CN111825773A

CN111825773A - 重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用

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Publication number: CN111825773A
Application number: CN202010759687.2A
Authority: CN
Inventors: 王明丽; 夏兵兵; 吴博; 何志远; 蒋敏之; 周炜; 许智勇; 赵俊; 张俊玲; 余莉
Original assignee: Wuhu Tianming Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111825773B

Abstract

本发明公开了一种重组人TSG6‑IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用，通过对已有的人TSG‑6、猪IFN‑α或人IFN‑α基因进行优化后，经Link连接肽基因片段将猪IFN‑α或人IFN‑α基因与人TSG‑6基因连接后克隆至pET‑32a表达载体并转化至大肠埃希菌中，经过诱导表达，对表达后的菌体进行洗涤、变性和复性；再经分离纯化后加入冻干保护剂进行冷冻干燥，制得rhTSG6‑PoIFNα融合蛋白及rhTSG6‑hIFNα融合蛋白；rhTSG6‑PoIFNα融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(1.60±0.45)×10⁷IU/mL；rhTSG6‑hIFNα融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(4.50±1.32)×10⁶IU/mL；本发明的方法实现了对非自然存在的特征性融合蛋白的高效表达及批量制备；重组人TSG6‑IFNα融合蛋白在体内的半衰期长达60～72h，抗病毒的效果更佳，可作为一种新型抗病毒的药物开发应用。

Description

重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用。

背景技术

2019年底始于国内继之在全球爆发的新冠肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)由新型冠状病毒感染导致的，临床以发热、乏力、干咳为主要临床症状，部分患者可因“细胞因子风暴”由轻症快速发展为重症，其表现为急性呼吸窘迫综合征、代谢性酸中毒和脓毒血症，甚至多器官衰竭导致患者死亡。曾于2012年爆发的中东呼吸道综合征(MERS)和2003年爆发的SARS等急性病毒性重大传染病的重症患者也具有相似临床特征和病理过程。由于临床上缺乏特异性治疗药物，常规使用的糖皮质激素虽能抑制炎症反应，但常会出现严重的不良反应，如股骨头坏死等，治疗效果受限。

肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-αstimulated gene 6，TSG-6)是Lee等在筛选肿瘤坏死因子α干预的人二倍体FS-4成纤维cDNA文库时发现的一个新基因。该基因主要由相邻的两个组件即Link和CUB组成，其中Link组件负责与信号分子识别，并与透明质酸(hyaluronicacid，HA)、硫酸软骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1链等结合；而CUB组件则作为功能区发挥其生物学作用。在成纤维细胞中的研究发现，TSG-6基因启动子序列中存在激活物蛋白-1(AP-1)和核因子-白细胞介素(NF-IL)结合位点，当受到TNF-α、白介素-1(IL-1)等致炎因子刺激后，该基因表达显著增高。因此，被认为该基因被认为是一个受TNF-α等炎症因子调节的基因。TSG-6基因位于人染色体2q23 3，mRNA全长1440bp，其编码的相应蛋白TSG-6含有277个氨基酸残基，属于透明质酸结合蛋白家族，具有多种功能，包括抑制中性粒细胞移行、蛋白网络的调控等，是一个由TNF-α等诱导的、参与多种炎症反应的基因。在多种炎症性疾病或类似炎症的疾病过程中呈高表达，通过与透明质酸、间α-蛋白酶抑制剂结合，介导抑制炎性细胞的迁移、黏附，参与细胞外基质重塑，调节蛋白酶网络，是一个正调节的功能蛋白，在多种病理如在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤、瘢痕疙瘩等炎症过程及生理过程如羊膜、肺和皮肤等组织的屏障防御保护中，以及组织重塑中扮演重要角色。

机体在遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。但如果炎症反应持续很长时间或程度剧烈，则会对机体有害。大量研究表明，TSG-6是一种效果明显的抗炎因子，其通过有效抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，产生抑制中性粒细胞移动或浸润等功能，间接发挥较强的抗炎作用；如中国专利CN 108530528 A证实，重组人TSG-6对于HCMV病毒感染小鼠引起的急性肺炎有很好的治疗效果，这为病毒感染所致的急性炎症性疾病的治疗提供了新思路。

干扰素(interferon，IFN)是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，于1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，刺激机体产生成百上千种的干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)产物，具有抑制病毒增殖和免疫调节功能，但不是直接灭活病毒，而是诱导机体产生多种具有抗病毒作用的蛋白质，抑制病毒蛋白的合成，适用于病毒性传染病的紧急预防和早期治疗。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类，其中α型干扰素在机体内能发挥广谱、高效抗病毒作用并能选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用微弱，在临床上IFN-α已作为一种常用的广谱抗病毒药物，得到广泛地应用。

根据临床研究和实践表明，干扰素-α需要在病毒感染的早期阶段或预防性用药方可显效，大大限制了临床应用的范围。且在人与动物体内的半衰期仅为3h～5h，半衰期较短，需要多次注射来维持药效；除不利于临床治疗外，还增加了患者的痛苦和经济负担。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用。本发明通过对已有的人TSG-6、人IFN-α或猪IFN-α基因进行优化后，采用Link连接肽片段实现人IFN-α或猪IFN-α与人TSG-6的基因连接后，克隆至pET-32a表达载体并转化至大肠埃希菌中，经培养后诱导表达；对表达后的重组菌体进行洗涤、变性和复性；再经分离纯化后与冻干保护剂混合。经冷冻干燥，制备得到重组人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG6)与重组人或重组猪IFN-α(recombinant human orporcine IFN-α，rhIFNαor rpoIFNα)融合蛋白，简称重组人TSG6-IFNα融合蛋白(下同)。

本发明通过密码子优化实现了对该融合蛋白的高效表达，本发明的制备方法可实现对于该类融合蛋白的批量制备。

此外，本发明首次采用细胞病变抑制法检测了该融合蛋白的体外抗病毒活性，其能准确客观地观察与检测该融合蛋白的抗病毒活性，重复性及准确度均高，且以此为评价结果的标准，可使不同批次的融合蛋白的效价检测结果更为可靠可信。

本发明公开的重组人TSG6-IFNα融合蛋白具有明显的抗病毒活性。其中，重组hTSG6-PoIFNα融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(1.60±0.45)×10⁷IU/mL，重组hTSG6-hIFNα融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(4.50±1.32)×10⁶IU/mL。首次发现该蛋白在体内相对于IFNα可以延长半衰期约68h，抗病毒的效果更佳。

本发明采取的具体技术方案如下：

一种重组人TSG6-IFNα融合蛋白，所述IFN-α可以为人IFN-α(hTSG-6)、猪IFN-α(PoIFN-α)、犬IFN-α、猫IFN-α、牛IFN-α、马IFN-α、羊IFN-α、禽IFN-α或者水生动物IFN-α；

其中，重组hTSG-6与PoI FN-α融合蛋白(rhTSG6-PoIFNα融合蛋白)的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；

重组hTSG-6与hIFN-α融合蛋白(rhTSG6-hIFNα融合蛋白)的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

本发明还提供了编码重组hTSG-6-IFN-α融合蛋白的基因，其中，编码所述rhTSG6-PoIFNα融合蛋白的基因序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示；编码所述rhTSG6-hIFNα融合蛋白的基因序列如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示。

本发明还提供了所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白基因的构建方法，将如SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示的重组猪IFN-α基因或如SEQUENCE LISTING 400〈12〉所示重组人IFN-α基因，通过Link连接肽片段连接基因至如SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示的重组人TSG-6基因。

进一步地，如SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示的重组猪IFN-α基因，是将如SEQUENCE LISTING 400〈8〉所示的重组猪IFN-α基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到，其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈10〉所示。

如SEQUENCE LISTING 400〈12〉所示的重组人IFN-α基因，是将如SEQUENCELISTING 400〈11〉所示的重组人IFN-α基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到，其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈13〉所示。

如SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示的重组人TSG-6基因，是将如SEQUENCE LISTING400〈5〉所示的重组人TSG-6基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到，其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈7〉所示。

进一步地，所述的Link连接肽长度为2-100个氨基酸残基，优选为5-50个氨基酸残基，更优选为12-30个氨基酸残基。连接肽氨基酸残基长度可短至对人TSG-6和IFN-α结构域的构成影响最小为佳，例如(G4S)3-4，更优选地是(G4S)2-6。

进一步地，所述Link连接肽基因片段如SEQUENCE LISTING 400〈14〉所示，其编码的氨基酸残基序列如SEQUENCE LISTING 400〈15〉所示。

本发明还提供了含有所述的重组hTSG6-IFNα融合蛋白基因的表达载体。

本发明还提供了含有所述的表达载体的细胞。

本发明还提供了所述重组hTSG6-IFNα融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将编码所述的重组hTSG6-IFNα融合蛋白的基因亚克隆至pET-32a表达载体中，并转化至Roseeta-gami(DE3)pLysS大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组菌；

(2)将重组菌进行放大培养，并经IPTG诱导表达，然后收集菌体；

(3)将步骤(2)收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到重组hTSG6-IFNα融合蛋白粗制品；

(4)粗制品经分离纯化后，再与冻干保护剂混合，经冷冻干燥，即可得到所述重组hTSG6-IFNα融合蛋白。

进一步地，步骤(1)中，还包括对LB平板上培养得到的单菌落进行PCR鉴定，鉴定结果为阳性即说明重组hTSG6-IFNα融合蛋白的重组菌构建成功。

步骤(2)中，放大培养所用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基；培养至OD₆₀₀值在0.6～0.8，然后经终浓度为1.0mM的IPTG在30℃诱导表达6h。

步骤(4)中，所述分离纯化的方法为：将粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱纯化，再经透析处理，然后调节pH至5.0；再经阴离子交换层析柱纯化，即可得到蛋白纯品。

所述His-tag亲和层析柱纯化所用的洗脱液为50mMTris-Cl和500mM咪唑组成的混合液，其pH为8.0。

步骤(5)中，所述冻干保护剂为终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL组成的PBS混合液。

同时，本发明还提供了所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白在抗病毒药物中的应用。

本发明于MDBK/VSV效价测定系统上测定重组人TSG6-IFNα融合蛋白的抗病毒活性，MDBK/VSV效价测定系统还可替换为MDBK/VSV-GFP、Hep-2/VSV、Hep-2/VSV-GFP、WISH/VSV、WISH/VSV-GFP、PK-15/VSV、PK-15/VSV-GFP效价测定系统；结果显示，使用了该重组融合蛋白的细胞可以免于受到VSV病毒对该细胞的侵害，细胞形态特征保持完好，没有出现可见的特征性病毒致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，显示其具有抗VSV病毒的活性。

rhTSG6-PoIFN-α融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(1.60±0.45)×10⁷IU/mL，rhTSG6-hIFNα融合蛋白的抗VSV病毒的效价高达(4.50±1.32)×10⁶IU/mL。首次发现，该蛋白在体内相对于IFN-α可以延长其半衰期约68h，抗病毒的效果更佳。本发明提供的检测与评价方法能准确客观地观察检测与评价重组人TSG6-IFNα融合蛋白抗病毒活性，重复性及准确度均高。

本发明具有以下优点：

1、通过Link连接肽将人TSG-6基因与猪IFN-α基因或人IFN-α基因进行连接后，克隆至pET-32a表达载体中并转化至大肠埃希菌中，经培养后诱导表达；对表达后的菌体进行洗涤、变性和复性，再经分离纯化后与冻干保护剂混匀，经冷冻干燥，制备得到rhTSG6-hIFNα融合蛋白、rhTSG6-PoIFNα融合蛋白，均是一种自然界不存在的均质纯净重组蛋白，具有成分、结构和理化性状明确，且可大量制备生产的生物制品。

2、本发明制备得到的rhTSG6-hIFNα融合蛋白、rhTSG6-PoIFNα融合蛋白在体外基于MDBK/VSV效价测定系统上显示均具有明显抗VSV病毒活性。

3、本发明制备得到的rhTSG6-hIFNα融合蛋白、rhTSG6-PoIFNα融合蛋白均具有既能增强机体对抗病毒侵袭，刺激机体免疫应答，又有明显抑炎作用。

4、本发明制备得到的rhTSG6-hIFNα融合蛋白、rhTSG6-PoIFNα融合蛋白在体内外的半衰期较长，均高达60～72h，相对于IFNα延长了约68h；大大减少了给药频次。降低了生产制造成本，并具有更为显著的临床疗效。

5、以Rosetta-gami(DE3)pLysS大肠埃希菌作为宿主细胞，其含有突变的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强了重组蛋白的可溶性和生物活性。

6、本发明中的人IFN-α、猪IFN-α还可替换为犬IFN-α、猫IFN-α、牛IFN-α、马IFN-α、羊IFN-α和、禽IFN-α或者水生动物IFN-α，并通过Link连接肽片段将各IFN-α基因与如SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示的重组人TSG-6基因连接，并按照与本发明同样的方法进行诱导表达，同样可以获得可高效表达及在体内具有较长半衰期的重组人TSG6-IFNα融合蛋白。

附图说明

图1为实施例1中的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白基因PCR鉴定的结果，其中泳道M：DNAMarker DL2000；泳道1：阴性对照；泳道2-4：rhTSG6-PoIFNα融合蛋白基因PCR鉴定结果；

图2为实施例1中30℃时使用1.0mM IPTG诱导表达的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道1～2为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道3～6为重组人TSG-6工程菌诱导6h后菌体表达的全蛋白；

图3为实施例1中rhTSG6-PoIFNα融合蛋白表达方式检测结果，其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为rhTSG6-PoIFNα工程菌诱导6h后菌体破碎后的上清，泳道3为rhTSG6-PoIFNα工程菌诱导6h后菌体破碎后的沉淀；

图4为实施例1中Western Blot鉴定rhTSG6-PoIFNα融合蛋白结果；其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rhTSG6-PoIFNα融合蛋白样品；

图5为实施例1中rhTSG6-PoIFNα融合蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为纯化前的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白溶液，泳道3为纯化后的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品；

图6为实施例1中rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品效价滴定结果，其中A为重组人干扰素α国家标准品，B为rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品；

图7为实施例3中不同时间下家兔体内rhTSG6-PoIFNα融合蛋白或rPoIFN-α代谢曲线；

图8为实施例4中的rhTSG6-hIFNα融合蛋白基因PCR鉴定的结果，其中泳道M：DNAMarker DL2000；泳道1：阴性对照；泳道2-5：优化后的rhTSG6-hIFNα融合蛋白基因PCR鉴定结果；

图9为实施例4中的30℃时使用1.0mM IPTG诱导表达的rhTSG6-hIFNα融合蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道1～3为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道4～6为rhTSG6-hIFNα工程菌诱导6h后菌体表达的全蛋白；

图10为实施例4中的rhTSG6-hIFNα融合蛋白表达方式检测结果，其中M为蛋白marker，泳道1为rhTSG6-hIFNα工程菌诱导6h后菌体破碎后的上清，泳道2为rhTSG6-hIFNα工程菌诱导6h后菌体破碎后的沉淀；

图11为实施例4中的Western Blot鉴定rhTSG6-hIFNα融合蛋白结果，与鼠抗人IFN-α单克隆抗体发生特异性反应；其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rhTSG6-hIFNα融合蛋白样品；

图12为实施例4中的Western Blot鉴定rhTSG6-hIFNα融合蛋白结果，与鼠抗人TSG-6单克隆抗体发生特异性反应；其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rhTSG6-hIFNα融合蛋白样品；

图13为实施例4中的rhTSG6-hIFNα融合蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2～3为rhTSG6-hIFNα工程菌诱导6h后菌体表达的全蛋白，泳道4～5为纯化后的rhTSG6-hIFNα融合蛋白纯品；

图14为实施例4中的rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品效价滴定结果，其中A为重组人干扰素α国家标准品，B为rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品

图15为实施例6中的不同时间下家兔体内rhTSG6-hIFNα或重组人IFN-α代谢曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。

实施例1

一种重组人TSG-6与猪IFN-α融合蛋白(rhTSG6-PoIFNα融合蛋白)的制备方法，包括以下步骤：

(1)将如SEQUENCE LISTING 400〈5〉所示的重组人TSG-6基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到如SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示的优化后的重组人TSG-6基因，其编码的重组人TSG-6的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈7〉所示；

将如SEQUENCE LISTING 400〈8〉所示的重组猪IFN-α基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到如SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示的优化后的重组猪IFN-α基因，其编码的重组猪IFN-α的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈10〉所示；

使用一段如SEQUENCE LISTING 400〈14〉所示的连接肽基因片段将如SEQUENCELISTING 400〈10〉所示的优化后的重组猪IFN-α基因与如SEQUENCE LISTING 400〈7〉所示的优化后的重组人TSG-6基因进行连接，获得的连接后的基因如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。优化前融合蛋白基因的密码子适应指数(CAI)为0.68，优化后的CAI为0.98。

(2)将步骤(1)所得连接后的基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至Rosetta-gami(DE3)pLysS大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取LB平板上单菌落进行PCR鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功，得到rhTSG6-PoIFNα重组菌；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳2号泳道在1323bp附近出现单一条带，如图1所示；

PCR鉴定引物为：

F1：GGATCCTGTGATCTGCCGCA(BamHⅠ)；

R1：AAGCTTCAGATGGCTAAAGC(HindⅢ)。

(3)挑取rhTSG6-PoIFNα重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养，后在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中放大培养2～3h后，测OD₆₀₀值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mM IPTG，30℃诱导表达6h，收集菌体；经SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，经IPTG诱导表达6h后的菌体蛋白在70kD处可见优势表达条带，表达量达到15％；经Western blot鉴定，如图4所示，经IPTG诱导表达5h后的菌体蛋白能与鼠抗猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应，在70kD左右处出现特异性条带，且特异性高；

其中Western blot鉴定方法为：以Abcam公司鼠抗猪IFN-α单克隆抗体为一抗(1：2000稀释)，以中杉金桥公司HRP标记山羊抗兔IgG为二抗(1：50000稀释)。

(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200mL的PBS重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀。超声破碎的条件为：功率：400W，工作3S，间隔3S。超声破碎6min，重复3～4次；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过洗涤、变性和复性，复性产物即为rhTSG6-PoIFNα融合蛋白粗制品。分别取沉淀和上清及菌体经SDS-PAGE电泳检测，如图3所示。经SDS-PAGE电泳分析，该重组蛋白为包涵体表达。

所述洗涤、变性和复性的方法为：

①洗涤：使用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，2mol/L尿素，1mmol/LEDTA，0.5％TritonX-100，pH为8.0)以1∶20的湿重体积比对包涵体(10g)进行重悬，洗涤2h，12000r/min离心20min取沉淀，再重复洗涤一次；

②变性：称量洗涤后沉淀湿重(4.8g)，再用溶解缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，7mol/L盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，pH为8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(240ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；

③稀释复性：配制复性缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，1mmol/L GSH，0.2mmol/L GSSG，pH8.0)进行复性。取溶解后的蛋白溶液，12000r/min离心20min取上清，加入等体积的复性缓冲液(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h；再加入复性缓冲液稀释至原体积的4倍(加500ml复性缓冲液)，4℃静置3h；最后加入复性缓冲液稀释至原体积的5倍(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h。

(5)rhTSG6-PoIFNα融合蛋白粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱，用Elutionbuffer(50mMTris-Cl、500mM咪唑pH 8.0)梯度洗脱，收集显示出rhTSG6-PoIFNα融合蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节pH至5.0，使用1M NaCl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为重组rhTSG6-PoIFNα融合蛋白纯品。经SDS-PAGE检测，结果如图5所示，从图中可以看出制备的目的蛋白纯度达到90％以上。

(6)将步骤(5)得到的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白纯品与冻干保护剂按照1∶1等体积混合后，经冷冻干燥，即可得到所述rhTSG6-PoIFNα融合蛋白成品，其规格为40μg/支(即每支rhTSG6-PoIFNα融合蛋白成品中含有rhTSG6-PoIFNα融合蛋白的量为40μg)；所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖的PBS混合液，三者在10mmol/L PBS缓冲液中的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例2

rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品的抗病毒活性效价测定

a.实验材料：

重组人干扰素α(rhIFN-α)标准品：其效价为15000IU/mL，作为已知阳性对照品，购自北京中国食品药品鉴定研究院，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素；

rhTSG6-PoIFNα融合蛋白成品：由实施例1制得，作为供试品；

细胞株：牛肾细胞(MDBK)，购自ATCC；

病毒株：攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)，由安徽医科大学临床病毒研究所惠赠。

b.实验方法

在无菌条件下操作，取rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品1支加入1mL注射用水溶解，接着再将其在试剂瓶中用含10％新生牛血清的DMEM细胞营养液稀释10⁵倍后加入96孔细胞培养板中继续进行二倍递增系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2孔。再取重组rhIFN-α标准品，按说明书复溶后，先用含10％新生牛血清的DMEM细胞营养液稀释至每毫升含100IU，再将其加入96孔细胞培养板中，做二倍递增系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。同时设置细胞对照组和病毒对照组。

将处于对数生长期的MDBK细胞即传代后24h已形成单层，镜下观察发现，细胞铺满单层，透明度高时，即可用于制备单细胞悬液。调整细胞数为5×10⁵/mL，按100μL/孔加入上述96孔板孔中，置37℃、5％CO₂电热恒温培养箱培养24h左右。观察到细胞长满了单层而且其生长状态良好时，弃去各孔内培养液，加入新鲜配制的含2％新生牛血清DMEM细胞维持液稀释VSV病毒悬液至每毫升为100TCID₅₀，按照每孔100μL量加到各孔中；但细胞对照组仅加入等量的维持液。然后置37℃、5％CO₂电热恒温培养箱内培养24h。

将电热恒温培养箱内的培养物置倒置显微镜下观察。首先观察“细胞对照孔”和“病毒对照孔”，各孔中出现的CPE用“+”表示。当病毒对照孔出现“+++或++++”，即病毒对照孔中的细胞出现75％～100％的明显病变和死亡脱落，而细胞对照孔中的细胞基本生长状态良好时，则表明本次试验对照系统合格，否则弃去重做。此时即可判定结果。加结晶紫染色液50μL/孔，3～5min后脱色即可记录结果，结晶紫染色结果如图6所示。

++++表示全部细胞病变；

+++表示75％细胞病变；

++表示50％细胞病变；

+表示25％细胞病变；

肉眼观察记录，板孔着色完整良好呈紫色全覆盖状态如细胞对照孔C，则判为CPE(–)；干扰素保护孔应有板孔结果呈紫色全覆盖状态(–)，100％病变细胞为细胞全脱落故无色，如病毒对照孔和无干扰素保护的板孔均无色，则判为CPE(++++)。

根据Reed-Munch公式计算

距离比＝(高于50％百分比–50％)/(高于50％百分比–低于50％百分比)

＝(90％–50％)/(90％–22.2％)＝0.59

稀释度的对数：lg(1/2)＝–0.3；

高于50％病变的细胞病变抑制率的稀释度的对数：lg(1/64)＝–1.81；

lg(抑制50％的细胞病变的最高稀释度)＝距离此例×稀释度对数+高于50％病变率的稀释度的对数+稀释倍数＝0.59×(–0.3)+(–1.81)+(–2.176)＝–4.163；

抑制50％的细胞病变的最高稀释度＝10^-4.163；

即此次干扰素标准品稀释到10^-4.163(1︰14554)时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”侵害。即rPoIFN-α-hTSG-6融合蛋白标准品的工作效价为1.63×10⁷U/mL。

工作单位修正：R1：R2＝X1：X2

如上所示：R1＝15000IU/mL，R2＝14554IU/mL，X2＝1.63×10⁷IU/mL；

R1：干扰素标准品的标准工作单位；R2：在相同条件下测定的干扰素标准品的工作单位；X2：待检rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品测定的工作单位；X1：修正后待检rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品的工作单位。

修正后所得效价：X1＝1.68×10⁷IU/mL即为最终rhTSG6-PoIFNα融合蛋白成品的效价标定结果。

从此实施例证实，本发明提供的rhTSG6-PoIFNα融合蛋白标准品能够明显抑制被VSV病毒感染的MDBK细胞发生细胞病变效应，未见到明显特征性CPE。因此，其具有作为抗病毒药物的活性效力进行应用。

实施例3

rhTSG6-PoIFNα在家兔血浆内半衰期测定

3.1、测定了在家兔血浆中rhTSG6-PoIFNα的半衰期。40μg/kg重组猪干扰素α(即rPoIFN-α)作为阳性对照品，将rhTSG6-PoIFNα以40μg/kg剂量肌肉注射家兔体内，然后在不同时间分别采集血液样品(1ml)。具体为：给药前1h，药后的第0.25h、1h、3h、4h、8h、10h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和第168h，于家兔耳缘静脉采血。血样采集后转移入含EDTA的EP管一起离心，上清液置-80℃冰箱中保藏。

3.2、采用2015版《中国药典》上的“细胞病变抑制法”测定家兔血液中rhTSG6-PoIFNα存留时间。横坐标为家兔体内各时间点采集的血浆，纵坐标为测试家兔体内rhTSG6-PoIFNα或rPoIFN-α抗病毒活性。

3.3、结果如图7所示，结果显示，rPoIFN-α的血液半衰期为3h～4h，而本发明的rhTSG6-PoIFNα的血液半衰期则为60h～72h。rhTSG6-PoIFNα半衰期明显比已知阳性对照品rPoIFN-α长68h，表明该重组蛋白在动物体内能够缓慢释放。rhTSG6-PoIFNα在动物体内显示出本发明具有明显的较长代谢周期。

实施例4

一种重组人TSG-6与人IFN-α融合蛋白(rhTSG6-hIFNα融合蛋白)的制备方法，包括以下步骤：

将如SEQUENCE LISTING 400〈11〉所示的重组人IFN-α基因经大肠埃希菌密码子偏爱性进行密码子优化得到如SEQUENCE LISTING 400〈12〉所示的优化后的重组人IFN-α基因，其编码的重组人IFN-α的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈13〉所示；

使用一段如SEQUENCE LISTING 400〈14〉所示的连接肽基因片段将如SEQUENCELISTING 400〈13〉所示的优化后的重组人IFN-α基因与如SEQUENCE LISTING 400〈7〉所示的优化后的重组人TSG-6基因进行连接，获得的连接后的基因如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示，其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。优化前融合蛋白基因的密码子适应指数(CAI)为0.65，优化后的CAI为0.98。

(2)将步骤(1)所得的rhTSG6-hIFNα融合蛋白基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至Roseeta-gami(DE3)pLysS大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取LB平板上单菌落进行PCR鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功，得到rhTSG6-hIFNα重组菌；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳第2～5号泳道在1266bp附近出现单一条带，如图8所示；

PCR鉴定引物为：

F1：GGATCCAGCCTGGGTAGCCGTCGTAC(BamHⅠ)；

R1：AAGCTTCAGATGGCTAAAGC(HindⅢ)。

(3)挑取rhTSG6-hIFNα重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养，后在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中放大培养2h～3h后，测OD值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mM IPTG，30℃诱导表达6h，收集菌体；经SDS-PAGE电泳分析，如图9所示，经IPTG诱导表达6h后的菌体蛋白在67.2kD处可见优势表达条带，表达量达到30％；经Western blot鉴定，如图11和图12所示，经IPTG诱导表达6h后的菌体蛋白分别能与鼠抗人IFN-α单克隆抗体和鼠抗人TSG-6单克隆抗体发生特异性反应，在67.2kD左右处出现特异性条带，且特异性高；

其中Western blot鉴定方法为：分别以Abcam公司鼠抗人IFN-α单克隆抗体为一抗(1：2000稀释)和R&D公司鼠抗人TSG-6单克隆抗体(1：2000稀释)，以中杉金桥公司HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗(1：50000稀释)。

(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200mL的PBS重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀。超声破碎的条件为：功率：400W，工作3S，间隔3S。超声破碎6min，重复3～4次；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过洗涤、变性和复性。复性产物即为rhTSG6-hIFNα融合蛋白粗制品。分别取沉淀和上清及菌体经SDS-PAGE电泳检测，如图10所示。经SDS-PAGE电泳分析，该重组蛋白为包涵体表达。

所述洗涤、变性和复性的方法为：

②变性：称量洗涤后沉淀湿重(5.0g)，再用溶解缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，7mol/L盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，pH为8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(250ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；

(5)rhTSG6-hIFNα融合蛋白粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱，用Elutionbuffer(50mMTris-Cl、500mM咪唑pH 8.0)梯度洗脱，收集显示出rhTSG6-hIFNα融合蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节pH至5.0，使用1M NaCl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为rhTSG6-hIFNα融合蛋白纯品，经SDS-PAGE检测，结果如图13所示，从图中可以看出制备的目的蛋白纯度达到90％以上。

(6)将步骤(5)得到的rhTSG6-hIFNα融合蛋白纯品与冻干保护剂按照1∶1等体积混合后，经冷冻干燥，即可得到所述rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品，其规格为40μg/支(即每支rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品中含有rhTSG6-hIFNα融合蛋白的量为40μg)；所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖的PBS混合液，三者在10mmol/L PBS缓冲液中的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例5

采用与实施例2同样的方法及步骤测定rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品抗病毒活性效价，其结晶紫染色结果如图14所示。

++++表示全部细胞病变；

+++表示75％细胞病变；

++表示50％细胞病变；

+表示25％细胞病变；

肉眼观察记录，板孔着色完整良好呈紫色全覆盖状态如细胞对照孔C，则判为CPE(-)；干扰素保护孔应有板孔结果呈紫色全覆盖状态(-)，100％病变细胞为细胞全脱落故无色，如病毒对照孔和无干扰素保护的板孔均无色，则判为CPE(++++)。

根据Reed-Munch公式计算

＝(75％–50％)/(75％–12.5％)＝0.40

稀释度的对数：lg(1/2)＝–0.30；

高于50％病变的细胞病变抑制率的稀释度的对数：lg(1/32)＝–1.51；

lg(抑制50％的细胞病变的最高稀释度)＝距离此例×稀释度对数+高于50％病变率的稀释度的对数+稀释倍数＝0.40×(–0.30)+(–1.51)+(–2.176)＝–4.106；

抑制50％的细胞病变的最高稀释度＝10^-4.106；

即此次干扰素标准品稀释到10^-4.106(1︰12764)时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”侵害。即rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品的工作效价为3.85×10⁶U/mL。

工作单位修正：R1：R2＝X1：X2

如上所示：R1＝15000IU/mL，R2＝12764U/mL，X2＝3.85×10⁶IU/mL；

R1：干扰素标准品的标准工作单位；R2：在相同条件下测定的干扰素标准品的工作单位；X2：待检rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品测定的工作单位；X1：修正后待检rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品的工作单位。

修正后所得效价：X1＝4.52×10⁶IU/mL即为最终rhTSG6-hIFNα融合蛋白成品效价标定结果。

从此实施例证实，本发明提供的rhTSG6-IFNα融合蛋白标准品能够明显抑制被VSV病毒感染的MDBK细胞发生细胞病变效应，未见到明显特征性CPE。因此，其具有作为抗病毒药物的活性效力可以实施应用。

实施例6

rhTSG6-hIFNα在家兔血浆内半衰期测定

3.1、测定了在家兔血浆中rhTSG6-hIFNα的半衰期。40μg/kg的重组人干扰素α(即rhIFN-α)作为已知阳性对照品，rhTSG6-hIFNα以40μg/kg剂量肌肉注射家兔体内，然后在不同时间分别采集血液样品(1ml)。具体为：给药前1h，药后的第0.25h、1h、3h、4h、8h、10h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和第168h，于家兔耳缘静脉采血。血样采集后转移入含EDTA的EP管一起离心，上清液置-80℃冰箱中保藏。

3.2、采用2015版《中国药典》上的“细胞病变抑制法”测定家兔血液中rhTSG6-hIFNα存留时间。横坐标为家兔体内各时间点采集的血浆，纵坐标为测试家兔体内rhTSG6-hIFNα或rhIFN-α抗病毒活性。

3.3、结果如图15所示，结果显示，rhIFN-α的血液半衰期为3h～4h，而本发明的rhTSG6-hIFNα的血液半衰期则为60h～72h。rhTSG6-hIFNα半衰期明显比rhIFN-α长68h，表明该重组蛋白在动物体内能够缓慢释放。rhTSG6-hIFNα在动物体内显示出本发明具有明显的较长代谢周期。

上述参照实施例对重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 芜湖天明生物技术有限公司

<120> 重组人TSG6-IFNα融合蛋白及其制备方法以及其作为抗病毒药物的应用

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 重组人TSG-6-猪IFN-α融合蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

20 25 30

Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser

65 70 75 80

Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

100 105 110

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val

130 135 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp

145 150 155 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

165 170 175

Gly Gly Gly Gly Ser Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser

180 185 190

Ile Trp Leu Glu Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser

195 200 205

Gly Lys Tyr Lys Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe

210 215 220

Glu Gly Gly His Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys

225 230 235 240

Ile Gly Phe His Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val

245 250 255

Gly Tyr Pro Ile Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr

260 265 270

Gly Ile Ile Asp Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp

275 280 285

Ala Tyr Cys Tyr Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr

290 295 300

Asp Pro Lys Gln Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu

305 310 315 320

Asp Asn Gln Ile Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg

325 330 335

Ile His Leu Ser Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys

340 345 350

Leu Ala Asp Tyr Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly

355 360 365

Phe Val Gly Arg Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser

370 375 380

Thr Gly Asn Val Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr

385 390 395 400

Ala Gly Gly Phe Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys

405 410 415

Ser Ser Gln Gly Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn

420 425 430

Phe Leu Ala Gly Arg Phe Ser His Leu

435 440

<210> 2

<211> 422

<212> PRT

<213> 重组人TSG-6-人IFN-α融合蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys

1 5 10 15

Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro

20 25 30

Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val

35 40 45

Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp

50 55 60

Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu

65 70 75 80

Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val

85 90 95

Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

115 120 125

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe

130 135 140

Ser Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu

165 170 175

Glu Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr

180 185 190

Lys Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly

195 200 205

His Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe

210 215 220

His Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro

225 230 235 240

Ile Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile

245 250 255

Asp Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys

260 265 270

Tyr Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys

275 280 285

Gln Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln

290 295 300

Ile Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu

305 310 315 320

Ser Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp

325 330 335

Tyr Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly

340 345 350

Arg Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn

355 360 365

Val Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly

370 375 380

Phe Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln

385 390 395 400

Gly Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala

405 410 415

Gly Arg Phe Ser His Leu

420

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> 重组人TSG-6-猪IFN-α融合蛋白的基因序列

<400> 3

tgtgatctgc cgcagaccca tagcctggcc catacccgtg ccctgcgtct gctggcacag 60

atgcgtcgca ttagcccgtt tagctgtctg gatcatcgcc gcgattttgg ttttccgcag 120

gaagccctgg gtggtaatca ggtgcagaaa gcccaggcca tggccctggt tcatgaaatg 180

ctgcagcaga cctttcagct gtttagtacc gaaggtagcg ccgccgcctg ggatgaaagt 240

ctgctgcatc agttttgtac cggtctggat cagcagctgc gtgatctgga agcatgcgtt 300

atgcaggaag ccggcctgga aggtaccccg ctgctggaag aagatagtat tctggccgtt 360

cgtaaatatt ttcatcgcct gaccctgtat ctgcaggaaa aaagttatag cccgtgtgca 420

tgggaaattg ttcgcgcaga agtgatgcgt gcattttcaa gcagcaccaa tctgcaggat 480

cgcctgcgta aaaaagaagg cggtggcggt agcggtggcg gcggtagcgg cggtggtggt 540

agttggggct ttaaagatgg tatttttcat aatagcatct ggctggaacg tgcagcaggt 600

gtttatcatc gcgaagcccg cagcggtaaa tataaactga cctatgcaga agcaaaagca 660

gtttgtgaat ttgaaggcgg ccatctggcc acctataaac agctggaagc agcacgtaaa 720

attggttttc atgtgtgcgc agccggttgg atggccaaag gccgtgttgg ctatccgatt 780

gtgaaaccgg gtccgaattg cggctttggt aaaaccggca ttattgatta tggcattcgc 840

ctgaatcgta gcgaacgttg ggatgcatat tgttataatc cgcatgccaa agaatgcggc 900

ggtgttttta ccgatccgaa acagattttt aaaagcccgg gttttccgaa tgaatatgaa 960

gataatcaga tctgttactg gcatattcgc ctgaaatatg gccagcgtat tcatctgagt 1020

tttctggatt ttgatctgga agatgatccg ggctgtctgg cagattatgt tgaaatctat 1080

gatagctatg acgatgtgca tggctttgtt ggccgttatt gtggtgacga actgccggat 1140

gatattatta gtaccggtaa tgttatgacc ctgaaatttc tgagcgatgc cagtgttacc 1200

gccggcggct ttcagattaa gtatgtggcc atggaccctg ttagcaaaag cagccagggc 1260

aaaaatacca gcaccaccag caccggcaat aagaattttc tggcaggtcg ctttagccat 1320

ctg 1323

<210> 4

<211> 1266

<212> DNA

<213> 重组人TSG-6-人IFN-α融合蛋白的基因序列

<400> 4

agcctgggta gccgtcgtac cctgatgctg ctggcacaga tgcgtaaaat tagcctgttt 60

agctgtctga aagatcgcca tgattttggt tttccgcaag aagaatttgg caaccagttt 120

cagaaagcag aaaccattcc ggttctgcat gaaatgattc agcagatctt taacctgttc 180

agcaccaaag atagcagcgc agcatgggat gaaaccctgc tggataaatt ctataccgaa 240

ctgtatcagc agctgaatga tctggaagca tgtgttattc aaggtgttgg tgttaccgaa 300

acaccgctga tgaaagaaga tagcattctg gcagttcgca aatatttcca gcgtattacc 360

ctgtatctga aagagaaaaa atacagcccg tgtgcatggg aagttgttcg tgcagaaatt 420

atgcgtagct ttagcctgag cggcggtggc ggtagcggtg gcggcggtag cggcggtggt 480

ggtagttggg gttttaaaga tggcattttt cataatagca tctggctgga acgcgccgcc 540

ggcgtttatc atcgtgaagc ccgtagtggc aaatataaac tgacctatgc agaagccaaa 600

gcagtgtgcg aatttgaagg cggtcatctg gcaacctata aacagctgga agcagcccgt 660

aaaattggct ttcatgtgtg cgcagccggt tggatggcca aaggtcgcgt gggctatccg 720

attgtgaaac cgggcccgaa ttgcggtttt ggcaaaaccg gtattattga ttatggtatt 780

cgtctgaatc gtagtgaacg ttgggatgcc tattgttata atccgcatgc aaaagaatgc 840

ggtggcgttt ttaccgatcc gaaacagatt tttaaaagcc cgggctttcc gaatgaatat 900

gaagataatc agatctgcta ctggcatatt cgtctgaaat atggtcagcg cattcatctg 960

agttttctgg attttgatct ggaagatgat ccgggctgcc tggcagatta tgttgaaatc 1020

tatgatagct atgacgatgt tcatggtttt gtgggtcgct attgtggtga cgaactgccg 1080

gatgatatta ttagtaccgg caatgtgatg accctgaaat ttctgagtga tgccagcgtg 1140

accgcaggcg gttttcagat taagtatgtt gcaatggacc ctgtgagcaa aagcagccag 1200

ggcaaaaata ccagtaccac cagtaccggt aataagaatt ttctggccgg tcgctttagt 1260

catctg 1266

<210> 5

<211> 780

<212> DNA

<213> 优化前人TSG-6基因

<400> 5

tggggattca aggatggaat ttttcataac tccatatggc ttgaacgagc agccggtgtg 60

taccacagag aagcacggtc tggcaaatac aagctcacct acgcagaagc taaggcggtg 120

tgtgaatttg aaggcggcca tctcgcaact tacaagcagc tagaggcagc cagaaaaatt 180

ggatttcatg tctgtgctgc tggatggatg gctaagggca gagttggata ccccattgtg 240

aagccagggc ccaactgtgg atttggaaaa actggcatta ttgattatgg aatccgtctc 300

aataggagtg aaagatggga tgcctattgc tacaacccac acgcaaagga gtgtggtggc 360

gtctttacag atccaaagca aatttttaaa tctccaggct tcccaaatga gtacgaagat 420

aaccaaatct gctactggca cattagactc aagtatggtc agcgtattca cctgagtttt 480

ttagattttg accttgaaga tgacccaggt tgcttggctg attatgttga aatatatgac 540

agttacgatg atgtccatgg ctttgtggga agatactgtg gagatgagct tccagatgac 600

atcatcagta caggaaatgt catgaccttg aagtttctaa gtgatgcttc agtgacagct 660

ggaggtttcc aaatcaaata tgttgcaatg gatcctgtat ccaaatccag tcaaggaaaa 720

aatacaagta ctacttctac tggaaataaa aactttttag ctggaagatt tagccactta 780

<210> 6

<211> 780

<212> DNA

<213> 优化后人TSG-6基因

<400> 6

tggggcttta aagatggtat ttttcataat agcatctggc tggaacgtgc agcaggtgtt 60

tatcatcgcg aagcccgcag cggtaaatat aaactgacct atgcagaagc aaaagcagtt 120

tgtgaatttg aaggcggcca tctggccacc tataaacagc tggaagcagc acgtaaaatt 180

ggttttcatg tgtgcgcagc cggttggatg gccaaaggcc gtgttggcta tccgattgtg 240

aaaccgggtc cgaattgcgg ctttggtaaa accggcatta ttgattatgg cattcgcctg 300

aatcgtagcg aacgttggga tgcatattgt tataatccgc atgccaaaga atgcggcggt 360

gtttttaccg atccgaaaca gatttttaaa agcccgggtt ttccgaatga atatgaagat 420

aatcagatct gttactggca tattcgcctg aaatatggcc agcgtattca tctgagtttt 480

ctggattttg atctggaaga tgatccgggc tgtctggcag attatgttga aatctatgat 540

agctatgacg atgtgcatgg ctttgttggc cgttattgtg gtgacgaact gccggatgat 600

attattagta ccggtaatgt tatgaccctg aaatttctga gcgatgccag tgttaccgcc 660

ggcggctttc agattaagta tgtggccatg gaccctgtta gcaaaagcag ccagggcaaa 720

aataccagca ccaccagcac cggcaataag aattttctgg caggtcgctt tagccatctg 780

<210> 7

<211> 260

<212> PRT

<213> 人TSG-6的氨基酸序列

<400> 7

Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu

20 25 30

Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu

35 40 45

Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val

50 55 60

Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val

65 70 75 80

Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr

85 90 95

Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn

100 105 110

Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln Ile

115 120 125

Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile Cys

130 135 140

Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe

145 150 155 160

Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr

180 185 190

Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met

195 200 205

Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Gln

210 215 220

Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly Lys

225 230 235 240

Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly Arg

245 250 255

Phe Ser His Leu

260

<210> 8

<211> 498

<212> DNA

<213> 优化前的重组猪IFN-α基因

<400> 8

tgcgacctgc ctcagaccca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctccccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg attcccccaa 120

gaggccttgg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180

ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg ggatgagagc 240

ctcctgcacc agttctgcac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300

atgcaggagg ccgggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420

tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga gccttctctt cctccacaaa cctgcaagac 480

agactcagga agaaggag 498

<210> 9

<211> 498

<212> DNA

<213> 优化后的重组猪IFN-α基因

<400> 9

tgtgatctgc cgcagaccca tagcctggcc catacccgtg ccctgcgtct gctggcacag 60

atgcgtcgca ttagcccgtt tagctgtctg gatcatcgcc gcgattttgg ttttccgcag 120

gaagccctgg gtggtaatca ggtgcagaaa gcccaggcca tggccctggt tcatgaaatg 180

ctgcagcaga cctttcagct gtttagtacc gaaggtagcg ccgccgcctg ggatgaaagt 240

ctgctgcatc agttttgtac cggtctggat cagcagctgc gtgatctgga agcatgcgtt 300

atgcaggaag ccggcctgga aggtaccccg ctgctggaag aagatagtat tctggccgtt 360

cgtaaatatt ttcatcgcct gaccctgtat ctgcaggaaa aaagttatag cccgtgtgca 420

tgggaaattg ttcgcgcaga agtgatgcgt gcattttcaa gcagcaccaa tctgcaggat 480

cgcctgcgta aaaaagaa 498

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> 重组猪IFN-α的氨基酸序列

<400> 10

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His

20 25 30

Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser

65 70 75 80

Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu

100 105 110

Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val

130 135 140

Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp

145 150 155 160

Arg Leu Arg Lys Lys Glu

165

<210> 11

<211> 441

<212> DNA

<213> 优化前的重组人IFN-α基因

<400> 11

agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc ctggcacaga tgaggaaaat ctctcttttc 60

tcctgcttga aggacagaca tgactttgga tttccccagg aggagtttgg caaccagttc 120

caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat gagatgatcc agcagatctt caatctcttc 180

agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa 240

ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag 300

actcccctga tgaaggagga ctccattctg gctgtgagga aatacttcca aagaatcact 360

ctctatctga aagagaagaa atacagccct tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc 420

atgagatctt tttctttgtc a 441

<210> 12

<211> 441

<212> DNA

<213> 优化后的重组人IFN-α基因

<400> 12

agcctgggta gccgtcgtac cctgatgctg ctggcacaga tgcgtaaaat tagcctgttt 60

agctgtctga aagatcgcca tgattttggt tttccgcaag aagaatttgg caaccagttt 120

cagaaagcag aaaccattcc ggttctgcat gaaatgattc agcagatctt taacctgttc 180

agcaccaaag atagcagcgc agcatgggat gaaaccctgc tggataaatt ctataccgaa 240

ctgtatcagc agctgaatga tctggaagca tgtgttattc aaggtgttgg tgttaccgaa 300

acaccgctga tgaaagaaga tagcattctg gcagttcgca aatatttcca gcgtattacc 360

ctgtatctga aagagaaaaa atacagcccg tgtgcatggg aagttgttcg tgcagaaatt 420

atgcgtagct ttagcctgag c 441

<210> 13

<211> 147

<212> PRT

<213> 重组人IFN-α的氨基酸序列

<400> 13

Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys

1 5 10 15

Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro

20 25 30

Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val

35 40 45

Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp

50 55 60

Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu

65 70 75 80

Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val

85 90 95

Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

115 120 125

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe

130 135 140

Ser Leu Ser

145

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 连接肽基因片段

<400> 14

ggcggtggcg gtagcggtgg cggcggtagc ggcggtggtg gtagt 45

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 连接肽氨基酸序列

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1.一种重组人TSG6-IFNα融合蛋白(rhTSG6-IFNα融合蛋白)，其特征在于，所述IFNα可以为人IFN-α、猪IFN-α、犬IFN-α、猫IFN-α、牛IFN-α、马IFN-α、羊IFN-α、禽IFN-α或者水生动物IFN-α；

其中，重组人TSG-6-猪IFN-α融合蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；

重组人TSG-6-人IFN-α融合蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

2.编码如权利要求1所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白的基因，其特征在于，编码所述重组人TSG-6-猪IFN-α的融合蛋白的基因的序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示；编码所述重组人TSG-6-人IFN-α融合蛋白的基因的序列如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示。

3.如权利要求2所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于：将如SEQUENCELISTING 400〈9〉所示的重组猪IFN-α基因或如SEQUENCE LISTING 400〈12〉所示重组人IFN-α基因，通过连接肽基因片段连接至如SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示的重组人TSG-6基因。

4.根据权利要求3所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于：所述连接肽基因片段如SEQUENCE LISTING 400〈14〉所示。

5.含有如权利要求2所述的基因的表达载体。

6.含有如权利要求5所述的表达载体的细胞。

7.如权利要求1所述的重组人TSG6-IFNα融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将权利要求2所述的基因亚克隆至pET-32a表达载体中，并转化至Rosetta-gami(DE3)pLysS大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组菌；

(3)将步骤(2)收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到rhTSG6-IFNα融合蛋白粗制品；

(4)粗制品经分离纯化后，再与冻干保护剂混合，经冷冻干燥，即可得到所述rhTSG6-IFNα融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述分离纯化的方法为：将粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱纯化，再经透析处理，然后调节pH至5.0；再经阴离子交换层析柱纯化，即可得到蛋白纯品。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述冻干保护剂为终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL组成的PBS混合液。

10.如权利要求1所述的rhTSG6-IFNα融合蛋白作为抗病毒药物的应用。