KR20040101426A

KR20040101426A - 신규한 ｍｃｐ 단백질의 길항제

Info

Publication number: KR20040101426A
Application number: KR10-2004-7016121A
Authority: KR
Inventors: 아만다 프로우드풋트; 마리에 코스코-빌보이스; 트레이시 한델
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2004-12-02
Also published as: PL373007A1; EA200401342A1; RS89104A; AR039629A1; AU2003240765A1; NO20044850L; WO2003084993A1; IL164464A0; US7425324B2; CN1665839A; EP1495050A1; BR0309238A; MXPA04009874A; US20070004906A1; HRP20040946A2; ZA200409062B; JP2006505243A; CA2509767A1

Abstract

MCP 단백질, 특히 MCP-1 단백질의 신규한 길항제는 MCP 단백질의 N-말단에 위치하는 GAG 결합 위치가 비-보존성 치환으로 제거된 MCP 변이체를 발생시킴으로써 수득할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 화합물은 MCP 단백질의 바람직하지 않은 활성에 관련된 질환, 예를 들면 염증 질환, 자가면역 질환, 혈관 질환, 암의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

Description

신규한 ＭＣＰ 단백질의 길항제{NOVEL ANTAGONISTS OF MCP PROTEINS}

케모킨은 작은 친-염증성 분비 단백질인데, 이는 백혈구를 혈액으로부터 손상 부위로 주도적으로 이동시킨다. 이런 단백질 집단을 특성화하는 보존된 시스테인의 위치에 따라, 케모킨 집단은 일련의 막 수용체에 상응하는 C, C-C, C-X-C, C-X3-C 케모킨으로 구조적으로 구분할 수 있다(Baggiolini M et al., 1997; Fernandez EJ and Lolis E, 2002). 일반적으로, 케모킨은 손상 부위에서 생성되고 백혈구 이동과 활성화를 유도하여 염증, 면역, 재생, 혈관생성 과정에 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 이들 분자들은 백혈구의 과도한 유인과 활성화를 예방하여 특정 케모킨과 이들의 수용체를 저해함으로써 이들 과정과 연관된 질환에서 치료 개입을 가능하게 한다(Baggiolini M, 2001; Loetscher P and Clark-Lewis I, 2001; Godessart N and Kunkel SL, 2001).

단핵구 주화성 단백질 1(이후, MCP-1)은 CCL2, 소형 유도성 사이토킨 A2 (SCYA2), 단핵구 주화성과 활성화 인자(MCAF), 단핵구 분비 단백질 Je, 단핵구 주화성 인자, HC11과 같은 다양한 이름으로 알려져 있는 CC 케모킨 집단의 구성원이다. 이 케모킨은 다양한 염증 질환, 상이한 유형의 암, 심장 동종이식, AIDS, 폐결핵에서 손상과 감염 신호에 반응하여 단핵구와 호염기구의 유인을 촉진할 수 있다(Gu L et al., 1999).

구조적ㆍ기능적으로 상동한 단백질이 동정되었고, MCP-2(CCL7), MCP-3(CCL8), MCP-4(CCL13), Eotaxin(CCL11)이라 한다. C-C 케모킨의 이런 하위집단은 다른 C-C 케모킨, 예를 들면 RANTES 또는 MIP-1 알파/베타와 현저하게 구별되고, 공통 선조 서열로부터 동시-진화한 것으로 보인다. 이들은 유사한 수용체 활용을 보이고 CCR1, CCR3, CCR5에도 결합하긴 하지만 특히 CCR2에 결합한다. 따라서, 이들 C-C 케모킨의 많은 면역학적ㆍ염증성 항진 또는 길항 활성은 공통한다(Hughes AL and Yeager M, 1999; Berhkout TA et al., 1997; Luster AD and Rothenberg ME, 1997, Proost P et al., 1996).

MCP-1과 연관된 생리학적 활성은 유전자도입 동물 및 다른 동물에서 광범위하게 연구되었는데, MCP-1은 여러 감염 질환, 염증 질환 또는 자가면역 질환에서 단핵구 및 다른 세포형(예, 성상세포)의 유인을 조절하고 T 보조세포 반응에 관련된 사이토킨의 발현을 조절한다. MCP-1에 의해 유도되는 것으로 보이는 다른 질환은 혈관 질환(관상동맥 개입이후 재협착, 동맥 경화증, 죽상경화증, 허혈, 뇌졸증) 및 암-관련된 혈관생성이다(Ikeda Y et al., 2002; Egashira K et al., 2002; Gu L et al., 2000; Salcedo R et al., 2000; Gosling J et al, 1999; Lu B et al, 1998; Rutledge BJ et al., 1995).

MCP-1 표적화가 여러 질환에 가능한 치료 방식으로 간주되고 있기 때문에,MCP-1-유도된 병리학적 활성에 대한 다소간 중요한 저해 효과를 달성하는 상이한 유형의 MCP-1 길항제가 기존 문헌에서 보고되었다(Dawson J, 2003). MCP-1 길항제의 예는 자연적으로 또는 합성에 의해 N-말단 아미노산 2 내지 10이 결실되는 M CP-1의 N-말단 결실 변이체(Egashira K et al., 2000; Zhang Y and Rollins BJ, 1995; McQuibban GA et al., 2002), 항-MCP-1 단클론 항체(Ajuebor MN et al., 1998; Eghtesad M et al., 2001), RNA 엡타머(Rhodes A et al., 2001), MCP-1에 내재하는 서열에 기초하여 설계된 펩티드(Reckless J and Grainger DJ, 1999), MCP-1 길항제 펩티드 유사물질(Kaji M et al., 2001), 안티센스 올리고뉴클레오티드(WO 94/09128), 소형 분자(Mirzadegan T et al., 2000), 중합체-변형된 MCP-1(WO 02/04015), 또는 바이러스 디코이 수용체(Alexander JM et al., 2002; Beck CG et al., 2001)이다.

구조적으로, MCP 단백질은 N-말단 루프 및 C-말단에서 1개의 α-나선에 의해 덥힌 3개의 β-시트를 나타낸다(Handel TM et al., 1996; Lubkowski J, et al.,1997; Blaszczyk J et al., 2000). 기존 문헌에서는 구조-활성 연구의 많은 실례를 제공하는데(Gong JH and Clark-Lewis I, 1995; Zhang et al., 1996; Beall CJ et al., 1996; Steitz SA et al., 1998; Gu L et al., 1999; Hemmerich S et al., 1999; Seet BT et al., 2001), 여기서 MCP-1 변이체는 수용체에 대하여 감소된 활성 및/또는 친화성을 보유하거나, N-말단 절두(많은 다른 케모킨에서처럼) 또는 잔기 3, 8, 10, 13, 15, 18, 19, 24, 28, 30, 37, 38, 39(성숙 사람 MCP-1의 넘버링에 따라)에서 단일 돌연변이를 발현함으로써 다른 결합 단백질이 수득되었다.Eotaxin에서 유사한 결과가 보고되었다(Mayer MR and Stone MJ, 2001).

케모킨은 많은 세포-신호전달 가용성 단백질(인터루킨, 성장 인자)에 공통하는 프로테오글리칸(PG) 및 글리코사미노글리칸(GAG)과 상호작용한다. 프로테오글리칸은 세린 잔기에서 글리코사미노글리칸 측쇄의 부가에 의해 번역이후 변형되는 음으로 하전된 단백질이다. 염기성 잔기(주로, 아르기닌과 리신)의 클러스터는 단백질이 GAG와 상호작용할 수 있도록 하는데, 이는 헤파린, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란 설페이트, 데르마탄 설페이트, 히알루론산과 같은 이당류 반복에 의해 공통적으로 특성화된다. PG와 GAG는 가용성 분자뿐만 아니라 막 표면에 존재하여 분자가 세포외 환경에서 단백분해되는 것을 예방할 수 있다. 또한, GAG는 세포 신호전달 분자의 특정 수용체로의 정확한 제시를 보조하고, 궁극적으로 표적 세포 활성화의 조절을 보조하는 것으로 제안되었다. 케모킨의 경우에, 염증 부위에서 고정된 구배로의 농축, 결과적으로 세포 수용체와의 상호작용 및 이들의 활성화 상태가 특정 GAG에 의해 조절되는 것으로 보인다. GAG와의 상호작용 및 이들 구배의 형성은 MCP-1을 비롯한 여러 케모킨에서 상대적 친화성의 측정으로 입증되었다. 따라서, 이런 상호작용의 조절은 염증 질환에서 치료 방식을 대표하는 것으로 제안되었다(Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999; Ali S et al., 2001; Patel Det al., 2001; WO 02/28419; WO 99/50246).

하지만, GAG/MCP-1 상호작용의 구조적 요구조건 및 기능적 효과는 거의 연구되지 없었다. GAG는 내피 세포로부터 분비된 MCP-1의 활성과 생산을 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다(Douglas MS et al., 1997). 또한, MCP-1의 C-말단에서 리신58과 히스티딘 68이 알라닌으로 치환되면 수용체 결합, Ca²⁺유입 또는 주화 활성에 대한 영향없이 GAG 결합이 예방되는 것으로 보고되긴 했지만(Chakravarty L et al, 1998), MCP-1의 다른 GAG 결합 위치가 존재하는 지와 이들의 제거가 생체내 효과를 결과하는 지에 관하여 기존 문헌에서 개시된 바가 없다. 일부 케모킨에서 광범위한 연구가 진행되고 있긴 하지만, 서열 상동성에 기초하여, GAG 결합을 손상시키는 비-보존성 치환으로 어떤 잔기를 변형해야 하는 지와 어떤 효과가 달성될 지를 예측하는 것이 불가능한데, 그 이유는 케모킨에서 GAG 결합 도메인의 현저한 구조적 다양성이 존재하기 때문이다(Lortat-Jacob H et al., 2002).

본 발명의 요약

사람 MCP-1의 N-말단에서 이중염기성 위치(아르기닌 18, 리신 19)가 MCP-1과 GAG의 상호작용을 주도하는 것으로 밝혀졌다. 비-보존성 치환(예, 알라닌으로 치환)으로 상기 위치를 제거하면, GAG와의 감소된 상호작용 경향뿐만 아니라 MCP-1에 대한 놀라운 용량-관련된 길항 활성을 보이는 MCP-1 변이체가 만들어진다. 이런 증거를 활용하여 MCP-1의 변이체 및 다른 MCP 단백질을 상응하는 MCP 단백질의 길항제로 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 화합물은 수용체를 발현하는 백혈구의 이동과 활성화를 저해하여 과도하거나 무절제한 백혈구 이동과 연관된 질환, 예를 들면 염증 질환과 자가면역 질환의 치료에 유용한 치료 조성물을 제공하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 MCP 단백질, 특히 사람 MCP-1의 신규한 길항제에 관하는데, 상기 길항제는 MCP 단백질을 적절히 돌연변이시켜 발생시킨다.

도 1: (A) 실시예에서 발현되고 검사된 사람 MCP-1 단백질과 돌연변이된 MCP-1 단백질의 아미노산 서열(돌연변이된 아미노산은 밑줄로 표시한다). MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A에서 N-말단 메티오닌은 정제동안 아미노펩티다제 처리로 제거하여 이런 부가적인 잔기로 인한 단백질의 활성에 대한 임의의 간섭을 예방하였다. (B) 사람 MCP-1 변이 형태의 정렬(CCL2; SWISSPROT Acc. NㅀP13500), MCP-2 (CCL7; SWISSPROT Acc. NㅀP80075), MCP-3(CCL8; SWISSPROT Acc. NㅀP80098), MCP-4(CCL8; SWISSPROT Acc. NㅀQ99616), Eotaxin(CCL11; SWISSPROT Acc. NㅀP51671). 본원에서 GAG와의 결합에 관여하는 것으로 동정된 MCP-1에서 염기성 잔기(잔기 18과 19) 및 좀더 상동한 사람 단백질에서 보존된 상응하는 잔기는 박스로 표시한다. 모든 사람 MCP 단백질에서 보존된 다른 염기성 잔기는 밑줄로 표시한다.

도 2: [³H]-헤파린 및 케모킨으로써 MCP-1WT*(○) 또는 MCP-1WT*2A(●)로 실시된 헤파린 결합 분석의 결과를 보여주는 그래프.

도 3: 케모킨으로써 hMCP-1(□), MCP-1WT*(○) 또는 MCP-1WT*2A(●)의 첨가에 따른 CCR2-발현 CHO 막으로부터 [¹²⁵I]-MCP-1의 이탈을 모니터함으로써 실시된 균형 경쟁 수용체 결합 분석의 결과를 보여주는 그래프.

도 4: THP-1 세포 및 주화성 인자로써 재조합 사람 MCP-1(□), MCP-1WT*(○) 또는 MCP-1WT*2A(●)로 실시된 트랜스웰(transwell) 주화성 분석의 결과를 보여주는 그래프.

도 5: MCP-1WT* 및/또는 MCP-1WT*2A를 이용하여 생쥐에서 실시한 복강 세포유인 분석의 결과를 보여주는 그래프. MCP-1WT*에 의해 유인된 다수의 세포에 대한 통계학적으로 유의한 w해 활성을 보이는 MCP-1WT*2A의 농도는 그래프에 *로 표시한다.

도 6: 지연된 접촉성 과민증 분석의 결과를 보여주는 그래프. 생쥐는 0.5 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A(■) 또는 운반제 단독(□)으로 처리하였다. 효과는 처리동안 귀 부종 크기의 측면에서 매일 측정한다.

도 7: 폐 섬유증을 유도하는 블레오마이신을 투여한 생쥐의 체중에 대한 효과를 보여주는 그래프. 대조 생쥐(□)의 평균 체중은 0.25 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A(●) 또는 PBS 단독(○)으로 처리된 생쥐의 평균 체중과 비교한다. 표시된 중량은 각 생쥐 군의 평균 체중값이다.

도 8: 처리되지 않은 생쥐와 블레오마이신-처리된 생쥐에서 섬유증 수준을 비교하는 그래프, 상기 생쥐는 PBS 단독으로, 또는 0.25 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A의 복강내 투여로 추가 처리하였다. 섬유증 수준은 실시예에서 밝힌 바와 같이 분광분석으로 또는 조직학적으로 측정하였다.

도 9: PBS 단독(1군), 1 ㎎/mouse MCP-1WT*2A(2군) 또는 10 ㎎/mouse MCP-1WT*2A(3군)로 처리된 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동물 모델에서 측정된 임상 스코어를 비교하는 그래프.

도 10: PBS 단독 또는 1 ㎎/mouse MCP-1WT*2A로 처리된 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 동물 모델에서 측정된 임상 스코어를 비교하는 그래프.

도 11: PBS 단독으로 처리되고 공격접종된 동물 모델(1군), PBS로 처리되고난알부민으로 공격접종된 동물 모델(2군) 또는 10 ㎎/mouse MCP-1WT*2A로 처리되고 난알부민으로 공격접종된 동물모델(3군)의 기관으로부터 분리된 세포 양을 비교하는 그래프.

앞서 언급된 기존 문헌에서는 사람 MCP-1의 N-말단에서 특정 이중염기성 위치가 GAG 결합 위치를 정의하고, 상기 위치에서 잔기의 비-보존성 치환이 MCP-1에 길항 활성을 보유하는 분자를 유도한다는 사실을 암시한 바가 없다. 게다가, 공지된 MCP 단백질에서 이중염기성 위치 및 염기성이거나 GAG 결합에 관여하는 것으로 알려진 다른 잔기의 보존에 비추어, MCP 단백질의 길항제가 사람 MCP-1에서 기능적으로 특성화된 위치에 상응하는 잔기에서 비-보존성 치환에 의해 수득될 수 있음을 추론할 수 있다.

본 발명의 주목적은 MCP 단백질의 변이체로 구성되는 MCP 단백질의 신규한 길항제를 제공하는 것인데, 사람 성숙 MCP-1의 서열에 기초하여 넘버링(numbering)된 아래의 잔기 조합은 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루탐산 또는 글루타민으로 치환된다:

a) 18번과 19번;

b) 58번과 함께 18번 및/또는 19번;

c) 66번과 함께 18번 및/또는 19번;

d) 58번 및 66번과 함께 18번 및/또는 19번;

e) 24번, 44번, 49번, 75번중 한가지이상과 함께 18번 및/또는 19번.

본원에서는 상기한 조합의 구체적인 실례로써 아르기닌 18과 리신 19가 알라닌으로 치환된 신규한 재조합 MCP-1 변이체에서 수득된 놀라운 생체내 데이터와 시험관내 데이터를 제공한다. 다른 고도로 보존된 MCP 단백질의 서열과 구조에 관한 지식과 더불어 이들 결과로부터, 상기 이중염기성 위치가 MCP 단백질 생물 활성에서 통상적인 역할을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 이들 상동성 단백질에서 적절하게 변형되면 길항 분자가 생성될 수 있음을 알 수 있다.

길항 특성을 보유하는 분자를 수득하기 위하여 MCP 단백질에서 비-보존성 방식으로 돌연변이되는 염기성 잔기는 본질적으로 18번과 19번 위치의 양 잔기; GAG 결합에 관여하는 것으로 이미 공지된 적어도 하나의 잔기, 예를 들면 56과 66(Chakravarty L et al., 1999)과 결합된 18번과 19번 위치의 염기성 잔기중 적어도 하나; 또는 모든 사람 MCP 단백질에 보존된 다른 염기성 잔기중 적어도 하나와 결합된 18번과 19번 위치의 염기성 잔기중 적어도 하나이다(도 1B; Berhkout TA et al., 1997). 염기성 잔치를 대체하는 아미노산은 가급적 비-극성의 작은 아미노산, 예를 들면 알라닌 또는 글리신이지만, 단백질의 구조를 거의 간섭하지 않고 GAG 결합과 양립하지 않는 전하와 크기를 보유하는 다른 단백질, 예를 들면 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루탐산 또는 글루타민 역시 적합하다.

따라서, 본 발명의 주목적은 앞서 정의된 돌연변이의 조합을 보유하고 MCP 단백질의 길항제로 작용하는 MCP 단백질의 변이체를 제공하는 것이다.

"MCP 단백질의 길항제"는 상응하는 성숙한 전장 자연-발생(야생형) MCP 단백질에 대한 길항제로 작용하는 임의의 분자를 의미한다. 당분야에 공지된 MCP-1 길항제는 변형을 수반한다.

본원에서, MCP 단백질에는 사람 MCP-1, 사람 MCP-2, 사람 MCP-3, 사람 MCP-4, 사람 Eotaxin(도 1B; 범례는 상응하는 SWISSPROT 수탁 번호를 표시한다) 및 사람 성숙 MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 또는 Eotaxin과 적어도 70%, 적절하게는 80%, 좀더 적절하게는 90% 상동성을 보유하고 앞서 정의된 모든 위치에서 염기성의 양전하 아미노산(아르기닌, 리신 또는 히스티딘)을 보유하는 임의의 다른 단백질이 포함된다.

본 발명의 다른 목적은 아래에서 선택되는 MCP 단백질의 길항제이다:

a) MCP 단백질의 앞서 정의된 변이체중 활성 변이체, 여기서 하나이상의 아미노산 잔기가 길항 활성을 간섭하지 않으면서 부가, 결실 또는 치환된다;

b) 폴리펩티드/펩티드의 서열 또는 구조에 기초하여 설계된 펩티드 유사물질;

c) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열 및 상응하는 MCP 단백질 이외의 단백질 서열에 속하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드/펩티드;

d) (a), (b) 또는 (c)의 활성 분획물, 전구물질, 염 또는 유도체.

앞서 정의되고 본원에서 MCP-1 길항제로써 MCP-1WT*2A를 이용하여 예시되는 MCP 변이체의 길항 특성은 활성 변이체에서 유지되거나 심지어 강화될 수 있다. 이런 분자 카테고리에는 상기 서열의 자연 또는 인공 유사체가 포함되는데, 이들 유사체는 본 발명에서 특성화되는 생물 활성을 유사하거나 초과하는 수준으로 나타낸다는 조건하에 하나이상의 아미노산 잔기가 부가, 결실 또는 치환된다.

가령, GAG 결합에 관여하지 않는 잔기에서 수용가능 치환, 예를 들면 실시예에 도시된 메티오닌 64의 이소루이신으로의 치환(MCP-1WT*2A; SEQ ID NO: 3)을 실시하여 사람 MCP-1의 필수적인 특성을 변화시키지 않으면서 정제(purification)를 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 MCP-1WT*2A(SEQ ID NO: 3)에 상응하는 서열을 보유하는 MCP-1 길항제이다. 대안으로, MCP-1 길항제는 GAG 결합에 관여하는 잔기에 대한 치환에 더하여, MCP-1의 공지된 N-말단 결실 변이체에서처럼 2 내지 10개의 N-말단 아미노산이 결실하여(Egashira K et al., 2000; Zhang Y and Rollins BJ, 1995; McQuibban GA et al., 2002), 향상된 길항 특성을 달성할 수도 있다.

자연 유사체는 사람 또는 다른 유기체에서 동정된 MCP 단백질의 상응하는 아미노산, 예를 들면 생쥐 MCP-1(SWISSPROT Acc. NㅀP10148)을 의미한다. 인공 유사체는 공지된 화학적 합성 및/또는 특정 위치 돌연변이유발 기술, 또는 적합한 임의의 다른 공지된 기술로 만들어진 펩티드를 의미하는데, 이들 기술은 선행 기술 및 본원의 실시예에 제시된 교시를 이용하여 당업자에 의해 통상적으로 수득되고 검사될 수 있는 일단의 실질적으로 상응하는 돌연변이되거나 단축된 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에서, 이들 활성 변이체에서 바람직한 변화는 통상적으로 "보존성" 또는 "안정적인"치환이라 하고 비-염기성 잔기에 영향을 준다. 보존성 아미노산 치환은 분자의 생물학적 구조와 기능을 보존할 만큼 충분히 유사한 화학적 특성을 보유하는 아미노산을 이용한 치환이다. 아미노산의 삽입과 결실 역시 기능을 변화시키지 않으면서 앞서 정의된 서열에 적용될 수 있는데, 단 이런 삽입과 결실은 수개의 아미노산, 예를 들면 10개 미만의 아미노산, 적절하게는 3개 미만의 아미노산에만 영향을 주고 단백질 또는 펩티드의 기능적 형태에 중요한 아미노산을 제거 또는 치환하지 않아야 한다.

기존 문헌에서는 자연 단백질의 서열 및/또는 구조에 관한 통계학적ㆍ물리-화학적 연구에 기초하여 보존성 아미노산 치환을 실시할 수 있는 다양한 모델을 제공한다(Rogov SI and Nekrasov AN, 2001). 단백질 설계 실험은 아미노산의 특정한 서브세트를 이용하면 접힘가능한 활성 단백질이 생산될 수 있음을 보이고, 단백질 구조에서 좀더 용이하게 수용될 수 있고 기능적ㆍ구조적 동족체와 파라로그(paralog)를 탐지하는데 이용될 수 있는 아미노산 "유의성"치환을 구분하는데 기여하였다(Murphy LR et al., 2000). 유의성 아미노산 군과 좀더 바람직한 유의성 군은 표 1에 정의한다.

이들 교시에 기초한 치환으로 생성된 활성 변이체 및 본 발명의 요체에서 하나이상의 아미노산이 결실되거나 부가된 활성 변이체, 다시 말하면 불량한 GAG 결합 특성 및 상응하는 MCP 단백질에 대한 길항 활성을 보유하는 MCP 단백질의 신규한 변이체는 최초 분리된 변이체에 필적하거나 이들보다 우월하였다.

상기한 대안적 화합물은 특히 길항 활성의 관점에서 본원에 개시된 염기성 특성에 영향을 주지 않는 앞서 정의된 MCP 변이체의 서열에서 변화를 보유하는 분자를 포괄한다. 유사한 화합물은 인코딩 DNA의 통상적인 돌연변이유발 기술로부터, DNA 서열을 인코딩하는 수준에서 조합 기술(예, DNA 섞기, 파지 전시/선별)로부터,또는 컴퓨터-보조된 설계 연구, 이후 선행 기술과 하기 실시예에 기술된 바람직한 활성의 검증으로부터 유도될 수 있다.

특정 길항제는 앞서 정의된 MCP 변이체의 펩티드 유사물질 형태로 수득될 수 있는데, 펩티드 또는 폴리펩티드의 본성이 아미노산 측쇄, 아미노산 키랄성(chirality) 및/또는 펩티드 골격의 수준에서 화학적으로 변화된다. 이런 변화는 유사하거나 향상된 치료, 진단 및/또는 약동학적 특성을 보유하는 MCP 길항제의 제공을 목적으로 한다.

가령, 펩티드가 개체에 주사된 이후 펩티다제 절단에 대한 취약성이 문제가 되면, 절단불가능 펩티드 유사물질로 취약한 펩티드를 대체함으로써 좀더 안정하고, 따라서 치료제로써 좀더 유용한 펩티드를 제공할 수 있다. 유사하게, L-아미노산 잔기의 치환은 펩티드가 단백분해에 덜 민감하고, 최종적으로 펩티드 보다는 유기 화합물에 좀더 유사하도록 하는 표준 방법이다. 아미노-말단 차단기, 예를 들면 t-부틸옥시카르보닐, 아세틸, 테일, 숙시닐, 메톡시숙시닐, 수베릴, 아디필, 아젤라일, 단실, 벤질옥시카르보닐, 플루오레닐메톡시카르보닐, 메톡시아젤라일, 메톡시아디필, 메톡시수벨릴, 2,4-디니트로페닐 역시 유용하다. 증가된 효능, 연장된 활성, 용이한 정제 및/또는 증가된 반감기를 제공하는 다른 많은 변형 방법이 당분야에 공지되어 있다(WO 02/10195; Villain M et al., 2001).

펩티드 유사물질에 포함되는 아미노산의 바람직한 대안적 "유의성"군은 표 Ⅱ에 정의한다.

펩티드 유사물질 및 비-펩티드 유사물질의 합성과 개발 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다(Sawyer TK, 1997; Hruby VJ and Balse PM, 2000; Golebiowski A et al., 2001). 단백질 구조와 기능을 탐침하거나 향상시키기 위하여 시험관내와 생체내 번역 체계를 이용하여 비-자연 아미노산을 단백질에 통합시키는 다양한 방법 역시 기존 문헌에서 개시한다(Dougherty DA, 2000). MCP-1에 고도로 상동하지 않은 MCP-1 길항제 펩티드 유사물질은 기존 문헌에서 보고한다(Kaji M et al., 2001).

본원에서는 앞서 정의된 아미노산 서열 및 상응하는 MCP 단백질 이외의 다른 단백질 서열에 속하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 MCP 길항제로 개시한다. 이질성 후자 서열은 길항 활성을 현저하게 손상시키거나 GAG 결합 특성을 제공하지 않으면서 추가적인 특성을 제공한다. 이런 추가적인 특성의 예는 용이한 정제 과정, 체액에서 연장된 반감기, 또는 세포외 국지화이다. 이런 후자 특징은 상기 정의에 포함된 특정한 융합이나 키메라 단백질 군을 정의하는데 특히 중요한데, 그 이유는 후자 서열이 본원에서 MCP 길항제로 정의된 분자가 이들 펩티드의 분리와 정제를 용이하게 하고 MCP 단백질과 이들의 수용체가 자연적으로 상호작용하는 공간에 국지화될 수 있도록 하기 때문이다.

(c)의 폴리펩티드/펩티드를 생성하는데 이용할 수 있는 다른 단백질 서열은 막-결합 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역, 다량체화(multimerization) 도메인, 세포외 단백질, 신호 펩티드-보유 단백질, 이출 신호-보유 단백질이다. MCP 단백질의 변이체에 융합되는 이들 서열중 한가지이상의 선택은 상기 작용제의 특정 용도에 적합된다. 일반적으로, 이들 융합 단백질은 이들을인코딩하는 핵산 분절을 만들고, 통상적인 유전자 조작 기술을 이용하며, 에피솜이나 비-상동성/상동성 통합된 벡터 및 형질전환-, 감염- 또는 트랜스펙션-기초한 기술을 이용하여 진핵이나 원핵 숙주 세포의 변형에 이용되는 바이러스 또는 플라스미드 기원의 복제가능 벡터에 클로닝함으로써 생산할 수 있다. 이들 벡터는 세포에서 본질적으로 활성화되거나 유도가능한 자체 전사 개시/종결 조절 서열의 통제하에 원핵이나 진핵 숙주 세포에서 MCP 길항제를 포함하는 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 이후, 이런 세포에서 실질적으로 풍부한 세포주를 분리하여 안정적인 세포주를 제공할 수 있다.

세포외 이출 신호, 또는 신호-펩티드 보유 단백질의 서열의 경우에서처럼 부가적인 단백질 서열에 의해 MCP 길항제가 세포외 공간에서 분비될 수 있는 경우에는 상기 작용제가 후속 가공의 관점에서 좀더 용이하게 수집되고 정제될 수 있다, 또는 대안으로 이들 세포가 직접 사용되거나 투여될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드와 펩티드는 바람직한 이용 및/또는 생산 방법에 따라 선호되는 다른 형태, 예를 들면 활성 분획물, 전구물질, 염, 유도체, 공액체 또는 복합체일 수 있다

"활성"은 이런 대안적 화합물이 본 발명의 MCP 변이체의 기능적 특징을 유지하고, 제약학적으로 수용가능하고 유용하다는 것을 의미한다.

"분획물"은 단독으로 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 최초 폴리펩티드/펩티드의 응집체)와 공동으로 화합물 자체의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편을 의미한다. 이런 분자는 정상적으로 주요 서열을 변화시키지 않는 다른 변형, 예를 들면 펩티드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도(아세틸화 또는 카르복실화)로부터 파생될 수도 있는데, 이들 분자는 인산화(포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌 잔기의 도입)또는 당화(당화에 영향을 주는 효소, 예를 들면 포유동물 당화 또는 탈당화 효소에 펩티드 노출)의 패턴을 변화시켜 만든다.

"전구물질"은 세포 또는 체내에 투여 전후에 대사와 효소 공정에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 화합물이다.

본 명세서에서 "염"은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 이의 유사체에서 카르복실기의 염과 아미노기의 산부가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생산될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산부가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 이들 염은 본 발명의 펩티드와 폴리펩티드 또는 이들의 유사체와 실질적으로 유사한 활성을 보유한다.

본 명세서에서 "유도체"는 공지된 방법에 따라 아미노산 부분의 측면 사슬 또는 N-/C-말단 작용기에 존재하는 기능기로부터 파생되는 유도체를 의미한다. 이런 유도체에는 카르복실기의 에스테르 또는 지방족 아마이드 및 아실기(예, 알카노일- 또는 아로일-기)로 형성된 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 유리 하이드록실기의 O-아실 유도체등이 포함된다.

본 발명에 따른 MCP 길항제의 유용한 공액체 또는 복합체는 수용체 또는 다른 단백질과의 상호작용, 치료 효능, 또는 약물 전달 효능의 측면에서 향상을 위한 당분야에 공지된 분자와 방법(방사성이나 형광 라벨, 비오틴), 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 자연이나 합성 중합체를 이용하여 발생시킬 수 있다(Pillai 0 andPanchagnula R, 2001).

본 발명의 화합물은 상기한 재조합 DA-관련된 기술 및 화학적 합성 기술을 비롯한 당분야에 공지된 과정에 따라 만들 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 MCP 변이체를 코딩하는 DNA 서열 및 이들 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열이다. "실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열"은 유전자 코드의 축중(degeneracy)에 의하여 일정한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 다른 핵산 서열을 포괄한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 이런 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 형질전환된 세포를 적절한 배양 배지에서 배양하고 발현된 단백질을 회수하는 본 발명에 따른 MCP 길항제의 제조 방법에 관한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 적절한 플라스미드에 삽입하고 결찰시킬 수 있다. 일단 형성된 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입하고, 이후 상기 벡터를 발현시켜 원하는 단백질을 산출한다.

본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현은 적절한 발현 벡터를 이용하여 진핵 세포(예, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포) 또는 원핵 세포에서 실행할 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

가령, 본 발명의 방법으로 수득되는 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 당분야에 공지된 기술로 적절하게 작제된 발현 벡터에 삽입한다. 이중 가닥 cDNA는 동종중합성 테일링(homopolymeric tailing)으로, 또는 합성 DNA 링커 또는 평활-말단 결찰 기술을 수반하는 제한 결합(restriction linking)으로 플라스미드 벡터에 결합시킨다: DNA 분자는 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시키고, 원치않는 결합은 알칼린 포스파타아제로 처리하여 예방한다.

발현 벡터는 원하는 단백질을 발현하기 위하여, 상기 단백질의 유전자 발현과 생산이 가능하도록 이런 단백질을 코딩하는 DNA에 결합된 전사와 번역 조절 정보를 보유하는 특정 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다. 먼저, 유전자를 전사하기 위하여 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터가 선행되어야 하는데, 상기 중합효소는 프로모터에 결합하여 전사 과정을 개시한다. 서로 다른 효능(강한 프로모터와 약한 프로모터)으로 작용하는 다양한 프로모터가 현재 사용되고 있다.

진핵 숙주에서, 숙주의 본성에 따라 서로 다른 전사와 번역 조절 서열을 이용할 수 있다. 이들은 바이러스 소스, 예를 들면 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 조절 신호는 높은 수준으로 발현되는 특정 유전자와 연관된다. 예는 포진 바이러스의 TK 프로모터, SV40 조기 프로모터, 효소 gal4 유전자 프로모터 등이다. 유전자의 발현을 조절할 수 있는 억제 및 활성화 가능한 전사 개시 조절 신호를 선택한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자는 작동가능하게 결합된 전사와 번역 조절 신호를 보유하는 벡터에 삽입하는데, 상기 벡터는 원하는 유전자 서열을 숙주 세포에 통합할 수 있다.

도입된 DNA에 의해 안정적으로 형질전환된 세포는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나이상의 마커를 도입함으로써 선별할 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 광영양성(phototrophy), 살생제, 예를 들면 항생제, 구리와 같은 중금속 저항성 등을 제공할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 직접 연결되거나 동시-트랜스펙션에 의해 동일 세포에 도입될 수 있다.

또한, 벡터의 추가적인 요소가 본 발명에 따른 단백질의 최적 생산, 특히 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 보유하는 특정 세포의 선별을 달성하는데 유용할 수 있다: 벡터를 보유하지 않는 수용자 세포로부터 벡터를 보유하는 수용자 세포를 인식하고 선별하는 용이성; 특정 숙주에서 원하는 벡터의 사본 수; 서로 다른 종의 숙주 세포 사이에 벡터를 이동시킬 수 있는 지의 여부.

DNA 구조체를 보유하는 벡터 또는 DNA 서열이 발현용으로 제조되면, 상기 구조체는 다양한 수단: 형질전환, 트랜스펙션, 접합, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 인산칼슘-침전, 직접 미세주사 등으로 적절한 숙주 세포에 도입할 수 있다.

숙주 세포는 원핵 또는 진핵이다. 진핵 숙주, 예를 들면 사람, 원숭이, 생쥐, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포가 바람직한데, 그 이유는 이들이 정확한 접힘 또는 정확한 위치에서 당화를 비롯한 단백질 분자에 번역후 변형을 제공하기 때문이다. 효모 세포 역시 당화를 비롯한 번역후 펩티드 변형을 진행할 수 있다. 효모에서 원하는 단백질의 생산에 이용될 수 있는 강한 프로모터 서열 및 많은 사본 수의 플라스미드를 활용한 다수의 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 클론된 포유동물 유전자 산물에서 리더 서열을 인식하고 리더 서열(즉, 전-펩티드)을 보유하는 펩티드를 분비한다.

벡터의 도입이후, 숙주 세포는 벡터-보유 세포의 성장을 선별하는 선택 배지에서 성장시킨다. 클론된 유전자 서열의 발현은 원하는 단백질의 생산을 결과한다.

본 발명의 이들 목적은 MCP 단백질의 길항제에 대한 본원의 개시 및 통상적인 분자 생물학 기술에 관한 지식을 통합함으로써 달성할 수 있다. 여러 개관 (Makrides SC, 1999)과 문헌에서는 벡터 및 원핵이나 진핵 숙주 세포를 이용하여 재조합 단백질을 클론하고 생산하는 방법에 관한 교시를 제시한다[참조: "A Practical Approach" published by Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001].

화학적 합성 기술의 예는 고체상 합성과 액체상 합성이다. 고체상 합성에서, 합성되는 펩티드의 C-말단에 상응하는 아미노산은 유기 용매에 불용성인 지지체에 결합하고, 교대되는 반응: 아미노기 및 적절한 보호기로 보호된 측쇄 기능기를 보유하는 아미노산이 C-말단에서 N-말단 방향으로 하나씩 압축되는 반응; 수지 또는 펩티드의 아미노기의 보호기에 결합된 아미노산이 방출되는 반응의 반복으로 펩티드 사슬이 확장된다. 고체상 합성 방법은 사용되는 보호기에 따라 크게 tBoc 방법과 Fmoc 방법으로 구분된다. 전형적인 보호기는 아미노기의 경우에 tBoc(t-부톡시카르보닐), CI-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐), Br-Z(2-브로모벤질옥시카르보닐),Bz(벤질), Fmoc(9-플루오르에닐메톡시카르보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈하이드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카르보닐), Cl₂-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노기의 경우에 N0₂(니트로)와 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 하이드록실기의 경우에 tBu(t-부틸)이다. 원하는 펩티드의 합성이후, 탈보호 반응을 실시하고 고형 지지체로부터 절단한다. 이런 펩티드 절단 반응은 Boc 방법의 경우에 불화수소 또는 트리플루오르메탄 설폰산, Fmoc 방법의 경우에 TFA로 실행할 수 있다. 완전 합성 MCP 단백질은 기존 문헌에서 개시한다(Brown A et al., 1996).

본 발명의 자연, 합성 또는 재조합 MCP 길항제의 정제는 이런 목적으로 공지된 방법, 다시 말하면 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 등을 수반하는 임의의 통상적인 과정으로 실행할 수 있다. 본 발명의 단백질을 정제하는데 우선적으로 이용될 수 있는 다른 정제 과정은 표적 단백질에 결합하고 칼럼내에 포함된 겔 매트릭스에서 생산되고 고정되는 단클론 항체 또는 친화성 작용기를 이용한 친화성 크로마토그래피이다. 단백질을 함유하는 불순한 제형은 칼럼에 통과시킨다. 단백질은 헤파린 또는 특이적인 항체에 의해 칼럼에 부착되고, 반면 불순물은 통과하게 된다. 세척이후, 단백질은 pH 또는 이온 강도에서 변화로 겔로부터 용리시킨다. 대안으로, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 이용할 수 있다. 용리는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 물-아세토니트릴-기초한 용매를 이용하여 실행할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 정제된 제형을 포괄한다. 본 명세서에서 정제된 제형은 본 발명에 따른 화합물의 건조 중량당 적어도 1%. 적절하게는 적어도 5%인 제형을 의미한다.

본 발명의 또 다른 목적은 앞서 정의된 MCP 길항제의 약물로써 용도, 특히 수용체를 발현하는 백혈구의 과도한 이동과 활성화를 초래하는 MCP 단백질의 바람직하지 않은 활성에 관련된 질환, 예를 들면 자가면역 질환과 염증 질환 및 박테리아와 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 제약학적 조성물(제약학적으로 수용가능한 담체, 부형제, 안정제 또는 희석제와 공동으로 제제화)에서 활성 성분으로써 용도이다. 이런 질환의 무-제한적 예는 아래와 같다: 관절염, 류머티스 관절염(RA), 건선성 관절염, 건선, 골관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 전신 경화증, 경피증(scleroderma), 다발성근염(polymyositis), 사구체신염, 섬유증, 폐 섬유증, 알레르기나 과민증 질환, 피부염, 지연형 과민증이나 DTH로 불리는 IV형 과민증, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 패혈성 쇼크, HIV-감염, 장기이식, 이식편-숙주 질환(GVHD), 자궁내막염, 췌장염, 갑상선염(thyroiditis), 뇌척수염.

기존 문헌에 비추어, MCP 단백질 길항제는 MCP 단백질의 바람직하지 않는 활성에 연관된 다른 질환, 예를 들면 혈관 질환(관상동맥 개입이후 재협착, 동맥 경화증, 죽상경화증, 허혈, 뇌졸증) 또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 제약학적 조성물에서 활성 성분으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 MCP 단백질 길항제의 효과량을 투여하여 상기한 질환의 치료하거나 예방하는 방법이다.

제약학적 조성물은 MCP 길항제 이외에, 동물 투여에 적합한 제약학적으로 수용가능한 담체, 생물학적으로 적합한 운반제, 첨가제를 함유하고, 제약학적으로 사용될 수 있는 제형으로 활성 화합물의 가공을 조장하는 보조성분(예, 부형제, 안정제 또는 희석제)을 선택적으로 함유한다. 이런 조성물은 본 발명의 MCP 변이체와 상승적으로 또는 정합 방식으로 작용하는 다른 치료 조성물과 선택적으로 병용될 수 있다. 가령, CC-케모킨 길항제의 유사한 상승적 특성이 사이클로스포린과의 병용에서 확인되었다(WO 00/16796). 대안으로, 다른 조성물은 특정 질환에 길항하는 것으로 알려진 화합물(예, 다발성 경화증의 경우에 IFN-베타, 류머티스 관절염의 경우에 가용성 TNF 수용체)을 기초할 수 있다.

제약학적 조성물은 투여 양식의 필요를 충족시키는 수용가능한 방식으로 제제화될 수 있다. 가령, 약물 전달을 위한 생체적합물질(biomaterial)과 다른 중합체의 이용 및 특정 투여 양식을 유효하게 하는 상이한 기술과 모델은 기존 문헌에서 개시한다(Luo B and Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).

"효과량"은 질환의 진행과 심각도에 영향을 주어 이런 병리의 감소 또는 퇴행을 유도할 수 있을 만큼 충분한 활성 성분의 양을 의미한다. 효과량은 투여 경로 및 환자의 상태에 좌우된다.

"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 제제화될 수 있다.

당업자는 임의의 승인된 투여 양식을 이용하고 확정하여 활성 성분의 바람직한 혈액 수준을 확립할 수 있다. 가령, 투여는 장관외 경로, 예를 들면 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 비내, 경피, 직장, 경구 또는 협측 경로로 실행할 수 있다. 장관외 투여는 거환 주사 또는 시간 경과에 의한 점진적인 관류로 실행할 수 있다. 장관외 투여용 제형에는 무균 수성이나 비-수성 용액, 현탁액, 에멀젼 등이 포함되는데, 이들은 당분야에 공지된 보조제 또는 부형제를 함유하고 통상적인 방법에 따라 만들 수 있다. 이에 더하여, 적절한 유성 주사 현탁액으로써 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 운반제는 지방 오일, 예를 들면 참깨 기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드이다. 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유하는 수성 주사 현탁액의 예는 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 및/또는 덱스트란이다. 선택적으로, 현탁액은 안정제를 함유할 수도 있다. 제약학적 조성물은 주사 투여에 적합한 용액을 포괄하고, 부형제와 함께 대략 0.01 내지 99%, 적절하게는 대략 20 내지 75%의 활성 화합물을 함유한다. 직장으로 투여될 수 있는 조성물은 좌약을 포괄한다.

투여되는 용량은 수용자의 연령, 성별, 건강, 체중; 병행 치료의 종류; 치료 빈도; 요구되는 효과의 특성에 좌우된다. 용량은 개별 피험자에 맞춤되고, 당업자에 의해 인식되고 결정될 수 있다. 각 치료에 요구되는 총량은 복수 분량 또는 단일 분량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 단독으로, 또는 상기 질환이나 이런 질환의 다른 증상을 표적하는 다른 치료제와 공동으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 일일 용량은 체중 ㎏당 0.01 내지 100 ㎎이다. 분할된 분량 또는 서방 형태로 제공되는 일일 1 내지 40 ㎎/㎏로 원하는 결과를 달성할 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 피험자에 투여된 최초 또는 이전 분량과 동일한 분량, 좀더 적은 분량, 또는 좀더 많은 분량으로 실행할 수 있다.

본 발명은 특정 구체예와 연계하여 기술하였지만, 특허청구범위의 기술적 사상과 목적을 벗어나지 않는 당해 기술분야의 평균적 기술자에게 자명한 모든 개변은 본 발명에 포섭된다.

본 발명은 아래의 실시예로 기술하지만, 이들 실시예는 본 발명을 한정하지 않는다. 실시예에서는 하기에 명시된 도면을 참조한다.

실시예 1: 비-헤파린 결합 MCP-1 변이체 MCP-1WT*2A의 시험관내 특성화

재료와 방법

MCP-1 변이체 MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A의 발현.

MCP-1 변이체는 사람 MCP-1(hMCP-1; 도 1; SEQ ID NO: 1), 특히 선조 분자(SWISSPROT Acc. NㅀP13500)의 24-99 분절에 상응하는 사람 MCP-1의 변이형을 코딩하는 DNA 서열의 시험관내 PCR-기초한 돌연변이유발로 발생시켰다.

먼저, 사람 MCP-1(24-99)을 코딩하는 서열의 N-말단에 메티오닌 시작 코돈이 부가되고 메티오닌(전구물질에서 87번 성숙 단백질에서 64번 아미노산)이 이소루이신으로 대체된 MCP-1WT*라고 하는 활성 변이 MCP-1 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 만들었다. 이런 치환은 MCP-1의 전형적인 특성에 영향을 주지 않으면서, 플라스미드가 대장균(E. coli)의 발현에 사용되는 경우에 메티오닌 설폭사이드를 보유하는 원치않는 MCP-1 화학종의 형성을 예방한다(Paavola CD et al, 1998). MCP-1WT*라고 하는 생성 서열은 pET3 플라스미드(Paavola CD et al, 1998)에 기초한 플라스미드를 77개 잔기를 보유하는 단백질(도 1A; SEQ ID NO: 2)로 이용하여 대장균(E. coli)에 클론하고 발현시켰다.

이후, MCP-1WT*를 발현하는 플라스미드는 사람 MCP-1 전구물질의 41번과 42번 위치(성숙 단백질에서 18번과 19번 위치)에서 아르기닌과 리신 대신에 2개의 알라닌을 인코딩하는 PCR 단편을 클로닝하여 돌연변이시키고, MCP-1WT*와 동일한 길이 및 정제 특징을 보유하는 MCP-1 변이체 MCP-1WT*2A(도 1; SEQ ID NO: 3)를 발생시켰다.

모든 구조체는 표준 분자 생물학 기술(PCR 돌연변이유발과 증폭, DNA 서열분석, 제한 절단)로 수득하고 조절하며 클로닝 과정동안 대장균(E. coli)의 DH5알파 균주에 유지시켰다. 대장균(E. coli)에서 발현을 위한 코돈 활용을 최적화하는 코딩 서열을 선택하였다(Kane JF, 1995).

이후, MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A를 인코딩하는 pET3-기초한 플라스미드는 TAP302라고 하는E. coliBL21(pLys)-유래된 균주에 이전하고, 생성 균주는 MCP-1 변이체의 재조합 발현에 이용하였다(Paavola CD et al, 1998). 이런 프로토콜은 N-말단 메티오닌을 제거하기 위한 아미노펩티다제의 이용을 수반하고, 따라서 자연 성숙 형태와 동일한 길이를 보유하는 재조합 MCP-1 변이체(76개 아미노산; 도 1B)를 수득한다. 재조합 단백질의 실체는 질량 분광법으로 확증하였다.

MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A의 크로마토그래피 분석.

MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A는 Heparin Sepharose 칼럼 또는 SP Sepharose 양이온 교환 칼럼에 적하하였다. 양 경우에, 칼럼은 10 mM 인산칼륨(pH 7.5)에서 평형시키고, 단백질은 동일 완충액에서 0 내지 1 M NaCl의 선형 구배로 용리하였다.

MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A의 헤파린 결합 분석.

0.02-30 μM 범위를 커버하는 인산염 완충액(PBS)에서 MCP-1WT* 변이체의 연속 희석액은 37℃에서 1시간동안 170 nM [³H]-헤파린과 함께 배양하였다. 삼중의 20 ㎕ 각 시료는 니트로셀룰로오스 필터가 구비된 96 웰 P81 Unifilter 평판에 이전하였다. 평판은 진공 펌프를 이용하여 200 ㎕ PBS로 3회 세척하고, 결합되지 않은 표지된 헤파린을 제거하였다. 신틸레이션 액(50 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 베타 계측기에서 방사능을 계산하였다(1분/웰). 데이터는 Prism 프로그램(GraphPad Software)을 이용하여 분석하였다.

균형 경쟁 수용체 결합 분석

상기 분석은 Scintillation Proximity 분석법(SPA) 및 추적자로 [¹²⁵I]-MCP-1을 이용하여, MCP-1 수용체(CCR2)를 안정적으로 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래된 막에서 실시하였다. 방사성표지된 케모킨(2200 mCi/mole의 특이 활성)은 [¹²⁵I] 제공업체(Amersham)의 설명서에 따라 재조합 성숙 MCP-1로부터 발생시켰다. 경쟁자는 결합 완충액(50 mM HEPES pH 7.2, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.15M NaCl, 0.5% BSA)에서 표지되지 않은 MCP-1 변이체의 연속 희석액(범위 10^-6- 10^-12M)으로 준비하였다.

밀 배아 SPA 비드(Amersham)는 PBS에서 50 ㎎/㎖로 부유시키고 결합 완충액에서 10 ㎎/㎖로 희석하며, 상기 분석에서 최종 농도는 0.25 ㎎/웰이었다. CCR2를 발현하는 막은 -80℃에 저장하고 결합 완충액에서 80 ㎍/㎖로 희석하였다. 최종 막 농도는 2 ㎍/웰이었고, [¹²⁵I]-MCP-1의 최종 막 농도는 0.1nM이었다. 평판은 4시간동안 교반하면서 실온에서 배양하였다. 방사능은 베타 계측기에서 계산하였다(1분/웰). 삼중 시료로부터 데이터는 Grafit 프로그램(Erithacus Software)을 이용하여 분석하였다.

결과

기존 문헌에서는 MCP-1의 헤파린/GAG 결합 특성을 검사하는데 상이한 접근 방식을 보여준다(Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999; Ali S et al., 2001; Patel D et al., 2001; Chakravarty L et al, 1998).

서열이 사람 MCP-1의 성숙 형태에 기초하는 MCP-1의 2가지 변이체(도 1)는 대장균(E. coli)에서 발현시켰다. 첫 번째 변이체, MCP-1WT*는 MCP-1의 전형적인 결합 특성과 활성을 간섭하지 않으면서 메티오닌 산화의 가능성을 예방하도록 돌연변이된 성숙 사람 MCP-1 전구물질에 상응한다(Paavola CD et al, 1998). 이런 "활성" 변이체의 서열에 기초하여, N-말단에서 이중염기성 위치가 알라닌 잔기로 부가적으로 치환된 두 번째 변이체, MCP-1WF*2A를 발현시켰다.

먼저, MCP-1 특성에 대한 후자 치환의 효과는 헤파린 크로마토그래피로 검사하였다. 크로마토그래피 칼럼에 적용된 2가지 변이체의 용리 프로필은 현저하게 상이한데, 그 이유는 MCP-1WT*를 용리하는데 요구되는 NaCl의 농도가 0.54 M NaCl인 반면, MCP-1WT*2A는 0.24 M NaCl에서 용리되었기 때문이다. SP Sepharose 칼럼 에서 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하면 좀더 작은 차이가 측정되었다(0.55 M NaCl vs. 0.27 M NaCl).

이런 크로마토그래피 매체에서 용리 프로필의 비교 결과는 헤파린 결합 특성에 대한 염기성 아미노산에 기인한 비-특이적 정전 상호작용의 기여에 대한 정성적 시도를 제공한다(Proudfoot A et al., 2001). 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻어진 NaCl 농도에서 차이는 헤파린 크로마토그래피에서 얻어진 차이로부터 삭감한다. 이런 방법에 따라, 결과의 수치가 양(본원에서 0.02 M)이면, 헤파린과의 특이적인 상호작용이 MCP-1WT*2A에서 돌연변이된 이중염기성 위치에 연관한다고 결론할 수 있다.

이후, 삼중수소화된 헤파린 및 대장균(E. coli) 발현된 MCP-1 변이체의 연속 희석액을 이용하여 헤파린에 결합을 직접 측정하였다(도 2). 단백질-헤파린 복합체는 희석액을 니트로셀룰로오스 필터에 첨가하여 분리하였다. 이런 지지체는 단백질을 효과적으로 유지할 수 있고, 따라서 단백질에 결합된 방사성표지된 헤파린의 양을 평가할 수 있다. 이런 방식으로 MCP-1WT*2A의 헤파린 결합 특성은 MCP-1WT*에 비하여 현저하게 감소하는 것으로 확인되었다.

최종적으로, 균형 경쟁 수용체 결합 분석을 실시하여 특이적인 수용체 CCR2의 결합에 대한 MCP-1WT*2A의 감소된 헤파린 결합 특성의 효과를 입증하였다(도 3). 2가지 변이체중 한가지 또는 MCP-1의 연속 희석액과 혼합된 방사성표지된 MCP-1을 보유하는 시료는 CCR2를 안정적으로 발현하는 CHO 세포로부터 준비된 막과 함께 배양하였다. MCP-1WT*와 MCP-1 단백질은 거의 동일한 결합 프로필을 보이는 반면, MCP-1WT*2A 변이체는 CCR2에 대한 친화성에서 20배 감소를 보이는데, 그 이유는 상기 변이체가 다른 2가지 검사 단백질의 0.08ㅁ 0.045 nM과 비교하여 1.73ㅁ 0.6 nM의 IC₅₀을 보유하기 때문이다. 이런 결과는 높은 친화성이 헤파린-결합 결함성 MCP-1 변이체에 유지된다는 것을 입증한다.

실시예 2: 세포 동원의 모델에서 비-헤파린 결합 MCP-1 변이체의 특성화

재료와 방법

주화성 분석

상기 분석은 5 μm 구멍 크기 막(Neuroprobe)이 구비된 24-웰 트랜스웰 주화성 챔버(Costar)에서 사람 친-골수성 세포주(THP-1)를 이용하여 실시하였다. 재조합 MCP-1 단백질은 5% 불활화된 소 태아 혈청(FCS), 2 mM 글루타민, 25 mM HEPES(pH 7.2)을 함유하는 600 ㎕ RPMI 배지에서 연속으로 희석하였다(범위 10^-6- 10^-12M). 이들 시료는 하부 웰에 위치시키고, 반면 THP-1 세포(동일 배지에서 10x 10⁶세포/㎖의 100 ㎕ 세포 현탁액)는 삽입체에 위치시켰다. 챔버는 5% CO₂하에 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 이후, 시료는 1.5 ㎖ 튜브에 이전하고 200xg에서 5분동안 원심분리하였다. 펠렛된 세포는 100 ㎖ PBS에 재부유시키고 Coulter 계측기(Beckman)에서 계산하였다. 데이터는 Prism 프로그램(GraphPad Software)으로 분석하였다.

복막 세포 동원 분석

세포 동원은 0.2-㎖ 무균의 리포폴리사카라이드-없는 PBS에 희석된 10 ㎍ 재조합 MCP-1WT* 또는 MCP-1WT*2A 단백질을 8 내지 12주령의 암컷 BALB/c 생쥐의 복강내 주사하여 유도하였다. MCP-1WT*2A의 길항 특성을 검사하는 경우에, 동일한 0.2 ㎖ 무균 용액에 희석된 단백질의 지정된 양을 항진제(MCP-1WT*) 투여 30분전에 투여하였다. 생쥐는 항진제 투여 16시간후에 연무화된 CO₂로 희생시키고, 복강 세척(peritoneal lavage)은 5 ㎖ PBS로 3회 실시하였다. 세척액은 모으고 600xg에서 10분동안 원심분리하며, 펠렛된 세포는 1 ㎖ 최종 부피로 재부유시키고, 완전 유도된 백혈구는 혈구계측기로 계산하였다.

세포 동원 분석은 MCP-1에 관련된 서로 다른 단백질을 특성화하는데 이용되고 있다(Ajuebor MN et al., 1998; Reckless J and Grainger DJ, 1999; Kaji Met al., 2001).

사람 단핵구(THP-1 세포주)에 대한 주화성 분석에서 MCP-1WT*2A로부터 얻어진 결과는 실시예 1에 기술된 수용체-결합 분석에서 얻어진 결과와 일치한다. MCP-1WT*2A는 기준선의 9배 증가를 유도하는 야생형 단백질의 1 nM에 비하여 10 nM에서 최대 활성이 관찰되긴 했지만, 강한 THP-1 주화성 반응(기준선의 6배)을 유도할 수있었다(도 4).

MCP-1의 길항제 또는 항진제로써 MCP-1WT*2A의 활성은 복막 세포 동원 분석을 이용하여 평가하였다(도 5). MCP-1WT*와 MCP-1WT*2A를 투여하는 경우에, 헤파린-결합 결함성 변이체는 MCP-1WT*가 실질적인 동원을 유도하는 용량(10 ㎎/mouse)에서 복막으로 세포 동원을 유도할 수 없었다. 더 나아가, MCP-1WT*2A를 MCP-1WT* 투여 30분전에 투여하면, MCP-1WT*에 의해 유도되는 세포 동원이 용량-의존 방식으로 현저하게 길항되었다. 따라서, MCP-1에서 GAG-결합을 파괴하면, MCP-1에 유도되는 세포 동원을 생체내에서 저해할 수 있는 MCP-1의 길항제가 생성된다.

실시예 3: 동물-기초한 모델에서 비-헤파린 결합 MCP-1 변이체의 특성화

재료와 방법

지연된 접촉 과민증 모델

접촉 과민증을 측정하는 생쥐 귀-부종 검사를 실시하였다(Garrigue JL et al., 1994). 간단히 말하면, 생쥐는 아세톤/올리브 오일(4:1)에 녹인 25 ㎕의 0.5% 2,4-디니트로플루오르벤젠(DNFB; SigmaChemical Co.)을 털이 제거된 복부에 국소 주입하여 미리 감작화시켰다. 5일후, 동일 운반제에 녹인 20 ㎕의 0.2% DNFB를 오른쪽 귀에 주입하고, 운반제 단독을 왼쪽 귀에 주입하였다. 생쥐는 D5에서 D9까지 0.5 ㎎/㎏(10 ㎎/mouse) MCP-1WT* 또는 PBS 단독(대조군)의 복강내 투여로 매일 처리하였다. 첫 번째 처리는 DNFB 공격 1시간전에 주입하였다. 귀 두께는 다이알 두께 게이지(Mitutoyo Corp.)로 측정하고, 귀 부종은 공격후 수치에서 공격전 수치를 감하고, 운반제-공격된 반대쪽 귀에서 탐지된 부종을 추가로 감하여 산정하였다.

블레오마이신 유도된 폐 섬유증 모델

C57BL/6 암컷 생쥐(25 ㎕ PBS에서 3.75 U/kg)에 블레오마이신을 기관내 주입하였다(0일). 블레오마이신 주입 1시간후, 검사 동물은 0.2 ㎖ PBS에 녹인 0.25 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A 또는 0.2 ㎖ PBS 단독을 복강내 주입하였다. 이런 처리는 10일동안 매일 제공하였다. 체중 감소와 치사율은 매일 기록하였다. 10일에, 모든 생쥐는 CO₂질식으로 희생시켰다. 4개의 폐엽(lung lobe)은 콜라겐 침착의 지표인 하이드록시프롤린 수준의 측정하기 위하여 -80℃에 위치시키고, 1개의 폐엽은 폐 섬유증의 조직학적 결정을 위하여 가공하였다. 전체 폐 콜라겐은 하이드록시프롤린의 분석으로 결정하였다. 간단히 말하면, 폐는 Tissue Tearor로 Tris-HCl(pH 7.6)에서 균일화시키고, 이후 115℃에서 하룻밤동안 Amberlite에 배양하였다. 시트레이트/아세테이트 완충액, 이소프로판올, 클로라민-T, DAB 용액을 시료에 첨가하고 60℃에서 30분동안 방치하였다. 시료는 실온에서 10분동안 냉각하고 분광광도계에서 560 nm에서 판독하였다. 폐 섬유증은 오른쪽 폐엽을 10% 포르말린에 고정하고, 이후 파라핀에 포매시키고 절단하며 Masson 트리크롬 용액으로 염색하여 조직학적으로 결정하였다. 조직학적 변화는 광 현미경으로 검사하였다. 반-정량적 점수화 방법을 이용하여 블레오마이신-유도된 폐 염증과 섬유증을 형태학적으로 평가하고 섬유증 부위의 비율을 추정하였다.

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델

암컷 생쥐(8-주령; C57 BL/6NCrlBR 균주; 18-22 g 체중)는 완전 프레운드 어쥬번트(CFA; Difco Lab.)에서 MOG_35-55펩티드(200 ㎎)와 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(500 ㎎)을 보유하는 0.2 ㎖ 에멀젼을 왼쪽 옆구리에 피하 주사하여 0일에 면역화시켰다. 직후에, 백일해 독소(0.5M NaCI, 15 mM Tris(pH 7.5), 0.017% Triton X-100을 함유하는 400 ㎕ 완충액에서 500 nanogram)를 복강내 투여하였다. 2일에, 동물은 백일해 독소를 함유하는 동일 용액을 2차로 복강내 주사하였다. 7일에, 생쥐는 CFA에서 2차 용량의 MOG_35-55펩티드(200 ㎍)를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 이런 과정은 대략 18-20일에 발병을 유도하는데, 꼬리에서 시작하여 앞다리까지 점진적으로 진행성 마비가 나타난다.

처리는 실험 7일(통상적인 발병으로부터 대략 1-3일전)에 각 동물에서 시작하여 21일동안 지속하였다. 7일부터 시작하여, 동물은 아래와 같은 임상적 스코어로 마비의 존재를 개별적으로 검사하였다:

0 = 병의 징후 없음

0.5 = 부분적인 꼬리 마비

1 = 꼬리 마비

1.5 = 꼬리 마비 + 한쪽 뒷다리 부분적인 마비

2 = 꼬리 마비 + 뒷다리 약화 또는 뒷다리 부분적인 마비

2.5 = 꼬리 마비 + 뒷다리 부분적인 마비(낮춰진 골반)

3 = 꼬리 마비 + 뒷다리 완전 마비

3.5 = 꼬리 마비 + 뒷다리 완전 마비 + 요실금

4 = 꼬리 마비 + 뒷다리 마비 + 앞다리의 약화 또는 부분적인 마비

5 = 죽음.

본 실험은 아래와 같이 각 10마리의 3가지 동물군으로 실시하였다. 1군은 양성 대조이고 PBS로 처리하였다. 2군은 0.05 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A의 복강내 주사로 매일 처리하였다. 3군은 0.5 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A의 복강내 주사로 매일 처리하였다. MCP-1WT*2A 변이체 단백질은 무균수에 용해시키고, 이후 무균 PBS(200 ㎖/mouse)에 희석하여 요구되는 농도를 달성하였다.

콜라겐 유도된 관절염(CIA) 모델

수컷 생쥐(8-12 주령; DBA/1 균주; 18-22 g 체중)는 완전 프레운드 어쥬번트(CFA; Difco Lab.)에서 소 Ⅱ형 콜라겐(100 ㎍; Morwell Diagnostics)과 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(400 ㎎)으로 구성되는 0.2 ㎖ 에멀젼을 꼬리 기부에 피내 주사하여 0일에 면역화시켰다.

대략 16-20일부터 염증의 징후가 나타나기 시작하여 하나이상의 다리에 영향을 주었다. 동물은 앞발과 뒷발의 발가락에서 염증의 존재에 대한 시각적 임상 점수에 기초하여, 질환 심각도를 임상 점수로 개별적으로 채점하였다.

0 = 병의 징후 없음

0.5 = 1 내지 5개의 발가락에서 염증의 징후가 나타남

1 = 6 내지 10개의 발가락에서 염증의 징후가 나타남

1.5 = 11 내지 15개의 발가락에서 염증의 징후가 나타남

2 = 16 내지 20개의 발가락에서 염증의 징후가 나타남.

전체 임상 점수 > 0.5를 보유하는 두 군(n = 10마리 생쥐)은 PBS(대조군) 또는 0.05 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A의 복강내 주사로 7일 연속 처리하였다. 모든 동물은 최종 처리하고 24시간후 희생시켰다.

난알부민 유도된 폐 염증(OVA) 모델

암컷 생쥐(8-10 주령; Balb/c 균주)는 200 ㎕의 전체 부피로 2 ㎎ 수산화알루미늄 2%(Serva)에 침전된 10 ㎍ 난알부민(Sigma)의 복강내 주사로 감작화시켰다. 수산화알루미늄 2%/난알부민 용액은 725 ㎕　LPS-없는 0.9% NaCl에서 25 ㎕ 난알부민(2 ㎎/㎖)과 250 ㎕ 수산화알루미늄을 혼합하여 준비하고 4℃에서 3-4시간동안 침전시켰다. 감작화(sensitization)하고 15일후, 생쥐는 6마리 군으로 아래와 같이 처리하고 공격하였다.

1군: LPS-없는 0.9% NaCl로 공격 및 PBS로 처리(기준선)

2군: 난알부민으로 공격 및 PBS로 처리(음성 대조)

3군: 난알부민으로 공격 및 0.5 ㎎/㎏ MCP-1WT*2A로 처리.

PBS 또는 MCP-1WT*2A는 5일 연속으로 각 공격 30분전에 복강내 주사(200 ㎕)로 투여하였다. 생쥐는 이소플루란으로 흡입 마취하에 난알부민(50 ㎕ LPS-없는 0.9% NaCl에 재부유된 15 ㎍ 침전된 난알부민)으로 비내 공격하였다. 공격후 72시에, 생쥐는 0.9% NaCl에 녹인 300㎕의 14% 우레탄(v:v)의 복강내 주사로 사멸시켰다. 기관(trachea)은 연결 조직이 남아있지 않도록 손질하고, 작게 절제하여 기관내에 0.75 ㎜ 직경의 카테터를 삽입하였다. 캐뉼러는 봉합사 조각으로 고정시키고 1-㎖ 주사기에 부착하였다. 폐는in situ에서 0.4 ㎖ PBS로 채웠다. 부드럽게 마사지한 이후, 폐로부터 유체를 뽑아내 세포를 분리하고 얼음 위의 플라스틱 튜브에 수집하였다. 이런 과정은 4회 반복하고, 각 동물로부터 회수된 세포 현탁액은 얼음 위에서 합쳐 대략 1.4 ㎖의 최종 부피를 제공하였다. 세포 계수는 세포 현탁액의 트립탄 블루(Trypan blue)로의 2배 희석액을 이용하여 혈구계측기로 실시하였다.

결과

MCP-1의 생체내 특성은 특히 유전자도입 생쥐를 이용하여 여러 문헌에서 특성화되었다(Lu B et al., 1998; Rutledge BJ et al., 1995). 이후, MCP-1WT*2A는 사람 염증과 질환의 동물 모델을 이용하여 검사하였는데, 이의 결과는 복막 세포 동원 모델을 이용하여 얻은 MCP-1 헤파린-결합 결함성 변이체의 길항 활성에 대한 결과를 확증하였다.

지연형 접촉 과민증은 T 세포에 의해 매개된 합텐-특이적 피부 염증을 귀 부종으로 측정하는 동물 모델이다. 혈청에서 높은 수준의 MCP-1을 본질적으로 생산하는 유전자도입 생쥐에서 강화된 접촉 과민증이 관찰되었다(Mizumoto N et al., 2001). 정상 생쥐의 귀 피부는 접촉 감작물질 2,4-디니트로플루오르벤젠(DNFB)을 합텐으로 이용하여 공격하였다. 결과의 부종은 전체 처리 기간동안 운반제 단독으로 처리된 생쥐에서 관찰된 효과와 비교하여, MCP-1WT*2A의 복강내 투여로 처리된 생쥐에서 현저하게 적었다(DNFB로 공격 시점부터)(도 6).

MCP-1WT*2A의 특성은 폐 염증/섬유증 모델에서 검사하였는데, 그 이유는 MCP-1이 폐 또는 피부 염증 과정에서 프로콜라겐(procollagen) 침착을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다(Hogaboam CM et al., 1999).

생쥐에서 블레오마이신의 기관내 주입은 각각 7 내지 10일 이내에 폐 염증과 섬유증을 유도하는데, 폐에서 콜라겐이 현저하게 축적되고 체중이 급속하게 감소하였다(Chen ES et al., 2001). 블레오마이신에 노출시키고, 1시간후 MCP-1WT*2A의 복강내 투여 또는 PBS 단독으로 처리한 생쥐에서 10일동안 체중을 기록하고, 블레오마이신으로 처리되지 않은 대조군과 비교하였다. 2일부터 분명하게, PBS-처리된 대조 생쥐는 MCP-1WT*2A 처리된 생쥐와 비교하여 현저하게 많은 체중이 감소하였다(도 7). 폐 섬유증과 염증은 10일에 동물을 사멸시킨 이후, 2가지 서로 다른 방법을 이용하여 평가하였다. 블레오마이신은 콜라겐 합성과 섬유증에 비례하여 폐 하이드록시프롤린 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Madtes DK et al., 1999). PBS 단독으로 처리된 생쥐에서 측정된 하이드록시프롤린 수준은 MCP-1WT*2A를 복강내 주입한 군에서 측정된 수준보다 현저하게 높았다. 실제로, 후자 군에서 상기 수준은 블레오마이신 처리되지 않은 생쥐에 필적하였다. 다른 반-정량적 조직학적 평가에서, 대조군과 비교하여 MCP-1WT*2A 처리된 군에서 섬유증의 전체 수준에서 현저한 감소가 확증되었다(도 8).

MCP-1에 대한 항체 및 기능적 MCP-1 유전자가 결핍된 유전자도입 생쥐는 포진 바이러스-유도된 뇌척수염(HSM) 및 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 연관된 중추신경계에서 대식세포 동원과 염증에 대한 MCP-1의 결정적인 역할을 증명하였다(Nakajima H et al., 2001; Huang DR et al., 2001). MCP-1WT*2A의 투여는 양 검사 용량에서 EAE 동물 모델의 임상 점수를 향상시켰다(도 9).

전술한 바와 같이, MCP-1은 강한 섬유소형성 효과를 나타낸다. 이런 MCP-1 활성에 대항하는 MCP-1WT*2A의 특성은 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서 검사하였다. 이 경우에도 MCP-1WT*2A는 처리된 생쥐의 임상 점수를 상당히 개선하였다(도 10).

천식을 특징짓는 폐 알레르기 염증과 기도 과민 반응성(BHR)은 폐에서 서로 다른 백혈구 하위집합의 축적과 활성화로 달성한다. 항체에 의한 MCP-1의 차단은 BHR과 염증을 급격하게 감소시킨다(Gonzalo JA et al., 1998). 난알부민-유도된 폐 염증(OVA) 모델에서, MCP-1WT*2A는 감소된 세포 동원의 측면에서 현저한 향상을 제공한다(도 11).

GAG에 대한 MCP-1 결합에 관여하는 것으로 알려진 다른 잔기, 예를 들면 히스티딘 66과 리신 58(Chakravarty L et al., 1999)과 함께, 본 발명의 실시예에서 돌연변이된 이중염기성 부위가 모든 MCP에 존재한다는 점을 고려하면(도 1B), 본 발명에 기반하여 길항 활성을 보유하는 다른 MCP-기초한 변이체를 설계할 수 있다.

특히, MCP 길항제는 18번과 19번 위치, 18번과 58번(또는 66번) 위치, 19번과 58번(또는 66번) 위치에서 사람 성숙 MCP-1(SEQ ID NO: 4), MCP-2(SEQ ID NO: 5), MCP-3(SEQ ID NO: 6), MCP-4(SEQ ID NO: 7) 또는 Eotaxin(SEQ ID NO: 8)의 이중 변이체 및 18번, 19번, 58번(또는 66번) 위치에서 삼중 변이체일 수 있다(넘버링은 사람 성숙 MCP-1에서와 동일하다). 18번과 19번 위치에서 추가로 돌연변이될 수 있는 잔기는 모든 사람 MCP 단백질에서 고도로 보존된 다른 염기성 잔기이다(잔기 24, 44, 49, 75; 도 1B).

이들 대안적 분자의 특성은 상기한 방법중 한가지 또는 당분야에 공지된 다른 검증 방법으로 검사할 수 있다. 많은 다른 유용한 케모킨-관련된 기술(재조합 발현, 시험관내 분석법, 유전자도입 동물)은 기존 문헌에서 광범위하게 개관(槪觀)되고 있다("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 138, Humana Press, 2000; "Chemokine Receptors", Methods in Enzymology vol. 288, Academic Press, 1997).

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SEQUENCE LISTING <110> Applied Research Systems ARS holding <120> NOVEL ANTAGONISTS OF MCP PROTEINS <130> WO512 <160> 8 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr 1 5 10 15 Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val 20 25 30 Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu 35 40 45 Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val 50 55 60 Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln 65 70 75 80 Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr 85 90 95 Pro Lys Thr <210> 2 <211> 77 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 2 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 3 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ala Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr 20 25 30 Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro 65 70 75 <210> 6 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile 1 5 10 15 Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr 20 25 30 Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu 65 70 75 <210> 7 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys 35 40 45 Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys 50 55 60 His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr 65 70 75 <210> 8 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg 1 5 10 15 Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Glu 35 40 45 Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr 50 55 60 Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro 65 70

Claims

MCP 단백질의 변이체로 구성되는 MCP 단백질의 길항제에 있어서, 사람 성숙 MCP-1의 서열에 기초하여 넘버링(numbering)된 아래의 잔기 조합은 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루탐산 또는 글루타민으로 치환되는 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제:

a) 18번과 19번;

b) 58번과 함께 18번 또는 19번;

c) 66번과 함께 18번 또는 19번;

d) 58번 및 66번과 함께 18번 또는 19번;

e) 24번, 44번, 49번, 75번중 한가지이상과 함께 18번 또는 19번.
제 1 항에 있어서, 18과 19번 잔기는 알라닌으로 치환되는 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, MCP 단백질은 사람 MCP-1, 사람 MCP-2, 사람 MCP-3, 사람 MCP-4 또는 사람 Eotaxin인 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, MCP 단백질은 사람 성숙 MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 또는 Eotaxin과 적어도 70% 상동성을 보유하는 단백질인 것을 특징으로 하는MCP 단백질의 길항제.
아래에서 선택되는 MCP 단백질의 길항제:

a) 제 1 항 내지 5 항중 어느 한 항의 MCP 단백질의 길항제의 활성 변이체, 여기서 하나이상의 아미노산 잔기가 길항 활성을 간섭하지 않으면서 부가, 결실 또는 치환된다;

b) 폴리펩티드/펩티드의 서열 또는 구조에 기초하여 설계된 펩티드 유사물질;

c) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열 및 상응하는 MCP 단백질 이외의 단백질 서열에 속하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드/펩티드;

d) (a), (b) 또는 (c)의 활성 분획물, 전구물질, 염 또는 유도체.
제 5 항에 있어서, (a)의 폴리펩티드/펩티드는 SEQ ID NO:3에 상응하는 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제.
제 5 항에 있어서, (c)의 폴리펩티드/펩티드는 막-결합 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역, 다량체화 도메인, 세포외 단백질, 신호 펩티드-보유 단백질, 이출 신호-보유 단백질에서 선택되는 한가지이상의 단백질 서열에 속하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제.
제 5 항 또는 7 항에 있어서, 활성 공액체, 또는 방사성 라벨, 비오틴, 형광 라벨, 세포독성제, 약물 전달제에서 선택되는 분자와의 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 MCP 단백질의 길항제.
제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, 이들 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 9 항의 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 10 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제를 제조하는 방법에 있어서, 제 11 항의 형질전환된 세포를 배양하고 발현된 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제의 정제된 제형.
약물로 사용되는 MCP 단백질의 길항제의 용도.
과도한 백혈구 이동과 활성화에 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 제약학적 조성물에서 활성 성분으로 사용되는 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제의 용도.
제 15 항에 있어서, 질환은 염증 질환, 자가면역 질환 또는 감염인 것을 특징으로 하는 용도.
혈관 장애 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 제약학적 조성물에서 활성 성분으로 사용되는 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제의 용도.
제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제를 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물.
과도한 백혈구 이동과 활성화에 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제의 효과량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 질환은 염증 질환, 자가면역 질환 또는 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
혈관 장애 또는 암을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 MCP 단백질의 길항제의 효과량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.