NDV이고, 이때 상기 작용제 또는 제2 길항제가 이 바이러스에 의해 발현되는, 방법.
  39. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    사이토카인이 IL-2, IL-7, IL-15 또는 IL-21인, 방법.
  40. 제33항에 있어서,
    보조자극 수용체가 GITR, OX40, CD27, CD28, 4-1BB 또는 CD40인, 방법.
  41. 제34항에 있어서,
    억제 수용체가 CTLA-4, PD1, BTLA, KIR, LAG3 또는 TIM3인, 방법.
  42. 제33항에 있어서,
    작용제가 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  43. 제33항에 있어서,
    작용제가 보조자극 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드인, 방법.
  44. 제33항에 있어서,
    작용제가 GITR, OX40, CD27, CD28, 4-1BB 또는 CD40에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  45. 제42항 또는 제44항에 있어서,
    항체가 단일클론 항체 또는 단일 쇄 Fv인, 방법.
  46. 제43항에 있어서,
    리간드가 CD137L, OX40L, CD40L, GITRL, CD70 또는 ICOSL인, 방법.
  47. 제34항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  48. 제34항에 있어서,
    길항제가 CTLA-4, PD1, BTLA, KIR, LAG3 또는 TIM3에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  49. 제34항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체의 리간드의 가용성 수용체인, 방법.
  50. 제34항에 있어서,
    길항제가 억제 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  51. 제34항에 있어서,
    길항제가 PDL1, PDL2, B7-H3, B7-H4, HVEM 또는 Gal9에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    가용성 수용체가 PD1, BTLA, KIR, LAG3 또는 TIM3의 세포외 도메인인, 방법.
  53. 제47항, 제48항, 제50항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 단일클론 항체 또는 scFv인, 방법.
  54. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    양자(adoptive) T 림프구를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제33항 내지 제38항, 제40항 내지 제44항 및 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 흑색종, 대장암, 유방암, 난소암 또는 신장세포암인, 방법.
  56. 제33항 내지 제38항, 제40항 내지 제44항 및 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 악성 흑색종, 악성 신경아교종, 신장세포암종, 췌장 선암종, 악성 중피종, 폐 선암종, 폐 소세포암종, 폐 편평세포암종, 역형성 갑상선암 또는 두경부 편평세포암종인, 방법.
  57. 제33항 내지 제38항, 제40항 내지 제44항 및 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인, 방법.
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