CN114853911A

CN114853911A - 三叶因子2/干扰素α2融合蛋白及其防治病毒感染性疾病的应用

Info

Publication number: CN114853911A
Application number: CN202210567298.9A
Authority: CN
Inventors: 徐建青; 张晓燕; 翟贯星
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114853911B

Abstract

本公开提供了三叶因子2/干扰素α2融合蛋白及其防治病毒感染性疾病的应用。具体而言，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：含三叶因子2(TFF2)肽的TFF2元件，以及与TFF2元件融合的、含干扰素α2(IFNα2)肽的IFNα2元件。本公开还提供了此类融合蛋白在预防和/或治疗病毒感染性疾病(例如急性呼吸道/肠道病毒感染)中的应用。

Description

三叶因子2/干扰素α2融合蛋白及其防治病毒感染性疾病的应用

技术领域

本申请属于生物医学技术领域，具体涉及三叶因子2(TFF2)与干扰素α2 (IFNα2)的融合蛋白、及其制备和在治疗及预防病毒感染疾病方面的应用。

背景技术

病毒感染对于人类和哺乳动物生命和健康造成了极大危害，其中呼吸道病毒感染与肠道病毒感染是最常见的急性病毒感染。

肠道病毒是一类与人类和哺乳动物疾病相关的正义单链RNA病毒，其通过肠道进行传播。肠道病毒每年影响全世界数百万人，通常存在于感染者的呼吸道分泌物(例如唾液、痰或鼻粘液)和粪便中。感染可导致多种症状，包括：轻度呼吸道疾病(普通感冒)、手足口病、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、严重新生儿败血症样疾病、急性弛缓性麻痹、和相关的急性弛缓性脊髓炎。

呼吸道与肠道病毒均为粘膜感染病毒。尽管不同病毒的特性和感染方式不完全一致，然而其共性致病机制依然有迹可循：一方面病毒直接感染造成靶细胞凋亡或坏死、损害正常粘膜的结构和功能；另一方面病毒通过调控宿主免疫反应，抑制I型干扰素产生及其信号转导通路，大量诱导炎症细胞因子与趋化因子分泌，产生炎症风暴，招募大量免疫细胞浸润到粘膜组织，严重破坏粘膜结构，导致粘膜损伤、炎症渗出等，最终导致宿主致病或致死。因此，针对呼吸道与肠道病毒感染的共性致病机制，需要在限制病毒复制的同时，抑制炎症风暴，促进粘膜损伤修复，以达到改善患者预后的目的。

目前，针对病毒感染所诱导的炎症反应，常见的抑炎药物是糖皮质激素，其是一类类固醇激素。糖皮质激素是免疫系统反馈机制的一部分，可降低免疫功能的某些方面，由此可有效抑炎。然而，其副作用也很明显，目前使用的糖皮质激素药物具有非选择性作用，会损害许多健康的合成代谢过程。长期服用该药物的副作用包括：医源性肾上腺皮质机能亢进症，诱发或加重感染或使体内潜在的感染病灶转移，造成消化性溃疡，诱发胰腺炎和脂肪肝，医源性肾上腺皮质功能不全，诱发精神分裂症和癫痫，股骨头坏死等。

干扰素作为抗病毒药物，单独或与其他疗法联合使用已在各种病毒感染中被广泛应用，其对目前已知的许多病毒均有抑制作用。IFNα2作为一种经典抗病毒药物，在临床上已经被广泛应用，其α-2b喷雾剂在治疗儿童急性上呼吸道感染中，疗效显著，能有效改善患儿临床症状和体征(陈青等，重组人干扰素α-2b喷雾剂治疗儿童急性上呼吸道感染疗效分析，生物医学工程与临床. 2019,23(04))；α-2b喷雾剂以低剂量20μg联合奥司他韦治疗甲型流感，可下调细胞炎症因子水平，提高病毒转阴率，促进症状改善，并且安全性高(许光锋，重组人干扰素α-2b喷雾剂联合奥司他韦治疗甲型流感的疗效评价，山西卫生健康职业学院学报.2020,30(04))。动物实验和临床研究都表明IFNα2与利巴韦林联用可有效抑制MERS-CoV的复制、改善MERS症状和临床结果。在 2003的SARS治疗方案和最新版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中，均推荐使用IFNα2治疗(成人每次500万U或相当剂量，加入灭菌注射用水2mL，每日2次，雾化吸入，疗程不超过10天)。Anuja Pandit在2020 年进行了聚乙二醇干扰素α-2b(PEG IFN-α2b)在中度COVID-19中的II期研究评估其疗效与安全性。单剂量1μg/kg的PEG IFN-α2b皮下给药+标准治疗相比标准治疗能减少病毒消失的持续时间，显着改善临床结果(Anuja Pandit， Efficacy and safety of pegylatedinterferon alfa-2b in moderate COVID-19:A phase II,randomized,controlled,open-label study，Int J Infect Dis.202104；105:516-521)。

TFF2作为胃肠道分泌的小分子多肽，能参与黏膜修复，虽然它在炎症过程中过度表达，但添加TFF2会产生降炎作用，有助于创造组织修复所需的微环境，促进组织修复(Abdelaziz Ghanemi等，Trefoil factor family member 2 (TFF2)as an inflammatory-induced and anti-inflammatory tissue repair factor，Animals(Basel).2020Sep 14；10(9):1646.)。在前期研究中，我们发现一种宿主分泌肽TFF2能通过抑制炎症反应，减轻病理损伤，促进肺组织损伤修复，发挥保护效果，改善流感病毒感染的预后(CN105582526B)。我们将TFF2与I型干扰素κ(IFN-k)联用，采用雾化吸入的方式治疗中度新冠肺炎患者，结果表明这种组合治疗能够显著缩短 COVID-19患者的核酸阴转时间，提升核酸转阴患者的比例，加快患者的CT 好转，减少患者的住院时间。同时，接受治疗的患者血浆中的炎症细胞因子水平快速下降(EClinicalMedicine 2020:100478/100547；中国专利申请号：202010239633.3)。

在人类与病毒感染的长期斗争中，仍然迫切需要开发出更安全有效防治病毒感染的药物和方法。

发明内容

本公开中正是提供了一种能够更安全有效用于病毒感染的预防和/或治疗的有效活性物质、其在制药中的应用和防治疾病的方法。

在本公开的一个方面中，提供了一种融合蛋白，其包含一个或多个融合单元，每个融合单元包括：

(a)三叶因子2(TFF2)元件，所述TFF2元件包含TFF2肽或其活性片段；

(b)干扰素α2(IFNα2)元件，所述IFNα2元件包含IFNα2肽或其活性片段，

其中，所述TFF2元件和IFNα2元件以1:1的分子比融合，且在各融合单元中所述TFF2元件位于所述IFNα2元件的N端。

在一些实施方式中，TFF2肽或其活性片段来源于人、灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、犬、猫。

在一些实施方式中，TFF2肽或其活性片段包含选自下组的氨基酸序列： SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:12、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性且具有TFF2活性的氨基酸序列)。

在一些实施方式中，TFF2肽或其活性片段由包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子编码：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性且能够编码活性TFF2肽的核酸分子)。

在一些实施方式中，IFNα2肽或其活性片段来源于人、灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、犬、猫。

在一些实施方式中，IFNα2肽或其活性片段包含选自下组的氨基酸序列： SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性且具有IFNα2活性的氨基酸序列)。

在一些实施方式中，IFNα2肽或其活性片段由包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子编码：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13具有至少80％序列同一性且能够编码活性IFNα2肽的核酸分子)。

在一些实施方式中，融合蛋白还包含连接TFF2元件和IFNα2元件和/或元件中组成肽段的接头。

在一些实施方式中，接头为包含n个氨基酸残基的柔性接头，n为2～300 的整数。

在一些实施方式中，接头是甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸接头。在一些实施方式中，接头选自G_n、(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n或(GGGGGS)_n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。

在一些实施方式中，融合蛋白包含一个或多个连续或间隔排列的TFF2肽和/或一个或多个连续或间隔排列的IFNα2肽。

在一些实施方式中，融合蛋白还包含Fc区，所述Fc区不含突变。在一些实施方式中，融合蛋白包含一个或多个降低抗体介导的ADCC和CDC活性的突变。在一些实施方式中，融合蛋白包含根据EU编号方式的氨基酸突变D265A 和N297G。

在一些实施方式中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方式中，融合蛋白中的信号肽选自tPA2信号肽、TFF2信号肽、IL-2信号肽、bPRL信号肽、 CD33信号肽。

在一些实施方式中，融合蛋白还包含标记物，例如用于纯化、检测、定位的标记物，如选自荧光标记物、非放射性核素标记物、生物素类标记物、磷酸化修饰标记、肽标签。

在一些实施方式中，融合蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方式中，融合蛋白由具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子或与所述序列具有至少80％的序列同一性的核酸分子编码。

在本公开的一些方面中，提供了一种分离的核酸分子或包含所述核酸分子的构建体或载体，其中，所述核酸分子编码本公开的融合蛋白。在一些实施方式中，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与所述序列具有至少 80％的序列同一性。在一些实施方式中，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO:2 的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一些实施方式中，载体选自病毒载体、mRNA载体、DNA载体。

在本公开的一些方面中，提供了一种细胞，其包含如权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白、或如权利要求8或9所述的核酸分子、构建体或载体。

在本公开的一些方面中，提供了一种组合物，其包含本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体和/或细胞；以及载剂。

在本公开的一些方面中，提供了本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞和/或组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病中的应用。

在本公开的一些方面中，提供了一种预防和/或治疗病毒感染性疾病的方法，所述方法包括给予有需要的对象预防或治疗有效量的本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物或包含前述物质的药物。

在本公开的一些方面中，提供了本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物，其用于预防和/或治疗病毒感染性疾病。

在一些实施方式中，病毒感染性疾病选自急性病毒感染，例如呼吸道病毒感染和肠道病毒感染。

在一些实施方式中，病毒感染性疾病由选自下组的一种或多种病毒引起：冠状病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒。

在一些实施方式中，本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物作为预防性药物在病毒感染发生前预防性给药以预防病毒感染发生或降低后续病毒感染的严重程度。

在一些实施方式中，本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物作为治疗性药物在病毒感染发生后给药以降低病毒感染与疾病的严重程度。

在一些实施方式中，本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物既作为预防性药物，也作为治疗性药物，在病毒感染发生之前和之后连续或间隔给药。

在一些实施方式中，本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物的形式适于选自下组的给药方式：呼吸道雾化吸入、滴鼻、喷雾、口服、肌注和/或静脉给药。

在一些实施方式中，本公开的融合蛋白、核酸分子、构建体、载体、细胞、组合物和/或药物适于单独使用或与其他抗病毒药物、免疫药物或病毒疗法联合使用。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：融合蛋白表达载体的构建以及体外表达：

图1A：TFF2与IFNα2融合蛋白真核表达载体pSV1.0 IFNα2-TFF2-Fc、 pSV1.0TFF2-IFNα2-Fc和pSV1.0 2xTFF2-IFNα2-Fc的构建图谱；

图1B：不同信号肽的TFF2与IFNα2融合蛋白在293F悬浮细胞系中及 CHO-K1细胞中的表达，其中Blank为对照细胞，Cell为细胞，Sup为上清液，信号肽分别为TFF2、IL-2信号肽、tPA2信号肽。

图2：TFF2与IFNα2的融合蛋白的验证及其对病毒蛋白表达和复制的影响。

图2A：TFF2与IFNα2的融合蛋白在纯化后在聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)上的验证；

图2B&2C：TFF2与IFNα2融合蛋白在肺上皮细胞系A549中对干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)蛋白的表达的影响；

图2D&2E：TFF2与IFNα2融合蛋白对流感病毒PR8在体外肺上皮细胞系A549中复制的影响。

图3：TFF2与IFNα2融合蛋白对病毒诱导的炎症相关因子表达的影响。

图3A：TFF2与IFNα2融合蛋白对PR8诱导的COX-2的表达的影响；

图3B：TFF2与IFNα2融合蛋白对PR8引起的IL-6的表达的影响；

图3C：TFF2与IFNα2融合蛋白对LPS诱导体外肺上皮细胞系A549中 iNOS表达的影响。

***表示p<0.001。

图4：TFF2-IFNα2-Fc、IFNα2-TFF2-Fc对流感病毒攻毒动物的保护作用。

图4A：TFF2-IFNα2-Fc、IFNα2-TFF2-Fc流感病毒的攻毒及给药模型；

图4B：PR8感染后小鼠的生存率曲线与体重变化曲线(TFF2-IFNα2-Fc)；

图4C：PR8感染后小鼠的生存率曲线与体重变化曲线(IFNα2-TFF2-Fc)；

图4D：TFF2-IFNα2-Fc、2xTFF2-IFNα2-Fc流感病毒的攻毒及给药模型；

图4E：PR8感染后小鼠的生存率曲线(TFF2-IFNα2-Fc、 2xTFF2-IFNα2-Fc)；

图4F：PR8感染后小鼠的体重变化曲线(TFF2-IFNα2-Fc、 2xTFF2-IFNα2-Fc)。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，构建了各种形式的TFF2与IFNα2融合蛋白，通过对单独TFF2或IFNα2多肽和各种融合蛋白的抗病毒、降低炎症、动物保护效果等功能的测试、比较和筛选，克服各种技术难度，获得了具有正确结构、优异效果的特定融合蛋白形式。由此，本公开中提供了具有特定结构和配比的TFF2与IFNα2融合蛋白，并验证了其对病毒感染性疾病的优异预防和治疗效果。本申请的融合蛋白既具有优异的抗病毒效果，又具有抑制过度炎症的效果，其效果显著优于单独使用TFF2或IFNα2，具有协同效果，且也显著优于其他结构和配比的TFF2和IFNα2融合蛋白。

具体而言，本公开中将TFF2多肽与IFNα2多肽以多种形式融合表达，通过体外实验验证了融合蛋白的成功表达，并测试了TFF2与IFNα2融合蛋白对流感病毒复制的抑制作用，以及对炎性因子分泌的降低作用。小鼠流感感染模型中进一步研究发现雾化吸入TFF2与IFNα2融合蛋白能提高流感感染小鼠的生存率，减少小鼠体重丢失。而在所构建的多种融合蛋白中，所含TFF2多肽和IFNα2多肽以1:1的分子比融合且TFF2多肽位于IFNα2的N端的融合蛋白具有最为优异的效果。测试结果表明，该特定类型融合蛋白的抗病毒、抑制过度炎症的体内外效果显著优于单独使用TFF2或IFNα2，具有协同效果，且也显著优于其他结构和配比的TFF2和IFNα2融合蛋白。

更具体而言，为了开发新型抗病毒药物并验证其在抗病毒感染防治中的效果，发明人构建了真核表达载体pSV1.0 IFNα2-TFF2-Fc、pSV1.0 TFF2-IFNα2-Fc 和pSV1.02xTFF2-IFNα2-Fc，在293T中对其进行表达，采用Western Blot验证融合蛋白的表达，并在293F细胞中表达，收集上清，然后采用

pure 进行纯化，考马斯亮蓝对纯化的蛋白纯度进行鉴定，并通过BCA测定蛋白浓度。在体外细胞实验中Western blot检测了TFF2与IFNα2融合蛋白对流感病毒PR8在体外肺上皮细胞系A549中复制的影响，证明了融合蛋白能够降低病毒的复制。

对流感病毒H1N1毒株PR8毒株感染小鼠，观察PR8感染后小鼠体重变化和生存率。发现TFF2与IFNα2融合蛋白处理组能显著提高小鼠的生存率，减少体重丢失，改善高致病性流感感染的症状。在此基础上，我们进行了TFF2 与IFNα2融合蛋白的预防实验，进一步验证其对流感病毒H1N1毒株PR8毒株攻毒的预防及保护效果。这些结果充分证明TFF2与IFNα2融合蛋白在呼吸道病毒或其他因素诱导的急性病毒感染损伤模型中发挥了重要的保护作用。

由于其他的急性病毒感染引起的组织损伤的机理与流感病毒感染类似，因此TFF2与IFNα2融合蛋白的保护作用并不局限于流感病毒造成的呼吸道组织损伤，包括其他急性病毒感染引起的呼吸道损伤，以及肠道病毒等引发急性症状的肠道疾病。并且，对参与急性病毒感染疫情处理的疾控人员、高风险人群的进行预防性给药，可有效降低上述人员的风险以及受到的损害。

综上，本申请是在前期研究基础上进一步改进和优化，通过将TFF2与 IFNα2以特定形式融合，能够同时发挥多分子、多功能的作用，效果显著优于分别给予单一药物。通过融合形成单一分子既能够发挥多功能的作用，也能够降低多蛋白组合的复杂性，提升疗效，能够发挥抗病毒与降低炎症的双重作用。通过单一分子的TFF2与IFNα2的融合蛋白，解析该融合蛋白在病毒感染性疾病，尤其是急性病毒感染性疾病中的抗病毒、抑炎与保护功能。本公开的特定融合蛋白针对急性病毒感染的共性致病机制，一方面可以发挥IFNα2广谱抑制病毒复制的功能，另一方面通过TFF2抑制炎症细胞因子风暴，促进粘膜损伤修复，改善预后，发挥抗病毒与促修复的作用。同时，两种融合组分间相辅相成，出乎意料地发挥了显著优于两者单独给予所能获得的效果。通过调整该融合蛋白中TFF2与IFNα2的表达比例，有助于消除IFNα2诱导炎症细胞因子风暴的副反应，达到安全有效的干预目的。

另外，TFF2是一种宿主小分子多肽，在不同物种中具有高度的保守性，例如成熟的人TFF2分子由106个氨基酸组成，分子量约为12kD，含有两个对称的由约40个氨基酸残基组成的特殊保守序列，包含6个半胱氨酸残基形成三个链内二硫键(cys1-cys5，cys2-cys4及cys3-cys6)，从而产生特异而稳定的三叶草型结构，耐酸、耐热且抗蛋白酶水解，在运输上极具优势。IFNα2也是宿主分泌的多肽，在临床上已被广泛应用。因此，将TFF2与IFNα2进行融合表达，不仅活性明确，安全性良好，且具有较高的成药率，在急性呼吸道病毒感染及肠道病毒感染的预防与治疗中具有较高的应用潜力。

本公开中首次提出TFF2与IFNα2融合蛋白的干预策略，采用抗病毒+抑炎+促修复三效合一策略，可用于广谱预防和治疗病毒感染引起的急性传染病。融合蛋白不仅可以系统给药，还可以进行局部雾化吸入给药，针对性强、见效快、副作用小，能发挥更好的效果。另外，本公开的产品成本低，易在经济较薄弱的国家或地区推广和应用，也可作为国家防控新发突发病毒引起的传染病的一种技术储备，具有较高的经济价值、社会价值和意义。

本公开中提供了三叶因子2与干扰素α2的融合蛋白，利用此类融合蛋白能抑制病毒的复制、降低组织炎症减少组织损伤和促进肺组织功能修复等优点，其可用于制备治疗和/或预防急性病毒感染疾病的药物，该药物对急性病毒感染引起的预后有明显的改善效果。

与现有技术相比，本公开提供了基于TFF2与IFNα2的融合蛋白。发明人通过试验证明了所述TFF2与IFNα2融合蛋白分子能在流感病毒PR8感染中起保护作用，减少发病率和死亡率，减轻呼吸道感染炎症症状，由此可在应对呼吸道新发病毒性感染的疫情中起重要作用，尤其对预防与治疗尚无有效治疗药物的病毒性感染以及重症感染尤为有益。TFF2与IFNα2融合蛋白针对急性病毒感染的共性致病机制，通过抑制炎症反应，促进粘膜组织修复，减少组织损伤，同时抑制病毒的复制功能，发挥抗病毒作用。因此，TFF2与IFNα2融合蛋白的保护作用并不局限于流感病毒造成的呼吸道组织损伤，包括其他病毒感染引起的损伤，对参与急性病毒感染疫情处理的疾控人员、高风险人群的进行预防性给药，可有效降低上述人员的风险以及受到的损害。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“哺乳动物”可包括人、灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠)、驯养动物或畜牧哺乳动物。

TFF2元件和IFNα2元件

如本文所用，术语“元件”是指构成融合蛋白中一部分的氨基酸序列。术语“单元”是指元件构成功能的基本片段。例如，融合蛋白的TFF2元件中可包含一个或多个连续或间隔的TFF2单元，它们各自可产生所需的TFF2相关功能活性。

如本文所用，术语“TFF2元件”和“TFF2蛋白(多肽)”可互换使用，是指构成融合蛋白一部分的天然(例如哺乳动物来源)、重组或合成的TFF2多肽序列。天然TFF2在哺乳动物中具有高度保守性，具有特异而稳定的三叶草型结构，具有一定的黏膜修复和炎症抑制作用。TFF2多肽也包含TFF2的天然变体和片段(例如剪接变体或等位基因变体)，以及具有天然TFF2活性的非天然存在变体。

天然TFF2多肽的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如GenBank 登录号(人Gene ID:7032；鼠Gene ID:21785)。

本文的TFF2元件可包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列(人TFF2)或由包含 SEQ IDNO:7所述的核酸分子编码，包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列(小鼠 TFF2)或由包含SEQ IDNO:11所述的核酸分子编码，或可为与这些蛋白质具有相同或类似活性的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得同源序列)、变异体或修饰形式。例如，所述TFF2多肽可选自：(a)包含SEQ ID NO：8或12所示氨基酸序列的多肽(例如序列如SEQ ID NO:8或12所示的多肽)；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黏膜修复和炎症抑制作用的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

如本文所用，术语“IFNα2(多肽)”和“IFNα2蛋白(多肽)”可互换使用，是指是指天然(例如哺乳动物来源)、重组或合成的IFNα2多肽。如背景部分中所述， IFNα2的结构和功能在本领域中已有一定的研究和了解。本申请中可采用本领域中已知的IFNα2多肽，也可采用其天然变体和片段(例如剪接变体或等位基因变体)，以及具有IFNα2活性的非天然变体。

天然IFNα2多肽的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如GenBank 登录号(人Gene ID:3440；鼠Gene ID:15965)。

本文所用的IFNα2蛋白可包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列(人IFNα2) 或由包含SEQ ID NO:9所述的核酸分子编码，可包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列(小鼠IFNα2)或由包含SEQ ID NO:13所述的核酸分子编码，或可为与这些蛋白质具有相同或类似活性的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得同源序列)、变异体或修饰形式。例如，所述IFNα2多肽可选自：(a)包含SEQ ID NO：10或14所示氨基酸序列的多肽(例如序列如SEQID NO:10或14所示的多肽)；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黏膜修复和炎症抑制作用的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

本公开融合蛋白中的TFF2多肽元件和IFNα2多肽元件优选由人基因或其同源基因或家族基因编码。本公开中蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1～50个，较佳地1～30个，更佳地1～20个，最佳地1～10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如融合蛋白可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有其所需的病毒感染防治活性。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与其蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

融合蛋白

如本文所用，术语“融合蛋白”，是指包含相融合的至少一个TFF2多肽和至少一个IFNα2多肽的氨基酸分子。本公开融合蛋白可以使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞；优选真核宿主)中产生，也可通过人工合成产生，例如采用全序列合成或片段合成后拼接而成。

本文的融合蛋白中的TFF2肽可连接于IFNα2肽的N端或C端，优选TFF2 肽可连接于IFNα2肽的N端(即上游)。本文的融合蛋白可包含一个或多个TFF2 肽和/或IFNα2肽，例如TFF2肽和IFNα2肽以5:1～1:5的分子比例融合，如 1:1或2:1的分子比例融合，优选以1:1的分子比例融合。

在本申请的优选实施方式中，本文的融合蛋白中的TFF2肽连接于IFNα2 肽的N端，且TFF2肽和IFNα2肽以1:1的分子比例融合。

本申请的融合蛋白还可包含Fc区。如本文所用，术语“Fc区”或“Fc片段”是指用于融合蛋白中的免疫球蛋白Fc段。在一些实施方式中，Fc区具有与天然的或变异的免疫球蛋白Fc片段基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然 Fc片段基本上相同的生物活性。除了免疫球蛋白的CH2和CH3区以外，Fc 区还可包含铰链区。Fc区可来源于例如IgG或IgA。

与单克隆抗体中Fc段功能类似，融合蛋白的Fc段可以起到延长功能蛋白在血浆内的半衰期、提高分子的稳定性、特异性结合体内的Fc受体，并发挥相应的生物学功能等作用。除此之外，Fc段可以特异性结合protein A，简化了 Fc融合蛋白的纯化步骤，在相关生物制品的研发制备具有重要意义。用于本文融合蛋白中的Fc区可不含突变，或者包含一个或多个突变，如降低抗体介导的ADCC和CDC活性的突变，例如根据EU编号方式的氨基酸突变D265A和 N297G/N297Q。

本文的融合蛋白还可包含信号肽，诸如具有引导融合蛋白分泌、定位和/ 或输送功能的氨基酸序列，其长度通常为5-50个氨基酸。在一些实施方式中，信号肽可选自例如：tPA2信号肽、TFF2信号肽、IL-2信号肽、bPRL信号肽 CD33蛋白信号肽等。

本文的融合蛋白还可包含标记物，例如用于纯化、检测、定位的标记物，如选自荧光标记物、非放射性核素标记物、生物素类标记物、磷酸化修饰标记、肽标签。

本文融合蛋白中各多肽元件或元件中的肽单元可通过接头连接。在本申请中优选采用柔性接头，以使得多肽元件或肽单元之间可存在相互作用。可用于本申请融合蛋白中的接头可包含2～300个氨基酸残基，例如5～100个、10～ 50个、15～3个氨基酸残基。示例性的接头可为甘氨酸接头，如(G)_n或甘氨酸 /丝氨酸接头，如(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n或(GGGGGS)_n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。

根据本申请中所提供的序列以及本领域中的技术，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA 法，人工合成等[参见Murray KM,Dahl SLAnn；Pharmacother 1997Nov； 31(11):1335-8]。例如，本文的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产，也可以分别化学合成融合蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

载体和宿主

本文还涉及包含用于产生融合蛋白的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本文所述的编码融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目标融合蛋白。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体，其能在宿主细胞内复制并表达目标蛋白。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本文中可采用诸如使用pSV1.0载体、pcDNA3.1载体、 pIRES2-EGFP载体、AdMaxTM表达系统。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：动物细胞，如293F细胞、CHO细胞等；大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10 到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

通过上述方法，融合蛋白可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、

pure 法、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物或试剂盒

本文还提供了一种产品，其中含有有效量的本文的融合蛋白、包含融合蛋白编码分子的载体、宿主细胞，以及药学上或生理学上可接受的载剂。如本文所用，术语“活性物质”是指本文的融合蛋白、其编码核酸分子、包含该核酸分子的构建体或载体、宿主细胞或前述的组合物。

在较佳的实施方案中，本文的产品可用于预防或治疗与病毒感染相关的疾病和/或其征状。如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”指用于治疗剂给药的载剂，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载剂：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载剂是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载剂可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载剂中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性介质中，其中pH通常约为 5～8，较佳地，pH约为6～8。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了施用方便，将本发明的组合物制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂、冻干粉末)、液体剂(如溶液)、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中活性物质的含量为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～ 1000mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量，通过是呼吸道雾化吸入、滴鼻、喷雾、口服、肌注和/或静脉给药等方式进行施用。

为了提高用药效果，本发明的活性物质或产品之间可相互间联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于感染性疾病(尤其是急性病毒感染) 的预防和治疗。例如，如果本发明的融合蛋白用于预防和/或治疗急性病毒感染，则可同时或先后采用临床上用于急性病毒感染治疗的其他药物或方法，所述其他药物或方法包括但不限于：预防进一步的伤害、调节局部区域功能、抗炎症、施用糖皮质激素、非甾体抗炎药NSAID等。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York： Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：融合蛋白质粒的构建和设计以及真核表达

本实施例首先根据人源TFF2的氨基酸序列(如SEQ ID NO:8所示)与人源IFNα2蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO:10所示)克隆基因序列，将重组的不同形式的质粒转染进入293T细胞后，再通过WB检测TFF2与IFNα2融合蛋白的真核表达，随后在293F细胞中进行大量表达，收获表达上清，并通过HiTrap MabSelect SuRe柱进行纯化，收集目的蛋白后鉴定纯度，超滤置换为 PBS，得到高纯度的TFF2与IFNα2融合蛋白，其具体步骤如下：

通过将人源TFF2序列与干扰素α2通过3个G4S进行连接，并且TFF2 具有不同的重复克隆，并在末端加入人源的Fc片段(图1A)。将测序正确的重组质粒转染进入293T细胞，转染试剂为TurboFect，培养基为DMEM完全培养基(10％FBS和1％P/S)，37℃孵箱培养24h后将细胞取出，收集细胞加入SDS上样缓冲液，收集细胞到EP管中，并以PBS缓冲液清洗细胞，加入上样缓冲液，并在沸水浴中加热10分钟使蛋白质变性，瞬时离心后通过SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分离蛋白，分离胶浓度为10％。电泳的电压为70V，时间为30～40分钟(以marker开始分离为标志)，待溴酚蓝迁移到分离胶位置后，将电压调至110V，直至溴酚蓝迁移到胶底部位置，之后进行快速转膜，恒流400mA，时间50分钟。转膜完毕后，将PVDF正面膜(与胶接触的面)作好记号，并置于5％的脱脂奶粉中室温封闭2小时。后加入合适稀释比例的一抗(TFF2，Proteintech：13681-1-AP，1:1000；IFNα2，SantaCruz， sc-73305，1:1000；β-actin，ABclonal，AC028，1:5000)，采用5％脱脂奶粉稀释，置于摇床4℃孵育过夜。用0.05％PBST洗膜后加入二抗(羊抗兔(1:5000)；羊抗鼠(1:5000))，采用5％脱脂奶粉的PBST稀释，室温摇床孵育1小时后洗膜，对膜进行ECL显色，PVDF膜采用定量分析仪曝光2分钟，记录并分析显色结果。

结果表明(图1B左上)，细胞大量表达TFF2与IFNα2融合蛋白，采用 TFF2信号肽时融合蛋白主要表达于细胞中，另一部分则分泌到上清中。

为了大量获得分泌的融合蛋白，我们对TFF2与IFNα2重组质粒的信号肽进行了替换，将其本身的TFF2信号肽替换为IL-2信号肽(图1B右上)及tPA2 信号肽(图1B左下，右下)，通过对不同的信号肽的上清分泌进行比较，发现 tPA2信号肽能够更有效地促进融合蛋白的分泌，因此在后续在融合蛋白表达中使用tPA2信号肽。

实施例2：融合蛋白的纯化及体外抗病毒和抑炎功能

为了大量获得重组蛋白，将测序正确的TFF2与IFNα2重组质粒转染进入 293F悬浮细胞中。具体而言，使用SMM 293-TI无血清培养基来悬浮培养293F 细胞，培养基中添加1％的青霉素/链霉素抗生素；每次以5x10⁵个细胞/mL密度接种至新鲜培养基，培养至3x10⁶个细胞/mL以上密度时进行实验或传代，细胞摇床通5％的二氧化碳，转速为125rpm/min。融合蛋白质粒瞬时转染时细胞密度为1x10⁶个细胞/mL。采用PEI进行转染，转染过程中DNA：PEI的比例为1：3.5，取适量的质粒于1.5mL EP管，用150mM的氯化钠稀释至40ng/μL，混匀之后加入PEI，漩涡震荡充分混匀后，室温孵育15～30min，将DNA/PEI mix加入细胞中；24小时之后按1：1000加入抗细胞结团剂(Anti-Clumping Agent，Thermo Fisher，0010057AE)；在细胞摇床上培养5～7天收集上清与细胞。经WB检测，融合蛋白主要分泌在上清中，因此直接采用上清进行纯化。

采用蛋白质纯化仪

Pure对融合蛋白进行纯化，柱子选用HiTrapMabSelect SuRe 1mL柱，通过运行UNICORN软件进行操作，所有缓冲液0.22 μm滤膜过滤。首先，用超纯水清洗泵与管路，随后接入柱子并清洗，用至少 5倍体积的蒸馏水冲洗乙醇。采用结合缓冲液(0.02M磷酸钠，0.15M NaCl， pH 7.2)进行通过A1管路进行柱子平衡，B1泵充满洗脱缓冲液(0.1M sodium citrate,pH 3.0)。平衡好之后通过管路A1进行上样，样品在上样前也通过 12000xg离心，0.22μm滤膜过滤。以0.5mL/min速率进行上样，同时收集流穿液。上样完成后，用结合缓冲液洗至基线平，随后切换到B1进行100％洗脱液进行洗脱，收集洗脱液,直至基线基本平，每个1.5mL EP管加入100～200μL 的中和液(Tris-HCl，pH 9.0)。再用5个CV的柱体积洗脱再生柱子，用3个 CV的结合缓冲液，5个CV的0.1～0.5M NaOH清洗柱子，再用5～10个CV 的结合缓冲液，重新平衡，20％乙醇洗净柱子，4℃保存。对于纯化后的融合蛋白，通过10kDa的超滤离心管进行置换为PBS缓冲液。为了定量TFF2与 IFNα2融合蛋白的纯度，按照上述方法进行SDS-PAGE后，采用Quick Blue 快速染胶液染色30～60min，用ddH₂O洗涤过夜(图2A)。为了定量TFF2与 IFNα2融合蛋白的浓度，采用BCA定量试剂盒的方法，做出了BSA的标准曲线，根据标准品的光密度(OD)值，定量出了TFF2与IFNα2融合蛋白的浓度，分装后-80度冻存。

在A549细胞进行融合蛋白的干扰素活性实验，前一天铺板，24孔板，1x10⁵个细胞/孔，加入融合蛋白，24h细胞PBS洗一遍，胰酶消化2～3min，培养基终止，吹打下来，PBS再洗一遍，加入100μL 1x上样缓冲液，沸水浴10min， WB检测干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)蛋白的表达(图2B)。IFITM3 属于干扰素诱导基因ISG，可以被干扰素和病毒诱导表达，融合蛋白能够刺激IFITM3的表达，表明融合蛋白具有诱导干扰素活性的作用。不同顺序的TFF2与IFNα2融合具有不同的体外活性，IFNα2-TFF2-Fc能够诱导较强的IFITM3 的表达，而TFF2-IFNα2-Fc与2xTFF2-IFNα2-Fc，其IFITM3表达水平稍弱。进一步结合后续体内外试验来确定融合蛋白的干扰素诱导活性是否适中。

在A549细胞进行融合蛋白的抗病毒实验，前一天铺板，24孔板，1x10⁵个细胞/孔，提前4～6h加入融合蛋白，第二天按照MOI＝5的比例感染细胞，感染2h，PBS洗一次，替换为10％FBS的DMEM培养基，24h细胞PBS洗一遍，胰酶消化2～3min，培养基终止，吹打下来，PBS再洗一遍，加入100 μL 1x上样缓冲液，沸水浴10min，WB检测NP蛋白的表达(图2C)。结果表明融合蛋白能够降低病毒的复制作用，并且随着融合蛋白浓度的增加，抗病毒作用逐渐增强，而TFF2单独并不能影响病毒的复制作用。

WB检测COX-2蛋白的表达(图3A)。COX-2在正常组织细胞内的活性极低，当细胞受到炎症等刺激时，其在炎症细胞中的表达水平可升高至正常水平的10～80倍。实验中，A549细胞在PR8病毒作用下，COX-2的表达水平呈现显著提高，证明了TFF2-IFNα2-Fc与IFNα2-TFF2-Fc融合蛋白在抑制PR8 的复制过程中，也能降低环氧化酶COX-2的表达，IFNα2也能够降低环氧化酶COX-2的水平，TFF2单独并不能抑制病毒的复制，因此无法降低病毒诱导的COX-2的水平。

在A549细胞通过ELISA检测PR8感染后上清炎症因子IL-6的表达(图 3B)。细胞铺板，24孔板，1x10⁵个细胞/孔，12孔，24h收集上清。检测前包被板子，用4℃预冷的ELISA包被液(ELISA包被液：10mM碳酸钠(Na₂CO₃)， 30mM碳酸氢钠(NaHCO₃)，溶液pH＝9.6，用0.2μm的滤膜过滤除菌后，4℃保存)。在ELISA板的每孔加入1：250稀释的100μL捕获抗体溶液，4℃过夜。炎症因子标准品蛋白为冻干粉。先按标签说明将冻干粉用无菌蒸馏水溶解，再用标准品稀释液进行倍比稀释。充分溶解后母液浓度为1000pg/mL。稀释前将标准品轻轻振荡5min。第二天，板子加入300μL/孔洗涤缓冲液(0.05％吐温 -20的PBS)洗3次，ELISA封闭液(10％FBS的PBS)封闭1h。加样：100 μL/孔加入稀释后的细胞因子标准品，使用标准品浓度梯度为：500pg/mL、250 pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.6pg/mL、7.8pg/mL，在进口EP管中完成对标准品的倍比稀释。随后100μL/孔加入样品至孔。样品及标准品孵育2h后，洗涤缓冲液洗5次。加检测抗体：100μL/well加入稀释后的在每孔中加入100μL检测抗体+SAv-HRP试剂。在室温下孵育1小时。洗掉孔内液体，洗涤缓冲液停留1min后弃去孔内液体，重复7次，最后一次在滤纸上扣干。显色：100μL/孔加入TMB，室温避光孵育30min。终止反应：迅速100μL/孔加入终止溶液终止反应。读板：加入终止溶液后10min内在450nm 处读值。根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

结果表明，与IFNα2μg/mL处理组相比，TFF2-IFNα2-Fc融合蛋白在0.2， 1μg/mL剂量处理时，能够显著降低PR8诱导的IL-6炎症水平，而在5μg/mL 的剂量时，也与IFNα2处理所分泌的IL-6炎症水平相持平。而与IFNα2相比， IFNα2-TFF2-Fc则能够诱导的较高的IL-6炎症水平，并且有剂量依赖性。IFNα2 本身虽然具有抗病毒作用，但是在其作用下，IL-6的炎症水平也呈现，表明不同顺序的TFF2与IFNα2能够影响IFNα2所诱导的IL-6炎症水平。在RAW264.7 细胞中，前一天铺板，12孔板，2.5x10⁵个细胞/孔，提前4～6h加入融合蛋白。以融合蛋白0.2、1、5μg/mL的浓度进行孵育4h，然后加入LPS 1ng/mL，24 h细胞PBS洗一遍，胰酶消化2～3min，培养基终止，吹打下来，PBS再洗一遍，加入100μL 1x上样缓冲液，沸水浴10min，通过WB检测iNOS的表达，在RAW264.7细胞进行LPS刺激下，与IFNα2相比TFF2-IFNα2-Fc产生较低的iNOS(图3C)。

iNOS其含量的高低可能最为一种机体内炎症程度的指标，结果显示：与 IFNα2相比，TFF2-IFNα2-Fc能显著减少iNOS的表达。IFNα2-TFF2-Fc能够促进炎症的表达水平，并且随着剂量升高，逐渐诱导iNOS的表达水平的升高， TFF2-IFNα2-Fc中IFNα2居中的结构能够影响IFNα2的功能发挥，IFNα2能够诱导较高的iNOS，IFNα2居中的结构能够降低其诱导的iNOS水平，而 IFNα2-TFF2-Fc中IFNα2在前的结构则对IFNα2功能发挥无影响，因此随着剂量升高，诱导的iNOS水平也随之升高。该结果表明TFF2-IFNα2-Fc融合蛋白能够诱导适宜的iNOS水平，降低了过度炎症反应的风险。

实施例3：融合蛋白的动物攻毒保护及预防实验

本实施例采用流感病毒H1N1病毒株PR8(在P2试验室中)通过滴鼻的方法感染C57小鼠，感染前提前6h进行给药(图4A)感染前麻醉采用0.5g 三溴乙醇(Tribromoethanol)+1mL 2-甲基2-丁醇(2-Methyl-2-Butanol)+39mL 水配置成40mL的溶液，300μL/只的剂量麻醉小鼠，以1000TCID50/只的剂量进行攻毒，攻毒时间为第0天，攻毒后6h、第2天、第4天、第6天进行雾化给药，每次给药剂量为0.2、1、5μg/g。连续14天称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态。生存率分析(图4B与图4C)显示，PR8感染的小鼠在感染后第8天开始死亡，13天全部死亡，TFF2-IFNα2-Fc融合蛋白能够保护 40％左右的小鼠免于流感死亡。如图4B与图4C所示，PR8感染的小鼠体重持续下降，在第10天大部分小鼠体重丢失20～30％以上，融合蛋白组在第11天开始体重逐渐增加，而IFNα2-TFF2-Fc 0.5μg/g组的体重则一直下降。与TFF2-IFNα2-Fc相比，IFNα2-TFF2-Fc整体的保护效果不佳，可能因其诱导较高的炎症反应而降低了保护效果。

融合蛋白的动物的预防实验采用流感病毒H1N1病毒株PR8(在P2试验室中)通过滴鼻的方法感染C57小鼠，感染前提前12h进行给药(图4D)，感染前麻醉采用0.5g三溴乙醇(Tribromoethanol)+1mL 2-甲基-2-丁醇 (2-Methyl-2-Butanol)+39mL水配置成40mL的溶液，300μL/只麻醉小鼠，以500TCID50/只的剂量进行攻毒，攻毒时间为第0天，攻毒后6h、第2天、第4天、第6天进行雾化给药，给药剂量为1μg/g与5μg/g。连续14天称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态(体重变化)。生存率分析(图4E)显示，PR8感染的小鼠在感染后第7天开始死亡，最后PBS组小鼠存活率30％， TFF2-IFNα2-Fc融合蛋白在1μg/g剂量具有保护全部小鼠的流感死亡；如图4F 所示，PR8感染的小鼠体重持续下降，在第7天，大部分小鼠体重丢失10～30％以上，融合蛋白TFF2-IFNα2-Fc在5μg/g的剂量下体重最大下降10％左右，在 1μg/g的剂量下体重基本不下降。2xTFF2-IFNα2-Fc在1μg/g剂量以及5μg/g 剂量下，均无保护效果，表明2xTFF2-IFNα2-Fc中2xTFF2的结构会影响IFNα2 的功能发挥进而影响保护效果。

上述结果证明了，融合蛋白TFF2-IFNα2-Fc融合蛋白在预防及保护小鼠因流感病毒导致的体重流失和死亡中可产生显著优于TFF2单独、IFNα2单独以及其他形式融合蛋白的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附：序列信息

序列表

<110> 复旦大学

<120> 三叶因子2/干扰素α2融合蛋白及其防治病毒感染性疾病的应用

<130> 221765 1CNCN

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1554

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> TFF2-G4S-IFNα2-Fc mRNA编码序列

<400> 1

gagaagccta gcccttgcca gtgcagcaga ctgtctcctc acaaccgcac aaactgcggc 60

ttccctggca ttacatccga ccagtgcttc gacaacggct gctgcttcga ctctagcgtg 120

acaggcgtgc cttggtgctt ccacccactg ccaaagcagg agtccgacca gtgcgtgatg 180

gaggtgagcg accgccggaa ctgcggctac cccggcatta gccccgagga gtgcgcctcc 240

cggaagtgct gcttcagcaa cttcattttc gaggtgcctt ggtgcttctt ccctaagtcc 300

gtggaggact gccactacgg cggcggcggc tctggcggcg gcggctctgg cggcggcggc 360

tcttgcgacc tcccacagac ccactctctg ggctctcgca gaacactgat gctcctcgcc 420

cagatgagac ggattagcct gttctcttgc ctcaaggaca ggcacgactt cggcttccct 480

caggaggagt tcggcaacca gttccagaag gccgagacca ttccagtgct gcacgagatg 540

attcagcaga ttttcaacct gttcagcacc aaggactcta gcgccgcctg ggacgagacc 600

ctcctcgaca agttctacac agagctgtac cagcagctga acgacctcga ggcctgcgtg 660

attcagggcg tgggcgtgac agagacccca ctcatgaagg aggactccat tctggccgtg 720

agaaagtact tccagcgcat tacactgtac ctgaaggaga agaagtactc tccatgcgcc 780

tgggaggtgg tgcgcgccga gattatgaga tctttcagcc tgagcacaaa cctgcaggag 840

tccctcagat ctaaggagga gccaaagtct tgcgacaaga cccacacatg cccaccttgc 900

cccgcccccg agctcctggg cggcccatct gtgttcctgt tcccacctaa gccaaaggac 960

acactcatga tttcccgtac acctgaggtg acatgcgtgg tggtggacgt gtctcacgag 1020

gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 1080

aagcctagag aggagcagta caactctaca taccgggtgg tgtctgtgct caccgtgctg 1140

caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtctaacaa ggccctcccc 1200

gcccctattg agaagacaat ttctaaggcc aagggccagc ctagagagcc acaggtgtac 1260

acactgccac catctcggga cgagctgaca aagaaccagg tgtctctgac atgcctcgtg 1320

aagggcttct acccatctga catcgccgtg gagtgggagt ctaacggcca gcccgagaac 1380

aactacaaga caacacctcc agtgctcgac tccgacggct ctttcttcct gtactctaag 1440

ctcaccgtgg acaagagccg ctggcagcag ggcaacgtgt tctcttgcag cgtgatgcac 1500

gaggccctgc acaaccacta cacacagaag tccctgtctc tgtccccagg caag 1554

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TFF2-G4S-IFNα2-Fc氨基酸序列

<400> 2

Glu Lys Pro Ser Pro Cys Gln Cys Ser Arg Leu Ser Pro His Asn Arg

1 5 10 15

Thr Asn Cys Gly Phe Pro Gly Ile Thr Ser Asp Gln Cys Phe Asp Asn

20 25 30

Gly Cys Cys Phe Asp Ser Ser Val Thr Gly Val Pro Trp Cys Phe His

35 40 45

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65 70 75 80

Arg Lys Cys Cys Phe Ser Asn Phe Ile Phe Glu Val Pro Trp Cys Phe

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 小鼠(Mus musculus)

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Val Gln Glu Pro Pro Leu Thr Gln Glu Asp Ala Leu Leu Ala Val Arg

130 135 140

Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr Val Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser

145 150 155 160

Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser

165 170 175

Ser Ser Val Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu

180 185 190

Claims

1.一种融合蛋白，其包含一个或多个融合单元，每个融合单元包括：

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述TFF2肽或其活性片段来源于人、灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、犬、猫：和/或

所述TFF2肽或其活性片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性且具有TFF2活性的氨基酸序列)；和/或

所述TFF2肽或其活性片段由包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子编码：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性且能够编码活性TFF2肽的核酸分子)。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述IFNα2肽或其活性片段来源于人、灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、犬、猫：和/或

所述IFNα2肽或其活性片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性且具有IFNα2活性的氨基酸序列)；和/或

所述IFNα2肽或其活性片段由包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子编码：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:13、或其活性片段(例如与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13具有至少80％序列同一性且能够编码活性IFNα2肽的核酸分子)。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包含连接所述TFF2元件和所述IFNα2元件和/或元件中组成肽段的接头，

例如，所述接头为包含n个氨基酸残基的柔性接头，n为2～300的整数；

例如，所述接头是甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸接头，如G_n、(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n或(GGGGGS)_n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含一个或多个连续或间隔排列的TFF2肽和/或一个或多个连续或间隔排列的IFNα2肽。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包含Fc区，所述Fc区不含突变，或者包含一个或多个降低抗体介导的ADCC和CDC活性的突变，例如根据EU编号方式的氨基酸突变D265A和N297G；和/或

所述融合蛋白还包含信号肽，例如选自tPA2信号肽、TFF2信号肽、IL-2信号肽、bPRL信号肽、CD33信号肽；和/或

所述融合蛋白还包含标记物，例如用于纯化、检测、定位的标记物，如选自荧光标记物、非放射性核素标记物、生物素类标记物、磷酸化修饰标记、肽标签。

7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％的序列同一性；和/或

所述融合蛋白由具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子或与所述序列具有至少80％的序列同一性的核酸分子编码。

8.分离的核酸分子或包含所述核酸分子的构建体或载体，其中，所述核酸分子编码权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白。

9.如权利要求8所述的核酸分子、构建体或载体，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与所述序列具有至少80％的序列同一性；和/或

所述核酸分子编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的多肽；和/或

所述载体选自病毒载体、mRNA载体、DNA载体。

10.一种细胞，其包含如权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白、或如权利要求8或9所述的核酸分子、构建体或载体。

11.一种组合物，其包含如权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8或9所述的核酸分子、构建体或载体或者如权利要求10所述的细胞；以及载剂。

12.如权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8或9所述的核酸分子、构建体或载体、如权利要求10所述的细胞或如权利要求11所述的组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其中，所述病毒感染性疾病选自急性病毒感染，例如呼吸道病毒感染和肠道病毒感染；和/或

所述病毒感染性疾病由选自下组的一种或多种病毒引起：冠状病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、新型肠道病毒。

14.如权利要求12所述的应用，其中，所述药物作为预防性药物在病毒感染发生前预防性给药以预防病毒感染发生或降低后续病毒感染的严重程度；

所述药物作为治疗性药物在病毒感染发生后给药以降低病毒感染与疾病的严重程度；和/或

所述药物既作为预防性药物，也作为治疗性药物，在病毒感染发生之前和之后连续或间隔给药。

15.根据权利要求12所述的应用，其中，所述药物的剂型适于选自下组的给药方式：呼吸道雾化吸入、滴鼻、喷雾、口服、肌注和/或静脉给药；和/或

所述药物适于单独使用或与其他抗病毒药物、免疫药物或病毒疗法联合使用。