CN110129329A - 一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法 - Google Patents

一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法。所述引物如SEQ ID NO:3‑4所示。本发明通过引物PCR扩增获得日本鳗鲡IFN‑γrel基因序列，构建pET32a原核表达载体，转化到大肠杆菌培养，通过诱导条件的优化，可大量表达日本鳗鲡IFN‑γrel重组蛋白，通过镍柱纯化并优化纯化条件获得高纯度高质量的蛋白。

Description

一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程重组领域，尤其涉及一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法。
背景技术
干扰素(IFN)是一类由病毒诱导产生具有抗病毒作用的细胞因子。根据其序列特征和功能差异，哺乳动物干扰素分为I型、II型和III型三大类。I型干扰素主要包括IFN-α/IFN-β等。II型干扰素(Interferon，IFN)，即IFN-γ，是一类二聚化的可溶性细胞因子，主要由T淋巴细胞和NK细胞分泌，具有抗病毒和免疫调节作用。III型干扰素即IFN-λ，由IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4组成。
在哺乳动物中，II型干扰素只有一种类型，即IFN-γ，由一个基因编码，包含有4个外显子和3个内含子。与哺乳动物不同的是，鱼类的II型干扰素存在两个IFN-γ基因(IFN-γ1和IFN-γ2)，与哺乳动物同源的IFN-γ命名为IFN-γ2，而IFN-γ1由于与高等脊椎动物同源性很低，所以又被命名为干扰素相关因子(IFN-γrel，IFN-related molecule)。IFN-γrel首次在斑马鱼(Danio rerio)和绿河豚(Tetraodon nigirovirdis)中被发现。随后在大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤(Cyprinus carpio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、金鱼(Carassius auratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、日本鲫(Carassius auratus langsdorfii)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)等中均鉴定出两个IFN-γ基因。已有的研究表明，二者的结构、功能、信号转导存在差异：(1)结构：与IFN-γ不同，IFN-γrel基因的C端缺乏核定位信号(NLS)结构域，这使其丧失了诱导趋化因子的能力。与其他鱼类的IFN-γrel相似，日本鳗鲡IFN-γrel的C-端也缺乏NLS；(2)功能：在免疫原刺激下，斑马鱼IFN-γ和IFN-γrel基因在各组织中的表达水平有所不同，表明其功能可能存在差异。在鲤中发现IFN-γrel主要由IgM+细胞产生，而IFN-γ主要在IgM－细胞中检测到，表明IFN-γrel主要调控体液免疫应答。IFN-γrel处理金鱼单核细胞后，可引起CXCL-8，IL-1β表达上调，而这些基因对IFN-γ的刺激无应答。金鱼IFN-γ能产生持久的反应氧中间体(Reactive Oxidant Intermediates，ROI)效应，而IFN-γrel只能产生短暂的ROI效应随后快速下调。(3)信号转导：有研究显示硬骨鱼类的两个IFN-γ基因分别有其特异性的受体而不是共用相同的受体。在斑马鱼及金鱼中发现了2个IFNGR1基因，即IFNγR1-1/CRFB17和IFNγR1-2/CRFB13，它们能分别和不同的II型干扰素配体结合。金鱼的IFNγR1-1特异性结合IFN-γrel，IFNγR1-2特异性结合IFN-γ。Grayfer等发现IFN-γ能诱导金鱼单核细胞中IRF1和IRF8表达上调，而IFN-γrel却不能。此外，IFN-γrel与IFN-γ都能诱导STAT1的磷酸化，但是STAT1的核定位仅发生在IFN-γ处理过的单核细胞内，这说明金鱼IFN-γrel的细胞信号途径可能不同于IFN-γ。
研究表明，鱼类IFN也是通过类似哺乳动物的JAK-STAT信号通路诱导ISGs的表达从而建立宿主抗病毒防御体系。同样，鱼类IFN-γ与哺乳动物IFN-γ具有类似的功能，鱼类IFN-γ能够参与机体的抗病毒免疫。此外，鱼类IFN-γ还参与机体的抗菌和抗寄生虫感染免疫反应。作为硬骨鱼中不同于哺乳动物的IFN-γrel，对其研究起步较晚，功能性研究证实鱼类两种II型干扰素的结构及表达有很大差别，IFN-γrel基因转录激活的分子机理及免疫功能还没被完全阐述，导致我们对其认识非常有限。正因如此，IFN-γrel的免疫学地位值得探讨。
为了了解鱼类IFN-γrel的功能特性，需要在基因水平研究的基础上完善蛋白质水平的研究。但是目前对于鱼类干扰素的应用研究并不多见，且主要集中于IFN-γ，而对鱼类中特有的II型干扰素IFN-γrel的应用研究几乎没有。
因此，建立一种表达及制备鱼类IFN-γrel蛋白的方法能够为深入研究IFN-γrel的免疫功能提供帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种日本鳗鲡II型干扰素IFN-γrel(即干扰素相关因子IFN-γrel，为鱼类特有的II型干扰素)重组蛋白的表达及制备方法，用于高效表达日本鳗鲡干扰素相关因子蛋白。
为实现上述目的，本发明提供一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，使用了所述的引物。
进一步，包括如下步骤：
PCR扩增日本鳗鲡干扰素相关因子：采用所述的引物对(SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4)；
重组质粒pET32a-IFN-γrel的构建：将所得去掉信号肽的日本鳗鲡干扰素相关因子ORF与表达载体pET32a重组得到重组质粒pET32a-IFN-γrel；
原核表达载体诱导表达；
目的蛋白的变复性处理；
纯化得到IFN-γrel重组蛋白。
进一步，所述PCR扩增日本鳗鲡干扰素相关因子步骤中的PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
进一步，所述原核表达载体诱导表达步骤的诱导表达条件为加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，在37℃诱导温度下，对IFN-γrel蛋白表达工程菌诱导2-6h；优选的，诱导6h。
进一步，所述目的蛋白的变复性处理步骤为采用尿素。
进一步，所述纯化步骤采用HisPurTM Ni-NTA Spin Columns；
进一步，所述纯化步骤中，纯化使用的缓冲液的pH值为8.0，NaCl浓度为300mM。
目前对于鱼类干扰素应用方面的研究鲜有报道，且大部分集中于I型干扰素和IFN-γ，而对硬骨鱼类中特有的II型干扰素IFN-γrel的应用研究寥寥无几。本发明的发明人根据已获得的日本鳗鲡IFN-γrel cDNA序列，生物软件预测去掉其信号肽，并根据与序列的匹配性及连接效率选择合适的酶切位点，设计一对带酶切位点(BamH I和Hind III)的特异性引物，PCR扩增获得带有酶切位点的日本鳗鲡IFN-γrel基因片段。构建pET32a原核表达载体，转化到大肠杆菌培养，通过诱导条件的优化，可大量表达日本鳗鲡IFN-γrel重组蛋白，通过镍柱纯化并优化纯化条件获得高纯度高质量的蛋白。
附图说明
图1是IFN-γrel基因PCR扩增结果图。
图2是pET32a-IFN-γrel重组载体的阳性克隆鉴定图。
图3是不同诱导时间对pET32a-IFN-γrel在BL21感受态细胞中表达的影响图。
图4是pET32a-IFN-γrel重组蛋白表达形式鉴定图
图5是纯化的IFN-γrel重组蛋白SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.日本鳗鲡II型干扰素IFN-γrel基因扩增
1、日本鳗鲡IFN-γrel重组质粒pMD19-T-IFN-γrel的制备：
设计引物对：
AJIFN-γrelTL-F：GCTAACGCTCGACAAGCTCAGA，SEQ ID NO:1；
AJIFN-γrelTL-R：CGACTGGTCTATGAATCGCAATCT，SEQ ID NO:2。
以日本鳗鲡肠cDNA为模板进行PCR扩增。
扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。割胶回收目的片段，将回收的目的基因片段连接入pMD19-T载体，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板上。倒置平板，于37℃培养16h。挑取单菌落，经PCR阳性克隆鉴定，将测序鉴定正确的菌液接种到LB固体培养基(Amp)平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆接种至LB液体培养基(Amp)中扩大培养，按E.Z.N.A Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit质粒提取试剂盒(Omega,美国)提取全长质粒，即为日本鳗鲡IFN-γrel重组质粒pMD19-T-IFN-γrel。
2、IFN-γrel基因扩增：
生物软件预测去掉IFN-γrel信号肽，设计带有酶切位点的正反向引物AJIFN-γrel-F和AJIFN-γrel-R，具体序列如下：
AJIFN-γrel-F：CGGATCCAACTCCCCGCTCGTCCTGG SEQ ID NO:3；
其中下划线为BamH I酶切位点GGATCC。
AJIFN-γrel-R:CAAGCTTGTCGGACAGTGAATCAGTCAGCC SEQ ID NO:4。
其中下划线为Hind III酶切位点AAGCTT。
以上述所得日本鳗鲡IFN-γrel重组质粒pMD19-T-IFN-γrel或其他日本鳗鲡组织cDNA为模板扩增，以AJIFN-γrel-F和AJIFN-γrel-R为上下游引物。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小约为440bp，电泳结果如图1所示，泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1为IFN-γrel基因PCR产物。割胶回收目的片段。
实施例2.重组质粒pET32a-IFN-γrel的构建
将实施例1中PCR产物和表达载体pET32a于37℃分别进行BamH I和Hind III水浴双酶切后用T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET32a-IFN-γrel。将pET32a-IFN-γrel质粒转化至DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板上。倒置平板，于37℃培养直至出现单菌落。挑取单菌落，经PCR阳性克隆鉴定，结果见图2，泳道M为DL 2000DNA Marker，泳道1为PCR阳性克隆。鉴定正确的阳性克隆送通用生物技术有限公司测序，测序正确的阳性重组质粒即为重组质粒pET32a-IFN-γrel。
实施例3.原核表达载体诱导表达、诱导条件优化
将重组质粒pET32a-IFN-γrel转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经1.0mmol/LIPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析，结果表明与pET32a空载体相比，重组质粒pET32a-IFN-γrel在BL21中有明显的诱导表达蛋白条带，大小在31kD左右，与预计算的理论分子量(34kD)相似。
将重组质粒pET32a-IFN-γrel转化至BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养过夜，涂布含抗生素抗性平板上。37℃培养至平板上出现单菌落，挑取阳性菌落，转接至LB培养基中(含氨苄青霉素)，于37℃下，180rpm/min震荡培养过夜。当菌液OD200达到0.6左右时，于37℃，1.0mmol/L IPTG诱导剂浓度下，对IFN-γrel蛋白表达工程菌测定诱导2h、4h和6h对重组蛋白表达量的影响。结果详见图3，其中泳道1-4分别表示pET32a空载体未诱导的和采用1mmol/L IPTG分别诱导2、4、6h后的表达蛋白；其中泳道5-8分别表示转化pET32a-IFN-γrel的BL21工程菌未诱导的和采用1mmol/L IPTG分别诱导2、4、6h后的表达蛋白；泳道M为蛋白质Marker。从图3可以看出，与未诱导的IFN-γrel蛋白表达工程菌相比，诱导0-6h内，随着诱导时间的延长，蛋白表达量越高。申请人根据图3结果确定最佳培养条件为：加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，在37℃诱导温度下，对IFN-γrel蛋白表达工程菌诱导6h，可获得最大的重组IFN-γrel蛋白表达量。
实施例4.IFN-γrel重组蛋白表达形式的鉴定
选择实施例3中的最佳条件小体积诱导表达工程菌，收集表达菌液，10000×g离心5min，弃上清，用PBS重悬菌体，于4℃，进行超声波裂解(工作6s间隔9s)，13000×g离心5min，分别收集上清液和沉淀，取少量上清和沉淀处理后用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达形式。结果见图4，其中泳道1-4分别表示未诱导的,1.0mmol/L IPTG诱导2h、4h、6h后pET32a-IFN-γrel超声破碎上清；泳道5-8分别表示未诱导的,1.0mmol/L IPTG诱导2h、4h、6h后pET32a-IFN-γrel超声破碎沉淀；泳道M为蛋白质Marker。从图4中可以看出重组表达pET32a-IFN-γrel蛋白大部分以包涵体蛋白的形式存在于破碎菌体的沉淀中，并且获得了高效表达。
实施例5.目的蛋白的变复性处理
选择实施例3中的最佳条件大体积诱导表达工程菌，收集诱导表达菌液；选择实施例4中的条件获得沉淀，并收集沉淀；用事先预冷的PBS重悬沉淀，加入适当的蛋白酶抑制剂PMSF，于4℃超声波裂解，13000×g离心5min，收集沉淀；加入10ml含4mol/L尿素的变性液洗涤沉淀2次，再加入10mL含8mol/L尿素的蛋白变性液，于4℃震荡过夜，彻底溶解包涵体；次日将收集的蛋白变性液放入处理好的透析袋中，移至含4mol/L尿素的透析液中，期间更换透析液，使变性液中8mol/L的尿素逐步降低至4、2、1mol/L，最后用pH 8.0的PBS透析2次，将溶液中的尿素全部去除完成复性。
实施例6.干扰素IFN-γrel重组蛋白的纯化制备
收集复性好的重组蛋白溶液过HisPurTM Ni-NTA Spin Columns纯化目的蛋白。优化纯化条件：比较了7.4(该pH值为镍柱纯化蛋白常规使用pH值)、8.0和8.5三个pH值缓冲液对目的蛋白与Ni离子结合效果的影响；比较了NaCl浓度分别为500mM(该浓度为镍柱纯化蛋白常规使用盐浓度)和300mM的两种缓冲液对IFN-γrel蛋白溶解度的影响。结果表明缓冲液pH值为8.0时，目的蛋白和Ni离子能有效结合；IFN-γrel蛋白在500mM NaCl的缓冲液体系中可能发生了一定的盐析作用，导致蛋白的损耗，纯化效率非常低，将NaCl浓度从500mM降低至300mM，回收到的目的蛋白量明显增加。优选pH8.0、NaCl浓度为300mM的缓冲液进行纯化。纯化过程：首先加入6mL平衡缓冲液(20mM磷酸钠，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)平衡柱子，重复一次；向柱子内加入复性好的重组蛋白溶液，于4℃结合30min，使样品在重力的作用下缓慢流出，收集流出液；将收集的流出液再加入柱子内，重复过柱一次；加入6mL洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，300mM NaCl，25mM咪唑，pH 8.0)洗涤柱子，重复洗柱2次；而后加入3mL洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，300mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0)，收集洗脱液，并进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果如图5(纯化的IFN-γrel重组蛋白SDS-PAGE分析)所示，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为纯化后的IFN-γrel蛋白。从图5可以看出，经过纯化步骤所得到的IFN-γrel重组蛋白纯度高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法
<130> JMDX-18021-CNI
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gctaacgctc gacaagctca ga 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgactggtct atgaatcgca atct 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cggatccaac tccccgctcg tcctgg 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
caagcttgtc ggacagtgaa tcagtcagcc 30

Claims (8)

1.一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物，其特征在于，所述引物如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
2.一种制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，使用了权利要求1所述的引物。
3.如权利要求2所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
PCR扩增日本鳗鲡干扰素相关因子：采用权利要求1所述的引物对；
重组质粒pET32a-IFN-γrel的构建：将所得去掉信号肽的日本鳗鲡干扰素相关因子开放阅读框ORF与表达载体pET32a重组得到重组质粒pET32a-IFN-γrel；
原核表达载体诱导表达；
目的蛋白的变复性处理；
纯化得到IFN-γrel重组蛋白。
4.如权利要求3所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，所述PCR扩增日本鳗鲡干扰素相关因子步骤中的PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
5.如权利要求3所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，所述原核表达载体诱导表达步骤的诱导表达条件为加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，在37℃诱导温度下，对IFN-γrel蛋白表达工程菌诱导2-6h；优选的，诱导6h。
6.如权利要求3所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，所述目的蛋白的变复性处理步骤为采用尿素。
7.如权利要求3所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，所述纯化步骤采用HisPurTMNi-NTA Spin Columns。
8.如权利要求7所述制备日本鳗鲡干扰素相关因子的方法，其特征在于，所述纯化步骤中，纯化使用的缓冲液的pH值为8.0，NaCl浓度为300mM。
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