JP2006505243A - Ｍｃｐタンパク質の新規のアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

ＭＣＰタンパク質のＮ末端に位置するＧＡＧ結合部位が、非保存的置換に従って除去されるＭＣＰ変異体を生成することによって、ＭＣＰタンパク質、特にＭＣＰ−１タンパク質の新規のアンタゴニストを得ることができる。本発明に従って調製される化合物は、炎症性疾患、自己免疫疾患、血管障害、および癌などのＭＣＰタンパク質の所望されない活性に関連する疾患の治療または予防に使用することができる。

Description

本発明は、ＭＣＰタンパク質を適切に変異させることによって生成されているＭＣＰタンパク質、特にヒトＭＣＰ−１の新規のアンタゴニストに関する。

ケモカインは、血液から損傷部位への白血球の直接的遊走を仲介する小さな分泌型炎症性タンパク質である。このファミリーのタンパク質を特徴付ける保存されたシステインの位置に依存して、ケモカインファミリーは、一連の膜受容体に対応するＣ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｘ₃−Ｃケモカインに構造的に分けることができる（バギオリニ Ｍ（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ）ら、１９９７；フェルナンデス ＥＪ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＥＪ）およびロリス Ｅ（Ｌｏｌｉｓ Ｅ）、２００２）。通常、ケモカインは、損傷部位で産生され、白血球遊走および活性化を引き起こし、炎症、免疫、ホメオスタシスおよび血管形成過程において基本的な役割を果たす。従って、これらの分子は、白血球の過剰な漸増および活性化を予防する目的で、特に、特定のケモカインおよびそれらの受容体を阻害することによって、上記過程に関連する疾患における治療的介入の可能性を付与する（バギオリニ Ｍ（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ）、２００１；ロエトシャー Ｐ（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｐ）およびクラーク−ルイス Ｉ（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ）、２００１；ゴッデサルト Ｎ（Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ Ｎ）およびクンケル ＳＬ（Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ）、２００１）。

単球走化性タンパク質１（以後、ＭＣＰ−１）は、ＣＣＬ２、小誘導サイトカインＡ２（ＳＣＹＡ２）、単球走化活性化因子（ＭＣＡＦ）、単球分泌タンパク質Ｊｅ、単球走化性因子、およびＨＣ１１などの様々な名称でも公知であるＣＣケモカインファミリーのメンバーである。このケモカインは、様々な炎症性疾患、異なるタイプの腫瘍、心同種移植、ＡＩＤＳ、および結核における損傷と感染のシグナルに応答して、単球および好塩基性細胞の漸増を促進することが可能である（グ Ｌ（Ｇｕ Ｌ）ら、１９９９）。

構造的かつ機能的に相同なタンパク質が同定されており、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ７）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ８）、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、およびエオタキシン（ＣＣＬ１１）と呼ばれている。このＣ−Ｃケモカインのサブファミリーは、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ−１α／βなどの他のＣ−Ｃケモカインとは顕著に異なり、おそらく、共通の祖先配列から共進化した。それらは、類似の受容体の用法を有し、特にＣＣＲ２（但し、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ５についても）結合する。従って、これらのＣ−Ｃケモカインの免疫学的および炎症性アゴニストまたはアンタゴニスト活性は共通である（ヒューゲス ＡＬ（Ｈｕｇｈｅｓ ＡＬ）およびエーガー Ｍ（Ｙｅａｇｅｒ Ｍ）、１９９９；ベルコート ＴＡ（Ｂｅｒｈｋｏｕｔ ＴＡ）ら、１９９７；ルスター ＡＤ（Ｌｕｓｔｅｒ ＡＤ）およびローデンベルグ ＭＥ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ＭＥ）、１９９７、プルースト Ｐ（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ）ら、１９９６）。

ＭＣＰ−１に関連する生理学的活性については、トランスジェニック動物および他の動物モデルによって広範に研究されており、ＭＣＰ−１は、多くの感染、炎症および自己免疫疾患における単球および他の細胞タイプ（例えば、星状細胞）、ならびにＴヘルパーの応答に関連するサイトカインの発現の漸増を制御することが実証されている。ＭＣＰ−１によって誘導されると思われる他の疾患は、血管障害（冠動脈介入後の再狭窄、動脈硬化症、アテローム硬化症、虚血、脳卒中）および癌関連血管形成である（イケダ Ｙ（Ｉｋｅｄａ Ｙ）ら、２００２；エガシラ Ｋ（Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｋ）ら、２００２；グ Ｌ（Ｇｕ Ｌ）ら、２０００；サルセド Ｒ（Ｓａｌｃｅｄｏ Ｒ）ら、２０００；ゴスリング Ｊ（Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｊ）ら、１９９９；ル Ｂ（Ｌｕ Ｂ）ら、１９９８；ルットレッジ ＢＪ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＢＪ）ら、１９９５）。

ＭＣＰ−１標的化はいくらかの疾患に対する可能な治療アプローチとして考えられるため、ＭＣＰ−１誘導性病因学的アッセイに対して多かれ少なかれ重要な阻害効果を得る異なるタイプのＭＣＰ−１アンタゴニストは文献に記載されている（ドーソン Ｊ（Ｄａｗｓｏｎ Ｊ）、２００３）。ＭＣＰ−１アンタゴニストの例には、天然または合成的にＮ末端アミノ酸２〜１０を失うＭＣＰ−１のＮ末端欠失変異（エガシラ Ｋ（Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｋ）ら、２０００；ザング Ｙ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）およびロリンス ＢＪ（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＢＪ）、１９９５；マックキバン ＧＡ（ＭｃＱｕｉｂｂａｎ ＧＡ）ら、２００２）、抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体（アジュエボール ＭＮ（Ａｊｕｅｂｏｒ ＭＮ）ら、１９９８；エグテサド Ｍ（Ｅｇｈｔｅｓａｄ Ｍ）ら、２００１）、ＲＮＡアプタマー（ローデス Ａ（Ｒｈｏｏｄｅｓ Ａ）ら、２００１）、ＭＣＰ−１に対する内部の配列において設計されるペプチド（レクレス Ｊ（Ｒｅｃｋｌｅｓｓ Ｊ）およびグラインゲル ＤＪ（Ｇｒａｉｎｇｅｒ ＤＪ）、１９９９）、ＭＣＰ−１アンタゴニストペプチド疑似物（カジ Ｍ（Ｋａｊｉ Ｍ）ら、２００１）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（国際公開第９４／０９１２８号パンフレット）、小さな分子（ミルザデーゲン Ｔ（Ｍｉｒｚａｄｅｇａｎ Ｔ）ら、２０００）、ポリマー修飾ＭＣＰ−１（国際公開第０２／０４０１５号パンフレット）、またはウイルスデコイ受容体（アレキサンダー ＪＭ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＪＭ）ら、２００２；ベック ＣＧ（Ｂｅｃｋ ＣＧ）ら、２００１）がある。

構造的に、ＭＣＰタンパク質は、Ｎ末端ループおよびＣ末端でαへリックスが重なっている３つのβシートを示す（ハンデル ＴＭ（Ｈａｎｄｅｌ ＴＭ）ら、１９９６；ルブノスキー Ｊ（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ Ｊ）ら、１９９７；ブラズクジク Ｊ（Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ Ｊ）ら、２０００）。文献には、構造活性研究の多くの例（ゴング ＪＨ（Ｇｏｎｇ ＪＨ）およびクラーク−ルイス Ｉ（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ）、１９９５；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、１９９６；ビール ＣＪ（Ｂｅａｌｌ ＣＪ）ら、１９９６；ステイツ ＳＡ（Ｓｔｅｉｔｚ ＳＡ）ら、１９９８；グ Ｌ（Ｇｕ Ｌ）ら、１９９９；ヘンメリッヒ Ｓ（Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ Ｓ）ら、１９９９；シート ＢＴ（Ｓｅｅｔ ＢＴ）ら、２００１）が提供されており、該研究では、ＭＣＰ−１変異体は受容体に対して低い活性および／または親和性を有するか、あるいは（他の多くのケモカインにおけるような）Ｎ末端短縮、または（成熟ヒトＭＣＰ−１の番号付けに従って）残基３、８、１０、１３、１５、１８、１９、２４、２８、３０、３７、３８、および３９での単一の変異を発現することにより他の結合タンパク質が得られている。同様の結果がエオタキシンについても得られている（メイヤー ＭＲ（Ｍａｙｅｒ ＭＲ）およびストーン ＭＪ（Ｓｔｏｎｅ ＭＪ）、２００１）。

ケモカインは、プロテオグリカン（ＰＧ）およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と相互作用し、多くの細胞シグナル伝達可溶性分子（インターロイキン、成長ホルモン）に共通の特徴である。プロテオグリカンは、セリン残基でグリコサミノグリカンの付加によって翻訳後修飾される負に荷電したタンパク質である。塩基性残基（主にアルギニンおよびリジン）のクラスターは、タンパク質が、一般に、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、およびヒアルロン酸などの二糖単位の反復を特徴とするＧＡＧと結合することを可能にする。ＰＧおよびＧＡＧは、おそらく、細胞外環境でタンパク質分解からこの分子を保護する目的で、膜表面ならびに可溶性分子上に存在し得る。ＧＡＧは、特異的受容体に対する細胞シグナル伝達分子の正確な提示、および究極的に標的細胞活性化の調節を援助し得ることも提唱されている。ケモカインの場合、炎症部位での固定勾配への濃縮、ならびに、従って、細胞受容体との相互作用およびそれらの活性化状態は、特定のＧＡＧによって調節されるようである。ＧＡＧとの相互作用およびそれらの勾配の形成については、相対的親和性を測定して、ＭＣＰ−１を含む多くのケモカインについて明らかに実証されている。従って、そのような相互作用の調節は、炎症性疾患における治療アプローチを表し得ることが示唆されている（フーゲベルフ ＡＪ（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ ＡＪ）ら、１９９７；クシェルト Ｇ（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ Ｇ）ら、１９９９；アリ Ｓ（Ａｌｉ Ｓ）ら、２００１；パテル Ｄ（Ｐａｔｅｌ Ｄ）ら、２００１；国際公開第０２／２８４１９号パンフレット；国際公開第９９／５０２４６号パンフレット）。

しかし、ＧＡＧ／ＭＣＰ−１相互作用の構造的要件および機能的効果についてはあまり研究されていない。ＧＡＧが、内皮細胞から分泌されるＭＣＰ−１の活性および産生を調節することができることは公知である（ダグラス ＭＳ（Ｄｏｕｇｌａｓ ＭＳ）ら、１９９７）。ＭＣＰ−１のＣ末端におけるリジン５８およびヒスチジン６６をアラニンで置換すると、受容体結合、Ｃａ²⁺流入、または走化性活性に影響を及ぼすことなくＧＡＧ結合が妨害されることも報告されている（チャクラバルティー Ｌ（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ Ｌ）ら、１９９８）が、それがＭＣＰ−１の他のＧＡＧ結合部位である可能性があること、およびインビボ効果がそれらの除去を生じ得るかどうかについては、先行分野において開示されていない。いくつかのケモカインについて広範な研究が実施されているが、ケモカインにはＧＡＧ結合ドメインの顕著な構造的多様性が存在するため、配列の相同性に基づいて、ＧＡＧ結合を減損するにはどの残基を非保存的置換で修飾しなければならないか、およびどのような効果を得ることができるかについて予想することは不可能である（ロルタット−ジャコフ Ｈ（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ Ｈ）ら、２００２）。

ヒトＭＣＰ−１のＮ末端の二塩基部位（アルギニン１８、リジン１９）は、ＭＣＰ−１のＧＡＧとの相互作用を担うことを見出した。非保存的置換（例えば、アラニン）によってこの部位を除去すると、ＧＡＧと相互作用する傾向が低いだけではなく、ＭＣＰ−１に対する驚くべきインビボ用量関連アンタゴニスト活性を有するＭＣＰ−１変異体を生成することが可能である。そのような証拠を活用して、対応するＭＣＰタンパク質のアンタゴニストとしてＭＣＰ−１、および他のＭＣＰ−１タンパク質の変異体を使用することができる。本発明に従って調製される化合物を使用して、それらの受容体を発現する白血球遊走および活性化を阻害し、それによって、炎症および自己免疫疾患などの過剰または制御されていない白血球遊走に関連する疾患の治療において使用するための有用な治療組成物を提供することができる。本発明の他の特徴および利点については、以下の詳細な説明から明らかになろう。

上記の文献を見ると、ヒトＭＣＰ−１のＮ末端における特定の二塩基性部位がＧＡＧ結合部位を規定すること、およびこの部位における残基の非保存的置換により、ＭＣＰ−１に対するアンタゴニスト活性を有する分子が生じることは示されていない。さらに、公知のＭＣＰタンパク質の間この二塩基性部位、ならびに塩基性でありおよび／またはＧＡＧ結合に関与することが公知である他の残基が変換されれば、ＭＣＰタンパク質のアンタゴニストは、ヒトＭＣＰ−１において機能的に特徴付けられた残基に対応する残基の非保存的置換によって得ることができるといえる。

本発明の主な目的は、ヒト成熟ＭＣＰ−１の配列に対して番号付けされた以下の組み合わせの残基、
ａ）１８および１９；
ｂ）１８および／または１９と５８；
ｃ）１８および／または１９と６６；
ｄ）１８および／または１９と５８および６６；
ｅ）１８および／または１９と２４、４４、４９、７５のうちの１つもしくはそれ以上；
がアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに置換されている、ＭＣＰタンパク質の変異体からなるＭＣＰタンパク質の新規のアンタゴニストを提供することである。

本特許出願は、上記の組み合わせの特定の例である、アルギニン１８およびリジン１９がアラニンに置換された、新規の組換えＭＣＰ−１変異体によって得られる驚くべきインビボまたはインビトロデータを提供する。これらの結果は、他の高度に保存されたＭＣＰタンパク質の配列および構造に関する知識と組み合わせると、この二塩基性部位は、ＭＣＰタンパク質の生物学的活性において一般的な役割を果たすことができるだけではなく、従って、他のアンタゴニスト分子を得るために、これらの相同タンパク質において改変をすることができることが示唆される。

アンタゴニスト特性を有する分子を得るために、ＭＣＰタンパク質において非保存的様式で変異しなければならない塩基性残基は、本質的に、１８および１９位の両方の残基、５８および６６などのＧＡＧ結合に関与することがすでに公知である残基の少なくとも一方と組み合わされた１８および１９位の塩基性残基の少なくとも１つ（チャクラバルティ Ｌ（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ Ｌ）ら、１９９９）、またはすべてのヒトＭＣＰタンパク質において保存されている他の塩基性残基の少なくとも１つと組み合わされた１８および１９位の塩基性残基の少なくとも１つ（図１Ｂ；ベルコート ＴＡ（Ｂｅｒｈｋｏｕｔ ＴＡ）ら、１９９７）である。塩基性残基と置き換わるアミノ酸は、好ましくは、アラニンまたはグリシンのような非極性の小さなアミノ酸であるが、タンパク質の構造にそれほど干渉しない電荷およびディメンションを有し、かつ同時にＧＡＧ結合に適合しなければ（例えば、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、もしくはグルタミン）、他のアミノ酸も適切である。

従って、本発明の主な目的は、上記の変異の組み合わせを含有し、ＭＣＰタンパク質のアンタゴニストとして作用するＭＣＰタンパク質の変異体を提供することである。

用語「ＭＣＰタンパク質のアンタゴニスト」は、対応する成熟、全長、天然に存在する（野生型）ＭＣＰタンパク質に対してアンタゴニストとして作用する任意の分子を意味する。当該分野において既知のＭＣＰ−１アンタゴニストは、改変に関与する。

本出願では、ＭＣＰタンパク質という用語は、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２、ヒトＭＣＰ−３、ヒトＭＣＰ−４、およびエオタキシン（図１Ｂ；説明書きは、対応するスイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号を示す）、ならびにヒト成熟ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、またはエオタキシンとの間に少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の相同性を有し、上記で同定されたすべての位置において塩基性の正に荷電したアミノ酸（アルギニン、リジン、もしくはヒスチジン）を含有する他の任意のタンパク質を含む。

本発明のさらなる目的は、ＭＣＰタンパク質のアンタゴニストであって、
ａ）アンタゴニスト活性を妨げることなく、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換されている、上記で規定したＭＣＰタンパク質の変異体の活性変異体；
ｂ）（ａ）のポリペプチドあるいはペプチドの配列および／または構造に対して設計されるペプチド疑似物；
ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のアミノ酸配列、および対応するＭＣＰタンパク質以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドまたはペプチド；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｄ）の活性フラクション、前駆体、塩もしくは誘導体、
から選択される、アンタゴニストである。

上記で規定し、ＭＣＰ−１アンタゴニストとしてＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを使用して、本特許出願において例示したＭＣＰ変異体は、活性変異体で維持するか、または増強することさえできる。このカテゴリーの分子は前記配列の天然または人工のアナログを含み、ここで、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換されており、但し、それらは、当該分野において公知の手段によって決定され、以下の実施例において開示されるように、同等もしくはそれより高いレベルで、本発明において特徴付けられるのと同じ生物学的活性を示す。

例えば、許容可能な置換は、ヒトＭＣＰ−１の本質的特性を変更することなく精製を改善ずるための実施例に示すメチオニン６４のイソロイシンによる置換（ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ；配列番号３）のようなＧＡＧ結合に関与しない残基に対するものであるべきである。従って、本発明の別の目的は、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａに対応する配列を有するＭＣＰ−１アンタゴニスト（配列番号３）である。あるいは、ＭＣＰ−１アンタゴニストは、ＧＡＧ結合に関与する残基に対する置換に加えて、ＭＣＰ−１の公知のＮ末端欠失変異体におけるように、２〜１０のＮ末端アミノ酸を失い得（エガシラ Ｋ（Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｋ）ら、２０００；ザング Ｙ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）およびローリングス ＢＪ（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＢＪ）、１９９５；マッククイバン ＧＡ（ＭｃＱｕｉｂｂａｎ ＧＡ）ら、２００２）、おそらく、改善されたアンタゴニスト特性を得る。

天然のアナログは、マウスＭＣＰ−１（スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ１０１４８）のようなヒトまたは他の生物体において同定されるＭＣＰタンパク質の対応する配列を意図する。人工のアナログは、既知の化学合成および／または部位特異的変異技術、もしくは適切な他の任意の既知の技術によって調製されたペプチドを意図し、先行技術および本特許出願の実施例において提示された教義を使用して、当業者が日常的に入手および試験することができる限定された組の実質的に対応する変異されたかもしくは短くされたペプチドまたはポリペプチドを提供する。

本発明に従えば、これらの活性変異の好適な変化は、「保存的」または「安全な」置換として一般に公知であり、非塩基性残基を含む。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生物学的機能を保存するために、十分に類似の化学特性を有するアミノ酸による置換である。特に、挿入または欠失が数個、例えば、１０個未満、好ましくは、３個未満のアミノ酸に関与し、タンパク質またはペプチドの機能的コンホメーションにきわめて重要であるアミノ酸を除去せずもしくは置き換えなければ、上記で規定した配列において、該配列の機能を変更することなく、アミノ酸の挿入および欠失を作製することができることも明らかである。

文献では、天然のタンパク質の配列および／または構造に対する統計的ならびに物理化学的研究に基づく保存的アミノ酸置換の選択を実施することができる多くのモデルが提供されている（ロゴブ ＳＩ（Ｒｏｇｏｖ ＳＩ）およびネクラソブ ＡＮ（Ｎｅｋｒａｓｏｖ ＡＮ）、２００１）。タンパク質設計実験は、特定のサブセットのアミノ酸を使用して、タンパク質構造においてより容易に適応することができ、機能的かつ構造的ホモログおよびパラログを検出するために使用することができるアミノ酸「同義」置換の分類を援助する折りたたみ可能および活性なタンパク質を産生することができることを示している（マルフィー ＬＲ（Ｍｕｒｐｈｙ ＬＲ）ら、２０００）。同義のアミノ酸のグループおよびより好適な同義のグループは、表１において規定したグループである。

これらの教義に基づいて作製される置換によって精製される活性な変異体、ならびに１つもしくはそれ以上のアミノ酸が除去または付加された活性な変異体は、本発明の目的、即ち、はじめに選択された変異体に匹敵するか、または可能であれば改善されたＧＡＧ結合特性および対応するＭＣＰタンパク質に対するアンタゴニスト活性をそれほど有さないＭＣＰタンパク質の新規の変異体の範囲にある。

上記の代替的化合物は、特に、アンタゴニストとしての能力に関する限り、本特許出願において開示された塩基性特徴に影響を及ぼさない上記で規定したＭＣＰタンパク質の変異体の配列に対する変化を有する分子を包括することを意図する。同様の化合物は、コーディングＤＮＡの従来の変異技術、コーディングＤＮＡ配列のレベルでのコンビナトリアル技術（ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイ／選択）、またはコンピュータ支援設計研究から生じ得、続いて、先行技術および以下の実施例に記載のように所望の活性についてバリデーションが行われる。

特定のアンタゴニストは、上記で規定したＭＣＰ変異体のペプチド疑似物（ペプチドの疑似物とも呼ばれる）の形態で得ることができ、ここで、ペプチドまたはポリペプチドの性質は、アミノ酸側鎖、アミノ酸のキラリティ、および／またはペプチド骨格のレベルで化学的に改変されている。これらの変更は、類似または改善された治療、診断および／または薬物動態特性を有するＭＣＰアンタゴニストを提供することを意図する。

例えば、ペプチドが、被験体への注入後にペプチダーゼによる切断を受けやすいことが問題である場合、特に感受性のペプチド結合を非切断型ペプチド疑似物で置換することによって、より安定で、従って治療としてより有用なペプチドを提供することができる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対する感受性を低下させ、最終的にペプチド以外の他の有機化合物により類似させる標準的な方法である。ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、エチル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンゾイルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末端遮断基もまた有用である。効力の増加、活性の延長、精製の容易化および／または半減期の増加を提供する他の多くの改変は当該分野において公知である（国際公開第０２／１０１９５号パンフレット；ビライン Ｍ（Ｖｉｌｌａｉｎ Ｍ）ら、２００１）。ペプチド疑似物に含まれるアミノ酸の好適な代替的「同義の」グループは、表ＩＩにおいて規定されるグループである。

ペプチド疑似物、ならびに非ペプチド疑似物の合成および開発のための技術は、当該分野において周知である（ソーヤ ＴＫ（Ｓａｗｙｅｒ ＴＫ）、１９９７；フルビー ＶＪ（Ｈｒｕｂｙ ＶＪ）およびバルセ ＰＭ（Ｂａｌｓｅ ＰＭ）、２０００；ゴレビオウスキー Ａ（Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ Ａ）ら、２００１）。インビトロおよびインビボ翻訳系の両方を使用して、タンパク質の構造および機能を探査ならびに／または改善して、非天然のアミノ酸をタンパク質に組み入れる様々な方法論もまた、文献に開示されている（ドーゲルティー ＤＡ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ＤＡ）、２０００）。ＭＣＰ−１アンタゴニストペプチド疑似物は、文献において公知であるが、ＭＣＰ−１に対して高度に相同ではない（カジ Ｍ（Ｋａｊｉ Ｍ）ら、２００１）。

本特許出願は、ＭＣＰアンタゴニストとして、上記で規定したアミノ酸配列および対応するＭＣＰタンパク質以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはペプチドを開示する。後者の異種配列は、アンタゴニスト活性を有意に損なうことなく、またはＧＡＧ結合特性を提供することなく、さらなる特性を提供すべきである。そのようなさらなる特性の例には、より容易な精製手順、体液中においてより長く継続する半減期、または細胞外局在化がある。この後者の特徴は、本特許出願においてＭＣＰアンタゴニストとして規定される分子を、これらのペプチドの単離および精製を容易にするだけでなく、ＭＣＰタンパク質およびそれらの受容体が自然に相互作用する空間に局在化することを可能にするため、上記の定義に含まれる融合またはキメラタンパク質の特定のグループを規定するのに特に重要である。

（ｃ）のポリペプチドまたはペプチドを生成するために使用することができるさらなるタンパク質配列は、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリンの定常領域、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、輸送シグナル含有タンパク質のポリペプチドまたはペプチドである。ＭＣＰタンパク質の変異体に融合しようとするこれらの配列の１つもしくはそれ以上は、前記因子の特定の使用に対して機能的である。一般的な手順として、これらの融合タンパク質は、それらをコードする核酸セグメントを作製し、一般的な遺伝子操作技術を使用し、エピソームもしくは非相同的に組み込まれたベクター、ならびに形質転換、感染、もしくはトランスフェクションに基づく技術を使用して、原核または真核宿主細胞を改変するために使用されるウイルスあるいはプラスミド由来の複製可能なベクターにおいてクローニングすることによって、産生させることができる。これらのベクターは、原核または真核宿主細胞において、構成的に活性もしくは誘導性であるように選択されるそれら自体の転写開始／終止調節配列の制御下で、該原核または真核宿主細胞においてＭＣＰアンタゴニストを含む融合タンパク質の発現を可能にする。次いで、そのような細胞において実質的に富化された細胞株を単離し、安定な細胞株を提供することができる。

細胞外、輸送シグナル、またはシグナルペプチド含有タンパク質の場合におけるように、さらなるタンパク質配列がＭＣＰアンタゴニストを細胞外空間に分泌させる場合、さらなるプロセシングのために因子をより容易に回収し、培養細胞から回収することができるか、あるいは、細胞を直接使用または投与することができる。

本発明のポリペプチドおよびペプチドは、例えば、活性フラクション、前駆体、塩、誘導体、共役もしくは複合体としての所望の使用および／または産生方法に従って好適であることができる他の代替的形態であることができる。

用語「活性」は、そのような代替的化合物が本発明のＭＣＰ変異体の機能的特長を維持すべきであり、また、薬学的に許容可能および有用であるべきであることを意味する。

用語「フラクション」とは、化合物単独あるいは関連分子または該化合物に結合した残基、例えば、糖もしくはリン酸の残基、または本来のポリペプチドもしくはペプチドの凝集体との組み合わせでの化合物自体のポリペプチド鎖の任意のフラグメントを指す。そのような分子は、通常、主要配列には影響を及ぼさない他の改変、例えば、ペプチドのインビボまたはインビトロ化学誘導（アセチル化もしくはカルボキシル化）からも生じることができ、それらは、ペプチドの合成およびプロセシング中あるいはさらなるプロセシング工程において、該ペプチドのリン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリン、もしくはホスホスレオニン残基の導入）または糖鎖形成（糖鎖形成に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳動物の糖鎖形成もしくは脱糖鎖酵素にペプチドを暴露させることによる）のパターンを改変することによって作製される。

「前駆体」とは、細胞または身体への投与の前後に、代謝的および酵素的プロセシングによって、本発明の化合物に変換することができる化合物である。

本明細書で使用する用語「塩」は、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当該分野において公知の手段によって形成することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩など、および例えば、アシン、例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどによって形成されるような有機性塩基との塩を含む。酸付加塩としては、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、および例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。そのようないずれの塩も、本発明のペプチドおよびポリペプチドまたはそれらのアナログに対して実質的に類似の活性を有するべきである。

本明細書で使用する用語「誘導体」は、既知の方法に従って、アミノ酸部分の側鎖上、またはＮ末端もしくはＣ末端基上に存在する官能基から調製することができる誘導体を指す。そのような誘導体としては、例えば、カルボキシル基のエステルもしくは脂肪族アミド、遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、例えば、アルカノイルまたはアロイル基のようなアシル基により形成される。

本発明のＭＣＰアンタゴニストの有用な共役または複合体は、受容体もしくは他のタンパク質との相互作用（放射能または経口標識、ビオチン）、治療効力（細胞障害性薬剤）、またはポリエチレングリコールおよび他の天然もしくは合成ポリマーなどの薬物送達効力に関する薬剤を改善する分野において公知の分子ならびに方法を使用して、生成することができる（ピライ Ｏ（Ｐｉｌｌａｉ Ｏ）およびパンチャグヌラ Ｒ（Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ Ｒ）、２００１）。

本発明の化合物は、上記の組換えＤＮＡ関連の技術、および化学合成技術を含む当該分野において任意の周知の手順によって調製することができる。

本発明の別の目的は、本発明のＭＣＰ変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなり、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子である。「実質的に同一のヌクレオチド配列」には、遺伝子コードの縮重によって、所定のアミノ酸配列を同様にコードする他のすべての核酸配列が含まれる。

本発明はまた、上記のＤＮＡを含んでなる発現ベクター、そのようなベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに前記形質転換細胞の適切な培養培地における培養および発現されたタンパク質の回収を介する本発明のＭＣＰアンタゴニストの調製プロセスを含む。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切なプラスミドに挿入および連結することができる。一旦形成されると、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、次いで、ベクターを発現させて所望のタンパク質が得られる。

本明細書に記載の本発明の組換えタンパク質の任意の発現は、適切な発現ベクターを使用して、真核細胞（例えば、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞）または原核細胞において生じさせることができる。当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。

例えば、上記のいずれかの方法によって得られるタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、当該分野において周知の技術によって、適切に構築された発現ベクターに挿入する。ホモポリマーテーリングまたは合成ＤＮＡリンカーもしくは平滑末端連結技術の使用に関与する制限連結によって、二本鎖ｃＤＮＡをプラスミドベクターに連結する：ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＮＡ分子を連結し、所望でない結合は、アルカリホスファターゼによる処置で回避する。

所望のタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターはまた、遺伝子発現およびタンパク質の産生を可能にするような方法で、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結された転写および翻訳調節の情報を含有する特定のヌクレオチド配列を含んでなる。まず、遺伝子を転写させるためには、ＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターは該遺伝子の前方に位置し、ポリメラーゼは該プロモーターに結合し、従って、転写のプロセスが開始される。異なる効率で稼動する上記のようなプロモーター（強力および弱いプロモーター）は多様に存在する。

真核細胞宿主では、宿主の性質に依存して、異なる転写および翻訳調節配列を用いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルス供給源から誘導することができ、ここで、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。その例には、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがある。遺伝子の発現を調節することができるような抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択してもよい。

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子は、宿主細胞に所望の遺伝子を組み込むことが可能な、操作可能に連結された転写および翻訳調節シグナルを有するベクターに挿入される。

導入されたＤＮＡによって安定に形質転換されている細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つもしくはそれ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。マーカーはまた、栄養要求性宿主に対する光合成、殺生物耐性、例えば、抗生物質、または銅などの重金属なども提供することができる。選択マーカー遺伝子は、発現しようとするＤＮＡ遺伝子配列に直接連結するか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。

ベクターのさらなるエレメントはまた、本発明のタンパク質の最適な産生を得ること、特に、プラスミドまたはウイルスベクターを含有する特定の細胞を選択するのに有用であり得る。即ち、ベクターを含有するレシピエント細胞を認識し、ベクターを含有しないレシピエント細胞から選択することが容易であること；特定の宿主細胞において所望のベクターのコピー数が得られること；および所望により異なる主の宿主細胞間でベクターを「往復させる」ことが可能であることである。

一旦、発現のために、構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を調製したら、様々な適切な手段：形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどのいずれかによって、ＤＮＡ構築物を適切な宿主細胞に導入することができる。

宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。真核生物宿主は、正確な折りたたみまたは正確な部位での糖鎖形成を含む翻訳後修飾をタンパク質分子に提供するため、真核生物宿主、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞が好ましい。また、酵母細胞は、糖鎖形成を含む翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。酵母における所望のタンパク質の産生のために利用することができる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物の遺伝子産物に対するリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する。

ベクターの導入後、宿主細胞を選択培地で増殖させ、ベクター含有細胞の増殖を選択した。クローニングした遺伝し配列の発現により、所望のタンパク質が産生される。

本発明の目的は、ＭＣＰタンパク質のアンタゴニストに関する本特許出願によって提供される開示内容を、一般的分子生物学技術の知識と組み合わせることによって、達成することができる。多くのレビュー（マクリデス ＳＣ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ）、１９９９）および書籍が、ベクターおよび原核または真核宿主細胞を使用して、どのようのにクローニングし、組換えタンパク質を産生させるかについての教義を提供しており、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）発行の「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」シリーズにいくつかのタイトル（「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、１９９５；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４： Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、１９９６；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、１９９９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、２００１）がある。

化学合成技術の例には、固相合成および液相合成がある。固相合成では、例えば、合成しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒に不溶性の支持体に結合させ、アミノ基を有するアミノ酸と適切な保護基で保護された側鎖の官能基とを、Ｃ末端からＮ末端の順に１個ずつ縮合する反応と、樹脂に結合したアミノ酸またはペプチドのアミノ基の保護基を脱離させる反応との交互の反復反応によって、ペプチド鎖は上記様式で伸張される。固相合成方法は、使用する保護基のタイプに依存して、大まかにｔＢｏｃ方法とＦｍｏｃ方法とに分類される。典型的に使用される保護基としては、アミノ基に対するｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基に対するＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；ならびに水酸基に対するｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる。所望のペプチドの合成後、該ペプチドを脱保護反応に供し、固相支持体から切り離す。そのようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ方法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、およびＦｍｏｃ方法ではＴＦＡで行う。総体的に、合成ＭＣＰタンパク質は、文献に開示されている（ブラウン Ａ（Ｂｒｏｗｎ Ａ）ら、１９９６）。

本発明の天然、合成または組換えＭＣＰアンタゴニストの精製は、この目的のための既知の方法のいずれか１つ、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などに関与する任意の従来の手順によって行うことができる。本発明のタンパク質を精製するために好適に使用することができるさらなる精製手順は、標的タンパク質に結合し、カラム内に含有されるゲルマトリックス上で生成および固定化されるモノクローナル抗体または親和性基を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。タンパク質を含有する不順な調製物をカラムに通過させる。タンパク質は、ヘパリンまたは特異的抗体によってカラムに結合する一方、不純物は通過する。洗浄後、ｐＨまたはイオン強度の変化によって、タンパク質はゲルから溶出される。あるいは、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）を使用することができる。溶出は、タンパク質の精製に一般に用いられる水−アセトニトリルを基剤とする溶媒を使用して行うことができる。本発明は、本発明の化合物の精製された調製物を含む。本明細書で使用される精製された調製物は、本発明の化合物の少なくとも１乾燥重量％、好ましくは５乾燥重量％である調製物を指す。

本発明の別の目的は、自己免疫および炎症性疾患ならびに細菌およびウイルス感染症などのＭＣＰタンパク質の受容体を発現する白血球の過剰な遊走および活性化をもたらすＭＣＰタンパク質の所望されない活性に関連する疾患を治療または予防するための医薬品、特に薬学的組成物の有効成分（薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、安定化剤、または希釈剤と組み合わせて処方される）として上記で規定したＭＣＰアンタゴニストの使用である。そのような疾患の非制限的例は、次の通りである。関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、感染、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、子宮体腎炎、線維症、肺線維症、アレルギー性または過敏性疾患、皮膚炎、遅延型過敏症またはＤＴＨとも呼ばれるＩＶ型過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血症性ショック、ＨＩＶ感染、移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、子宮内膜症、膵炎、甲状腺炎、脳症。

課題に関する文献を見ると、ＭＣＰタンパク質アンタゴニストは、血管障害（冠動脈介入後の再狭窄、動脈硬化症、アテローム硬化症、虚血、脳卒中）もしくは癌などのＭＣＰタンパク質の所望されない活性に関する他の疾患の治療または予防のための薬学的組成物における有効成分であることができる。

従って、本発明の別の目的は、本発明のＭＣＰタンパク質アンタゴニストの有効量の投与を含んでなる、上記疾患のいずれかを治療または予防するための方法である。

薬学的組成物は、ＭＣＰアンタゴニストに加えて、適切な薬学的に許容可能なキャリア、生物学的に適応可能なビヒクルおよび動物への投与に適切である添加物（例えば、生理食塩水）を含有してもよく、究極的に、活性化合物の薬学的に使用することができる調製物へのプロセシングを容易にする助剤（賦形剤、安定化剤または希釈剤など）を含んでなる。そのような組成物は、究極的に、相乗的に作用する別の治療組成物、または調整された様式で本発明のＭＣＰ変異体と組み合わせることができる。例えば、シクロスポリンとの併用でＣＣ−ケモカインアンタゴニストの類似の相乗的特性が実証されている（国際公開第００／１６７９６号パンフレット）。あるいは、他の組成物は、特定の疾患に対する治療上活性な薬剤であることが既知の化合物（例えば、多発性硬化症のためのＩＦＮβ、慢性関節リウマチのための可溶性ＴＮＦ受容体）と共に主薬を形成することができる。

薬学的組成物は、投与形態の要件を満たす許容可能な任意の方法で処方することができる。例えば、薬物送達のための生態適合物質および他のポリマーの使用、また特定の投与形態のバリデーションのための異なる技術およびモデルが文献に開示されている（ルオ Ｂ（Ｌｕｏ Ｂ）およびプレストウィッチ ＣＧ（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ＧＤ）、２００１；クラランド ＪＬ（Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬ）ら、２００１）。

「有効量」は、病状の減少または緩解をもたらす疾患の経過および重症度に影響を及ぼすのに十分な有効成分の量を指す。有効量は、投与経路および患者の症状に依存する。

「薬学的に許容可能」とは、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げることなく、かつ投与される宿主に毒性を示さない任意のキャリアを包含することを意味する。例えば、非経口投与では、上記の有効成分は、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル溶液などのビヒクル中で注射のための単位剤型で処方することができる。

当業者であれば、有効成分の所望の血液レベルを確立するために、任意の許容される投与形態を使用および決定することができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹膜内、鼻内、経皮、直腸、経口、または口内経路などの様々な非経口投与によってでもよい。非経口投与は、大量注入または経時的に緩徐な潅流によることができる。非経口投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳液を含み、当該分野において公知の助剤または賦形剤を含有してもよく、日常的方法に従って調製することができる。さらに、適切な油性注入用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる水性注入懸濁液には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる。必要に応じて、懸濁液は、安定化剤を含有してもよい。薬学的組成物は、注入による投与のために、適切な溶液を含み、約０．０１〜９９パーセント、好ましくは、約２０〜７５パーセントの活性化合物を、賦形剤と共に含有する。直腸に投与することができる組成物には、坐剤が含まれる。

投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および重量、併用治療の種類、存在すれば、治療回数、ならびに所望する効果の性質に依存することが理解される。用量は、個々の被験体に合わせて調整され、当業者によって理解および決定可能である。各治療に要求される総用量は、複数投与または単回投与によって投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、単独または症状、もしくは症状の他の徴候に対する他の療法と組み合わせて投与してもよい。通常、有効成分の１日あたりの用量は、体重１キログラムあたり０．０１〜１００ミリグラムの間からなる。通常、分割用量または徐放形態で１日あたり１キログラムあたり１〜４０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。第２または以後の投与を、個体に投与した初回または前回の用量と同量、未満、もしくはそれより多い用量で実施することができる。

特定の実施態様を参考にして本発明を説明してきたが、説明の内容は、当業者が特許請求の範囲の意義および目的を逸脱することなく行うことができるあらゆる改変または置換を含んでなる。

以下の実施例によって、本発明を説明するが、該実施例は、いずれの方法においても本発明を制限するものと解釈されるべきではない。実施例は、以下に明記した図面を指す。

実施例１：非ヘパリン結合ＭＣＰ−１変異体ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａのインビトロ特徴付け
材料および方法
ＭＣＰ−１変異体ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの発現
ヒトＭＣＰ−１（ｈＭＣＰ−１；図１；配列番号１）、および特に前駆体分子のセグメント２４〜９９に対応する成熟型のヒトＭＣＰ−１（スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ１３５００）をコードするＤＮＡ配列のインビトロ、ＰＣＲに基づく変異によって、ＭＣＰ−１変異体を生成した。

まず、ヒトＭＣＰ−１（２４〜９９）をコードする配列のＮ末端にメチオニンの開始コドンを付加し、内部のメチオニン（前駆体のアミノ酸８７および成熟タンパク質の６４）をイソロイシンで置換したＭＣＰ−１ＷＴ^*と呼ばれる活性な変異体ＭＣＰ−１タンパク質をコードするプラスミドを生成した。この置換によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためにプラスミドを使用する場合に、ＭＣＰ−１の典型的な特性に影響を及ぼすことなく、メチオニンスルホキシドを含有する所望されないＭＣＰ−１種の形成が回避される（パボラ ＣＤ（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ）ら、１９９８）。ＭＣＰ−１ＷＴ^*と呼ばれる得られる配列をクローニングし、７７個の残基を含有するタンパク質としてｐＥＴ３プラスミド（パボラ ＣＤ（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ）ら、１９９８）に基づくプラスミドを利用することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた（図１Ａ；配列番号２）。

次いで、ＭＣＰ−１ＷＴ^*と同じ長さおよび精製特徴を有するＭＣＰ−１変異体ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを生成するために、ヒトＭＣＰ−１前駆体の４１および４２位（成熟タンパク質の１８および１９位）のアルギニンおよびリジンの代わりに２個のアラニンをコードするＰＣＲフラグメントをクローニングすることによって、ＭＣＰ−１ＷＴ^*を発現するプラスミドをさらに変異した（図１；配列番号３）。

すべての構築物は、標準的な分子生物学的技術（ＰＣＲ変異および増幅、ＤＮＡ配列決定、制限消化）によって入手および制御し、クローニングプロセス中は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株に維持した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現に最適なコドン使用を有するために、コーディング配列を選択した（カネ ＪＦ（Ｋａｎｅ ＪＦ）、１９９５）。

次いで、ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２ＡをコードするｐＥＴ３に基づくプラスミドを、ＴＡＰ３０２と呼ばれる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ｐＬｙｓ）由来株に移し、（パボラ ＣＤ（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ）ら、１９９８）に記載のように、得られる株を、ＭＣＰ−１変異体の組換え発現に使用した。このプロトコルには、Ｎ末端メチオニンを除去し、従って、天然成熟型と同じ長さを有する組換えＭＣＰ−１変異体（７６アミノ酸；図１Ｂ）を得るためのアミノペプチダーゼの使用が含まれる。組換えタンパク質の正体を質量分析によって確認した。

ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａのクロマトグラフィーアッセイ
ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを、ヘパリンセファロースカラムまたはＳＰセファロース陽イオン交換カラムのいずれか一方に充填した。いずれの場合においても、カラムを１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化し、同緩衝液中０〜１ＮａＣｌの直線勾配でタンパク質を溶出させた。

ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａのヘパリン結合アッセイ
０．０２〜３０μＭの範囲を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ＭＣＰ−１ＷＴ^*変異体の系列希釈を、１７０ｎＭの［³Ｈ］−ヘパリンと共に１時時間、３７℃でインキュベートした。３回反復の２０μｌの各サンプルを、ニトロセルロースフィルターを固定した９６ウェルＰ８１ユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）プレート（ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ））に移した。真空ポンプを使用して、プレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、非結合標識ヘパリンを除去した。シンチレーション液（５０μｌ）を各ウェルに添加し、βカウンターで放射能を計数（１分間／ウェル）した。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）プログラム（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して、データを解析した。

平衡競合受容体結合アッセイ
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）およびトレーサーとして［¹²⁵Ｉ］−ＭＣＰ−１を使用し、ＭＣＰ−１受容体（ＣＣＲ２）を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の膜上で、アッセイを行った。［¹²⁵Ｉ］サプライヤー（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って、組換え成熟ＭＣＰ−１から放射性標識ケモカイン（２２００ｍＣｉ／モルの比放射能）を作製した。結合緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％ＢＳＡ）中非標識ＭＣＰ−１の系列希釈（範囲１０^-6〜１０^-12Ｍ）によって、競合物を調製した。

小麦胚芽ＳＰＡビーズ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））をＰＢＳに５０ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁し、結合緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、アッセイでの最終濃度は０．２５ｍｇ／ウェルであった。ＣＣＲ２を発現する膜を−８０℃で保存し、結合緩衝液中に８０μｇ／ｍｌとなるように希釈した。最終膜濃度は２μｇ／ウェルおよび［¹²⁵Ｉ］−ＭＣＰ−１の最終濃度は０．１ｎＭであった。プレートを室温で、撹拌しながら４時間、インキュベートした。βカウンターで放射能を計数（１分間／ウェル）した。グラフィット（Ｇｒａｆｉｔ）プログラム（エリサカス・ソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して、３回反復のサンプルのデータを解析した。

結果
文献には、ＭＣＰ−１のヘパリン／ＧＡＧ結合特性を試験するための異なるアプローチが示されている（フーゲベルフ ＡＪ（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ ＡＪ）ら、１９９７；カスチェルト Ｇ（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ Ｇ）ら、１９９９；アリ Ｓ（Ａｌｉ Ｓ）ら、２００１；パテル Ｄ（Ｐａｔｅｌ Ｄ）ら、２００１；チャクラバルティー Ｌ（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ Ｌ）、１９９８）。

配列が成熟型のヒトＭＣＰ−１（図１）に基づくＭＣＰ−１の２つの変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。第１の変異体ＭＣＰ−１ＷＴ^*は、ＭＣＰ−１の結合特性および典型的な活性を妨害することなく、メチオニン酸化の可能性を除去することが既知の変異を有する成熟ヒトＭＣＰ−１前駆体に対応する（パボラ ＣＤ（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ）ら、１９９８）。この「活性な」変異体の配列に基づいて、Ｎ末端の二塩基部位が付加的にアラニン残基に置換された第２の変異体ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを発現させた。

まず、ヘパリンクロマトグラフィーによって、ＭＣＰ−１特性に対するこの後者の置換の影響について試験した。ＭＣＰ−１ＷＴ^*を溶出させるのに必要なＮａＣｌの濃度は０．５４Ｍ ＮａＣｌである一方、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａは０．２４Ｍ ＮａＣｌで溶出されたため、このクロマトグラフィーカラムに適用された２つの変異体の溶出プロファイルはかなり異なる。ＳＰセファロースカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、類似の差異を測定した（０．２７Ｍ ＮａＣｌに対して０．５５Ｍ ＮａＣｌ）。

上記クロマトグラフィー媒体上の溶出プロファイルを比較することによって、塩基性アミノ酸対ヘパリン結合特性による非特異的静電的相互作用の寄与が定性的に示される（プロウドフット Ａ（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ）、２００１）。陽イオン交換クロマトグラフィー上で得られるＮａＣｌ濃度の差異を、ヘパリンクロマトグラフィー上で得られた濃度から差し引いた。この方法に従って、得られる数字が正（この場合、０．０２Ｍ）である場合、ヘパリンとの相互作用は、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの変異された二塩基性部位との関連が同定されると結論付けることができる。

次いで、滴定されたヘパリンおよびＭＣＰ−１発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異体の系列希釈を使用して、ヘパリンへの結合の直接測定を実施した（図２）。ニトロセルロースフィルターに希釈物を添加することによって、タンパク質−ヘパリン複合体を単離した。そのような支持体はタンパク質を効率的に保持することが可能であり、従って、タンパク質に結合した放射性標識ヘパリンの量を評価することが可能である。このアプローチにより、ＭＣＰ−１ＷＴ^*と比較して、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａのヘパリン結合特性が有意に減少したことが確認された。

最後に、平衡競合受容体結合アッセイを実施して、特異的受容体ＣＣＲ２の結合対するＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの低減したヘパリン結合特性の影響を実証した（図３）。２つの変異体のうちの１つ、またはＭＣＰ−１の系列希釈と混合した放射性標識ＭＣＰ−１を含有するサンプルを、ＣＣＲ２を安定に発現するＣＨＯ細胞から調製した膜と共にインキュベートした。ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１タンパク質がほとんど同一の結合プロファイルを示したが、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ変異体のＩＣ₅₀は、試験した他の２つのタンパク質の０．０８±０．０４５ｎＭと比較して、１．７３±０．６ｎＭであり、このヘパリン結合欠損ＭＣＰ−１変異体において高い親和性を示すため、該ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ変異体では、ＣＣＲ２に対する親和性が２０倍減少する。

実施例２：細胞漸増のモデルにおける非ヘパリン結合ＭＣＰ−１変異体の特徴付け
材料および方法
走化性アッセイ
５μｍポアサイズ膜（ニューロプローブ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ））を固定した２４ウェルトランスウェル走化性チャンバ（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））においてヒト前単球細胞株（ＴＨＰ−１）を使用し、アッセイを行った。組換えＭＣＰ−１タンパク質を、５％不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有する６００μｌのＲＰＭＩ培地中に系列希釈（１０^-6〜１０^-12Ｍの範囲）した。これらのサンプルを下方のウェルに配置する一方、ＴＨＰ−１細胞（同倍地中１０×１０⁶細胞／ｍｌでの１００μｌの細胞懸濁液）を挿入部に配置した。チャンバを３時間、３７℃、５％ＣＯ₂下でインキュベートした。次いで、サンプルを取り出し、１．５ｍｌチューブに移し、２００×ｇで５分間、遠心分離した。ペレット化した細胞を１００ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、コールターカウンター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））で計数した。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）プログラム（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して、データを解析した。

腹膜細胞漸増アッセイ
０．２ｍｌ滅菌、リポ多糖を含まないＰＢＳに希釈した１０μｇの組換えＭＣＰ−１ＷＴ^*またはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａタンパク質を８〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入することによって、細胞漸増を誘導した。ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａのアンタゴニスト特性を試験する場合、０．２ｍｌの同滅菌溶液に希釈した指示された量のタンパク質を、アゴニスト（ＭＣＰ−１ＷＴ^*）投与の３０分前に投与した。アゴニストの投与の１６時間後、エアゾール化したＣＯ₂によってマウスを屠殺し、５ｍｌのＰＢＳで３回、腹腔洗浄を実施した。洗浄液をプールし、６００×ｇで１０分間、遠心分離し、ペレット化した細胞を１ｍｌの最終容積で再懸濁し、誘発されたすべての白血球を、血球計で計数した。

結果
ＭＣＰ−１に関連する異なるタンパク質の特性を特徴付けるために、細胞漸増アッセイを使用した（アジュエボル ＭＮ（Ａｊｕｅｂｏｒ ＭＮ）ら、１９９８；レックレス Ｊ（Ｒｅｃｋｌｅｓｓ Ｊ）およびグラインジャー ＤＪ（Ｇｒａｉｎｇｅｒ ＤＪ）、１９９９；カジ Ｍ（Ｋａｊｉ Ｍ）ら、２００１）。

ヒト単球（ＴＨＰ−１細胞株）に対する走化性アッセイにおいてＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａについて得られる結果は、実施例１に記載の受容体結合アッセイで得られた結果に良好に対応する。ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａは、ＴＨＰ−１走化性の強固な応答（ベースラインの６倍を超える）を誘導することが可能であったが、ベースラインより９倍の増加を誘導した野生型タンパク質の１ｎＭと比較して、１０ｎＭで最大活性が観察された（図４）。

腹膜細胞漸増アッセイを使用して、ＭＣＰ−１のアンタゴニストまたはアゴニストとしてのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの活性も評価した（図５）。ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを投与する場合、ヘパリン結合欠損変異体は、ＭＣＰ−１ＷＴ^*が実質的な漸増を引き起こす用量（１０マイクログラム／マウス）で、腹膜への細胞漸増を誘導することができなかった。さらに、ＭＣＰ−１ＷＴ^*の投与の３０分前にＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを投与する場合、ＭＣＰ−１ＷＴ^*によって誘導される細胞漸増は、用量依存様式で有意に拮抗される。従って、ＭＣＰ−１のＧＡＧ結合を排除すると、ＭＣＰ−１によって誘導される細胞漸増を、インビボで阻害することが可能なＭＣＰ−１のアンタゴニストが産生される。

実施例３：動物に基づくモデルにおける非ヘパリン結合ＭＣＰ−１変異体の特徴付け
材料および方法
遅延型接触過敏症モデル
接触過敏症を測定するためのマウス耳膨潤試験を、先に記載（ガリグエ ＪＬ（Ｇａｒｒｉｇｕｅ ＪＬ）ら、１９９４）の通りに実施した。簡単に説明すると、アセトン／オリーブ油（４：１）中０．５％２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ；シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））溶液の２５μｌを、剃毛した腹部に適用することによって、マウスを局所的に予め感作させた。５日後、同ビヒクル中０．２％ＤＮＦＢの２０μｌを右側の耳に適用し、ビヒクル単独を左側の耳に適用した。５〜９日目の連日、０．５ｍｇ／ｋｇ（１０マイクログラム／マウス）のＭＣＰ−１ＷＴ^*またはコントロールグループではＰＢＳのみの腹腔内投与でマウスを処置した。ＤＮＦＢ攻撃の１時間前に、第１の処置を投与した。ダイヤル・シックネス・ゲージ（ミツトヨ社（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐ．））で耳の膨潤を測定し、攻撃後の値から攻撃前の値を差し引き、さらに、ビヒクル攻撃した反対側の耳において検出された任意の膨潤を差し引くことによって耳の膨潤を見積もった。

ブレオマイシン誘導性肺線維症モデル
Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスに、ブレオマイシン（２５μｌ ＰＢＳ中３．７５Ｕ／ｋｇ）を気管内投与した（０日目）。ブレオマイシンの点滴１時間後、試験動物に、０．２ｍｌ ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｋｇ ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａまたは０．２ｍｌ ＰＢＳのみのいずれかを腹腔内投与した。この処置を連日行い、１０日間継続した。体重の消失および死亡率の百分率を連日記録した。１０日目に、すべてのマウスをＣＯ₂窒息によって屠殺した。コラーゲン沈着の指標としてのヒドロキシプロリンレベルの測定のために、４つの肺胞を−８０℃に配置し、ならびに１つの肺胞を、肺線維症の組織学的決定のために処理した。ヒドロキシプロリンの分析によって、総肺コラーゲンを決定した。簡単に説明すると、肺を、ティッシュ・テアラー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ）によりＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で均質化し、続いて、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）中で１晩、１１５℃でインキュベートする。クエン酸／酢酸緩衝液、イソプロパノール、クロラミン−Ｔ、およびＤＡＢ溶液をサンプルに添加し、３０分間、６０℃で放置する。サンプルを室温で１０分間、冷却し、分光光度計上５６０ｎｍで読み取った。肺線維症は、１０％ホルマリンに右肺胞を固定化することによって組織学的にも決定し、続いて、パラフィンに包埋し、切片を作製し、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）のトリクロム溶液で染色した。光学顕微鏡で組織学的変化を調べた。半定量的評価法を使用し、線維化領域の百分率を計算して、ブレオマイシン誘導性肺炎症および線維症の形態学的評価を実施した。

実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
０日目に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；ディフコ・ラボ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．））中ＭＯＧ_35-56ペプチド（２００マイクログラム）および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（５００マイクログラム）を含有する０．２ｍｌの乳液を左側腹部の皮下に注入することによって、雌性マウス（８週齢；Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢＲ株；１８〜２２グラムの重量）に免疫した。直後に、百日咳毒（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０１７％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有する４００マイクロリットルの緩衝液中５００ナノグラム）を腹腔内投与した。２日目に、百日咳毒を含有する同溶液の第２の腹腔内注入を、動物に施した。７日目に、ＣＦＡ中ＭＯＧ_35-56ペプチド（２００マイクログラム）の２回目の投与を、右側腹部への皮下注入でマウスに投与した。この手順により、約１８〜２０日目に疾患が発症し、尾から生じて進行的に前肢にまで上昇する進行性の麻痺が出現する。

実験７日目（疾患の通常の発症の約１〜３日前）に、各動物について処置を開始し、連続２１日間、継続した。７日目から開始し、動物を、以下の臨床評価によって、麻痺の存在について個々に調べた。
０＝疾患の徴候なし
０．５＝尾の部分的麻痺
１＝尾の麻痺
１．５＝尾の麻痺＋後肢の片側のみに部分的麻痺
２＝尾の麻痺＋後肢の脆弱化または後肢の部分的麻痺
２．５＝尾の麻痺＋後肢の部分的麻痺（骨盤下部）
３＝尾の麻痺＋後肢の完全な麻痺
３．５＝尾の麻痺＋後肢の完全な麻痺＋失禁
４＝尾の麻痺＋後肢の麻痺＋前肢の脆弱化または部分的麻痺
５＝瀕死または死亡。

実験は、以下に示すように、それぞれ１０匹の動物からなる３つのグループで行った。グループ１はポジティブコントロールとしてＰＢＳで処置した。グループ２は、０．０５ｍｇ／ｋｇのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹腔内注入で連日処置した。グループ３は、０．５ｍｇ／ｋｇのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹腔内注入で連日処置した。ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ変異タンパク質を滅菌水に溶解し、次いで、滅菌ＰＢＳに希釈（２００マイクロリットル／マウス）し、必要とされる濃度を達成した。

コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデル
０日目に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；ディフコ・ラボ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．））中ウシＩＩ型コラーゲン（１００マイクログラム；モルウェル・ダイアグノスティクス（Ｍｏｒｗｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（４００マイクログラム）からなる０．２ｍｌの乳液を尾の付け根に皮内注入することによって、雄性マウス（８〜１２週齢；ＤＢＡ／１株；１８〜２２グラムの重量）に免疫した。

約１６から２０日目から炎症の徴候が出現し、１つもしくはそれ以上の肢に影響を及ぼした。前足および後ろ足の指の炎症の存在に関する目視臨床評価に基づき、以下からなる臨床評価によって、疾患の重症度について動物を個々に格付けした：
０＝疾患の徴候なし
０．５＝１〜５本の前／後足の指に炎症の徴候を伴う
１＝６〜１０本の前／後足の指に炎症の徴候を伴う
１．５＝１１〜１５本の前／後足の指に炎症の徴候を伴う
２＝１６〜２０本の前／後足の指に炎症の徴候を伴う。

総合的臨床評価＞０．５を有する２つのグループ（ｎ＝１０匹のマウス）を、７日間連続で、ＰＢＳ（コントロールグループ）の腹腔内注入または０．０５ｍｇ／ｋｇのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａで連日処置した。最後の処置の２４時間後にすべてのマウスを屠殺した。

オボアルブミン誘導性肺炎症（ＯＶＡ）モデル
雌性マウス（８〜１０週齢；Ｂａｌｂ／ｃ株）。２ｍｇ水酸化アルミニウム２％（セルヴァ（Ｓｅｒｖａ））において沈殿した２００μｌの総容積の１０μｇオボアルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の腹腔内注入によって、マウスを感作した。７５０μｌのＬＰＳを含まない０．９％ＮａＣｌにおいて２５μｌオボアルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）、２５０μｌ水酸化アルミニウムを混合し、水酸化アルミニウム２％／オボアルブミン溶液を調製し、３〜４時間、４℃で沈殿させた。感作の１５日後、以下のように６匹からなるグループで、マウスを処置および攻撃した：
グループ１：ＬＰＳを含まない０．９％ＮａＣｌで攻撃し、ＰＢＳで処置した（ベースライン）
グループ２：オボアルブミンで攻撃し、ＰＢＳで処置した（ネガティブコントロール）
グループ３：オボアルブミンで攻撃し、０．５ｍｇ／ｋｇのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａで処置した。

５日間連続、各攻撃の３０分前に、腹腔内注入（２００マイクロリットル）によって、ＰＢＳまたはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを投与した。オボアルブミン（５０マイクロリットルのＬＰＳを含まない０．９％ＮａＣｌ中に懸濁した１５マイクログラムの沈殿オボアルブミン）で、イソフルランによる吸入麻酔下のマウスの鼻腔内を攻撃した。攻撃後７２時間目に、０．９％ＮａＣｌ中１４％ウレタン（ｖ：ｖ）の３００μｌの致死的腹膜内注入によって、マウスを屠殺した。結合組織から気管を摘出し、小さな切開を作製し、０．７５ミリメートル径のカテーテルを気管に挿入した。その場所で１片の縫合糸によりカニューレを結び１ｍｌシリンジに付着させた。インサイチュで、肺に０．４ミリリットルのＰＢＳを充填した。緩徐にマッサージした後、肺から液体を抜き出して細胞を取り出し、氷上のプラスチックチューブに回収した。この手順を４回繰り返し、各動物から回収した細胞懸濁液を氷上で合わせて、約１．４ｍｌの最終容積を得た。血球計を使用し、細胞懸濁液のトリパンブルーへの２倍希釈液を使用して、細胞の計数を実施した。

結果
ＭＣＰ−１のインビボ特性については、多くの論文において、特にトランスジェニックマウスを利用することによって、特徴付けられている（ル Ｂ（Ｌｕ Ｂ）ら、１９９８；ルットレッジ ＢＪ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＢＪ）ら、１９９５）。次いで、ヒト炎症および疾患の動物モデルを利用して、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを試験し、腹膜細胞漸増モデルを使用して得られたこのＭＣＰ−１ヘパリン結合欠損変異体のアンタゴニスト活性に関する結果を確認した。

遅延型接触過敏症は、Ｔ細胞によって仲介されるハプテン特異的皮膚炎症を耳の膨潤によって測定する動物モデルである。増強された接触過敏症は、高レベルのＭＣＰ−１を血清に構成的に産生するトランスジェニックマウスで示されている（ミズモト Ｎ（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｎ）ら、２００１）。ハプテンとして接触感作物質２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を利用して、正常マウスの耳の皮膚を攻撃した。得られる膨潤は、処置期間を通してビヒクルのみで処置したマウスで観察された効果と比較した場合、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹膜内投与（ＤＮＦＢによる攻撃時に開始した）によって処置したマウスよりも有意に低かった（図６）。

ＭＣＰ−１は、肺または皮膚炎症プロセスにおいてプロコラーゲンの沈着を誘導することが公知である（ホガボアム ＣＭ（Ｈｏｇａｂｏａｍ ＣＭ）ら、１９９９）ため、肺炎症／線維症モデルで、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの特性について試験した。

マウスにおけるブレオマイシンの気管内点滴により、それぞれ７〜１０日以内に肺炎症および線維症が生じ、肺におけるコラーゲンの顕著な蓄積ならびに重要の迅速な減少を伴う（チェン ＥＳ（Ｃｈｅｎ ＥＳ）ら、２００１）。マウスをブレオマイシンに暴露させ、１時間後にＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹腔内投与またはＰＢＳのみで処置した後の１０日間を通して重量を記録し、さらにブレオマイシンで処置しなかったコントロールグループと比較した。２日目より明白になっている通り、ＰＢＳで処置したコントロールマウスは、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ処置マウスと比較して有意に高い量の重量を消失している（図７）。肺線維症および炎症は、２つの異なる方法を使用して、１０日目に動物を屠殺した後に評価した。ブレオマイシンが、コラーゲン合成および線維症に比例して肺のヒドロキシプロリンの合成を増加することは公知である（マドテス ＤＫ（Ｍａｄｔｅｓ ＤＫ）ら、１９９９）。ＰＢＳのみで処置したマウスで測定されるヒドロキシプロリンのレベルは、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹膜内投与を受けたグループで測定されたレベルよりも有意に高かった。実際、この後者のグループのレベルは、ブレオマイシン非処置マウスに匹敵した。別の半定量的組織学的評価により、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ処置グループ対コントロールにおける線維症の総レベルの有意な低下を確認した（図８）。

ＭＣＰ−１に対する抗体および機能的ＭＣＰ−１遺伝子を欠くトランスジェニックマウスにより、例えば、ヘルペスウイルス誘導性脳脊髄炎（ＨＳＭ）および実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）に関連する中枢神経系、多発性硬化症の動物モデルにおけるマクロファージ漸増および炎症に対するＭＣＰ−１の極めて重要な役割が実証された（ナカジマ Ｈ（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ）ら、２００１；ファング ＤＲ（Ｈｕａｎｇ ＤＲ）ら、２００１）。ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの投与により、試験した投与の両方において、ＥＡＥ動物モデルの臨床スコアが顕著に改善された（図９）。

上記で考察したように、ＭＣＰ−１は強力な線維形成誘導性効果を有する。コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、このＭＣＰ−１活性に対するＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの特性を試験した。また、この場合、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａは、処置したマウスの臨床評価を顕著に改善した（図１０）。

喘息を特徴とする肺アレルギー性炎症ならびに気管支高感受性（ＢＨＲ）は、肺における異なる白血球のサブセットの蓄積および活性化によって達成される。抗体によるＭＣＰ−１の遮断は、ＢＨＲおよび炎症を劇的に減少する（ゴンザロ ＪＡ（Ｇｏｎｚａｌｏ ＪＡ）、１９９８）。オボアルブミン誘導性肺炎症（ＯＶＡ）モデルでは、細胞漸増の減少について、ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａは有意な改善を提供した（図１１）。

本発明の実施例において変異させた二塩基性部位が、ヒスチジン６６およびリジン５８などのＧＡＧへのＭＣＰ−１結合に関与することが公知である他の塩基（チャクラバルティー Ｌ（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ Ｌ）ら、１９９８）と共に、すべてのＭＣＰにおいて変換されれば（図１Ｂ）、アンタゴニスト活性を有する他のＭＣＰに基づく変異体を、本特許出願の所見に基づいて設計することができる。

特に、ＭＣＰアンタゴニストは、１８および１９、１８および５８（または６６）、１９および５８（または６６）位でのヒト成熟ＭＣＰ−１（配列番号４）、ＭＣＰ−２（配列番号５）、ＭＣＰ−３（配列番号６）、ＭＣＰ−４（配列番号７）、またはエオタキシン（配列番号８）の二重変異、ならびに１８、１９および５８（または６６；番号付けはヒト成熟ＭＣＰ−１に与えられる番号付けに対応する）位での三重変異であることができる。１８および１９位の残基に加えてさらに変異させることができる他の残基は、すべてのヒトＭＣＰタンパク質において高度に変換されることが同定されている他の塩基性残基である（前記２４、４４、４９、７５；図１Ｂ）。

これらの代替的分子の特性については、上記の方法のいずれか、ならびに当該分野において既知の他のバリデーションアプローチを利用することによって試験することができる。他の多くの有用なケモカイン関連技術（組換え発現、インビトロアッセイ、トランスジェニック動物）は、文献（「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３８巻、ヒューマナ出版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２０００；「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２８８巻、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９７）において広範に検討されている。

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ル Ｂ（Ｌｕ Ｂ）ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、 １８７： ６０１−６０８、１９９８
ルブコスキー Ｊ（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ Ｊ）ら、 Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、 ４： ６４−６９、１９９７
ルオ Ｂ（Ｌｕｏ Ｂ）およびプレストウィッチ ＧＤ（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ＧＤ）、Ｅｘｐ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔｅｎｔｓ、 １１： １３９５−１４１０、２００１
ルスター ＡＤ（Ｌｕｓｔｅｒ ＡＤ）およびローテンベルグ ＭＥ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ＭＥ）、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ、 ６２： ６２０−３３、１９９７
マッドテス ＤＫ（Ｍａｄｔｅｓ ＤＫ）ら、 Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、 ２０： ９２４−９３４、 １９９９
マクリデス ＳＣ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、 １７： １８３−２０２、１９９９
メンテン Ｐ（Ｍｅｎｔｅｎ Ｐ）ら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ、 １２： ５５４−５６０、 ２００１
メイヤー ＭＲ（Ｍａｙｅｒ ＭＲ）およびストーン ＭＪ（Ｓｔｏｎｅ ＭＪ）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７６： １３９１１−１３９１６、２００１
マッククイバン ＧＡ（ＭｃＱｕｉｂｂａｎ ＧＡ）ら、Ｂｌｏｏｄ、 １００： １１６０−１１６７、 ２００２
ミルザデガン Ｔ（Ｍｉｒｚａｄｅｇａｎ Ｔ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７５： ２５５６２−２５５７１、２０００
ミズモト Ｎ（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、 ２０４： ４７７−４９３、２００１
マーフィー ＬＲ（Ｍｕｒｐｈｙ ＬＲ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、 １３： １４９−１５２、２０００
ナカジマ Ｈ（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ）ら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ、 ７０： ３７４−３８０、 ２００１
パボラ ＣＤ（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７３： ３３１５７−３３１６５、１９９８
パテル Ｄ（Ｐａｔｅｌ Ｄ）ら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ９９： ４３−５２、２００１
ピライ Ｏ（Ｐｉｌｌａｉ Ｏ）およびパンチャグヌラ Ｒ（Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ Ｒ）、Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、 ５： ４４７−４５１、２００１
プルースト Ｐ（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ）ら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ、 ５９： ６７−７４、１９９６
プラウドフット Ａ（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７６： １０６２０−１０６２６、 ２００１
レックレス Ｊ（Ｒｅｃｋｌｅｓｓ Ｊ）およびガラインガー ＤＪ（Ｇｒａｉｎｇｅｒ ＤＪ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、 ３４０： ８０３−８１１、１９９９
ローデス Ａ（Ｒｈｏｄｅｓ Ａ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 ５０６： ８５−９０、２００１
ルトレッジ ＢＪ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＢＪ）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １５５： ４８３８−４８４３、１９９５
ロゴブ ＳＩ（Ｒｏｇｏｖ ＳＩ）およびネクラソブ ＡＶ（Ｎｅｋｒａｓｏｖ ＡＮ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、 １４： ４５９−４６３、２００１
サルセド Ｒ（Ｓａｌｃｅｄｏ Ｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ、 ９６： ３４−４０、２０００
ソーヤー ＴＫ（Ｓａｗｙｅｒ ＴＫ）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、ビーラパンジアン Ｐ（Ｖｅｅｒａｐａｎｄｉａｎ Ｐ）編、マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．）、５５７−６６３頁、１９９７
シート ＢＴ（Ｓｅｅｔ ＢＴ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、 ９８： ９００８−９０１３、 ２００１
ステイツ ＳＡ（Ｓｔｅｉｔｚ ＳＡ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 ４３０： １５８−１６４、 １９９８
ビライン Ｍ（Ｖｉｌｌａｉｎ Ｍ）ら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、 ８： ６７３−９、２００１
ザング Ｙ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）およびロリンズ ＢＪ（Ｒｏｌｌｉｎｓ ＢＪ）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、 １５： ４８５１−５、１９９５
ザング Ｙ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ １０： ９３−１０３、１９９６

（Ａ）実施例において発現ならびに試験されるヒトおよび変異されたＭＣＰ−１タンパク質のアミノ酸配列（変異されたアミノ酸に下線を付している）を示す。ＭＣＰ−１ＷＴ^*およびＭＣＰ−１ＷＴ^*２ＡのＮ末端のメチオニンは、さらなる残基によるタンパク質の活性に対する任意の影響を回避するために、アミノペプチダーゼによる処置による精製により、除去した。（Ｂ）成熟型のヒトＭＣＰ−１（ＣＣＬ２；スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ１３５００）、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ７；スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ８００７５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ８；スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ８００９８）、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ８；スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ９９６１６）、およびエオタキシン（ＣＣＬ１１；スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）受託番号Ｐ５１６７１）のアラインメントを示す。ＧＡＧ（残基１８と１９）結合に関与するとして本特許出願におけるＭＣＰ−１において同定される塩基性残基がおよびより相同なヒトタンパク質において保存された対応する残基を枠で囲んでいる。すべてのヒトＭＣＰタンパク質の間で保存された他の塩基性残基に下線を付している。 ［³Ｈ］−ヘパリン、およびケモカインとして、ＭＣＰ−１ＷＴ^*（○）またはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（●）のいずれか一方により実施したヘパリン結合アッセイの結果を表すグラフを示す。 ケモカインとして、ｈＭＣＰ−１（□）、ＭＣＰ−１ＷＴ^*（○）、またはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（●）の付加を生じるＣＣＲ２を発現するＣＨＯ膜からの［¹²⁵Ｉ］−ＭＣＰ−１の置換をモニターすることによって実施した平衡競合受容体結合アッセイの結果を表すグラフを示す。 ＴＨＰ−１細胞、および走化性薬剤として組換えヒトＭＣＰ−１（□）、ＭＣＰ−１ＷＴ^*（○）、またはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（●）を使用して実施したトランスウェル走化性アッセイの結果を表すグラフを示す。 ＭＣＰ−１ＷＴ^*および／またはＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａを使用して、マウスにおいて実施した腹膜細胞漸増アッセイの結果の概要を表すグラフを示す。ＭＣＰ−１ＷＴ^*によって漸増した細胞数に対して統計的に有意な阻害活性を示すＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの濃度をグラフ内で^*で示す。 遅延型接触過敏症アッセイの結果の概要を表すグラフを示す。マウスを０．５ｍｇ／ｋｇ ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（黒四角）またはビヒクルのみ（□）で処置した。処置中の各日における耳の膨潤容積について、効果を測定する。 肺線維症を誘発させるためにブレオマイシンを投与したマウスの体重に対する影響の概要を表すグラフを示す。コントロールマウスの平均体重（□）を、０．２５ｍｇ／ｋｇ ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（黒四角）またはＰＢＳのみ（○）の腹膜内投与も同時に行った処置マウスの平均重量と比較する。示した重量は、各グループのマウスに対する平均重量値である。 非処置およびブレオマイシン処置マウス（さらにＰＢＳのみ、または０．２５ｍｇ／ｋｇ ＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａの腹膜内投与でさらに処置した）において線維症のレベルを比較したグラフを示す。実施例に記載のように、分光的（上）または組織学的（下）のいずれかで、線維症のレベルを測定した。 ＰＢＳのみ（グループ１）、１マイクログラム／マウスのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（グループ２）、または１０マイクログラム／マウスのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａ（グループ３）で処置した実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）動物モデルにおいて測定した臨床スコアを比較したグラフを示す。 ＰＢＳのみ、または１マイクログラム／マウスのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａで処置したコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）動物モデルにおいて測定した臨床スコアを比較したグラフを示す。 ＰＢＳのみ（グループ１）で処置および攻撃、ＰＢＳによる処置およびオボアルブミンで攻撃（グループ２）、または１０マイクログラム／マウスのＭＣＰ−１ＷＴ^*２Ａで処置およびオボアルブミンで攻撃（グループ３）した動物モデルの気管から単離した細胞の量を比較したグラフを示す。

Claims (21)

1. ヒト成熟ＭＣＰ−１の配列に対して番号付けされた以下の組み合わせの残基、
   ａ）１８および１９；
   ｂ）１８および／または１９と５８；
   ｃ）１８および／または１９と６６；
   ｄ）１８および／または１９と５８および６６；
   ｅ）１８および／または１９と２４、４４、４９、７５のうちの１つもしくはそれ以上；
   がアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに置換されている、ＭＣＰタンパク質の変異体からなるＭＣＰタンパク質のアンタゴニスト。
2. 残基１８および１９がアラニンで置換されている、請求項１に記載のアンタゴニスト。
3. ＭＣＰタンパク質が、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２、ヒトＭＣＰ−３、ヒトＭＣＰ−４、またはヒトエオタキシンである、請求項１または２に記載のアンタゴニスト。
4. ＭＣＰタンパク質が、ヒト成熟ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、またはエオタキシンと少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１または２に記載のアンタゴニスト。
5. ＭＣＰタンパク質のアンタゴニストであって、
   ａ）アンタゴニスト活性を妨げることなく、１もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失、または置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＭＣＰタンパク質のアンタゴニストの活性変異体；、
   ｂ）（ａ）のポリペプチドあるいはペプチドの配列および／または構造に基づいて設計されるペプチド疑似物；
   ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のアミノ酸配列、および対応するＭＣＰタンパク質以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドまたはペプチド；
   ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｄ）の活性フラクション、前駆体、塩もしくは誘導体、
   から選択される、アンタゴニスト。
6. （ａ）のポリペプチドまたはペプチドが配列番号３に対応する配列を有する、請求項５に記載のＭＣＰタンパク質。
7. （ｃ）のポリペプチドまたはペプチドが、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリンの定常領域、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、輸送シグナル含有タンパク質の１つもしくはそれ以上のタンパク質に属するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載のＭＣＰアンタゴニスト。
8. 前記アンタゴニストが、放射能標識、ビオチン、蛍光標識、細胞障害性薬剤、薬物送達剤との活性共役または複合体の形態にある、請求項５または７に記載のＭＣＰアンタゴニスト。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列又は当該ＤＮＡ配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含んでなる、ＤＮＡ分子。
10. 請求項９に記載のＤＮＡ分子を含んでなる発現ベクター。
11. 請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
12. 請求項１１に記載の形質転換された細胞を培養することおよび発現されたタンパク質を回収することを含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの調製のプロセス。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの精製された調製物。
14. 医薬品としてのＭＣＰアンタゴニストの使用。
15. 過剰な白血球遊走および活性化に関連する疾患の治療または予防のための薬学的組成物における有効成分としての請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの使用。
16. 疾患は炎症性疾患、自己免疫疾患または感染症である、請求項１５に記載の使用。
17. 血管障害または癌の治療もしく予防のための薬学的組成物における有効成分としての請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの使用。
18. 有効成分として請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストを含有する薬学的組成物。
19. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの有効量の投与を含んでなる、過剰な白血球遊走および活性化に関連する疾患の治療または予防方法。
20. 疾患は炎症性疾患、自己免疫疾患または感染症である、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＰアンタゴニストの有効量の投与を含んでなる、血管障害または癌の治療もしくは予防方法。

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