JP2000500328A - チキンインターロイキン−１５及びその使用 - Google Patents

チキンインターロイキン−１５及びその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明はトリインターロイキン-15(IL-15)をコードする単離され精製されたDNAを提供し、同様にIL-15を含むクローニング及び発現ベクターそしてIL-15コードベクターでトランスフォームされた細胞を提供する。本発明はまた単離され精製されたトリIL-15ポリペプチドを提供し、それはマイトジェン活性化トリT細胞を刺激する能力をもつ。本発明はまた、免疫応答を増大するのに有効量のトリIL-15を投与する前、後、または実質的に同時に免疫原を投与することによる、免疫原に対するトリにおける免疫応答を増大するための方法を提供する。最後に本発明は、免疫原及び有効量のトリIL-15を含む免疫原に対するトリにおける免疫応答を誘発するためのワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 チキンインターロイキン-15及びその使用 発明の分野 本発明はトリインターロイキン-15をコードする遺伝子の単離及びインターロ イキン-15ポリペプチドの精製に関する。 発明の背景 消費及び産卵のために先進国で生産されるほとんどのチキンが(少なくとも年 当たり100億)マレック病に対してそれらを保護するためにワクチン接種されてい る。産卵チキン及び繁殖家畜はまたニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイ ルス、感染性気管支炎ウイルス、鶏痘ウイルスを用いたワクチン接種、及びコク シジウムワクチンを受けている。最適な保護のために、マレックのワクチン接種 は孵化時または孵化前のいずれかに実施されている。効力のある孵化前及び孵化 時ワクチン接種摂生の発達の障害は、胎児の及び孵化したてのトリの免疫系は十 分に発達しておらず、孵化後2-3週間のものほど免疫原に対する免疫応答が有効 に開始できないことである。それゆえ孵化前及び孵化後のトリワクチン接種の有 効性を増大する試薬及び組成物に対する本分野での必要性が存在する。 インターロイキン-2及びインターロイキン-15は哺乳動物におけるT細胞の活性 及び増殖を刺激するサイトカインに関する。IL-2及びIL-5の両者はIL-2受容体の β及びγ鎖と相互作用し、四次構造のいくつかのエレメントを共有するであろう が、該2のポリペプチドは相同ではなく、別個の遺伝子産物を代表する。 いくつかの異なる哺乳動物種由来のIL-15をコードする遺伝子は、高程度のホ モロジーを有する。例えばヒト及びサルのIL-15は97%のアミノ酸同一性を有する 。対照的に本発明の目的物たるチキンIL-15は哺乳動物IL-15と25%のアミノ酸同 一性しか共有しない。チキンIL-15のもう一つの区別される性質は、マイトジェ ン活性化脾臓細胞によってそれは生産される(哺乳動物形態ではそうではない)こ とである。したがってチキンIL-15の発見及びそれがT細胞刺激活性を持っている という 発見は、トリ種におけるワクチン添加物に対する新たな試薬を提供する。いかな る理論と結び付けられることをも期待しないが、骨格筋発達を刺激する哺乳動物 IL-15の生活性は、トリIL-15もまたトリ種における成長を刺激するのに有用であ ることを示唆する。 発明の概要 本発明はトリインターロイキン-15(IL-15)をコードする単離され精製されたDN Aを提供し、同様にIL-15を含むクローニング及び発現ベクターそしてIL-15コー ドベクターでトランスフォームされた細胞を提供する。IL-15が由来するトリ種 はチキン、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジを制限することなく含む 。 本発明はまた単離され精製されたトリIL-15ポリペプチドを提供し、その天然 の分泌形態または成熟形態は約14kDaの分子量をもち、等電点は約6.57であり、2 の実効電荷をもち、0.278の親水性指標をもち、マイトジェン活性化トリT細胞を 刺激し他の細胞タイプの増殖を促進する能力をもつ。本発明にしたがったIL-15 は天然のソース及び組換えソースから得られるであろう。 トリIL-15DNA及びトリIL-15ポリペプチドの配列保存変異体および機能保存変 異体もまた本発明に包含され、例えば精製配列にインフレームで融合された生活 性IL-15配列またはサブ断片も含まれる。 もう一つの面として本発明は、免疫原に対するトリにおける免疫応答を増大す るための方法を提供し、それは免疫応答を増大するのに有効量のトリIL-15を投 与する前、後、または実質的に同時に免疫原を投与することによって達成される 。 さらにもう一つの面として本発明は、免疫原及び免疫応答増大のために有効量 のトリインターロイキン-15を含む、免疫原に対するトリにおける免疫応答を誘 発するためのワクチンを提供する。免疫原は例えばマレック病ウイルス、ニュー カッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス等のような トリ病原体から由来するであろう。 図面の簡単な説明 図1はチキンインターロイキン-15(IL-15)をコードする747ntのcDNA配列を含む 845nt配列の説明である。 図2はチキンインターロイキン-15前駆体ポリペプチドに相当する143アミノ酸 配列の説明である。 発明の詳細な説明 本明細書で引用されている全ての特許出願、特許及び文献はここで全体として 参考として取り込まれる。矛盾のある場合には定義を含む本記述が優先するであ ろう。 本発明はトリ種由来のインターロイキン-15(IL-15)を包含する。本発明はトリ IL-15をコードする単離され精製された核酸を提供し、同様に天然ソースまたは 組換えソースのいずれかから精製されたIL-15ポリペプチドを提供する。本発明 にしたがって生産されたトリIL-15は、成長を促進しトリワクチンの効力を増大 するために商業的なトリの養殖において用いられるであろう。 核酸、ベクター、トランスフォーマント チキンIL-15をコードするcDNAの配列が図1(SEQ ID NO:1)に示され、チキンIL- 15の予想されるアミノ酸配列が図2(SEQ ID NO:2)に示されている。このトリポリ ペプチドがIL-15である証拠は、哺乳動物IL-15に対する部分的なアミノ酸配列ホ モロジー及びマイトジェン活性化T細胞を刺激する該ポリペプチドの能力に基づ いている(以下参照)。さらにいかなる理論と結び付けられることも期待しないが 、トリIL-15はまた一つ以上の以下の生活性を示すことが予想される:NK(ナチュ ラルキラー)細胞の活性化、B細胞成熟の刺激、マスト細胞の増殖及びIL-2受容体 のβ及びγサブユニットとの相互作用。 遺伝学的コードの縮重(すなわち複数のコドンが特定のアミノ酸をコードする) のため、図1に示されている以外のDNA配列もまた図2に示されているチキンIL-15 アミノ酸をコードし得る。該他のDNAには、与えられたコドンにおける一つ以上 のヌクレオチドの変化がその位置でコードされるアミノ酸の改変を引き起こさな い「配列保存」変異体を含むものが含まれる。さらにポリペプチドにおける与えら れたアミノ酸は、しばしば天然のポリペプチドの全体の構造及び機能を改変しな い で変化され得る。該「機能保存」変異体には、例えば酸性、塩基性、疎水性等のよ うな同様の物理化学的性質を持つもので一つのアミノ酸を置換することが制限す ることなく含まれる(例えばアルギニンでのリシンの置換、グルタミン酸でのア スパラギン酸の置換またはアラニンでのグリシンの置換)。加えてアミノ酸配列 は分子の生活性を破壊することなく付加または欠失し得る。例えば付加的なアミ ノ酸配列が、精製タグとして機能するためにアミノ末端またはカルボキシ末端で 付加され得る(すなわちタンパク質の単一工程精製を許容し、その後でそれらは 化学的または酵素的に除去され得る)。代わりに付加的な配列は付加的な細胞表 面結合部位を与えることができ、またはそうではなくIL-15のターゲット細胞特 異性を改変し得る。 本発明の範囲にあるチキンIL-15cDNAは、図1のもの、配列保存変異体DNA、機 能保存変異体ポリペプチドをコードするDNA配列及びそれらの組み合わせである 。本発明は単独でまたは他の配列または組成物と組み合わせてのいずれでも、有 用な程度の生活性を示すトリインターロイキン-15の断片を包含する。いかに説 明するようにIL-15の配列を予想されるように操作すること、及び与えられたト リIL-15変異体が与えられた実用性に対する適当な安定性及び生活性をもつかど うかを確立することは、当業者の十分な範囲にある。これは組換え系において変 異体IL-15ポリペプチドを発現し精製し、細胞カルチャーおよび動物においてT細 胞刺激活性及び/または増殖促進活性をアッセイし、引き続き実用性をテストす ることによって達成され得る。 本発明はまたアヒル、七面鳥、キジ、ウズラ及びガチョウを制限することなく 含む、他のトリ種由来のIL-15DNA(及びポリペプチド)を包含する。図1に示され ているチキン配列のトリIL-15ホモローグは、図1の配列の全部または一部を含む プローブにハイブリダイズするクローンを同定するために、cDNAまたはゲノムラ イブラリーをスクリーニングすることによって容易に同定される。代わりに発現 ライブラリーをチキンIL-15を認識する抗体を用いてスクリーニングしてもよい 。いかなる理論に結び付けられることをも期待しないが、他のトリ種由来のIL-1 5遺伝子はチキンIL-15遺伝子と少なくとも約70%のホモロジーを共有するであろ うと予想される。IL-15のチキンホモローグをコードするDNAもまた発明の範囲に 包含さ れ、それはチキンIL-15と少なくとも約25%のアミノ酸同一性を共有するポリペプ チドをコードするDNAと定義される。 一般的に本発明にしたがった核酸操作は、例えばMolecular Cloning,A Labora tory Manual(第2版,Sambrook,Fritsch及びManiatis,Cold Spring Harbor)、また はCurrent Protocols in Molecular Biology(編者、Aufubel,Brent,Kingston,Mo re,Feidman,Smith及びStuhl,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY,NY,19 92)に開示されているもののような、本分野でよく知られている方法を用いる。 本発明はcDNA及びRNA配列そしてセンス及びアンチセンス配列を包含する。本 発明はまた調節配列を制限することなく含む、ゲノムトリIL-15ポリペプチドDNA 配列及びフランキング配列を包含する。トリIL-15ポリペプチド(類)をコードす る核酸配列はまた、プロモーター、エンハンサー、レスポンスエレメント、シグ ナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'-及び3'-非コード領域等を含む 異種配列と関連する。トリIL-15ポリペプチドDNA配列(類)と実施可能にリンクし ているであろう転写調節エレメントは、原核生物細胞、真核生物細胞、原核生物 細胞のウイルス、真核生物細胞のウイルス、及びそれらのいかなる組み合わせ由 来の遺伝子の発現に向ける能力を持つものを制限することなく含む。他の有用な 異種配列も当業者には知られている。 本発明の核酸をその安定性、溶解性、結合アフィニティーおよび特異性を改変 するために当業者に既知の方法で修飾することが可能である。例えば該配列を選 択的にメチル化し得る。本発明の核酸配列はまた直接的にまたは間接的にのそれ ぞれで検出可能なシグナルを提供することができるラベルを用いて修飾し得る。 例示的なレベルにはラジオアイソトープ、蛍光分子、ビオチン等が含まれる。 本発明はまたトリIL-15ポリペプチド(類)をコードする核酸を含むベクターを 提供する。該ベクターには例えば様々な真核生物及び原核生物ホストで発現する ためのプラスミドベクターが含まれる。好ましくはベクターはまた、部分をコー ドするトリIL-15ポリペプチドに実施可能にリンクしたプロモーターを含む。コ ードされるトリIL-15ポリペプチド(類)は、ここで説明されるような、さもなけ れば当業者に既知ないかなる適したベクター及びホスト細胞を用いることによっ ても発現され得る。 ベクターはしばしば、例えば抗生物質耐性及び一つ以上の発現カセットのよう なホストにおけるクローニングまたは発現のための一つ以上の複製系、選択のた めの一つ以上のマーカーを含む。該インサートされたコード配列は合成されても よいし、天然のソースから単離してもよいし、ハイブリッドのように調製しても よいし、その他も考え得る。転写調節配列に対するコード配列のライゲーション は、当業者に既知の方法で達成されるであろう。適したホスト細胞は、エレクト ロポレーション、CaCl2-またはリポソーム介在性DNA取り込み、カビ感染、マイ クロインジェクション、マイクロプロジェクティル等を含むいかなる適した方法 によっても、トランスフォーム/トランスフェクト/感染し得る。 本発明の実施の使用に適したベクターには、YEp352,pcDNA1(In Vitrogen,San Diego,CA),pRc/CMV(In Vitrogen)及びpSFV1(GIBCO/BRL,Gaitherburg,MD)が制限 されることなく含まれる。本発明の使用に対する一つの好ましいものはpSFV1で ある。適したホスト細胞には大腸菌、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、GH4C 1細胞、BHK-21細胞及び両生類黒色素胞細胞が含まれる。BHK-21細胞は本発明の 実施における使用に対して好ましいホスト細胞系である。 トリIL-15ポリペプチド(類)をコードする核酸もまた組換え操作により細胞内 に導入され得る。例えば該配列を細胞内にマイクロインジェクションし得、ポリ ペプチドそれの類似体またはシュードジーン、またはトリIL-15ポリペプチドコ ード遺伝子に対して実質的に同一の配列をコードする内因性遺伝子の部位で相同 的組換えさせ得る。非相同的組換え、および特に多能性細胞における相同的組換 えによる内因性遺伝子の欠失のような他の組換えベースの方法もまた用いられ得 る。 IL-15ポリペプチド チキンIL-15遺伝子(図1に示されているcDNA)は、143アミノ酸(図2)のポリペプ チドをコードする。いかなる理論と結びつくことをも期待しないが、サルIL-15 との比較により、及び予想されるシグナルペプチダーゼ切断部位(Von Heijne,Nu c.Acids Res.,14:4683,1986)に対する一般的な方法の使用により、約22アミノ酸 のアミノ末端リーダー配列(分泌シグナルペプチド)が成熟IL-15を生産するため 一次翻訳産物から切断されることが予想される。121アミノ酸の予想される成熟 配列は、 13,971の予想される分子量;6.57の等電点;ヒト、マウス及びサルIL-15で共通に 保存されている4のシステインに相当し、分子内ジスルフィド結合に関与すると 考えられる4のシステイン残基(図2に示されている前駆体IL-15におけるアミノ酸 番号63,70,116及び119で);ヒトIL-15におけるのと同じ部位に相当するN結合型グ リコシル化(図2に示されている配列のアスパラギン110で)に対する1のコンセン サス部位によってさらに特性指摘される。 天然ソースまたは組換えソースからのIL-15の精製は、イオン交換クロマトグ ラフィー、C4カラムでの逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動、 アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー等 を制限することなく含む本分野で既知の方法によって達成される。好ましい実施 態様としては、生活性IL-15の大容量が、pSEV1レプリコン(GIBCO/BRL)において6 のC末端ヒスチジン残基をコードする配列にフレーム内で融合したIL-15に対する コード領域を含む組換えDNA配列を構築することによって得られ得る。本プラス ミドによってコードされるmRNAは、当業者によく知られた方法を用いて合成され 、エレクトロポレーションによってBHK-21細胞内に導入される。細胞は6のC末端 ヒスチジンを含む成熟グリコシル化IL-15ポリペプチドを合成し分泌する。修飾I L-15ポリペプチドはヒスチジン結合樹脂(His-bind,Novagen,Madison,WI)を用い てアフzィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から容易に精製される 。 いかなるソースから単離されたトリIL-15ポリペプチドも、本分野で既知の方 法によって修飾され得る。例えばトリIL-15はリン酸化または脱リン酸化し得、 グリコシル化または脱グリコシル化し得、その他もなし得る。トリIL-15の溶解 性、安定性及び結合特異性とアフィニティーを改変する修飾は特に有用である。 抗IL-15抗体 本発明は上述のように同定されたトリIL-15ポリペプチドに対して特異的な抗 体を包含する。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、異なる種か らトリIL-15を識別し、機能的なドメインを同定し、その他のこともする。該抗 体はしばしばここで引用されるHarlowとLane,Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988に開示されている方法と組成物を用いて作 製さ れ、同様に本分野で既知の免疫学的方法及びハイブリドーマ法を用いて作製され る。天然のまたは合成トリIL-15由来ペプチドがトリIL-15特異的免疫応答を誘導 するために用いられた場合、該ペプチドはKLHのような適したキャリアーに簡便 に結び付けられ、フロイントのような適したアジュバントにおいて投与される。 好ましくは選択されたペプチドはTam(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5409-54 13の方法にしたがってリシンコアキャリアーと実質的に結合される。結果として 生じた抗体は例えばFab,FAB'またはFV等の一価形態に修飾し得る。抗イディオタ イプ抗体、特に内部の像を検出可能な抗イディオタイプ抗体もまた既知の方法を 用いて調製し得る。 一つの実施態様として、本分野で標準的な方法にしたがって、精製されたトリ IL-15をマウスを免疫化するために用い、その後にその脾臓を摘出し、抗体分泌 細胞のクローンを得るためにメラノーマ細胞を用いて細胞ハイブリッドを形成す るのに脾臓細胞を用いる。該細胞によって分泌される結果として生じたモノクロ ーナル抗体を、以下の活性のためのin vitroアッセイで用いるためにスクリーニ ングする:トリIL-15に対する結合、IL-15の受容体結合活性の阻害、及びIL-15の T細胞刺激活性の阻害。 抗トリIL-15抗体をELISA、RIA等のような免疫アッセイを用いてトリIL-15を同 定し定量するために用い得る。抗トリIL-15抗体はまたトリIL-15の免疫欠失抽出 物にも用い得る。加えてこれらの抗体を異なるソースからトリIL-15を同定し、 単離しそして精製するために、及び細胞内局在研究及び組織化学的局在研究を実 施するために用い得る。 実施法 本発明にしたがって生産されたトリIL-15を、例えば活性化T細胞(Grabstein等 ,Science,264:965,1994)及びB細胞(Armitage等,J.Immunol.,154:483,1995)を刺 激するため、及び/またはたとえば筋肉細胞(Quinn等,Endocrinol.136:3669,1995 )のような非免疫細胞の増殖を促進するため、同種または異種のトリ種において 有益に用い得る。 ワクチン 本発明はトリ種における免疫応答の効力を増大するための方法及び組成物を包 含する。本実施態様において、トリIL-15を免疫応答を除去するのに望ましい免 疫原と接合して用いる。たとえばマレック病、ニューカッスル病ウイルス及び感 染性嚢炎ウイルスあるいは感染性気管支炎ウイルスのような他の病原体に対する もののようなトリワクチンにおいて、免疫応答の大きさと質を増大するためにワ クチンにトリIL-15を含ませることは望ましい。この目的のために、上述したよ うに天然のまたは組換えソースから精製されたIL-15を、チキン当たりのワクチ ン当たり約0.01μgから約1.0μgの範囲の濃度でワクチン処方に含ませる。 IL-15を生きた(すなわち複製可能な)ワクチンまたは非複製可能ワクチンと接 合して投与し得る。複製可能ワクチンの非限定的な例として、殺傷したまたは不 活性化ウイルスか他の微生物、または例えばコクシジウムワクチンのような非精 製のあるいは精製した天然ソース、組換えソースまたは合成ソース由来の抗原が 含まれる。トリワクチンの商業的なソースとしては、以下のものが制限されるこ となく含まれる:Rhone Merieux Laboratoire-IFFA(Lyon,France);Intervet Inte rnational BV(Boxmeer,The Netherlands);Mallinckrodt Veterinary;Solvay Ani mal Health(Mendota Heights,MN);Hoechst-Roussel(Knoxville,TN);及びNippon Zeon Co.,Ltd.(Kawasaki-kiu,Japan)。 一つの実施態様として、IL-15をコードする遺伝子を組換えウイルス内に取り 込ませ、それから生ワクチン内に処方する。IL-15遺伝子を発現が適したプロモ ーターでコントロールされるようウイルス内に取り込ませる。ワクチンの投与は 望ましい免疫応答に対する時間的場所的に非常に近接して、生活性IL-15の発現 を引き起こす。IL-15を米国特許第5,034,513号及び第5,028,421号に記述されて いるような本分野で既知の方法を用いて、孵化前または後のそれぞれで、好まし くは孵化前に、ワクチン処方の一部としてトリに投与し得る。 成長促進 本発明は医療上の及び/または商業上の目的のためトリ種の成長を促進するた めの方法及び組成物を提供する。この実施態様においては、IL-15をいかなる適 した 投与形態を用いてでもトリに投与する。成長促進のためにIL-15を約0.25μg/kg/ 日から約25μg/kg/日の範囲の量で投与する。必要とされるIL-15の量は、投与量 と頻度の組み合わせを確立し、組み合わせの各点で実験ユニットまたは患者のグ ループを比較することによるように、本分野でよく知られた日々の実験によって 決定され得る。 本発明にしたがって天然のまたは組換えトリIL-15を、例えばリン酸緩衝生理 食塩水または脱イオン水のような生理学的に許容できるキャリアーを用いて処方 し得る。処方にはまた、潤滑剤(類)、可塑剤(類)、着色料(類)、吸収促進剤(類) 、殺菌剤(類)等を含む本分野でよく知られた賦形剤も含まれる。本発明のIL-15 ポリペプチドを、静脈内、皮下、筋肉内、粘膜通過、局所的または経口の各経路 を限定することなく含むいかなる効果的な手段によっても投与し得る。皮下投与 に対しては、例えば投与形態は滅菌生理食塩水におけるIL-15より成るであろう 。経口投与に対しては、賦形剤の存在下でも不存在下でもIL-15は、例えばリポ ソーム及びマイクロスフェアー内にミクロまたはマクロカプセル化していよう。 皮膚パッチ(または他の持続放出投与形態)もまた用いられよう。 以下の実施例は本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明するよ う企図されている。 実施例1:チキンIL-15遺伝子のクローニング チキンIL-15をクローニングするために、コンカナバリンAを用いて活性化した 脾臓細胞由来のチキン脾臓細胞cDNAライブラリーを用いた(Kaplan,J.Immunol,15 1:628,1993)。5000コロニーを30μg/mlのアンピシリン及び10μg/mlのテトラサ イクリンを含むLBアガープレート上で35℃オーバーナイトで成育させた。15-20 コロニーをプールし、10mlのTerrific Broth(同じ抗生物質を含む)にトランスフ ァーし、オーバーナイトで成育させた。それから各プール由来のプラスミドDNA を出版物の方法(Maniatis,Section 1.28)にしたがって単離し、RNAアーゼで処理 し、TEバッファーに貯蔵した。 プラスミドDNAをLipofectamine(GIBCO/BRL,Gaithersburg,HD)を用いてCOS-7(A TCC)細胞にトランスフェクトした。それから1μgの各プラスミドプールを100μl のOpti-MEM培地(GIBCO/BRL)において3μlのLipofectamineと混ぜ、30分インキュ ベートし、それから12穴プレートに80-90%の飽和状態に成育したCOS-7細胞上に 置き、血清フリー培地でリンスした。細胞とDNAを血清と抗生物質の不存在下で ダルベッコMEMを用いて37℃で5時間インキュベートし、それから10％胎児ウシ血 清を含む同じ培地を用いて補い、37℃でオーバーナイトでインキュベートした。 翌日培地を10％胎児ウシ血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベ ッコMEMに取り替えた。さらに24時間のインキュベーション後、培地を回収し、- 20度で貯蔵した。 以下の実施例2に記述されているように、IL-15活性のため細胞上清を試験した 。最高刺激指標(1.6から2.1)を持つ5のプールが、残りの278プールの平均由来の 2の標準偏差より大きい活性のレベルを示した。5のプールのうち3は第二のスク リーニングにおいてもポジティブのままであり、6のプールに細分割した。第二 のプールから抽出されたプラスミドDNAをCOS-7細胞をトランスフェクトするため に用い、上清をIL-2様活性のため試験した。以下の実施例2に記述されているよ うに、3のポジティブプールを同定し、個々のクローンを生ずるために細分割し た:各プールから少なくとも１のポジティブクローンが単離された。 全ての3のポジティブクローンの完全なcDNA挿入物を、自動Applied Biosystem s Model 373Aシークエンスシステムを用いてシークエンスした。pcDNA1ベクター に含まれたフランキングT7及びSP6プライマーを、シークエンス反応のプライマ ーとして用いた。2のクローン、B1.16.2及びM2.12.1を同定し、それらは図1に示 されたcDNA配列に対してコードしていた。クローンF19.84は2のクローンと同様 であるが、5'末端で20ntを欠いており(すなわちコード領域の第一のATGで開始す る)、また3'末端で少なくとも100ntのpolyTテールを含む。 完全な747nt配列(図1、SEQ ID NO:1)をBLASTサーチを用いて分析した(それは 主要な国際的核酸データバンクの全てにアクセスする)。いかなる既知の配列と も有意なホモロジーは検出されなかった。配列をまたMac IIciコンピューターで 、Mac Vectorソフトウェアープログラム(Mac Vector 4.0;International Biotec hnologies,Inc.,New Haven,CT)を用いて分析した。この分析により、翻訳開始の ためのKozakコンセンサス配列によってその5'末端で位置するオープンリーディ ングフ レームが明らかにされた。このオープンリーディングフレームの予想されるアミ ノ酸配列は図2に示されている(SEQ ID NO:2)。このアミノ酸配列をBLASTPサーチ を用いて分析し(それは主要な国際的タンパク質データバンクの全てにアクセス する)、サルおよびヒト前駆体IL-15と有意なホモロジーが明らかにされた。 チキンIL-15の予想されるアミノ酸配列は、予想される16,305の分子量と6.37 の等電点を持つ143アミノ酸のポリペプチドより成る。そのアミノ末端の疎水性 質に基づき、及び既知のシグナルペプチド切断部位との比較により(von Heijne, Nucleic Acids Res.14:4683,1986)、グリシン22とアラニン23の間での切断が成 熟IL-15を生産するために、一次産物から約22アミノ酸のアミノ末端リーダー配 列(分泌シグナルペプチド)の除去を引き起こすことが予想される。 121アミノ酸の予想される成熟IL-15配列は、13,971の予想される分子量、6.57 の等電点、及び潜在的なN結合型グリコシル化部位(図2のアスパラギン110で)を 持つ。サル、ヒト、マウス及びチキン由来のIL-15の予想されるアミノ酸配列間 の比較、及びサルIL-15の四次構造の分析(Grabstein,Science,264:965,1994)の 分析により、チキンIL-15の4のシステイン(前駆体IL-15の63,70,116,119位)が保 存されており分子内ジスルフィド結合を形成していることが示唆された。 実施例2:チキンIL-15の生活性アッセイ IL-15に対する生活性アッセイを以下のように実施した:コンカナバリンA(ConA )活性化脾臓T細胞を、2mg/mlBSA、抗生物質及びグルタミンを含むRPMI1640培地( Sigma)において、ConA(10μg/ml)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を用いて40 ℃で24時間チキン脾臓細胞(107細胞/ml)をインキュベートすることによって調製 した。それから該培地を2％通常チキン血清(Sigma)及び0.05Mアルファ-メチルピ ランノシド(Sigma)を含むIscoves'培地(Sigma)にさらに2-4日間置換し、必要と されるような付加的な培地で細胞を希釈した。芽細胞をHistopaque密度勾配(Sig ma)上でそれらを緩やかに層状にしてこの混合物から精製し、製品の説明書にし たがってそれらを遠心分離した。それから細胞を3回洗浄し、最終的にアッセイ 培地(2％通常チキン血清(Sigma)を含むIscoves')に再懸濁した。 該アッセイのために2×104芽細胞を、IL-15(例えばトランスフェクトされたCO S-7細胞由来の上清の希釈物のような)及び適したコントロールを含むアッセイ培 地において、丸底96穴プレートに置いた。40℃でオーバーナイトでのインキュベ ーション後、細胞を6時間3H-チミジン(0.5μCi)(New England Nuclear,Boston,M A)+フルオロデオキシウリジン(10-6M)(Sigma)を用いて6時間パルスした。それか ら細胞をガラスファイバーフィルター(Wharman,Clifton,NJ)で回収し、放射性活 性を液体シンチレーションカウンターで測定した。IL-15を刺激指標として表し 、該指標は実験サンプルにおける放射性活性-コントロール(非トランスフェクト COS-7上清)における放射性活性である。典型的な結果を表1に示す。 a1/10希釈での第一のスクリーニングb5のポジティブプール及び3のネガティブプールを用いた繰り返しトランスフェクション 実施例3:IL-15の発現と精製 哺乳動物細胞におけるチキンIL-15の高レベル発現を得るために、pSFV1真核生 物発現ベクター(セムリキ森林ウイルスレプリコンを含む)を用いた(GIBCO/BRL,G aitherburg,MD)。該ベクターの使用はシグナルペプチド切断、グリコシル化及び 成熟活性タンパク質の分泌を可能にした。一つの実施態様として、組換えベクタ ーは天然のIL-15配列のカルボキシ末端に付加的な6のヒスチジン残基をコードし 、ニッケルカラム(Novagen,Madison,WI)上で分泌タンパク質の能率的な単一工程 精製を可能にする。 IL-15cDNAのコード領域の横に位置する5'及び3'配列を含むプライマーを構築 した。3'プライマーはまた6のヒスチジンに対してコードする核酸を含む。これ らのプライマーを、pcDNA1プラスミド内に含まれる完全なIL-2cDNAをテンプレー トとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で用いた。ヒスチジンコード配列 を含む結果として生じた増幅されたcDNAを、pSFV1プラスミド(GIBCO/BRL)内にラ イゲートした。該プラスミドを、DH5大腸菌(GIBCO/BRL)をトランスフォームし、 アガープレートとアンピシリンを含む肉汁上でトランスフォーマントを選択する ことによって得た。 プラスミドを製品のプロトコールを用いてin virtoでmRNAを生産するためにテ ンプレートとして用いる。mRNAを107細胞当たり10μgのRNAを用いて、エレクト ロポレーションによりBHK-21細胞内にトランスフェクトした。細胞上清を回収し 、適したバッファー系(His-bindバッファーキット;Novagen)を用いて樹脂マトリ ックス(His-Bind樹脂、Novagen,Madison,WI)を通過させた。タグを付したタンパ ク質の20mgまで単一2.5mlカラム上で精製した。IL-15をキットに溶出バッファー を提供してカラムから溶出した。50ml培地で成育するBHK-21細胞は、組換え的に 発現され分泌されたタンパク質を5％まで含む約25mgのトータルタンパク質を合 成すると見積もられる。これはおよそ1.25mgのcIL-15に相当する。 実施例4:ワクチンにおけるトリIL-15の使用 以下の実験はチキンワクチンにおけるチキンIL-15の免疫増大活性を評価する ために実施される。 チキンIL-15cDNAをチキンにおける組換えタンパク質の発現のために用いられ る2のウイルスベクター(それぞれ七面鳥ヘルペスウイルス及び鶏頭ウイルス)内 に挿入する(Morgan等,Avian Diseases,36:858,1992;Yanagida等,J.Virol.,66:14 02,1992;Nazerian等,J.Virol.,66:1409,1992)。これらのIL-15修飾生きたウイル スベクターを、現在用いられている様々なワクチンの投与と同時に、新生チキン に投与する。6日後チキンを相当する悪性ウイルスを用いてチャレンジし、疾患 の発達を8週間観察する。これらのチキンにおける疾患の発病率を、IL-15修飾生 きたウイルスベクターを受け取っていないコントロールと比較する。サンプルプ ロトコール(期待値を含む)を表2に示す。 aIL-15を発現する七面鳥のヘルペスウイルス 代わりの方法としては、新生チキンを、Ulmer,J.B.Science,259:1745-1749,19 93に記述された方法を用いて、チキンIL-15に対するcDNAを含む100μgのプラス ミドを用いて筋肉内に注射する。これらのチキン及びIL-15cDNAを欠いたコント ロールベクターを受け取ったコントロールチキンを、チキンワクチンを用いて2 日にワクチン接種し、それから相当する悪性ウイルスを用いて7日にチャレンジ する。それらを疾患の徴候のため8週間観察する。IL-15cDNAを含むpcDNA1ベクタ ーを用いて注射されたチキンは、コントロールと比較して減少した疾患発病率を 示すことが期待される。 最後に実施例3に記述された方法によって精製されたIL-15タンパク質を、孵化 時にチキンに筋肉内に投与し、引き続き更なる4日間のそれぞれで単一の毎日の 投与をする。チキンを3のグループにわけ、毎日の注射当たり0.01,0.1または1.0 μgを受け取る。第四のグループは偽薬の注射を受け取る。孵化時に全てのチキ ンにチキンウイルスを用いてワクチン接種し、それから相当する悪性ウイルスを 用いて7日にチャレンジする。それからそれらを疾患の徴候に対して8週間観察す る。IL-15を用いて注射されたチキンはコントロールと比較して減少した疾患発 病率を示すことが期待される。 実施例5:成長促進におけるトリIL-15の使用 哺乳動物IL-15は筋肉成長を刺激し(Quinn,L.S.,Endocrin.,136:3669,1995)、 半精製IL-2はチキン体重を刺激し食物の肉への変換を増大する(米国特許第5,028 ,421号)。トリIL-15の成長促進活性を評価するために、上述の実施例4に記述さ れた方法を、ウイルスまたはプラスミドベクターにおけるIL-15cDNA及び組換えI L-15タンパク質を投与するために用い得る。実験チキンとコントロールチキンを 6週間の期間体重増と食物の肉への変換をモニターする。一つ以上のこれらのプ ロトコールがコントロールに対するチキン成長を増大することが期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．トリインターロイキン-15をコードする単離し精製したDNA。 ２．チキン、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジから成るグループより 選択されたトリ種由来の請求項1のDNA。 ３．図1、SEQ ID NO:1に示された核酸配列を持つ単離し精製されたDNA。 ４．図1、SEQ ID NO:1に示された配列、それらの配列保存変異体、及びそれらの 機能保存変異体から成るグループより選択された配列を持つ単離し精製されたDN A。 ５．図2、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列をコードする単離し精製されたDN A。 ６．インターロイキン-15ポリペプチドが約14000ダルトンの分子量をもち、マイ トジェン活性化トリT細胞を刺激する能力を持つトリインターロイキン-15ポリペ プチドをコードする単離し精製されたDNA。 ７．チキンインターロイキン-15をコードする単離し精製したDNA。 ８．トリインターロイキン-15を含む単離し精製されたポリペプチド。 ９．チキン、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジから成るグループより 選択されたトリ種由来の請求項8のポリペプチド。 10．図2、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列を含む単離し精製されたポリペプ チド。 11．免疫原に対するトリにおける免疫応答を増大する方法で、トリインターロイ キン-15の上記免疫応答を増大するための有効量を、上記免疫原の投与の前、後 または実質的に同時に投与することを含む方法。 12．上記インターロイキン-15がチキン、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及 びキジから成るグループより選択された種由来である請求項11の方法。 13．上記インターロイキン-15が、図2、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列、 それらの配列保存変異体、及びそれらの機能保存変異体から成るグループより選 択されたアミノ酸配列を含む請求項11の方法。 14．上記投与されるインターロイキン-15の有効量が、投与当たり約0.01μgから 1.0μgの範囲にある量である請求項11の方法。 15．上記免疫原が非複製ワクチンである請求項11の方法。 16．上記免疫原が複製ワクチンである請求項11の方法。 17．免疫原に対するトリにおける免疫応答を誘導するために増大されたワクチン で、トリインターロイキン-15の上記免疫応答を増大するための有効量と接合さ れた上記免疫原を含むワクチン。 18．上記インターロイキン-15が上記ワクチンの投与量当たり約0.01μgから約1. 0μgの範囲の量で存在する請求項17のワクチン。 19．上記免疫原がマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎 ウイルス及び感染性気管支炎ウイルスから成るグループより選択された病原性試 薬から由来する請求項17のワクチン。
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