CN1200037A - 鸡白细胞介素-15及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了分离并纯化的编码鸟类白细胞介素-15(IL-15)的DNA,以及包含IL-15DNA的克隆及表达载体和用编码IL-15载体转化的细胞。本发明还提供了分离并纯化的具有刺激促分裂原激活的鸟类T细胞能力的鸟类IL-15多肽。本发明还提供了一种用于增强禽类对一种免疫原的免疫应答的方法,它通过给予鸟类IL-15之前、之后或同时给予这种免疫原。最后,本发明提供了一种用于诱导禽类对一种免疫原的免疫应答的疫苗,它包括这种免疫原及有效量的鸟类IL-15。
Description
发明领域
本发明涉及分离的编码鸟类白细胞介素-15的基因及纯化的白细胞介素-15多肽。
发明背景
在发展中国家生产的大多数用于消费及产蛋的鸡(每年至少100亿)要进行疫苗接种以保护它们免患Marek氏病。所有的产蛋鸡及育种鸡还要用新城疫病毒、传染性囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽痘病毒及球虫的疫苗进行接种。为获得最理想的保护,在孵卵时或孵卵后进行Marek氏疫苗接种。有效的孵化前及孵化时接种发展的一个障碍是胚胎的和刚孵化的鸟的免疫系统不是发育完全的且不能对免疫原达到孵化后2-3周那样的免疫反应。这样,本领域内就需要能增强孵化前及孵化后鸟类疫苗效果的制剂及组合物。
白细胞介素-2和白细胞介素-15是刺激哺乳动物T细胞活性及增殖的相关的细胞因子。虽然IL-2和IL-15都与IL-2受体的β链和γ链相互作用,且可能共有一些三级结构的成分,这两种多肽不是同源的且代表不同的基因产物。
不同哺乳动物来源的编码IL-15的基因享有高度的同源性。例如,人和猿猴的IL-15有97%氨基酸同源。相反,本发明的主题,鸡的IL-15与哺乳动物的IL-15仅有25%氨基酸一致。鸡IL-15的另一个区别特性是它(而不是哺乳动物形式)产生于促分裂原激活的脾细胞。因此,鸡IL-15及其具有T细胞刺激活性的发现提供了一种用于增强鸟类疫苗接种的新试剂。不希望受理论的束缚,哺乳动物IL-15刺激骨骼肌发育的生物活性提示鸟类的IL-15在刺激鸟类生长中也有作用。
发明概述
本发明提供了分离并纯化的编码鸟白细胞介素-15(IL-15)的DNA及含有IL-15 DNA的载体的克隆和表达,以及用编码IL-15的载体转化的细胞。IL-15的来源鸟类包括但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑及野鸡。
本发明还提供了分离并纯化的鸟IL-15多肽,这种天然分泌的或成熟的形式有约14kDa的分子量、等电点约6.57、净电荷-2、亲水性指数0.278,并具有刺激促分裂原激活的鸟类T细胞及促进其它类型细胞生长的活性。本发明的IL-15可从天然的或重组的来源中获得。
本发明还包括序列保守及功能保守的鸟IL-15 DNA及IL-15多肽的变异体,包括,如一段有生物活性的IL-15序列或与一段纯化序列同框融合的亚片段。
另一方面,本发明提供了一种用于增强禽类对一种免疫原的免疫应答的方法,这是通过在给予增强此免疫应答有效量的鸟IL-15之前、之后或同时给予这种免疫原来获得的。
还有一方面,本发明提供了一种用于诱导禽类对一种免疫原的免疫应答的疫苗,包括这种免疫原及增强免疫应答有效量的鸟IL-15。此免疫原可来源于如,Marek氏病病毒、新城疫病毒、传染性囊病病毒、传染性支气管炎病毒等鸟类病原体。
附图的简单描述
图1图解说明一段包括编码鸡IL-15的747nt cDNA的845nt的序列。
图2图解说明一段与鸡IL-15前体多肽一致的143氨基酸序列。
本发明的详细描述
本说明中引用的所有的专利申请、专利及参考文献都作为整体引入本文。如遇冲突,本说明书(包括定义)将控制。
本发明包括来自鸟类的IL-15。本发明提供了分离并纯化的编码鸟类IL-15的核酸以及从天然或重组来源提纯的IL-15多肽。按照本发明生产的鸟类IL-15可用于商业化禽类养殖以促进其生长并增强鸟类疫苗的效力。核酸、载体、转化
图1显示了编码鸡IL-15的cDNA序列(序列号1),图2显示了预期的鸡IL-15的氨基酸序列(序列号2)。将这种鸟类多肽称作IL-15是基于它的部分氨基酸序列与哺乳动物IL-15同源及这种多肽具有刺激促分裂原激活的T细胞的能力(见下面)。此外,不希望被理论束缚,鸟类IL-15多肽还预期表现出下面的一种或多种生物活性:激活NK细胞(自然杀伤细胞)、刺激B细胞成熟、肥大细胞的增殖及与IL-2受体的β及γ亚单位相互作用。
由于遗传密码的简单性(即多个密码子编码某个氨基酸),除了图1所示的以外的DNA序列也可编码图2中所示的鸡IL-15氨基酸序列。这些其它的DNA包括那些含有“保守序列”的变体,在这些变体中给定的密码子中的一个或多个核苷酸的改变不会导致那个位置编码氨基酸的改变。此外,常能改变多肽中的一个给定的氨基酸残基而不改变这种天然多肽的整体构象和功能。这种“功能保守”的变体包括但不限于,用一个具有相似理化性质,例如,酸性的、碱性的、疏水的等等氨基酸代替一个氨基酸(如,用精氨酸代替赖氨酸,用谷氨酸代替天冬氨酸,或用丙氨酸代替甘氨酸)。此外,可在不破坏此分子的生物活性的条件下,增加或删除氨基酸序列。例如,可在氨基末端或羧基末端加上一段氨基酸序列以作为纯化标记(即以便允许蛋白质的一步纯化,之后可将它们用化学的或酶的方法去除)。或者,此附加的序列可赋予一个附加的细胞表面结合位点或改变IL-15的靶细胞特异性。
本发明范围之内的这种鸡IL-15 cDNA是图1中的那些、序列保守性变异DNA、编码功能保守的变异多肽的DNA序列及其组合。本发明包括鸟类IL-15的片段,不论单独的,还是与其它序列或成分组合,它表现出一种有用程度的生物活性。如下面所解释的,在本领域的普通技能之内,能够可预期地操作IL-15序列并证实一个给定的IL-15变异体是否对一个给定的应用具有合适的稳定性及生物活性。这可能通过在一个重组系统中表达和纯化这种变异IL-15多肽,测定它的T细胞刺激活性和/或在细胞培养及动物中的促进生长活性,然后在应用中检验的过程来达到。
本发明还包括来源于包括但不限于鸭子、火鸡、野鸡、鹌鹑及鹅的其它鸟类的IL-15 DNA(及多肽)。通过筛选cDNA或基因组文库以鉴定与含有图1序列的全部或部分的探针杂交的克隆,容易确定图1所示的鸡序列的鸟IL-15同系物。或者,可利用识别鸡IL-15的抗体来筛选表达文库。不希望被理论束缚,预期来自其它鸟类的IL-15将与鸡IL-15基因享有至少约70%的同源性。包括在本发明范围内的还有编码IL-15鸡同系物的DNA,它被定义为编码与鸡IL-15享有至少大约25%氨基酸一致性的多肽的DNA。
总的来说,本发明的核酸操作应用本领域众所周知的方法进行,象那些公开的,例如《分子克隆,实验室手册》(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)(第二版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编,ColdSpring Harbor)或《分子生物学现行方法》(Current Protocols inMolecular Biology,Aufubel,Brent,Kingston,More,Feidman,Smith及Stuhl编。Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY,NY,1992)。
本发明包括cDNA及RNA序列及正义和反义序列。本发明还包括基因组鸟IL-15多肽DNA序列及侧翼序列,包括但不限于调节序列。编码鸟IL-15多肽的核酸序列还可与异源序列联系,包括启动子、增强子、效应元件、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5’及3’非编码区等等。可操作地与鸟IL-多肽DNA序列相联的转录调节元件包括但不限于那些具有引导源于原核细胞、真核细胞、原核细胞的病毒、真核细胞的病毒及其任意组合的基因的表达的能力的元件。其它有用的异源序列本领域中的技术人员都知道。
本发明中的核酸能用本领域技术人员所知的方法进行修改以改变它们的稳定性、溶解度、结合亲和力及特异性。例如,能选择性地将序列甲基化。本发明中的核酸序列还可用能直接或间接地提供一个可检测信号的标记进行修饰。典型的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等等。
本发明还提供了包括编码鸟IL-15多肽的核酸的载体。这样的载体包括,例如用于在一系列真核及原核宿主中表达的质核载体,优选地,载体还包括一个可操作地联接在鸟IL-15多肽编码部分的启动子。这个被编码的鸟IL-15多肽可通过利用任何这里解释的合适的载体及宿主细胞或其它的本领域技术人员所知的方法进行表达。
载体常常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统,一个或多个用于在宿主中筛选的标志例如象抗生素抗性及一个或多个表达盒。插入的编码序列可以是合成的、从天然来源中分离的、以杂交方式制备的等等。编码序列与转录调节序列之间的连接可通过本领域技术人员所知的方法获得,合适的宿主细胞可利用任何包括电穿孔、氯化钙或脂质体介导的DNA渗入、真菌感染、微注射、微粒轰击等合适方法进行转移/转染/感染。
用于实施本发明的合适的载体包括但不限于YEp352、pcDNAI(InVitrogen,San Diego,CA),pRc/CMV(In Vitrogen)及pSFV1(GIBCO/BRL,Gaithrsburg,MD)。用于本发明中的一个优选的载体是pSFV1。合适的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、COS细胞、PC12细胞、CHO细胞、GH4Cl细胞、BHK-21细胞及两栖动物黑色素细胞。BHK-21细胞是用于实施本发明的一种优选的宿主细胞系。
还可通过重组事件将编码鸟类IL-15多肽的核酸引入到细胞内。例如,可将这样一种序列微注射到细胞中,在编码此多肽的内源基因、其类似物或假基因或与编码鸟IL-15多肽基因基本相同的序列的位点上进行有效的同源重组。还可应用其它重组方法如非同源重组以及利用同源重组将内源基因删除,特别是在多潜能细胞中。
IL-15多肽
鸡IL-15基因(图1中显示的cDNA)编码一段143氨基酸的多肽(图2)。不希望被理论束缚,通过与猿猴IL-15对比以及利用已被接受的方法来预测信号肽酶切割位点(Von Heijne《核酸研究》(Nuc.Acids Res.) 14:4683,1986),可预期一段氨基端的约22氨基酸的引导序列(分泌信号肽)从初级翻译产物上切割下来以产生成熟的IL-15。这种推测的121氨基酸的成熟序列进一步的特征为预计13971道尔顿的分子量,等电点6.57;4个半胱氨酸残基(在图2所示的前体IL-15的氨基酸号63,70,116及119处)与共存于人、鼠及猴中的被认为是参与分子间的二硫健的四个半胱氨基酸一致;还有一个与人IL-15中相似位点一致的保守的N-联接的糖基化位点(在图2所示序列的天氨酰胺110处)。
从天然或重组的来源中对IL-5的纯化可通过本领域内熟知的方法获得,包括但不限于离子交换层析,C4柱上的反相层析,凝胶过滤,等电聚焦,亲和层析,免疫亲和层析等等。在一个优选的具体实施方案中,按如下方法获得大量生物活性IL-15,可通过在pSFV1复制子(GIBCO/BRL)中构建一个含有IL-15编码区的重组DNA序列,其中IL-15编码区与编码6C-末端组氨酸残基的序列同框架融合。应用本领域中技术人员所熟知的技术合成此质粒编码的mRNA并通过电穿孔技术将其引入到BHK-21细胞中,这种细胞合成并分泌成熟的糖基化的含有6-C末端组氨酸的IL-15多肽。这种修饰过的IL-15多肽可通过用组氨酸结合树脂(His-bind,Novagen,Madison,WI)的亲和层析容易地从细胞上清中纯化。
从任何来源分离出的鸟IL-15多肽都可以用本领域中熟悉的方法进行修饰,例如,鸟IL-15可被磷酸化或去磷酸化,糖基化或去糖基化等等。改变鸟IL-15溶解度、稳定性、及结合特异性和亲和力的修饰特别有用。抗IL-15抗体
本发明包括对上述鸟IL-15多肽特异的抗体,这些抗体可以是多克隆的或单克隆的,并且可以区分来自不同种类的鸟IL-15,鉴别功能区域,等等。利用Harlow和Lane《抗体,实验室操作手册》((Antibodies,A Laboratory Manual),Cold Spring HarborLaboratory,1988)及这里引用的其他参考文献中公开的方法及成分,以及本领域中所知的免疫学及杂交瘤技术来方便地制备这些抗体。用来自天然的或合成的鸟IL-15肽来诱导一种鸟IL-15特异的免疫应答的时候,可将这种多肽方便地连接到一种如KLH的合适载体上,并在一种合适的如弗氏佐剂中给药。优选地,基本按照Tam的方法(1988,《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:5409-5413)将所选的肽偶联到一种赖氨酸核心载体上。这样产生的抗体可 改造成一价的形式,如Fab,FAB’或FV。还可用所知的方法制备抗独特型抗体,特别是内部的影像抗独特型抗体。
在一种具体实施方案中,纯化的鸟IL-15被用于免疫小鼠,之后取出它们的脾脏,按照本领域中的标准技术将脾细胞与骨髓瘤细胞杂交以获得分泌抗体细胞的克隆。针对下述功能对由这种细胞分泌的单克隆抗体利用体外检测进行筛选:与鸟IL-15结合、抑制IL-15的受体结合活性及抑制IL-15的T细胞刺激活性。
利用如ELISA、RIA等免疫测定法,抗鸟IL-15抗体可用于鸟类IL-15的鉴定及定量。抗鸟IL-15抗体还可用于免疫消耗鸟类IL-15的提取液。此外,这些抗体还可用于鉴定、分离及纯化不同来源的鸟类IL-15,并进行亚细胞及组织化学的定位研究。应用
按本发明生产的鸟类IL-15能有益地用于同源的或异源的鸟类中,例如,刺激激活的T细胞(Grabstein等,《科学》(Science),264:965,1994)及B细胞(Armitage等,《免疫学杂志》(J.Immunol.,154:483,1995)和/或促进比如象肌肉细胞的非免疫细胞的生长(Quinn等,内分泌学(Endocrinol.)136:3669,1995)。疫苗
本发明包括用于增强鸟类免疫应答效力的方法及组合物。在这个具体实施方案中,鸟类IL-15与一种期望对其诱出免疫应答的免疫原联合使用。例如,在鸟类疫苗诸如那些抗Marek氏病、新城疫病毒及其他如传染性囊病病毒和传染性支气管炎病毒病原体的疫苗中,期望在疫苗中包含禽类IL-15以增加免疫应答的数量和质量。为达到这个目标,上面描述的纯化于天然或重组来源的IL-15在疫苗配制品中的浓度范围为每只鸡每剂疫苗约0.01μg~1.0μg。
IL-15可与一种活疫苗(即复制性)或一种非复制性疫苗联合使用。复制性疫苗的例子不限于包括天然的或重组的病毒或细菌如修饰的火鸡疱疹病毒或修饰的禽痘病毒的那些。非复制性疫苗的例子不限于包括杀灭的或灭活的病毒或其他微生物,或者是粗制或纯化的来自天然的、重组的或合成的原料的抗原的那些,诸如球虫疫苗。禽疫苗的商业来源包括但不限于:Rhone Merieux Laboratoire-IFFA(里昂,法国);Intervet International BV(Bonmeer,荷兰);Mallinckrodt Veterinary;Solvay Animal Health(Mendota Heights,MN);Hoechst-Roussel(Knoxville,TN)及Nippon Zeon Co,Ltd.(Kawasaki-Kiu,日本)。
在一个具体实施方案中,将编码IL-15的基因结合到一种重组病毒中,然后将它配制成一种活疫苗。将IL-15基因结合到这种病毒中以便用一种合适的启动子控制它的表达。这种疫苗的使用使得生物活性的IL-15的表达在时间上及空间上与期望的免疫应答相近,从而增强疫苗的功效。IL-15可在孵化前及孵化后作为疫苗制剂的一部分给予鸟。优选在孵化前,利用本领域内已知的方法,例如美国专利号5,034,513及5,028,421所描述的那些。促进生长
本发明提供了用于医学和/或商业目的的增强鸟类生长的方法和组合物。在本具体实施方案中,利用任何合适的给药方式给予鸟IL-15。用于促进生长,IL-15的给药量为约0.25μg/kg/天到约25μg/kg/天。IL-15的量能通过本领域内熟知的常规实验确定,如通过建立一个剂量和频率的矩阵并与一组此矩阵中的每个点相对的实验单位或主体相比较。
按照本发明,天然或重组的禽IL-15可用一种生理可接受的载体配制,比如象磷酸盐缓冲盐水或去离子水。此配制品还可含有赋形剂,包括本领域所熟知的润滑剂、增塑剂、着色剂、吸附增强剂、杀细菌剂等等。本发明中的IL-15多肽可通过任何有效的手段进行给药,包括但不限于静脉内、皮下的、肌肉内、跨粘膜、局部的或口腔途径。例如,对于皮下给药方式,剂型可由灭菌生理盐水中的IL-15组成。对于口腔给药方式,带有或不带有赋形剂的IL-15可包裹在微小的或大的(如)脂质体和微球体中。还可利用皮膜片(小块)或其它缓慢释放的剂型。
下面的实施例用于进一步阐述本发明而不限制它的范围。实施例1:鸡IL-15基因的克隆
利用来自伴刀豆凝集素A激活的脾细胞的一种鸡脾细胞cDNA文库来克隆鸡IL-15(Kaplan,《免疫学杂志》(J.Immunol),151:628,1993)。在含有30μg/ml氨苄青霉素及10μg/ml四环素的LB琼脂平皿上5000个菌落在25℃生长过夜。挑取15-20个菌落并转到10mlTerrific培养液(含有同样的抗生素)中并生长过夜。然后用已发表的步骤(Maniatis,Section 1.28)分离来自每个组的质粒DNA,用RNA酶(10μg/ml)处理,并贮存在TE缓冲液中。
用脂质转染胺(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)将质粒DNA转染到COS-7细胞(ATCC)中。每组的1μg质粒与3μg脂质转染胺在100μl Opti-MeM培养液(GIBCO/BRL)中混合,孵育30分钟,然后加到在12孔板中已生长到汇合度约80-90%并在无血清培养液中清洗过的COS-7细胞上。将细胞与DNA用不含血清和抗生素的Dulbecco’s MEM在37℃孵育5小时,然后用含有10%胎牛血清的相同的培养液补充,并在37℃孵育过夜。第二天用含10%胎牛血清、青霉素及链霉素的Dulbecco’s MEM更换培养液。再孵育另外24小时后,收集培养液并贮存于-20℃。
按下面的实施例2中所描述的方法检测细胞上清的IL-15活性。具有最高刺激指数(1.6-2.1)的5个组显示出比其余278组的均值高2倍标准差的活性水平。这5组中的3组在第二次筛选中仍为阳性,并再分为6个组。从次级组中提取的质粒DNA用于转染COS-7细胞,上清用于IL-2样活性检测。象在下面实施例2中所描述的,鉴定了3个阳性组并进行细分以获得单独的克隆,从每个组中至少分离出了一个阳性克隆。
利用自动化的Applied Biosystems Model 373A测序系统对所有3个阳性克隆的完整的cDNA插入物进行测序。利用包含于pcDNA1载体中的侧翼T7及Sp6引物来启动测序反应。其中的两个克隆B2.16.2及M2.12.1相同并编码图1所示的cDNA序列。F19.84克隆与那两个克隆相似,但在5’末端丢失了20nt(即开始于此编码区的第一个ATG)并且在3’末端含有一个至少100nt的多聚T尾。
利用BLAST检索(它可进入所有主要的国际核酸数据库)分析这种完整的747nt序列,没有检测出与其他任何已知的序列有有意义的同源性。还在一台MacIIci计算机上利用Mac Vector软件程序(MacVector 4.0;国际生物技术公司,New Haven,CT)分析了这个序列。这种分析揭示了一个在它的5’末端侧翼有一段用于翻译启始的Kozak保守序列的开放阅读框架。这个开放阅读框架的预期的氨基酸序列在图2中显示(序列号2)。利用BLASTP检索(它可进入所有主要的国际蛋白质数据库)分析这种氨基酸序列,显示与猴及人前体IL-15具有有意义的同源性。
这种鸡IL-15的预期的氨基酸序列由一段143氨基酸的多肽组成,它有一个预期的16,305的分子量及6.37的等电点。基于它的氨基末端的疏水性及与已知的信号肽切割位点(Von Heijine,《核酸研究》14:4683,1986)的比较,预期位于甘氨酸22及丙氨酸23之间的切割位点导致了一段约22氨基酸的氨基端引导序列从初级产物中去除以产生成熟的IL-15。
预期的121氨基酸的成熟IL-15有预期的13,971的分子量及6.57的等电点和一个可能的N-连接的糖基化位点(图2中的天冬酰胺110)。预期的来自猴、人、小鼠和鸡的IL-15的氨基酸序列的比较及对猴IL-15三级结构的分析(Grabstein,科学,264:965,1994)提示,鸡IL-15中的4个半胱氨酸(图2中前体IL-15的63,70,116及119的位置)是保守的并形成链内二硫键。
实施例2:鸡IL-15的生物活性的测定
IL-15的生物活性测定按下面进行:通过用伴刀豆凝集素A(ConA)(10μg/ml)(Sigma公司,圣路易斯,MO)在含有2mg/mlBSA、抗生素及谷氨酰胺的RPMI 1640培养液(Sigma)中与鸡脾细胞(107/ml)在40℃孵育24小时来准备ConA激活的脾T细胞。然后将培养液换成含2%正常鸡血清(Sigma)及0.05Mα-甲基吡喃糖苷(Sigma)的Iscoves氏培养液(Sigma),再孵育2-4天,需要时另加培养液稀释细胞。能过将它们轻轻地铺在一种Histopaque密度梯度(Sigma)上,按制造商的操作指导离心来该这混合物中纯化母细胞。然后将细胞洗涤3次并最终悬浮在测定液中(含2%正常鸡血清的Iscoves氏液(Sigma))。
为了这种检测,将2×104母细胞在含IL-15(例如,来自转染的COS-7细胞的上清的稀释液)的测定液或合适的对照液中接种于圆底的96孔板中。在40℃孵育过夜后,细胞用3H-胸腺嘧啶(0.5μCi)(New England Nuclear,Boston,MA)+氟脱氧尿苷(10-6M)(Sigma)脉冲6小时,然后将细胞收获到玻璃纤维滤器上(Whatman,Clifton,NJ),并在液闪计数器上测定放射活性。IL-15以刺激指数表示,它是实验样品的放射活性-对照(非转染的COS-7细胞上清)的放射活性。一个典型的结果列于表1:
表1
a首次筛选在1/10稀释度。b用5个阳性及3个阴性组重复转染。
质粒DNA来源 | DNA名称 | 刺激指数1/10dila 1/10dilb 1/33dilb 1/100dilb | |||
初级组 | A19B2E7F19M2278组的均值±SD32个阴性组均值 | 1.62.21.81.81.71.1±0.1 | 1.94.21.73.53.21.4 | 1.32.31.52.01.91.3 | 1.21.70.91.21.31.1 |
次级组 | A19.7B2.16F19.8M2.12 | 0.76.09.83.2 | 1.93.53.42.2 | ||
单个克隆 | B2.16.2F19.8.4M2.12.1 | 6.67.57.2 | 3.34.03.9 | 2.73.03.6 |
实施例3:IL-15的纯化及表达
为了在哺乳动物细胞中获得鸡IL-15的高表达,应用pSFV1真核表达载体(它包括Semliki Forest病毒复制子)(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)。这种载体的应用允许信号肽的切割、糖基化及成熟的活性蛋白的分泌。在一个具体实施方案中,这种重组的载体在天然IL-15序列的羧基端编码另外的6个组氨酸残基,允许在一种镍柱(Novagen,Madison,WI)上有效地一步纯化分泌蛋白。
构建了包括IL-15 cDNA编码区侧面的5’及3’序列的引物。3’引物还包括编码6个组氨酸的核苷酸。这些引物被用于聚合酶链式反应(PCR)。用作模板的完整的IL-2 cDNA包含于pcDNA1质粒中。将扩增的cDNA,包括编码组氨酸的序列,连接到pSFV1质粒(GIBCO/BRL)中。通过纯化DH5大肠杆菌(GIBCO/BRL)及在含氨苄青霉素的琼脂平皿及培养液中挑选转化子来获得这种质粒。
利用制造商提供的程序以这种质粒为模板在体外产生mRNA。通过电穿孔法将这种mRNA转移到BHK-21细胞中,每107细胞用10μgRNA,然后将细胞孵育1-3天。收获细胞上清,利用一个合适的缓冲系统(组氨酸结合缓冲试剂盒,Novagen)将上清通过一个树脂基质(组氨酸结合树脂;Novagen,Madison,WI)。2.5ml的单一柱能纯化多达20mg的标记蛋白质。用试剂盒中提供的洗脱缓冲液将IL-15从柱中洗脱出来。估计在50ml培养液中生长的BHK-21细胞合成大约25mg总蛋白质,其中高达5%含有重组表达并分泌的蛋白质,这近似相当于1.25mg cIL-15。
实施例4:鸟类IL-15在疫苗中的应用
进行下面的实验以评估鸡IL-15在鸡疫苗中的免疫增强活性。
将鸡IL-15 cDNA插入到用于鸡重组蛋白表达的两种病毒载体中(分别源于火鸡疱疹病毒和禽痘病毒)(Morgan等,鸟类疾病,36:858,1992;Yanagida等,病毒学杂志,66:1402,1992;Nazerian等,病毒学杂志,66:1409,1992)。这些IL-15修饰的活病毒载体与现有的各种各样的疫苗同时用于新孵化的小鸡,6天后,用相应的有毒力的病毒进行攻击,观察8周疾病的进展。这些鸡的发病率与没有接受IL-15修饰的活病毒载体的对照相比。一个示范方案(包括预期的结果)列于表2:
表2组别第1天的处理 第6天的攻击 预期疾病的百分比
a表达IL-15的火鸡疱疹病毒
123456789 | 无无HVT(未修饰)HVT-IL-15aHVT(未修饰)+HVT-IL-15无HVT-IF-15NDV疫苗NDV疫苗+HVT-IL-15 | 无有毒力的Marek氏有毒力的Marek氏有毒力的Marek氏有毒力的Marek氏有毒力的NDV有毒力的NDV有毒力的NDV有毒力的NDV | 0>80%20%0-10%0-10%>80%30%->50%20%0-10% |
在一种替代方法中,利用Ulmer JB《科学》,259:1745-1749,1993中描述的方法,用100μg含鸡IL-15 cDNA的质粒给刚孵化的小鸡肌肉注射。这些小鸡及的接受了一种缺乏IL-15 cDNA对照载体的对照小鸡,在第2天用鸡疫苗接种,然后在第7天用相应的有毒力的病毒攻击。观察8周它们的疾病征象。预期用含IL-15 cDNA的pcDNA1载体注射的小鸡将比对照组表现出较低的发病率。
最后,由实施例3中描述的方法纯化的IL-15蛋白质通过肌内给予刚孵出的小鸡,然后在接下来的4天中每天给药一次。将小鸡分成3组,每天每次注射0.01、0.1或1.0μg。第4组注射安慰剂。孵出时,所有的小鸡用鸡疫苗进行接种,然后在第7天用相应的有毒力的病毒进行攻击,然后观察8周它们的疾病征象。预期用IL-15注射的小鸡相对于对照组显示较低的发病率。
实施例5:鸟类IL-15用于促进生长
哺乳动物IL-15刺激肌肉生长(Quinn,LS.内分泌学.,136:3669,1995),半纯的鸡IL-2刺激鸡体重并提高饲料转化(美国专利流水号5,028,421)。为了评估鸟类IL-15的生长促进活性,可用实施例4中描述的方法给予在病毒载体或质粒载体中的IL-15 cDNA或重组IL-15蛋白。在6周的时间内监控试验及对照组的鸡的体重增加和饲料转化。预期这些实验中的一个或多个与对照组相比加速鸡的生长。
Claims (19)
1.一种分离并纯化的编码鸟类白细胞介素-15的DNA。
2.权利要求1的DNA,它来自选自鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑及野鸡的一种鸟类。
3.一种分离并纯化的DNA,其具有图1中序列号1中所列出的核苷酸序列。
4.一种分离并纯化的DNA,其具有选自图1中序列号1中所列出的序列、它的序列保守的变体及它的功能保守的变体的序列。
5.一种分离并纯化的编码图2序列号2中所列出的氨基酸序列的DNA。
6.一种分离并纯化的编码一种鸟类白细胞介素-15的DNA,其中所说的多肽具有约14000道尔顿的分子量并具有刺激促分裂原激活的鸟类T细胞的能力。
7.一种分离并纯化的编码鸡白细胞介素-15的DNA。
8.一种分离并纯化的包含鸟类白细胞介素-15的多肽。
9.权利要求8的多肽,它来自选自鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑及野鸡的一种鸟类。
10.一种分离并纯化的包含图2中序列号2中所列出的氨基酸序列的多肽。
11.一种增强禽类对一种免疫原的免疫应答的方法,它包括在给予所说的免疫原之前、之后或基本上同时给予增强所说的免疫应答有效量的鸟类IL-15。
12.权利要求11的方法,其中所说的白细胞介素-15来自选自鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑及野鸡的一种鸟类。
13.权利要求11的方法,其中所说的白细胞介素-15具有选自图2中序列号2中所列出的序列、它的序列保守的变体及它的功能保守的变体的序列。
14.权利要求11的方法,其中所说的给予的白细胞介素-15的有效量是在每次给药约0.01μg~1.0μg的范围内。
15.权利要求11的方法,其中所说的免疫原包括非复制性疫苗。
16.权利要求11的方法,其中所说的免疫原包括复制性疫苗。
17.一种用于诱导禽类对一种免疫原的免疫应答的增强型疫苗,它包含所说的免疫原及增强所说的免疫应答有效的量的鸟类白细胞介素-15。
18.权利要求17的疫苗,其中所说的白细胞介素-15存在量的范围为每剂所说的疫苗约0.01μg-1.0μg。
19.权利要求17的疫苗,其中所说的免疫原来自一种选自Marek氏病病毒、新城疫病毒、传染性囊病病毒及传染性支气管炎病毒的病原体。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |