CN117925487A - 用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本分案申请公开了一种重组大肠埃希氏菌BYSW007，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.22853。本发明利用重组大肠埃希氏菌BYSW007制备的重组白细胞介素‑2蛋白制品是一种高效免疫增强剂，制备方法简单，可以应用于禽用灭活疫苗、活疫苗和亚单位疫苗中，在提高机体抗体效价的同时延长机体免疫持续期。

Description

用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用
本申请是分案申请，原申请的申请号为202110920822.1，申请日为2021年8月11日，发明名称为“用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用”。
技术领域
本发明涉及用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用。
背景技术
白细胞介素-2(interleukine-2,IL-2)是非常重要的具有广泛生物学活性的免疫调节因子之一，1976年Morgan等首先在PHA刺激的鼠脾淋巴细胞培养上清中发现了鼠的IL-2，因其可促进和维持T细胞的生长，因而被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,TCGF)。1979年5月于瑞士召开的第二届国际淋巴因子工作会议中正式命名为白细胞介素-2。其由特异性抗原或致丝裂素激活的T-淋巴细胞或T淋巴细胞系分泌产生的Th1型淋巴细胞因子。能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，诱导产生干扰素(Interferon,IFN)、肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)，增强单核细胞以及自然杀伤细胞(NK)的杀伤活性，可以提高动物机体细胞免疫和体液免疫能力，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用。
目前禽类疫病复杂多样，疫苗为防控禽类疾病的首要手段，现阶段的禽用疫苗中常用的灭活疫苗和亚单位疫苗注射入机体后都需要较长时间才激发机体产生免疫反应，直至抗体效价达到一定水平至少需要3-4周时间，而且疫苗抗体效价低或难以长时间维持较高水平，因此亟待开发高效的免疫佐剂，提高疫苗的抗体效价和免疫持续期。
发明内容
为此，本发明提供一种用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供重组大肠埃希氏菌BYSW007，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.22853。
本发明的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其用于制备免疫增强的鸭白细胞介素-2蛋白。
本发明的一个实施例中，所述鸭白细胞介素-2蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有免疫增强的鸭白细胞介素功能的由(a1)衍生的蛋白质。
本发明的一个实施例中，编码所述鸭白细胞介素-2蛋白的核酸分子为如下(b1)-(b3)任一所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b3)严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的分子。
本发明的一个实施例中，所述鸭白细胞介素-2蛋白，其应用为如下(c1)-(c8)中的至少一种：
(c1)作为免疫增强剂；
(c2)制备免疫增强剂；
(c3)作为疫苗的免疫增强剂；
(c4)作为鸭坦布苏病毒疫苗的免疫增强剂；
(c5)制备疫苗；
(c6)制备鸭坦布苏病毒疫苗；
(c7)作为抗病毒制剂；
(c8)制备抗病毒制剂。
本发明的一个实施例中，所述免疫增强剂包括以下组分：每毫升中含鸭白细胞白介素-2蛋白为10000IU、牛膝多糖1～5mg，维生素C 50～200μg；左旋咪唑5ng～10ng，余量为磷酸盐缓冲液。
本发明的一个实施例中，所述重组大肠埃希氏菌BYSW007是将核酸分子导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)得到。
本发明另一方面还提供一种制备用于免疫增强的鸭白细胞介素-2蛋白的方法，其包括如下步骤：培养所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，表达、纯化得到所述鸭白细胞介素-2蛋白。
本发明另一方面还提供一种免疫增强剂，其包含培养所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007获得的鸭白细胞白介素-2蛋白、牛膝多糖、维生素C、左旋咪唑以及磷酸盐缓冲液。
本发明另一方面还提供一种抗体，其利用所述的免疫增强剂制得。
本发明的重组大肠埃希氏菌BYSW007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCC NO.22853。
本发明具有如下优点：
本发明提供的重组白细胞介素-2制品是一种高效免疫增强剂，制备方法简单，可以应用于禽用灭活疫苗、亚单位疫苗和活疫苗中，在提高机体抗体效价的同时延长机体免疫持续期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的重组质粒pET-D-IL-2的双酶切鉴定结果图，其中，M:DL5000 DNAMarker；1:pET-D-IL-2的双酶切片段；
图2为本发明实施例提供的重组质粒pCR鉴定结果图，其中，M:DL1500DNAMarker；1:pCR鉴定片段；
图3为本发明实施例提供的鸭白细胞介素-2的Western-blot结果分析，其中，M：蛋白Marker，1：诱导表达菌体，2：阴性对照；
图4为本发明实施例提供的IL-2作为疫苗成分时，灭活疫苗和亚单位疫苗组试验鸭抗体阻断率(PI％)曲线图；
图5为本发明实施例提供的IL-2作为疫苗成分时，活疫苗试验鸭抗体阻断率(PI％)曲线图；
图6为本发明实施例提供的IL-2作为免疫增强剂协同免疫时，灭活疫苗和亚单位疫苗组试验鸭抗体阻断率(PI％)曲线图；
图7为本发明实施例提供的IL-2作为免疫增强剂协同免疫时，活疫苗组试验鸭抗体阻断率(PI％)曲线图；
图8为本发明实施例提供的96孔细胞培养板加样示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，pET-30a(+)载体购自Novagen，BL21(DE3)购自康为世纪生物科技有限公司。
实施例1、表达鸭白细胞介素-2大肠杆菌的构建
参照鸭白细胞介素-2基因序列(Genbank登录号：AAO39413.1)人工合成IL-2基因，其中，合成的鸭白细胞介素-2(IL-2)序列如序列表中序列2所示，氨基酸序列如序列表中序列1所示，将IL-2基因克隆至原核表达载体pET30a(+)中，转入原核表达菌株BL21(DE3)中，得到可表达鸭白细胞介素-2基因的重组大肠埃希氏菌BYSW007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22853。
表达鸭白细胞介素-2大肠杆菌的构建过程为：
1、鸭白细胞介素-2基因合成：参照鸭白细胞介素-2基因序列(Genbank登录号：AAO39413.1)，并在5’端加上Nde I酶切位点CATATG，3’端加上Xho I酶切位点CTCGAG，人工合成IL-2基因。
目的基因引物序列：
D-ILF 5'ATGTCTGACAAACCGGACATGGC 3'
D-IL R 5'TTATTTCAGCATAGAACGCAGG 3'
2、目的基因酶切：用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的IL-2基因双酶切，酶切体系(20μl)：IL-2基因1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒进行回收并纯化。
3、载体酶切：选用载体pET30a(+)，用限制性内切酶Nde I和Xho I对载体pET30a(+)双酶切，酶切体系(20μl)：pET30a(+)1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
4、目的基因与载体的连接：将IL-2基因酶切产物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接，连接体系(10μl)：10×Buffer 1μl，pET30a(+)酶切产物2μl，干扰素基因酶切产物2μl，T4 DNA连接酶1μl，ddH2O 4μl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。
5、转化：取10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500μl，于37℃，200r/min培养1h，取100μl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。
6、BYSW007菌液培养及pET-D-IL-2质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，200r/min培养12h，收获大肠杆菌菌株BYSW007菌液，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
7、pET-D-IL-2重组质粒的鉴定
7.1酶切鉴定：用Nde I与Xho I双酶切重组质粒，酶切体系(20μl)：pET-D-IL-2重组质粒1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载体条带和510bp的外源片段，大小与预期完全符合，电泳结果见图1。
7.2PCR鉴定：采用IL-2目的基因引物进行PCR鉴定，反应体系10×PCRbuffer 2μl，4×dNTP(2.5mM)1μl，引物D-ILF、D-IL R(10μM)各1μl，质粒模板0.1μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，补ddH2O至总体积20μl。反应程序94℃预变性5分钟后；按94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸7分钟。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，可见510bp的特异性条带，大小与预期完全符合，电泳结果见图2。
实施例2、鸭白细胞介素-2蛋白原核表达纯化
大肠埃希氏菌BYSW007转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经诱导表达，纯化获得白细胞介素-2蛋白。蛋白生物学活性测定为1.26×105IU/ml；蛋白含量为3.83mg/ml。
其中，鸭白细胞介素-2蛋白原核表达纯化过程为：
1、发酵培养：pET-D-IL-2质粒转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种至适量的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜；菌液按培养基量的2％接种于灭菌发酵罐中，37℃通气培养，控制发酵罐搅拌速度500～700r/min、溶氧为60～90％，pH值7.0；待菌体生长至对数生长中期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下诱导5h。
2、菌体破碎，培养结束后，离心收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次，制成10％的PBS悬液，在2～8℃下用高压匀浆机破碎细菌，破碎后的菌液，以8000r/min离心15分钟，收集包涵体。
3、重组蛋白的纯化，用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体，磁力搅拌器洗涤30分钟，4℃条件下，8000r/min离心10分钟，去上清后重复洗涤一次。加入8mol/L尿素溶解洗涤包涵体，于冰浴中超声清洗30分钟，8000r/min离心20分钟去沉淀，取上清即为包涵体溶解液，溶液4℃过夜，将溶液在超滤复性设备上进行复性，按5～10体积换液，复性结束后，经8000r/min，离心去沉淀，收集上清液以0.3ml/分钟的速度加入层析柱中，用pH 7.0磷酸盐缓冲液以1ml/分钟的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰，0.22μm的滤膜过滤除菌。采用BCA法测定蛋白含量为3.83mg/ml。
4、重组蛋白的western-blot鉴定，上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后，经100V，70min转至PVDF膜，TBST洗膜2次，1％BSA封闭液37℃封闭1.5h后TBST洗膜3次，兔源IL-2单克隆抗体作为一抗，加入1:1000稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的羊抗兔IgG(HRP)二抗，TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测，诱导后重组菌体中的重组蛋白大小为18.7KDa，与IL-2蛋白大小一致。
5、重组蛋白的生物学活性测定，在无菌条件下，将重组蛋白用测定培养液稀释至每1ml含200IU，在96孔细胞培养板中作作2倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作2孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％CO2条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制每毫升含有6.0×105个细胞的细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下备用，在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％CO2条件下培养18～24小时，然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO2条件下培养4～6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5％CO2条件下保温18～24小时，以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算蛋白生物学活性测定为1.26×105IU/ml.
实施例3、本发明的鸭白细胞介素-2作为免疫增强剂或作为疫苗成分的应用
本发明实施例的鸭白细胞介素-2免疫增强剂成分为：每毫升中含鸭白细胞白介素-2蛋白为10000IU、牛膝多糖1～5mg，维生素C 50～200μg；左旋咪唑5ng～10ng，其余为磷酸盐缓冲液，并按终浓度0.1％比例加入防腐剂苯甲醇，充分搅拌均匀，其中，磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值7.0。
本免疫增强剂可配合灭活疫苗、活疫苗以及亚单位疫苗等基因工程疫苗使用。也可以作为疫苗成分，在常规灭活疫苗、活疫苗以及亚单位疫苗等基因工程疫苗制备过程中，将上述鸭白细胞介素-2免疫增强剂混入到到抗原中，再按疫苗工艺生产而获得免疫原性增强型疫苗。应用本免疫增强剂后，能有效增强动物机体的免疫功能；同时有效地提高常规疫苗免疫效力和延长免疫持续期。
按常规方法制备鸭坦布苏灭活疫苗A和B，A为在坦布苏病毒抗原中加入免疫增强剂的疫苗；按常规方法制备鸭坦布苏亚单位疫苗C和D，C为在坦布苏亚单位疫苗抗原中加入免疫增强剂的疫苗；选用35日龄健康易感鸭(DTMUV抗原、抗体阴性)200羽，分为5组，每组40羽，第1组免疫疫苗A，第2组免疫疫苗B；第3组免疫疫苗C，第4组免疫疫苗D；第5组为空白对照组不免疫；首免后14日按相同方式进行二免，各组鸭在相同条件和环境隔离饲养，于首免前、首免后7日、二免前、二免后14日、21日、1个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血分离血清，逐羽检测DTMUV ELISA抗体，统计并分析抗体变化规律。于二免后14日、4个月、5个月、6个月采血后各组中分别取10只以DTMUVAX2015株攻毒，每羽肌肉注射AX2015株0.2ml(含104.0TCID50)，攻毒2日后采血分离血清，进行DTMU病毒分离。
按常规方法制备鸭坦布苏弱毒活疫苗E和F，E为在坦布苏病毒抗原中加入免疫增强剂的疫苗；选用35日龄健康易感鸭(DTMUV抗原、抗体阴性)120羽，分为3组，每组40羽，第6组免疫疫苗E，第7组免疫疫苗F；第8组为空白对照组不免疫；于免前、免后7日、14日、21日、1个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血分离血清，逐羽检测DTMUV ELISA抗体，统计并分析抗体变化规律。于免21日、4个月、5个月、6个月采血后各组中分别取10只以DTMUV AX2015株攻毒，每羽肌肉注射AX2015株0.2ml(含104.0TCID50)，攻毒2日后采血分离血清，进行DTMU病毒分离。
根据表1和图4结果可知，免疫增强剂应用于灭活疫苗、亚单位等基因工程疫苗配制中时，可以显著提高DTMUV ELISA抗体水平，首免后7日，添加免疫增强剂的A和C疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为31.02％、29.36％，而未添加免疫增强剂的B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为8.57％、0；随后，抗体水平均逐渐升高，至二免后14日，添加免疫增强剂的A和C疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为81.16％、80.37％，而未添加免疫增强剂的B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为59.88％、55.64％；至二免后21日抗体达到高峰，添加免疫增强剂的A和C疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为83.54％、82.40％，而未添加免疫增强剂的B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为64.73％、62.85％；至二免后6个月，添加免疫增强剂的A和C疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为49.37％、46.53％，而未添加免疫增强剂的B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为21.35％、12.01％；
根据表2和图5结果可知，免疫增强剂应用于活疫苗配制中时，可以显著提高DTMUVELISA抗体水平，免后7日，添加免疫增强剂的E疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为30.04％，而未添加免疫增强剂的F疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为5.88％；随后抗体水平均逐渐升高，至免后21日抗体达到高峰，添加免疫增强剂的E疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为80.35％，而的未添加免疫增强剂的F疫苗免疫组DTMUVELISA抗体阻断率平均值为59.61％；至二免后6个月，添加免疫增强剂的E疫苗免疫组DTMUVELISA抗体阻断率平均值为45.82％，而未添加免疫增强剂的F疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为9.49％。
血清抗体检测结果表明，含有免疫增强剂的疫苗组A、C、E组免疫组鸭DTMUV抗体阻断率均远远高于同期检测的B、D、F疫苗免疫组鸭DTMUV抗体阻断率。具体结果见表1～表2和图4～图5。
表1灭活疫苗和亚单位疫苗各试验组鸭DTMUV ELISA抗体检测结果(阻断率PI％)
注：“—”表示抗体阻断率为阴性。
表2活疫苗各试验组鸭DTMUV ELISA抗体检测结果(阻断率PI％)
注：“—”表示抗体阻断率为阴性。
表3灭活疫苗和亚单位疫苗二免后14日、4个月、5个月、6个月攻毒试验结果
表4活疫苗二免后14日、4个月、5个月、6个月攻毒试验结果
表3攻毒结果可知，灭活疫苗和亚单位疫苗组，二免后14日攻毒，未免疫的空白对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离均10/10阳性，添加免疫增强剂的A、C疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离10/10阴性，保护率均为100％，而未添加免疫增加剂B、D组疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离均2/10阳性，保护率均为80％；二免后4个月，A、C疫苗免疫保护率均为100％，B、D组疫苗免疫保护率分别为80％、70％；二免后5个月，A、C疫苗免疫保护率均为100％，B、D组疫苗免疫保护率分别为10％和0；二免后6个月，A、C疫苗免疫保护率分别为80％、60％，而B、D组疫苗免疫保护率均为0；
表4攻毒结果可知，活疫苗组，免后21日攻毒，未免疫的空白对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离均10/10阳性，添加免疫增强剂的E疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离10/10阴性，保护率均为100％，而未添加免疫增加剂F组疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离率分别为2/10，保护率为80％。免后4个月，E疫苗免疫保护率均为100％，F组疫苗免疫保护率为70％；免后5个月，E疫苗免疫保护率为100％，F组疫苗免疫保护率为10％；免后6个月，E疫苗免疫保护率为80％，而F组疫苗免疫保护率为0。
不同时间点攻毒结果表明，含有免疫增强剂的疫苗组A、C和E组免疫组鸭DTMU攻毒保护率均远远高于同期检测的B、D和F疫苗免疫组鸭DTMU病毒攻毒保护率，且添加免疫增强剂的疫苗A、C和E免疫保护期显著延长，至免疫后6个月保护率均不低于80％，而未添加免疫增加剂B、D和F疫苗在免疫后4个月后免疫保护率下降显著，至免疫后5个月和6个月已基本无保护力。
实施例5、免疫增强剂IL-2协同免疫效力
按常规方法制备鸭坦布苏弱毒灭活疫苗B，鸭坦布苏亚单位疫苗D，选用35日龄健康易感鸭(DTMUV抗原、抗体阴性)200羽，分为5组，每组40羽，第1组为IL-2+B协同免疫组，第2组为B免疫对照组；第3组为IL-2+D协同免疫组，第4组为D免疫对照组，第5组为空白对照组不免疫；首免后14日按相同方式进行二免，各组鸭在相同条件和环境隔离饲养，于二免后14日采血分离血清，逐羽检测DTMUV ELISA抗体，统计并分析抗体变化规律。于首免前、首免后7日、二免前、二免后14日、21日、1个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血分离血清，逐羽检测DTMUV ELISA抗体，统计并分析抗体变化规律。于二免后14日、4个月、5个月、6个月采血后各组中分别取10只以DTMUV AX2015株攻毒，每羽肌肉注射AX2015株0.2ml(含104.0TCID50)，攻毒2日后采血分离血清，进行DTMU病毒分离。
按常规方法制备鸭坦布苏弱毒活疫苗F，选用35日龄健康易感鸭(DTMUV抗原、抗体阴性)120羽，分为3组，每组40羽，第6组IL-2+F协同免疫组，第7组为F免疫对照组；第8组为空白对照组不免疫；于免前、免后7日、14日、21日、1个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血分离血清，逐羽检测DTMUV ELISA抗体，统计并分析抗体变化规律。于免21日、4个月、5个月、6个月采血后各组中分别取10只以DTMUV AX2015株攻毒，每羽肌肉注射AX2015株0.2ml(含104.0TCID50)，攻毒2日后采血分离血清，进行DTMU病毒分离。
根据表5和图6结果可知，IL-2制品可以显著提高灭活疫苗、亚单位等基因工程疫苗免疫抗体水平，首免后7日，IL-2制品协同B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为31.34％、31.06％，而B和D疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为8.92％、0；随后抗体水平均逐渐升高，至二免后14日，IL-2制品协同B和D疫苗免疫组DTMUVELISA抗体阻断率平均值分别为82.07％、81.53％，而B和D疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为60.24％、55.40％；至二免后21日抗体达到高峰，IL-2制品协同B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为83.76％、83.08％，而B和D疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为65.10％、62.37％；至二免后6个月，IL-2制品协同B和D疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为48.44％、47.61％，而B和D疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值分别为20.18％、10.53％。
根据表6和图7结果可知，IL-2制品可以显著提高活疫苗免疫抗体水平，免后7日，IL-2制品协同F疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为31.00％，而F疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为6.32％；随后抗体水平均逐渐升高，至免后21日抗体达到高峰，IL-2制品协同F疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为80.25％，而F疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为58.52％；至二免后6个月，IL-2制品协同F疫苗免疫组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为46.52％，而F疫苗免疫对照组DTMUV ELISA抗体阻断率平均值为10.01％。
血清抗体检测结果表明，IL-2制品协同B、D、F疫苗免疫组鸭DTMUV抗体阻断率均显著高于同期检测的B、D、F疫苗对照免疫组鸭DTMUV抗体阻断率。具体结果见表5～表6和图6～图7。
表5灭活疫苗和亚单位疫苗各试验组鸭DTMUV ELISA抗体检测结果(阻断率PI％)
注：“—”表示抗体阻断率为阴性。
表6活疫苗各试验组鸭DTMUV ELISA抗体检测结果(阻断率PI％)
注：“—”表示抗体阻断率为阴性。
表7灭活疫苗和亚单位疫苗二免后14日、4个月、5个月、6个月攻毒试验结果
表8活疫苗免后14日、4个月、5个月、6个月攻毒试验结果
表7攻毒结果可知，二免后14日攻毒，未免疫的空白对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离均10/10阳性，IL-2协同的B、D疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离10/10阴性，保护率均为100％，而B、D免疫对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离分别为1/10、2/10阳性，保护率分别为90％、80％；二免后4个月，IL-2协同的B、D疫苗免疫组免疫保护率均为100％，而B、D免疫对照组免疫保护率均分别为80％、70％；二免后5个月，IL-2协同的B、D疫苗免疫组免疫保护率均为100％，而B、D免疫对照组免疫保护率均为10％；二免后6个月，IL-2协同的B、D疫苗免疫组免疫保护率均为90％，而B、D免疫对照组免疫保护率均为0；
表8攻毒结果可知，免后21日攻毒，未免疫的空白对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离均10/10阳性，IL-2协同的F疫苗免疫组鸭攻毒后DTMU病毒分离10/10阴性，保护率均为100％，而F免疫对照组鸭攻毒后DTMU病毒分离率分别为2/10，保护率为80％。免后4个月，IL-2协同的F疫苗免疫组免疫保护率均为100％，F免疫对照组免疫保护率为70％；免后5个月，IL-2协同的F疫苗免疫组免疫保护率为100％，F组疫苗免疫保护率为10％；免后6个月，IL-2协同的F疫苗免疫组免疫保护率为80％，而F免疫对照组免疫保护率为0；
不同时间点攻毒结果表明，IL-2协同B、D、F疫苗免疫组鸭DTMU攻毒保护率均远远高于同期检测的B、D、F免疫对照组鸭DTMU病毒攻毒保护率。且协同免疫组B、D、F疫苗免疫保护期显著延长，至免疫后6个月保护率均不低于80％，而免疫对照组B、D和F疫苗在免疫后4个月后免疫保护率下降显著，至免疫后5个月和6个月已基本无保护力。
实施例6、免疫增强剂IL-2对机体免疫力影响试验
为评价IL-2对机体免疫功能，进行了淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等细胞水平指标的测定，结果表明IL-2能显著提高机体淋巴细胞刺激指数，促进巨噬细胞吞噬能力和NK细胞的杀伤能力，表明IL-2具有良好的免疫增强作用。
(1)淋巴细胞刺激指数检测选用20只试验鸭，随机分为2组，每组10只，一组作为试验组注射IL-2注射液0.5ml/只，另一组作为对照组注射生理盐水，0.5ml/只。注射后21日采血分离淋巴细胞，调节细胞悬液浓度为1.0×107/ml，加入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，试验组鸭和对组组鸭分别设置试验组分为+ConA组和-ConA组，每组两个重复孔，+ConA孔：加入ConA 10μl和细胞培养液90μl，-ConA组：加细胞培养液100μl，试验加样示意图见图8。培养箱中培养44小时，去除细胞培养板加入MTT溶液10μl，混匀后继续培养4小时，弃上清，加入DMSO裂解细胞，100μl/孔，微量震荡器震荡5min，待沉淀完全溶解，用酶联免疫检测仪测定细胞OD570值。按照淋巴细胞刺激指数计算公式计算每只鸭的淋巴细胞刺激指数(SI)，其中，
SI＝试验孔OD570/对照孔OD570；
注：A1～A10：10只试验组鸭+ConA孔；B1～B10为A1～A10重复孔；
C1～C10：10只试验组鸭-ConA孔；D1～D10为C1～C10重复孔；
E1～E10：10只对照组鸭+ConA孔；F1～F10为E1～E10重复孔；
G1～G10：10只试验组鸭-ConA孔；H1～H10为G1～G10重复孔；
A11～D11：细胞对照孔；
A12～D12：MTT+裂解液对照。
结果注射IL-2制剂的试验组鸭淋巴细胞刺激指数(SI)均远远高于对照组鸭淋巴细胞刺激指数，表明IL-2制剂能显著提高机体淋巴细胞刺激指数，可以提高细胞免疫功效，具体结果见10。
表10淋巴细胞刺激指数(SI)值结果
(2)巨噬细胞指数检测
选用20只试验鸭，随机分为2组，每组10只，一组作为试验组注射IL-2注射液0.5ml/只，另一组作为对照组注射生理盐水，0.5ml/只。注射后21日，两组试验鸭均翅静脉注入1：3稀释的印度墨汁0.2mL，并立即计时，注入墨汁后2min、10min分别从心脏采血0.2mL，加入20mL0.1％Na2CO3溶液中摇匀，用岛津紫外分光光度计
UVmini-1240在600nm波长处测定光密度值，以Na2CO3溶液作空白对照。将鸡颈动脉放血致死，取肝脏、脾脏称重，计算吞噬指数。
吞噬指数＝体重÷(肝重+脾重)×K1/3；
K为碳廓清率，K＝(lgOD1-lgOD2)/T2-T1；
OD1、OD2分别为2min、10min时采血所得待测血液的光密度值；T1、T2为注射印度墨汁后的采血时间。
结果注射IL-2制剂的试验组鸭巨噬细胞指数(SI)均远远高于对照组鸭巨噬细胞指数，表明IL-2制剂能显著提高机体巨噬细胞吞噬能力，可以提高细胞免疫功效。
表10巨噬细胞指数(SI)值结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.重组大肠埃希氏菌BYSW007，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.22853。
2.如权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其用于制备免疫增强的鸭白细胞介素-2蛋白。
3.如权利要求2所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其特征在于，
所述鸭白细胞介素-2蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有免疫增强的鸭白细胞介素功能的由(a1)衍生的蛋白质。
4.如权利要求3所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其特征在于，
编码所述鸭白细胞介素-2蛋白的核酸分子为如下(b1)-(b3)任一所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b3)严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的分子。
5.如权利要求3所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其特征在于，
所述鸭白细胞介素-2蛋白，其应用为如下(c1)-(c8)中的至少一种：
(c1)作为免疫增强剂；
(c2)制备免疫增强剂；
(c3)作为疫苗的免疫增强剂；
(c4)作为鸭坦布苏病毒疫苗的免疫增强剂；
(c5)制备疫苗；
(c6)制备鸭坦布苏病毒疫苗；
(c7)作为抗病毒制剂；
(c8)制备抗病毒制剂。
6.如权利要求5所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，其特征在于，
所述免疫增强剂包括以下组分：每毫升中含鸭白细胞白介素-2蛋白为10000IU、牛膝多糖1～5mg，维生素C 50～200μg；左旋咪唑5ng～10ng，余量为磷酸盐缓冲液。
7.一种制备用于免疫增强的鸭白细胞介素-2蛋白的方法，其包括如下步骤：培养权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌BYSW007，表达、纯化得到所述鸭白细胞介素-2蛋白。
8.一种免疫增强剂，其包含培养权利要求1重组大肠埃希氏菌BYSW007获得的鸭白细胞白介素-2蛋白、牛膝多糖、维生素C、左旋咪唑以及磷酸盐缓冲液。
9.一种抗体，其利用权利要求8所述的免疫增强剂制得。
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