CN111303302A

CN111303302A - 一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111303302A
Application number: CN202010195228.6A
Authority: CN
Inventors: 王明丽; 何志远; 赵俊; 张俊玲
Original assignee: Wuhu Tianming Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhu Tianming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开了一种可溶性高效表达的rChGM‑CSF‑IFNα融合蛋白及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：（1）分别提取扩增鸡GM‑CSF和鸡IFN‑α基因；（2）将扩增后的鸡GM‑CSF和鸡IFN‑α基因连接，得到融合蛋白基因；（3）构建重组克隆载体和重组表达载体，筛选得到基因工程菌；（4）融合蛋白的可溶性高效表达；（5）融合蛋白纯化。本发明通过ChGM‑CSF‑IFNα融合表达，提高了单纯ChIFNα的抗病毒活性，且延长了单纯ChIFNα在体内的药物半衰期，且通过ChGM‑CSF‑IFNα原核可溶性高效表达，有效解决了鸡GM‑CSF和鸡IFN在家禽养殖业的应用成本问题。

Description

一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养鸡业已由农村家庭副业发展成了一大社会产业。然而，鸡的病毒性传染病，如新城疫、传染性法氏囊病、马立克氏病、传染性支气管炎和禽流感等，每年都会在不同的季节暴发。鸡群一旦感染发病，会造成鸡的大面积死亡，给养殖业造成巨大经济损失。目前鸡类病毒性传染病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗。由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。且很多病毒性疾病目前尚无疫苗可用，有些病毒如禽流感已直接危害到人类的健康。动物用抗病毒药物种类则更加匮乏，临床治疗主要采用抗生素。但是近年来由于抗生素滥用，导致耐药性菌株大量产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来更大的威胁。

IFN(干扰素)是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的繁殖。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染的细胞，通过抑制受染细胞内病毒蛋白质的合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。IFN-α主要具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、激活免疫细胞的杀伤活性等生物学活性。

GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)是一种细胞因子，主要由淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞和巨噬细胞等产生，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞形成集落，并可促进早期巨核红细胞、嗜酸性祖细胞的增殖和发育。1977年Burgess等首次从小鼠的肺细胞培养液中发现一种能促进粒细胞和巨噬细胞形成集落的细胞因子，并将其命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，该细胞因子在机体免疫反应中发挥着重要的作用，不仅能够活化巨噬细胞、树突状细胞以及其他单核细胞，还能促进造血干细胞的增殖分化并在成熟时将其转移至外周。

GM-CSF在机体免疫应答过程中发挥着重要的作用，并作为疫苗佐剂被广泛使用。1993年Dranoff等首次使用GM-CSF作为抗肿瘤疫苗免疫效应增强剂。1999年SomasundaramC等首次将pGM-CSF作为伪狂犬病病毒(PRV)DNA疫苗佐剂，有效增强了疫苗的免疫效力。近些年来，又有研究报道了pGM-CSF在口蹄疫病毒(FD-MV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等疫苗中具有良好的增强免疫效应。

现已知，天然鸡IFN-α、重组鸡IFN-α及重组GM-CSF在体内的半衰期均较短，一般为3～5小时。这给临床治疗带来了诸多不便，如治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，也影响疗效并增大了机体不良反应发生的概率。聚乙二醇修饰的干扰素虽然能延长半衰期，但是聚乙二醇修饰的干扰素成本非常高，在家禽临床治疗上很难得到应用。

本发明提供了一种rChGM-CSF-IFNα融合蛋白可溶性高效表达及其制备方法，在大肠埃希菌破碎上清中获得了可溶性表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白，表达量可达40％以上，通过高密度发酵每升发酵液可获得2g目的蛋白，实现了rChGM-CSF-IFNα融合蛋白可溶性高效表达。生物学活性检测发现所述rChGM-CSF-IFNα融合蛋白实现了鸡GM-CSF与鸡IFN-α的优势互补，能显著提高鸡IFN-α的半衰期并具有较强的抗病毒活性。该发明意义在于，一是通过ChGM-CSF-IFNα融合表达，提高了单纯ChIFNα的抗病毒活性，且延长了单纯ChIFNα在体内的药物半衰期；二是通过ChGM-CSF-IFNα原核可溶性高效表达，有效地解决了GM-CSF和IFN在鸡的应用成本问题。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种可溶性高效表达的重组鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子干扰素α融合蛋白(rChGM-CSF-IFNα)及其制备方法和应用。

为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：

一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白，具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别提取扩增鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因；

(2)将扩增后的鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因连接，得到融合蛋白基因；

(3)构建重组克隆载体和重组表达载体，筛选得到基因工程菌；

(4)融合蛋白的可溶性高效表达；

(5)融合蛋白纯化。

所述步骤1中鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述步骤1中提取扩增鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因时的扩增引物分别为：

GM-CSF-F1：GCGGGATCCATGTTAGCGCAGC；

GM-CSF-R1：ACCACCACCAGAACCACCACCACCAATGCAATCTTTTTCTTCCG；

IFN-α-F1：GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCTGTGCCTGC；

IFN-α-R1：CCGAAGCTTAGTGCGCGTGTTG。

所述步骤2中融合蛋白基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述步骤2中鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因是通过柔性linker连接。

所述步骤3中筛选方法为使用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选。

所述步骤4中融合蛋白的可溶性高效表达是挑取步骤3得到的基因工程菌，于氨苄青霉素LB培养基进行发酵培养，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)进行诱导表达，获得融合蛋白。

所述步骤5中纯化是仅需经His-tag亲和层析纯化。

本发明还提供了一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白在延长鸡IFN-α的半衰期和抗病毒活性中的应用。

本发明的优点是：

1、通过融合蛋白技术将鸡GM-CSF和鸡IFN-α蛋白实现融合表达，与单纯鸡IFNα相比，在鸡体内的半衰期提高了4倍以上。

2、本发明公开的rChGM-CSF-IFNα蛋白，在CEF细胞/VSV效价测定系统上显示较单纯ChIFNα具有更强的抗VSV病毒活性。

3、本发明中rChGM-CSF-IFNα蛋白为可溶性高效表达，不仅纯化步骤简便，而且纯化产物纯度较高。

4、以重组大肠杆菌BL21/pET32a-rChGM-CSF-linker-IFNα作为表达菌株，具有生产成本低、产量高等优势，适用于大规模的工业化生产。

附图说明

图1所示为鸡GM-CSF基因与鸡IFN-α基因RT-PCR扩增的结果。其中泳道M：DNAMarker DL2000；泳道1-6：鸡GM-CSF基因RT-PCR扩增产物；泳道7-12：鸡IFN-α基因RT-PCR扩增产物。

图2所示为rChGM-CSF-IFNα融合基因扩增的结果。其中泳道M：DNA MarkerDL2000；泳道1-6：rChGM-CSF-IFNα融合基因扩增产物；泳道7：阴性对照。

图3所示为重组质粒pET32a-rChGM-CSF-linker-IFNα双酶切鉴定结果。其中M为DNA Marker，泳道1为重组质粒pET32a-rChGM-CSF-linker-IFNα经BamHI和HindⅢ双酶切结果，泳道2、3分别为重组质粒pET32a-rChGM-CSF-linker-IFNα经BamHI和HindⅢ单酶切结果，泳道4为重组质粒pET32a-rChGM-CSF-linker-IFNα。

图4所示为32℃时使用0.5mM IPTG诱导表达的rChGM-CSF-IFNα蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为rChGM-CSF-IFNα工程菌诱导5h后菌体表达的全蛋白，泳道3为rChGM-CSF-IFNα工程菌诱导5h后菌体破碎后的沉淀，泳道4为rChGM-CSF-IFNα工程菌诱导5h后菌体破碎后的上清。

图5所示为Western Blot鉴定rChGM-CSF-IFNα蛋白结果。其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rChIFNα蛋白样品，泳道3、4为rChGM-CSF-IFNα蛋白样品。

图6所示为rChGM-CSF-IFNα蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测结果。其中M为蛋白marker，泳道1为纯化后rChGM-CSF-IFNα蛋白。

图7所示为rChGM-CSF-IFNα蛋白抑制VSV致细胞病变效应。其中V为VSV病毒对照孔；C为CEF细胞对照孔；A1-10为梯度稀释的鸡干扰素标准品处理孔；B1-10为梯度稀释的rChGM-CSF-IFNα蛋白处理孔。

图8所示为静脉注射组血药浓度-时间变化曲线。

图9所示为肌肉注射组血药浓度-时间变化曲线。

图10所示为皮下注射组血药浓度-时间变化曲线。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：

实施例1

一种由重组鸡GM-CSF与重组鸡IFN-α组成的融合蛋白，其制备方法如下：

a.鸡GM-CSF与鸡IFN-α目的基因的获取与扩增引物设计：

根据Genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物，在鸡GM-CSF的上游引物和下游引物中分别引入BamHⅠ酶切位点和Linker序列，在鸡IFN-α的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列和HindⅢ酶切位点，如表1所示：

表1 PCR扩增引物

RT-PCR获取目的基因，如表2所示：

从鸡肝脏组织中提取RNA，通过反转录获得鸡GM-CSF和鸡IFN-α的目的基因，两者的基因序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

表2 RT-PCR反应体系

反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在432bp和579bp左右出现特异条带，其结果如图1所示，说明得到了分别连接有柔性linker的鸡GM-CSF目的基因与鸡IFN-α的目的基因。

b.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10μg/mL，利用重叠PCR连接两段目的基因，融合蛋白基因序列如SEQ ID NO.3所示；反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1000bp左右出现特异性条带，其结果如图2所示。

c.构建克隆载体：

胶回收PCR扩增的rChGM-CSF-IFNα基因，克隆于pMD18-T并转化DH5α大肠杆菌，涂布于卡那霉素LB平板培养过夜，次日挑取LB平板上单菌落进行后续PCR和双酶切鉴定。

d.构建表达载体：

选择测序无误的克隆载体，将rChGM-CSF-IFNα基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化BL21(DE3)大肠杆菌，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，次日挑取LB平板上单菌落进行后续PCR及BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功。PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳1号泳道在1000bp附近出现单一条带，如图3。

e.rChGM-CSF-IFNα蛋白的表达：

挑取rChGM-CSF-IFNα重组菌于含氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养，后在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中放大培养2～3h后，测OD值在0.6-0.8时，加入终浓度0.5mMIPTG，32℃诱导表达5h，收集蛋白。经SDS-PAGE电泳和WB检测，重组菌诱导5h后的菌体蛋白在55.0kD处可见优势表达条带，如图4、5。

f.rChGM-CSF-IFNα蛋白粗纯品的制备和可溶性鉴定：

收集细菌，使用200mL的PBS重悬菌体沉淀，4℃超声破碎细菌沉淀(功率：400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3～4次)，12000r/min离心15min分离上清和沉淀，分离出的上清即为rChGM-CSF-IFNα蛋白的粗纯品。分别取沉淀和上清及菌体经SDS-PAGE电泳检测，如图4所示。经SDS-PAGE电泳分析，该重组蛋白为可溶性表达。

g.rChGM-CSF-IFNα蛋白精纯品的制备：

将rChGM-CSF-IFNα蛋白粗纯品过滤处理后过His-tag亲和层析柱，用Elutionbuffer(50mMTris-Cl、500mM咪唑pH 8.0)梯度洗脱，收集rChGM-CSF-IFNα峰，即为rChGM-CSF-IFNα蛋白精纯品，纯化产物进行SDS-PAGE检测，结果如图6所示。

实施例2

一种rChGM-CSF-IFNα蛋白，由实施例1中的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。其中冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例3

rChGM-CSF-IFNα蛋白的鉴定：

a.蛋白定量检测：

采用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院提供的标准蛋白作标准品测定。

b.SDS-PAGE电泳检测：

与空载体菌体蛋白相比，重组菌表达的目的蛋白在55kD左右处出现预期宽厚的目的蛋白条带，与理论值基本一致。

c.Western Blot结果：

以Bio-Rad公司小鼠抗鸡GM-CSF多抗为一抗(1：2000稀释)，以中杉金桥公司HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗(1：50000稀释)。rChGM-CSF-IFNα蛋白能与鸡GM-CSF多克隆抗体发生特异性反应，在约55kD左右处出现特异性条带，见图5。

实施例4

rChGM-CSF-IFNα蛋白活性检测：

a.按照微量细胞病变抑制法，采用鸡胚成纤维细胞(chicken embryofibroblast,CEF)/水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)系统，在96孔微量细胞培养板上使用RPMI 1640营养液培养CEF细胞，待细胞长满单层，加入不同剂量的rChGM-CSF-IFNα蛋白，继续培养24小时后将其弃去，再分别加入100 TCID₅₀ VSV病毒200μL/孔。攻毒18h后终止反应，镜下及结晶紫染色观察细胞病变效应。结果表明，获得的rChGM-CSF-IFNα蛋白对VSV引起的细胞病变效应有明显的抑制作用，测得效价为4.9×10⁷IU/mL，比单纯rChIFNα对照组的效价(3.7×10⁷IU/mL)高出约24％，如图7。

b.按照促淋巴细胞增殖法检测rChGM-CSF-IFNα促淋巴细胞活性，具体操作方法为：无菌采鸡血2mL，置于15mL无菌离心管中并加入等体积的PBS稀释，再加入4mL鸡外周血淋巴细胞分离液，常温下3000r/min离心30min，吸取中间白色淋巴细胞层，置于另一无菌离心管中，加入10mL PBS上下颠倒两次，250r/min离心10min，加入RPMI 1640培养基，调整细胞浓度为5×106个/mL，再移液至96孔板中，每孔100μL；将rChGM-CSF-IFNα蛋白稀释成13个浓度梯度，分别为600、300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.58、0.29和0.15μg/mL，每孔加入100μL稀释蛋白，每个稀释度重复三次，并使用RPMI1640培养液作为阴性对照，37℃培养40h后，弃去培养液，每孔加入20μLMTT(5μg/mL)，继续培养4h后，每孔加入100μL的DMSO，吹打混匀，用酶标仪测定OD570nm值及SI值，当rChGM-CSF-IFNα蛋白浓度为150μg/mL时，SI值达到最大值为3.1，显示该重组融合蛋白有明显促淋巴细胞活性。检测结果如表4所示。

表4不同浓度rChGM-CSF-IFNα蛋白的促淋巴细胞增殖活性

实施例5

7周龄健康成年AA商品鸡48只，设置rChGM-CSF-IFNα试验组和rChIFNα对照组，两组按照肌肉、静脉和皮下注射给药途径随机各分为3小组，每小组8只。给药前每只鸡翼静脉采血1mL做内对照用。分别按1.0×106U/kg剂量给每只试验组鸡注射实施例2中的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白，给每只对照组鸡注射本室制备的rChIFNα蛋白溶液。每只鸡于注射后第1、2、4、8、16、24、48、72和第96小时翼静脉采血，每次大约1mL，置5mL采血管中。将血样置4℃凝固，2000r/min4℃离心10分钟分离血清。收集分装试验组与对照组各时间点每只鸡血样，采用常规细胞病变抑制法检测血清抗VSV病毒效价，并绘制血药浓度-时间变化曲线，见图8、9、10。试验组与对照组药代动力学检测参数见表5-6。结果对比表明，不同给药方式的rChGM-CSF-IFNα在鸡体内均有较长的半衰期。经鉴定，静脉注射组、肌肉注射组和皮下注射组的半衰期分别为24.32小时、26.85小时和25.74小时左右。较单纯重组鸡干扰素α对照组半衰期延长约4倍。

表5 rChIFNα(冻干型)三个注射组的各主要药代动力学参数

表6 rChGM-CSF-IFNα(冻干型)三个注射组的各主要药代动力学参数

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 芜湖天明生物技术有限公司

<120> 一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgttagcgc agctgaccat cttactgtca ctgggcgtgc tgtgtagtcc agccccgacg 60

acgacatata gttgttgcta taaggtgcta acgatcctgg aagaaattac aagtcatctg 120

gaatcaacag cggccacggc aggtctatcg tcagttccta tggacatacg agataaaaca 180

tgcctgcgca acaatctgaa aacctttatc gaatctctga aaaccaatgg caccgaagaa 240

gaatcaggta ttgtgtttca gttaaatcgc gttcatgaat gcgaacgcct gttcagtaat 300

attaccccta caccacaggt tccggataaa gaatgtcgta ccgcccaggt gtctcgcgaa 360

aagttcaaag aagcactgaa aacgttcttc atctatctga gtgatgtgct gccggaagaa 420

aaagattgca tt 432

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cgggggtacg gcatcctgct gctcacgctc 60

cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc 120

accttctctc acgacagcct ccagctcctc cgggacatgg ctcccacact accccagctg 180

tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240

cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300

cccagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac 360

cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga 420

tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccttcctc 480

caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540

ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acgcgcact 579

<210> 3

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgttagcgc agctgaccat cttactgtca ctgggcgtgc tgtgtagtcc agccccgacg 60

acgacatata gttgttgcta taaggtgcta acgatcctgg aagaaattac aagtcatctg 120

gaatcaacag cggccacggc aggtctatcg tcagttccta tggacatacg agataaaaca 180

tgcctgcgca acaatctgaa aacctttatc gaatctctga aaaccaatgg caccgaagaa 240

gaatcaggta ttgtgtttca gttaaatcgc gttcatgaat gcgaacgcct gttcagtaat 300

attaccccta caccacaggt tccggataaa gaatgtcgta ccgcccaggt gtctcgcgaa 360

aagttcaaag aagcactgaa aacgttcttc atctatctga gtgatgtgct gccggaagaa 420

aaagattgca ttggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt ctatggctgt gcctgcaagc 480

ccacagcacc cacgggggta cggcatcctg ctgctcacgc tccttctgaa agctctcgcc 540

accaccgcct ccgcctgcaa ccaccttcgc ccccaggatg ccaccttctc tcacgacagc 600

ctccagctcc tccgggacat ggctcccaca ctaccccagc tgtgcccaca gcacaacgcg 660

tcttgctcct tcaacgacac catcctggac accagcaaca cccggcaagc cgacaaaacc 720

acccacgaca tccttcagca cctcttcaaa atcctcagca gccccagcac tccagcccac 780

tggaacgaca gccaacgcca aagcctcctc aaccggatcc accgctacac ccagcacctc 840

gagcaatgct tggacagcag cgacacgcgc tcccggacgc gatggcctcg caaccttcac 900

ctcaccatca aaaaacactt cagctgcctc cacaccttcc tccaagacaa cgattacagc 960

gcctgcgcct gggaacacgt ccgcctgcaa gctcgtgcct ggttcctgca catccacaac 1020

ctcacaggca acacgcgcac t 1041

<210> 4

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Leu Ala Gln Leu Thr Ile Leu Leu Ser Leu Gly Val Leu Cys Ser

1 5 10 15

Pro Ala Pro Thr Thr Thr Tyr Ser Cys Cys Tyr Lys Val Leu Thr Ile

20 25 30

Leu Glu Glu Ile Thr Ser His Leu Glu Ser Thr Ala Ala Thr Ala Gly

35 40 45

Leu Ser Ser Val Pro Met Asp Ile Arg Asp Lys Thr Cys Leu Arg Asn

50 55 60

Asn Leu Lys Thr Phe Ile Glu Ser Leu Lys Thr Asn Gly Thr Glu Glu

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ile Val Phe Gln Leu Asn Arg Val His Glu Cys Glu Arg

85 90 95

Leu Phe Ser Asn Ile Thr Pro Thr Pro Gln Val Pro Asp Lys Glu Cys

100 105 110

Arg Thr Ala Gln Val Ser Arg Glu Lys Phe Lys Glu Ala Leu Lys Thr

115 120 125

Phe Phe Ile Tyr Leu Ser Asp Val Leu Pro Glu Glu Lys Asp Cys Ile

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Val Pro Ala Ser

145 150 155 160

Pro Gln His Pro Arg Gly Tyr Gly Ile Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu

165 170 175

Lys Ala Leu Ala Thr Thr Ala Ser Ala Cys Asn His Leu Arg Pro Gln

180 185 190

Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala

195 200 205

Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe

210 215 220

Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr

225 230 235 240

Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser

245 250 255

Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg

260 265 270

Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp

275 280 285

Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro Arg Asn Leu His Leu Thr Ile Lys

290 295 300

Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser

305 310 315 320

Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu

325 330 335

His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn Thr Arg Thr

340 345

Claims

1.一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白，其特征在于，具有序列表中SEQID No.4所示的氨基酸序列。

2.一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别提取扩增鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因；

（2）将扩增后的鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因连接，得到融合蛋白基因；

（3）构建重组克隆载体和重组表达载体，筛选得到基因工程菌；

（4）融合蛋白的可溶性高效表达；

（5）融合蛋白纯化。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中提取扩增鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因时的扩增引物分别为：

GM-CSF-F1：GCGGGATCCATGTTAGCGCAGC；

GM-CSF-R1：ACCACCACCAGAACCACCACCACCAATGCAATCTTTTTCTTCCG；

IFN-α-F1：GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCTGTGCCTGC；

IFN-α-R1：CCGAAGCTTAGTGCGCGTGTTG。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中融合蛋白基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中鸡GM-CSF和鸡IFN-α基因是通过柔性linker连接。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中筛选方法为使用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中融合蛋白的可溶性高效表达是挑取步骤3得到的基因工程菌，于氨苄青霉素LB培养基进行发酵培养，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，获得融合蛋白。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中纯化是仅需经His-tag亲和层析纯化。

10.一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白在延长鸡IFN-α的半衰期和抗病毒活性中的应用。