CN105582526A - 三叶因子2在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学技术领域，涉及TFF2蛋白在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用，本发明通过转录组芯片分析筛选重症流感和轻症流感感染小鼠肺组织的显著差异基因表达，筛选到TFF2为保护性分子，通过体外合成TFF2蛋白，发现滴入TFF2蛋白能显著提高流感感染小鼠的生存率，减少小鼠体重丢失。进一步研究发现，TFF2并不影响流感病毒复制，却能减少炎性因子分泌，促进肺粘膜修复，减少肺组织损伤。由于其他的呼吸道病原体或理化因素引起呼吸道组织损伤的机理与流感病毒感染类似，TFF2对流感病毒感染的保护并非特异性保护，而是广谱性的保护作用，因此，TFF2在呼吸道病原体或其他因素诱导的急性炎症损伤模型中发挥了重要的保护作用。

Description

三叶因子2在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用

技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及三叶因子2(TFF2)在制备治疗及预防呼吸道病原体感染或其他因素造成的肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用。

背景技术

呼吸道的急性炎症性疾病可见于呼吸道的感染、吸入高温、低温或有毒气体等，其中呼吸道感染导致的急性炎症性疾病为常见，且以病毒性感染最为多见。

呼吸道感染病原具有病原种类多、人群普遍易感、传播速度快、传染性强且不容易控制等特点，一旦爆发严重威胁人类的健康。近年来，呼吸道病毒急性感染造成的疫情从未间断，造成了大量的人员死亡和巨大的经济损失。2003年非典型肺炎冠状病毒（SARS-CoV）的爆发，全球累计病例报告数超过8437例，其中死亡病例数达到813例，并造成了我国严重的经济损失。2009年禽流感H1N1病毒再次席卷全球，截至2009年10月30日造成了全球190多个国家和地区感染病例44万例，死亡达5712人。2013年3月新型重组禽流感病毒H7N9出现在我国的长江流域，截至13年10月31日，中国内地确诊了136例人感染H7N9禽流感病例，其中死亡45人，随后散在的H7N9感染病例陆续被报道。最近几年，新中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）从中东地区出现并呈现跨区域传播趋势，自2012年9月至今，已经有26个国家报告了MERS-CoV病毒感染病例，全球有1626个感染者，已造成586个感染者死亡。这些数据充分说明急性传染性呼吸道病原体感染能引发严重的疫情，其社会危害巨大，应当引起我们的高度重视。

人呼吸道急性病毒感染后，由于病原体复制而引发肺/支气管组织过度的炎症反应，大量招募炎症细胞聚集在呼吸道组织，破坏了肺泡、气管/支气管和血管的正常组织结构，造成了间质水肿和肺出血，称之为呼吸道窘迫综合征（ARDS），这直接影响肺组织的正常的气体交换过程，如果机体不能对损伤的肺组织及时修复的话，能很快的造成宿主死亡，所以，呼吸道病毒感染发病率及死亡率一直居高不下，且每隔几年就发生一次疫情流行。而且，这些病毒变异速度快，很容易产生耐药株，同时，呼吸道内的炎症应答阻碍了治疗药物有效进入呼吸道组织，因而单纯的抗病毒药物治疗常常效果不佳。以流感为例，通过对不同的季节性或流行性流感以及禽流感感染的研究发现，即使能够及时使用抗病毒药物，如奥司他韦，虽然可降低重型流感的风险，但是并不能阻止大部分H5N1和H7N9重型感染患者的死亡。而且，抗病毒药物治疗可导致耐药株病毒的出现。

针对呼吸道急性病毒的大部分的策略是通过抗病毒药物来抑制病毒复制与播散，从而达到改善预后的目的。然而，他们忽视了宿主因素的作用。研究表明，呼吸道疾病的严重程度至少部分是由宿主因素决定的，许多感染病例的死亡是由与宿主炎症反应造成的不可逆肺损伤所致。我们通过比较高致病性的禽流感病毒H7N9和低致病性的禽流感病毒H9N2在不同时间点诱导的宿主反应来看，高致病性禽流感病毒诱导炎症反应启动慢（1天），然而持续时间长(7天)且严重程度高；而低致病性的流感病毒能快速启动炎症反应（6小时），并在第3天能及时终止炎症反应，表现出了精确的调控炎症反应的能力。提示，调节宿主的炎症反应可能是一种易操控的、与抗病毒药物互补的治疗策略；与抗病毒药物相比，其对预防耐药突变株的产生有优势；同时，对于尚无抗病毒药物的病毒感染（如MERS），调节宿主的炎症反应是唯一的治疗手段。因而，调节宿主的炎症反应具有广谱的治疗作用。

在我们的研究中发现：三叶因子2（TFF2）是H9N2感染后高表达、H7N9感染高度抑制的蛋白。提示该蛋白可能与炎症调节有关。TFF2于1982年由Jorgensen及其同事从猪胰腺中分离出来，在不同物种中具有高度的保守性，人三叶因子2（hTFF2）和鼠三叶因子2（mTFF2）含有同样的氨基酸数目，氨基酸序列的同源性达到82%。成熟的TFF2蛋白由106个氨基酸组成，分子量约为7-12kD，内含4个外显子及两个对称的三叶结构域，因此其结构极其稳定，耐酸、耐热且抗蛋白酶水解，主要表达在胃粘膜颈部杯状细胞中。之前的研究表明，TFF2主要在胃肠道中发挥作用，其拥有胃肠道黏膜保护和上皮修复的功能，参与了胃癌的调节，减少了细菌对肠道的损伤，保护了小鼠因DSS肠炎而导致的致死。另外，TFF2在过敏反应中也发挥重要作用，TFF2能减轻过敏反应，如缓解哮喘症状。其主要的作用机制不完全清晰，大体包括与黏蛋白相互作用、促进细胞迁移、抗凋亡、抑制炎症反应等。然而，迄今为止，TFF2对呼吸道急性炎症所引起的疾病的保护效果仍未知晓。本发明将着重解析TFF2在呼吸道急性炎症性疾病中的抗炎症与组织损伤的修复功能。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：提供一种TFF2蛋白，利用该蛋白能降低肺组织炎症产生，减少肺组织损伤，促进肺组织功能修复的优点，可用于制备治疗呼吸道病原体感染引起的肺损伤的药物，该药物对流感感染引起的预后有明显的改善效果。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种三叶因子2在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用，其中，所述三叶因子2的来源包括人源、鼠源以及TFF2基因来源的多肽片段。

所述的肺/支气管急性炎症疾病包括呼吸道病原体感染、吸入高温气体、吸入低温气体、吸入有毒气体及上述多种因素混合造成的肺/支气管急性炎症疾病，以及急性炎症进一步恶化的呼吸窘迫综合症、肺纤维化及迁延形成的慢性炎症。

上述应用中，利用三叶因子2所制备的治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物可在肺/支气管急性炎症发生前预防性给药用以预防炎症发生或降低后续炎症的严重程度；也可在肺/支气管急性炎症发生后作为治疗性药物给药以降低炎症与疾病的严重程度；也可自肺/支气管急性炎症发生前至发生后连续或间隔给药，以获得更佳疗效。

本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明发现了TFF2蛋白的新用途，现有技术表明TFF2蛋白能促进胃粘膜和肠粘膜修复，保护小鼠免于肠道细菌的攻击。本发明所述TFF2蛋白分子能在流感病毒H7N9，PR8和H9N2感染以及LPS引起的呼吸道损伤中起保护作用，减少发病率和死亡率，减轻呼吸道感染症状，可能在应对呼吸道新发病毒性感染的疫情中起重要作用，尤其对预防与治疗尚无有效治疗药物的病毒性感染以及重症呼吸道感染尤为有益，此外，TFF2蛋白在病毒感染中起保护作用并非通过抑制病毒复制，而是通过抑制炎症反应，促进呼吸道粘膜组织修复，减少呼吸道组织损伤进行的。由于其他的呼吸道病原体或理化因素引起呼吸道组织损伤的机理与流感病毒感染类似，因此，TFF2的保护作用并不局限于流感病毒造成的呼吸道组织损伤，包括其他呼吸道病原体或理化因素引起的呼吸道损伤，对参与呼吸道传染病疫情处理的疾控人员、参与火灾消防人员以及有毒气体处理的专业人员进行预防性给药，可有效降低上述人员职业工作的风险以及受到的损害。

附图说明

图1显示了流感病毒的攻毒模型（A），H7N9和H9N2感染后小鼠的体重变化曲线（B），H7N9以及H9N2感染后小鼠的生存率曲线（C）。

图2显示了这两株流感病毒感染后小鼠肺组织显著差异表达的基因（A），芯片数据中TFF2在不同时间点的表达情况（B），荧光定量PCR验证肺组织中TFF2的表达（C），以及WesternBlot验证TFF2在病毒感染的不同时间点的表达（D）。

图3显示了TFF2真核表达载体pSV1.0，pSV1.0-TFF2，pSV1.0-TFF2-6xHis的构建图谱（A），TFF2在体外细胞系的表达并被分泌到细胞上清中（B）以及TFF2-6xHis蛋白纯化在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上的验证（C）。

图4显示了TFF2蛋白处理对流感病毒H7N9，H9N2，PR8攻毒小鼠的保护模型（A），TFF2上清提高H7N9感染小鼠的生存率，减少体重丢失（B），TFF2蛋白减少H9N2感染造成的体重丢失，而TFF2基因敲除小鼠加重了体重丢失以及延长体重恢复时间（C），TFF2蛋白也保护PR8感染小鼠，减少PR8感染造成的致死和体重丢失（D）。

图5显示了TFF2对流感病毒在小鼠体内（A）和在体外肺上皮细胞系A549（B）中对病毒复制的影响，TFF2添加对H7N9感染小鼠肺组织显微结构的影响（C）以及炎性因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）表达的影响（D）；TFF2在脂多糖（LPS）诱导的急性肺炎症损伤模型中对肺组织显微结构的影响（E）以及对炎症因子TNF-α和IL-6的影响（F）。

具体实施方式

本发明通过对高致病性流感病毒和低致病性流感病毒感染小鼠的肺组织在6小时，1天，2天，3天，7天，14天时间点进行全基因组转录组学分析，筛选出显著差异表达的宿主分子TFF2，其在低致病性流感病毒感染过程中先微量下降，随后逐步升高，而在高致病性的流感病毒感染过程中急剧下降，这与其体重丢失的曲线非常类似，提示它可能在预防流感病毒引起的呼吸道损伤中具有重要作用。为了验证TFF2在流感感染中的作用，我们构建了TFF2真核表达载体pSV1.0-TFF2，在293FT细胞中表达，收集上清，浓缩，采用WesternBlot验证TFF2的表达，然后用ELISAKit对上清中的TFF2进行定量。采用含TFF2的上清与对照上清分别在感染前2小时，感染后的3天和8天滴鼻处理小鼠，观察H7N9感染后小鼠体重变化和生存率。发现含TFF2的细胞培养上清处理组能显著提高小鼠的生存率，减少体重丢失，改善高致病性禽流感感染的症状与预后。在此基础上，我们采用亲和层析的方法纯化了TFF2蛋白，进一步验证其对流感病毒H1N1毒株PR8以及H9N2毒株攻毒的保护效果；同时，TFF2基因敲除小鼠对H9N2病毒更为敏感，体重下降程度更高，恢复的时间更慢。机制研究表明：TFF2不影响流感病毒复制，而是通过降低炎症因子表达，减少呼吸道组织损伤与促进损伤修复以达到改善预后的效果。另外，TFF2对流感病毒感染的保护并非特异性保护，而是广谱性的保护作用，其在LPS诱导的急性炎症损伤模型中也能发挥同样的功能。这些结果充分证明TFF2在呼吸道病原体或其他因素诱导的急性炎症损伤模型中发挥了重要的保护作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一：建立高致病性流感和低致病性流感感染小鼠的模型

本实施例采用高剂量的流感病毒H7N9病毒株A/Shanghai/4664T/2013（3.5*10⁵半数组织细胞感染量TCID50/50ul体积）和H9N2病毒株A/Chicken/Shanghai/F/98（1.7*10⁷鸡胚半数感染量EID50/50ul体积）通过滴鼻的方法感染C57小鼠，感染前采用氯胺酮40ul/只麻醉小鼠。将小鼠放入IVC笼中，连续14天称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态。在感染后的6小时，1天，2天，3天，7天，14天取肺组织，液氮速冻，备用（图1A）。图1B所示，H7N9感染的小鼠体重持续下降，在第7天，大部分小鼠体重丢失30%以上，而H9N2感染的小鼠在感染后的前3天体重下降了12.6%，从第4天开始体重逐渐恢复，第8天体重恢复到感染前水平，第9天开始体重逐渐增加。生存率分析（图1C）显示，H7N9感染的小鼠在感染后第4天开始死亡，第7天死亡率达到37%，第8天全部死亡；而H9N2感染后，12%的小鼠死亡是由于病毒感染引发的狂怒，暴躁而被咬伤（有伤口），非直接病毒感染致死，剩余88%的小鼠能持续生存2周以上。（H7N9试验在P3试验室完成，H9N2试验在P2试验室完成）。

实施例二：转录组芯片分析筛选重症流感和轻症流感感染小鼠肺组织的显著差异基因表达，筛选到TFF2为保护性分子

本实施例采用了Agilent2100系统检测了H7N9与H9N2感染小鼠的0天，6小时，1天，2天，3天，7天，14天时间点的肺组织的全基因组表达谱。如图2A，我们将P值设为0.01，筛选到188个显著差异的基因，其中在H7N9组中高表达的基因有85个，而在H9N2组中高表达的基因有103个。典型的H7N9组中高表达的基因包括：Olfr11，IFNl3，IFNb1，Krt17，这些基因与炎症相关；而H9N2组中高表达差异基因包括TFF2，Gp2，Muc5b，Muc5a，Clca3，这些基因与宿主防御和上皮细胞修复密切相关。其中，TFF2在两组中差异最大，达到106.7倍，P值为0.002。TFF2mRNA在H9N2感染的前2天略有下降，第3天开始逐渐升高；而在H7N9感染中则持续下降（图2B）。为了进一步验证TFF2在H7N9和H9N2中的表达情况，我们采用SYBRReal-timePCR的方法，采用引物[TFF2-F（SEQIDNO：1）:GAGAAACCTTCCCCCTGTCG；TFF2-R（SEQIDNO：2）:TTTCGACTGGCACAGTCCTC]，根据GoTaqqPCRMasterMix（Promega，A6001）的说明进行qPCR试验，在两组每个时间点的3只小鼠中验证了TFF2mRNA的变化，其变化趋势与芯片数据一致（图2C）。下一步，我们检测了TFF2蛋白水平的表达情况，对照组有很微弱的TFF2蛋白表达，H7N9感染后，TFF2蛋白逐渐消失；而H9N2感染后，肺组织中TFF2蛋白随时间推移越来越多（图2D）。

实施例三：TFF2基因的克隆与TFF2蛋白的真核表达

本实施例首先根据TFF2序列克隆基因(人源TFF2蛋白（hTFF2）核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，鼠源TFF2蛋白（mTFF2）核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，氨基酸序列如SEQIDNO:6所示)，将重组的pSV1.0-TFF2或pSV1.0-TFF2-6xHis质粒转染进入293T细胞后，再通过WB检测TFF2蛋白的真核表达，并通过镍柱采用不同浓度梯度的咪唑洗脱，收集目的蛋白后过滤，洗涤，得到高纯度的TFF2蛋白，其具体步骤如下：

以感染H9N2的小鼠肺组织抽提的RNA反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，上游引物为SEQIDNO：7，即5’-CGCTCTAGAATGCGACCTCGAGGTGCCCC-3’，下游引物为SEQIDNO：8，即5’-CCTGGATCCTCAGTAGTGACAATCTTCCA-3’。TFF2-6xHis的引物序列为：上游引物为SEQIDNO：9，即5’-CGCTCTAGAATGCGACCTCGAGGTGCCCC-3’，下游引物为SEQIDNO：10，5’-CGGGATCCTCAGTGATGATGATGATGATGGTAGTGACAATCTTCCA-3’。其扩增程序为：预变性95℃，2分钟；变性95℃，15秒；退火55℃，30秒；延伸，72℃，30秒；终延伸，72℃，10分钟；循环数为30。扩增结束后，在1%的琼脂糖凝胶中分离目的基因，再使用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收扩增产物TFF2。将TFF2回收产物和载体pSV1.0都用内切酶BamHⅠ、XbaⅠ双酶切回收。37℃水浴酶切7小时，1%琼脂糖凝胶电泳后使用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收其片段。目的片段TFF2与载体pSV1.0，4℃连接过夜，形成重组质粒pSV1.0-TFF2和pSV1.0-TFF2-6xHis。将重组质粒转化至大肠杆菌E.coliTOP10，后通过菌落PCR和双酶切（BamHⅠ、XbaⅠ）鉴定阳性克隆，经测序鉴定目标序列完全正确，无突变产生。构建的克隆图谱见图3A。

将测序正确的重组质粒pSV1.0-TFF2转染进入293FT细胞，转染试剂为TurboFect，培养基为DMEM完全培养基（10%FBS和1%P.S.），37℃孵箱培养72h后将细胞取出，收集细胞到预冷的EP管中，并以RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并在上清中加入5×SDSLoadingBuffer，沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，瞬时离心后将上清作为点样样品。后通过SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分离蛋白，分离胶浓度为15%。电泳的电压为70V，时间为30-40分钟(以marker开始分离为标志)，待溴酚蓝迁移出浓缩胶位置后，将电压调至110V，1h30分钟后关闭电源，并进行转膜，恒流200mA，时间1.5小时。转膜完毕后，将PVDF正面膜（与胶接触的面）作好记号，并置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1小时。后加入合适稀释比例的一抗（TFF2:1:400或β-actin:1:1000），采用5%脱脂奶粉稀释，置于摇床4℃孵育过夜。用0.05%PBST洗膜后加入二抗，TFF2-羊抗兔（1:3000）；β-Actin-羊抗鼠（1:3000），5%脱脂奶粉稀释，室温摇床孵育1小时后洗膜，对膜进行显色，胶片采用定量分析仪曝光2分钟，记录并分析显色结果。结果表明（图3B），细胞大量表达TFF2蛋白，并被分泌到细胞上清中，浓缩后，在滤过废液中不含TFF2蛋白。为了定量TFF2的浓度，我们采用USCN公司的SEA748MUELISAKitforTrefoilFactor2(TFF2)试剂盒，做出了TFF2的标准曲线，根据标准品的光密度（OD）值，定量出了TFF2的浓度。

对TFF2-6xHis的制备与TFF2的制备方法类似，转染pSV1.0-TFF2-6xHis到293FT细胞中，48小时后收集上清，采用镍柱亲和层析纯化，具体方法是采用镍NTA琼脂糖凝胶制作1ml长度的镍柱，待液体留干后，加入10倍柱体积的水洗涤，用10倍柱体积的5mM的咪唑溶液平衡柱子后，加入含TFF2的细胞上清过柱，然后分别采用5倍柱体积的5mM，10mM，20mM，100mM，200mM，500mM浓度的咪唑依次洗涤，收集洗涤液，按照上述方法进行SDS-PAGE后，采用考马斯亮蓝G250染色30min，脱色液洗涤过夜。第二天观察到10mM，20mM，100mM的咪唑洗脱液中含有目标条带，收集这三管咪唑洗脱液，加入到Minipore的10,000KD的蛋白浓缩管AmiconUltra-15，3000g，10分钟，再加PBS洗涤两遍，去除溶液中的咪唑，得到的纯化蛋白重新进行SDS-PAGE鉴定，其纯度>99%，没有观测到杂蛋白条带（图3C）。Nanodrop软件检测浓度，分装后-80度冻存。

实施例四：TFF2蛋白对重症流感的保护作用

本实施例采用了在感染前2小时，感染后3天，8天分别滴鼻滴加一次TFF2蛋白（20μg/50ul）或对照上清，然后采用与实施例一完全相同的流感病毒攻毒模型，连续称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态（图4A）。图4B显示，添加TFF2蛋白处理后，能显著提高H7N9感染小鼠的生存率（由33.3%提高到87.5%），减少小鼠的体重丢失（平均减少了9.24%的体重丢失），改善了小鼠的生存状态。而且，人源的TFF2蛋白(hTFF2)对H7N9攻毒小鼠的保护效果（100%，n=5）与鼠源TFF2(mTFF2)的保护效果相似（87.5%，n=8）。在H9N2感染模型中，TFF2蛋白处理也减少了体重丢失（-0.9%Vs-6.1%），体重在第2天即恢复到感染前水平，而未处理组需要4天恢复；我们采用同源重组的办法制备了TFF2基因敲除小鼠，用敲除小鼠进行了上述的H9N2感染试验，我们发现，H9N2感染TFF2基因敲除小鼠体重丢失比野生型小鼠更严重（-9.3%Vs-6.1%），而且需要至少7天才能恢复到感染前水平（图4C）。另外，我们采用鼠适应株H1N1中的PR8流感病毒再次进行了验证，采用的PR8病毒剂量为10000TCID50，其余条件与前述一致，我们发现TFF2蛋白在鼠适应株PR8流感感染中也发挥作用，不仅大大减少了体重丢失的程度（平均减少了10.44%的体重丢失），而且能保护51.4%小鼠免于PR8诱导的致死（图4D）。

实施例五：TFF2蛋白不能抑制病毒复制，而是通过抑制炎症，促进肺组织损伤修复。

本实施例通过采集实施例4A中H7N9感染1天，3天，7天的肺组织标本，采用Trizol裂解液裂解并抽提肺组织RNA，然后用Promega的RNA反转录试剂盒反转录成cDNA，再采用Taqman荧光定量PCR法检测H7N9病毒载量。H7检测所需材料如下：

引物F（SEQIDNO:11）：GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA，

引物R(SEQIDNO:12)：CCCGAAGCTAAACCARAGTATCA，

Taqman探针(SEQIDNO:13)：5’-FAM-CCAGTCAAACTAAGCAGYGGCTACAAA-BHQ-3’。

通过比较2组小鼠的肺组织病毒载量，发现感染后病毒载量大幅增加，达到10⁵数量级，然而TFF2处理组与未处理组在感染后1天，3天，7天，病毒载量都没有显著差别（图5A）。我们也以A549细胞为模型进一步在体外验证TFF2对病毒复制的影响，采用WesternBlot的方法检测病毒的核蛋白（NP蛋白）的表达，发现pSV1.0-TFF2转染后，在细胞中过表达，然而，无论是H7N9感染还是H9N2感染，NP蛋白的表达在两组之间没有显著差异（图5B）。这充分说明，TFF2对流感病毒感染的保护机制并非通过抑制流感病毒复制。下一步，我们比较了TFF2处理组与对照组肺组织显微结构的差异，发现TFF2处理后H7N9在感染早期1天，3天的炎性细胞浸润明显减少，肺组织形态结构相对完整（图5C）。而且在感染早期，炎症因子TNF-α的分泌比对照组显著降低（在感染后1d后降低了61.9%）（图5D）。因此添加TFF2后，宿主减少了过度的炎症反应的发生，降低了肺粘膜组织的损伤程度，促进肺组织的损伤修复，因此能保护宿主免于高剂量的流感病毒引起的致死。为了进一步证实TFF2的作用机制，我们采用了滴鼻LPS诱导小鼠肺组织炎症疾病模型，首先将20ug纯化TFF2蛋白(50ul)滴鼻进入肺组织，2h后再采用5mg/kg的LPS滴鼻处理，24小时后取小鼠肺组织，分别制成病理切片和抽提肺组织RNA，分析组织病理显微结构和炎症细胞因子表达。我们发现添加TFF2蛋白处理后肺组织肺泡结构清晰，炎性浸润程度更低，无红细胞渗出（图5E）。而且，肺组织中TNF-α和IL-6的表达水平显著降低（TNF-α降低了56.6%，IL-6降低了74.1%）（图5F）。这进一步说明TFF2对流感病毒造成的急性肺损伤中的保护作用并非流感病毒特异性，对其他因素（如LPS）等造成的急性炎症疾病也发挥功能，因此TFF2在预防与治疗肺/支气管急性炎症疾病中发挥重要作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.三叶因子2在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三叶因子2的来源包括人源、鼠源。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三叶因子2包括经过修饰的三叶因子2蛋白以及三叶因子2基因来源的多肽片段。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肺/支气管急性炎症疾病包括呼吸道病原体感染、吸入高温气体、吸入低温气体、吸入有毒气体及上述多种因素混合造成的肺/支气管急性炎症疾病。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肺/支气管急性炎症疾病包括由急性炎症进一步恶化的呼吸窘迫综合症、肺纤维化及迁延形成的慢性炎症。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，利用三叶因子2所制备的治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物可在肺/支气管急性炎症发生前预防性给药用以预防炎症发生或降低后续炎症的严重程度；也可在肺/支气管急性炎症发生后作为治疗性药物给药以降低炎症与疾病的严重程度；也可自肺/支气管急性炎症发生前至发生后连续或间隔给药，以获得更佳疗效。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，利用三叶因子2所制备的治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物的给药方式包括呼吸道雾化吸入、滴鼻与喷雾给药、静脉给药方式。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，利用三叶因子2所制备的治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物可单独给药或与其他治疗技术联合。