CN101857872A - 甲型流感病毒抗原决定区更换方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法。本发明针对抗原决定区的位置，利用和设计酶切位点，能够实现同一亚型或不同亚型流感病毒株相互之间抗原决定区序列的整体或部分更换，并利用8质粒反向基因操作系统拯救出抗原性经过人为定向改变的重组流感病毒，在流感病毒减毒性活疫苗的快速制备和病毒载体在基因治疗中多次重复使用方面具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种甲型流感病毒不同毒株之间HA基因上抗原性片段相互替换的甲型流感病毒抗原决定区更换方法。
背景技术
流行性感冒简称流感，被人们认识已有一百余年的历史，每到秋冬以及冬春季节会就发生流行，成为全球最严重的传染病之一。20世纪发生的几次全球性大规模流行，造成大量人口死亡，给人类社会带来深重灾难。例如，因1918年的西班牙流感(H1N1)而死亡的人数估计超过5000万，1957年的亚洲流感(H2N2)和1968年的香港流感(H3N2)也有几百万人死亡，该病导致的死亡人数远远超过了因战争而死亡的人数。2009年，发端于墨西哥的新甲型H1N1流感在全球肆虐。
流感病毒是引起流感的病原体，属于正黏病毒科单股负义分节段的RNA病毒，根据核蛋白和M蛋白抗原性的不同，分为甲、乙、丙三个型。其中乙型流感病毒抗原性相对稳定，疫苗预防效果显著，并且普通人群自身携带的抗体已具有较好的免疫保护作用。丙型流感病毒抗原性稳定，多为散发病例，不引起流行，危害小。但甲型流感病毒具有极易变异、亚型众多、传染性强、宿主范围广等特点，是当前最难以控制的传染病原之一。引起世界范围大流行的都是甲型流感病毒，近十年来人类感染H5N1、H9N2、H7N7等亚型的禽流感病毒也属于甲型流感病毒范畴。甲型流感病毒按其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性不同，又可分为16个HA亚型和9个NA亚型，并且在HA和NA上存在着多个抗原决定区，如H1亚型的HA蛋白抗原决定区分为Sa、Sb、Ca1、Ca2和Cb，H3亚型病毒的HA蛋白抗原决定区分为A、B、C、D和E。甲型流感病毒抗原性变异分为抗原漂移和抗原转变两类。抗原漂移指逐渐发生点或局部变异，引起流感的中小规模流行，一般认为抗原漂移使得流感病毒每1～3年出现一次新变种；抗原转变指大的抗原变异，变异结果会产生新的不同亚型，并且它的改变和病毒的毒力密切相关。由于人群对新的亚型缺乏相应抗体，常常会引起大的流行。因此，亚型众多的甲型流感病毒及其抗原性极易变异等特点给疫苗研发带来了巨大困难，常规灭活疫苗不能完全覆盖随时变异的流感病毒株，病毒往往能逃逸疫苗的保护作用而引起大流行。现有的疫苗预防策略呈现一种明显的滞后状态，面对新的毒株或新的亚型，原有疫苗无法提供足够有效的保护，需要在短时间内研发针对性疫苗。随着分子生物学技术的飞速发展，反向基因操作系统的诞生与不断完善，使得人们定向改造流感病毒、利用流感病毒为人类服务成为可能。本发明提出了一种流感病毒抗原更换的平台，通过反向基因操作系统对流感病毒抗原性进行人为改变，在实现开发快速应变能力的流感疫苗，以及以流感病毒为载体的基因治疗中具有重大的应用价值。
反向遗传技术在病毒学研究领域具有重要作用，其中之一就是病毒的拯救和改造。利用反向遗传技术，人们可以根据需要对病毒进行改造，人为拯救新型病毒，作为病毒载体或疫苗株等来使用。1989年美国科学家首先利用反向基因操作系统并成功获得经人工重组的流感病毒。1999年Neumann等利用反向基因操作系统在拯救流感病毒方面取得了重大突破，采用的全质粒系统摆脱了辅助病毒的使用。随着技术的进步，质粒数量由最起先的17个不断缩减。目前最常用的是8个质粒系统，即RNA聚合酶I/II(Pol I/II)的双启动子载体系统。反向基因操作系统已越来越被广泛应用，包括流感病毒的分子生物学研究、流感疫苗的研制和流感病毒载体的尝试等，使得研究开发新型的流感疫苗成为可能。根据流感病毒生物学特性，在其HA、NA和NS基因都可以携带外源基因片段，流感病毒作为基因载体在基因治疗领域亦得到越来越多的关注。
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。然而选择适合的载体则是治疗取得成功的关键因素。基因治疗常用载体可分为非病毒载体和病毒载体两大类，其中非病毒载体转染能力差，动物水平研究以及临床应用都受到巨大限制；而病毒载体具有感染效率高、宿主范围广、稳定性强等优势令人瞩目。近年来，国内外学者利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体等在基因治疗上取得了较大进展，但是使用病毒载体首次治疗后因机体的免疫保护作用而使得重复使用的疗效不理想，这个科学难题始终制约着病毒载体在临床治疗上的推广使用，目前最为成熟的腺病毒载体也存在这个问题，尚不能有效解决。而亚型众多的流感病毒虽然为疫苗研发带来了巨大困难，但是在基因治疗过程中为病毒载体的重复使用提供了有利条件。流感病毒载体通过抗原的更换，再次使用时逃避免疫系统的追踪，从而有望能有效解决病毒载体在重复使用效果不理想这一难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法，本发明实现了不同亚型病毒之间以及同一亚型不同毒株之间的抗原区整体替换或部分替换，为流感减毒性活疫苗和流感病毒载体在基因治疗中的应用提供有效的抗原性转换技术平台。本发明中所涉及的装载流感病毒抗原区序列的转录载体为pPolI，全长HA基因插入到pPolI两个BsmBI限制性内切酶识别位点之间。插入的HA基因片段通过序列分析以及核苷酸定点突变，设定若干限制性酶切位点(这些酶切位点不存在于载体骨架上)，在氨基酸序列上，将抗原区分为若干个部分，适用于抗原决定区序列的更换。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法，该方法包括以下步骤：
(1)从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，该血凝素基因两端包含完整的非翻译区序列，并插入到转录载体pPolI中，构建出含有血凝素基因的重组转录载体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。
(2)在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点，适用于抗原决定区的更换。
(3)不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换：所述的抗原决定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更换，或者是整条HA基因的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型不同毒株的对应序列之间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。
(4)HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救：利用上述已进行过HA基因抗原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的反向基因操作系统，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感病毒。
本发明的有益效果是，
1.减毒性流感病毒活疫苗候选株的快速构建
一方面，通过上述抗原更换平台，可以将高致病性毒株的抗原更换为低致病性毒株的抗原，对病毒株进行减毒；另一方面，通过上述抗原更换平台，可以有目的地改变流感病毒株的抗原性，面对突发的流感疫情，将病原体的抗原决定区更换到原有的温度敏感性减毒活疫苗上，使得重组病毒一方面保留低毒特征，一方面具有与病原体相似的抗原性，对生产具有快速应变能力的减毒活疫苗具有重大意义。
2.解决病毒载体不能重复使用的瓶颈问题
基因治疗在未来攻克恶性肿瘤、遗传病等多种疑难病症方面具有非常广阔的应用前景。病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，去掉病毒基因组中与致病相关的基因，保留其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。病毒载体具有感染效率高、宿主范围广、稳定性强等优势令人瞩目，在基因治疗上具有独特优势。近年来，国内外学者利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体等在基因治疗上取得了较大进展，但是使用病毒载体首次治疗后因机体的免疫保护作用而使得重复使用的疗效不理想，这个科学难题始终制约着病毒载体在临床治疗上的推广使用。目前研究最为成熟的腺病毒载体虽然已经在临床上开展了诸多工作，但是始终无法有效突破在同一个体上多次使用效果不佳这一困境。而流感病毒的抗原多样，多个亚型之间免疫交叉反应弱这一特点，为解决这一难题带来希望。通过本发明可以对流感病毒进行有目的的抗原更换，构建出一系列抗原多样的流感病毒载体系统，在重复使用时利用不同抗原性的流感病毒载体进行多次治疗，逃避免疫系统的追踪，从而能有效解决病毒载体在重复使用效果不理想这一难题。
附图说明
图1为重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的PCR鉴定图，图中，从左至右排列分别是：M.DL2000；1.全长HA基因的PCR产物；2.XbaI和SacI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；3.SacI和NcoI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；4.NcoI和EcoRI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；M.DL2000。
图2为重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的酶切鉴定图，图中，从左至右排列分别是：M.DL2000；1.pPolI/WSN-HA/Xba82/H1；2.pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的NheI酶切；3.pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的XbaI和SacI双酶切；4.pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的SacI和NcoI双酶切；5.pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的NcoI和EcoRI双酶切；M.DL2000。
图3为重组质粒pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的PCR鉴定图，图中，从左至右排列分别是：M.200bp DNA Ladder；M.1kb DNA Ladder；1.全长HA基因的PCR产物；2.PstI和HindIII酶切位点之间DNA片段的PCR产物；3.HindIII和XbaI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；4.XbaI和NsiI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；5.NsiI和SphI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；6.SphI和XhoI酶切位点之间DNA片段的PCR产物。
图4为重组质粒pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的酶切鉴定图，图中，从左至右排列分别是：1.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3；2.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的NheI酶切；3.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的PstI和HindIII双酶切；4.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的HindIII和XbaI双酶切；5.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的XbaI和NsiI双酶切；6.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的NsiI和SphI双切；7.pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的SphI和XhoI双酶切；M.200bp DNA Ladder；M.1kb DNA Ladder。
图5为重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的PCR鉴定图，图中，从左至右排列分别是：M.200bp DNA Ladder；1.全长HA基因的PCR产物；2.XhoI和SacI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；3.SacI和BamHI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；4.BamHI和SphI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；5.SphI和AflII酶切位点之间DNA片段的PCR产物；M.1kb DNA Ladder。
图6为重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的酶切鉴定图，图中，从左至右排列分别是：1.pPolI/HK312-HA/Xho68/H52.pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的NheI酶切；3.pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的XhoI和SacI双酶切；4.pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的SacI和BamHI双酶切；5.pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的BamHI和SphI双酶切；6.pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的SphI和AflII双酶切；M.200bp DNA Ladder；M.1kb DNA Ladder。
具体实施方式
发明内容
本发明甲型流感病毒抗原决定区更换方法，包括以下步骤：
1.从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，血凝素基因两端包含完整的非翻译区序列，并插入到转录载体pHH21(又称为pPolI)中，构建出含有血凝素基因的重组转录载体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。
(1)H1亚型流感病毒
以H1亚型流感病毒株A/WSN/1933(H1N1)为材料，RT-PCR方法获得两端含有完整非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点BsmBI之间，该重组质粒命名为pPolI/WSN-HA/H1。
(2)H3亚型流感病毒
以H3亚型流感病毒株A/Memphis/1/1971(H3N2)为材料，RT-PCR方法获得两端含有完整非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点BsmBI之间，该重组质粒命名为pPolI/Memphis-HA/H3。
(3)H5亚型流感病毒
以H5亚型流感病毒株A/duck/HK/312/78(H5N3)为材料，RT-PCR方法获得两端含有完整非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点BsmBI之间，该重组质粒命名为pPolI/HK312-HA/H5。
2.在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点，适用于抗原决定区的更换。
(1).H1亚型流感病毒
对上述的重组质粒pPolI/WSN-HA/H1的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同时利用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的82位上有XbaI、124位上有SacI、267位上有NcoI、412位上有EcoRI酶切位点的重组质粒，命名为pPolI/WSN-HA/Xba82/H1，适用于抗原决定区的更换。上述重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/H1的XbaI和SacI酶切位点之间相距126个核苷酸；SacI和NcoI酶切位点之间相距429个核苷酸；NcoI和EcoRI酶切位点之间相距435个核苷酸(图1、图2)。
(2).H3亚型流感病毒
对上述的重组质粒pPolI/Memphis-HA/H3的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同时利用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的35位上有PstI、109位上有HindIII、235位上有XbaI、298位上有NsiI、321位上有SphI、425位上有XhoI酶切位点的重组质粒，命名为pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3，适用于抗原决定区的更换。上述重组质粒pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的PstI和HindIII酶切位点之间相距293个核苷酸；HindIII和XbaI酶切位点之间相距378个核苷酸；XbaI和NsiI酶切位点之间相距267个核苷酸；NsiI和SphI酶切位点之间相距69个核苷酸；SphI和XhoI酶切位点之间相距312个核苷酸(图3、图4)。
(3)H5亚型流感病毒
对上述的重组质粒pPolI/HK312-HA/H5的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同时利用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的68位上有XhoI、149位上有SacI、193位上有BamHI、306位上有SphI、468位上有AflII等酶切位点的重组质粒，命名为pPolI/HK312-HA/Xho68/H5，适用于抗原决定区的更换。上述重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的XhoI和SacI酶切位点之间相距243个核苷酸；SacI和BamHI酶切位点之间相距132个核苷酸；BamHI和SphI酶切位点之间相距339个核苷酸；SphI和AflII酶切位点之间相距486个核苷酸(图5、图6)。
3.不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换
所述的抗原决定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更换，或者是整条HA基因的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型不同毒株的对应序列之间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。
下面以高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)的抗原片段替换到低致病性流感病毒A/duck/HK/312/78(H5N3)为例。
(1).流感病毒HA基因抗原决定区序列的整体更换
当进行整条基因更换时，将上述的重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5中HA基因片段切除，插入A/Vietnam/1203/04(H5N1)毒株的HA基因片段的相对应序列，使得新构建的重组质粒中包含的HA基因完全来源于A/Vietnam/1203/04(H5N1)毒株，起到完全更换的效果。
(2).流感病毒HA基因抗原决定区序列的部分更换
当进行抗原区部分更换时，则在上述重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的XhoI、SacI、BamHI、SphI、AflII酶切位点中，根据所需要替换的抗原区大小及位置选择合适的两个酶切位点。如所需要更换的抗原区在酶切位点SacI和SphI之间，则可采用PCR扩增或酶切方法得到A/Vietnam/1203/04(H5N1)毒株HA基因相应区段的DNA片段，插入到上述的重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5中，替代原有相对应的基因序列，使得新构建的重组质粒HA基因SacI和SphI酶切位点之间的DNA序列来源于毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)，起到部分更换的效果。
采用上述整体更换和部分更换方法，可以对任意两个同一亚型或不同亚型的流感病毒株之间进行抗原决定区的相互替换。
4.HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救
利用上述已进行过HA基因抗原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的反向基因操作系统，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感病毒。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。但这些实施例不得理解为任何意义上对本发明的限制。
实施例1
血凝素基因的克隆
在生物安全柜中，按Initrogen公司说明书提供的方法用Trizol提取病毒RNA，以V13为逆转录引物，通过反转录酶MMLV合成病毒cDNA。并以上述的病毒cDNA为模板，通过V12和V13两条引物PCR扩增获得两端含有完整非翻译区的全长HA基因片段。再以此全长HA基因片段为模板，通过5BmHA和3BmHA两条引物扩增得到HA全长基因，同时在基因的两端各自引入一个BsmBI限制性酶切位点。具体就是：用于扩增H1亚型流感病毒(A/WSN/1933)全长HA基因的引物是V12和V13，再以扩增产物为模板，通过引物5BmHA和3BmHA在HA基因两端各引入一个BsmBI限制性酶切位点，用于克隆到转录载体pPolI中；用于扩增H3亚型流感病毒(A/Memphis/1/1971)全长HA基因的引物是V12和V13，再以扩增产物为模板，通过引物5BmHA和3BmHA在HA基因两端各引入一个BsmBI限制性酶切位点，用于克隆到转录载体pPolI中；用于扩增H5亚型流感病毒(A/duck/HK/312/78)全长HA基因的引物是V12和V13，再以扩增产物为模板，通过引物5BmHA和3BmHA在HA基因两端各引入一个BsmBI限制性酶切位点，用于克隆到转录载体pPolI中。
上述PCR的引物序列分别为：
V12：AGCAAAAGCAGG；
V13：AGTAGAAACAAGG；
5BmHA：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG
3BmHA：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
实施例2
全长HA基因克隆到转录载体pPolI
将实施例1所述的两端都具有BsmBI限制性酶切位点的全长HA基因用BsmBI酶切，酶切产物纯化后与BsmBI酶切的转录载体pPolI连接，筛选得到重组质粒后并进行DNA序列测定。在pPolI中插入H1亚型A/WSN/1933(H1N1)毒株HA基因的重组质粒命名为pPolI/WSN-HA/H1；在pPolI中插入H3亚型A/Memphis/1/1971(H3N2)毒株HA基因的重组质粒命名为pPolI/Memphis-HA/H3；在pPolI中插入H5亚型A/duck/HK/312/78(H5N3)毒株HA基因的重组质粒命名为pPolI/HK312-HA/H5。
实施例3
定点突变，引入新的酶切位点
通过定点突变的方法，在实施例2所述的重组质粒中引入新的酶切位点，用于抗原更换。以在所述的重组质粒pPolI/WSN/H1中引入XbaI限制性酶切位点为例，具体步骤如下：
以pPolI/WSN/H1为模板，以H1XbaHA82F和H1XbaHA82R为点突变引物，进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸6min，共18个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物纯化后用限制性内切酶DpnI在37℃消化1h，乙醇/醋酸钠沉淀后溶于20μl双蒸水中，取1μl转化大肠杆菌DH5α，筛选突变克隆并进行序列测定，证实引入XbaI酶切位点。经过点突变的HA基因含有XbaI、SacI、NcoI、EcoRI酶切位点(图2)。
以H3Pst35HAF和H3Pst35HAR为点突变引物，应用上述方法进行定点突变，在所述的重组质粒pPolI/Memphis-HA/H3血凝素基因的35位引入PstI酶切位点，经过定点突变的HA基因含有限制性酶切位点PstI、HindIII、XbaI、NsiI、SphI、XhoI。
以H5XhoHA68F和H5XhoHA68R为点突变引物，应用上述方法进行定点突变，在所述的重组质粒pPolI/HK312-HA/H5血凝素基因的68位引入Xho I酶切位点，经过定点突变的HA基因含有限制性酶切位点XhoI、SacI、BamHI、SphI、AflII。
上述定点突变的引物分别是：
H1XbaHA82F：GGGAAATCTAGAATGCGAC；
H1XbaHA82R：GTCGCATTCTAGATTTCCC；
H3Pst35HAF：CATCCTGCAGTGCCAAAC；
H3Pst35HAR：GTTTGGCACTGCAGGATG；
H5XhoHA68F：CCTCTCATCTCGAGGGATTG；
H5XhoHA68R：CAATCCCTCGAGATGAGAGG
实施例4
抗原更换——全基因更换
将高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)的HA基因整体更换到低致病性毒株A/duck/HK/312/78(H5N3)中。对于流感病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)，按照实施例1所述的血凝素基因克隆方法，扩增得到两端各自有一个BsmBI限制性酶切位点的完整HA基因(包含5’端和3’端的非翻译区)，BsmBI酶切后并进行纯化。同时用BsmBI对所述重组质粒pPolI/HK312-HA/H5进行酶切，去除来源于A/duck/HK/312/78(H5N3)的HA基因片段后并进行纯化。两者连接后筛选重组克隆，获得的重组质粒(命名为pPolI/VN1203-HA/H5)的HA基因完全来源于A/Vietnam/1203/04(H5N1)，HA基因得到整体更换。
实施例5
抗原更换——部分抗原区更换
将高致病性流感病毒A/Vietnam/1203/04(H5N1)的部分抗原片段替换到低致病性流感病毒A/duck/HK/312/78(H5N3)中，以SacI和SphI两个酶切位点之间抗原区序列的更换为例。
通过序列分析，A/Vietnam/1203/04(H5N1)和A/duck/HK/312/78(H5N3)两个病毒株的相应位置都具有SacI和SphI两个酶切位点。通过PCR扩增或双酶切方法获得A/Vietnam/1203/04(H5N1)病毒株HA基因中位于SacI和SphI两个酶切位点之间的DNA片段，并进行纯化。同时用SacI和SphI双酶切重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5，去除SacI和SphI位点之间的DNA片段后进行纯化。将上述两个经纯化的DNA片段进行连接，筛选重组克隆。获得的重组质粒中，HA基因上SacI和SphI位点之间的基因序列来源于病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)，HA基因的抗原区序列得到部分更换。
实施例6
拯救获得HA基因抗原更换的重组病毒
流感病毒拯救以8质粒反向基因操作系统为基础，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖。8个质粒分别为pPol-II/I-Ann60-PB2、pPol-II/I-Ann60-PB1、pPol-II/I-Ann60-PA、pPol-II/I-Ann60-NP、pPol-II/I-Ann60-HA、pPol-II/I-Ann60-NA、pPol-II/I-Ann60-M、pPol-II/I-Ann60-NS(参见国际流行病学传染病学杂志的第33卷第5期，“改进型反向基因操作系统的构建和流感病毒变异株的选育”一文)。
若要获得HA基因经过抗原更换的重组流感病毒，则采用上述反向基因操作系统，其中质粒pPol-II/I-Ann60-HA可根据需要进行选择性替换。例如要将重组病毒的HA完全更换为毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)的HA，则只要将pPol-II/I-Ann60-HA替换成pPolI/VN1203-HA/H5即可。
Claims (3)
1.一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，该血凝素基因两端包含完整的非翻译区序列，并插入到转录载体pHH21(又称为pPolI)中，构建出含有血凝素基因的重组转录载体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。
(2)在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点，适用于抗原决定区的更换。
(3)不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换。
(4)HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救。
2.根据权利要求1所述甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述的抗原决定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更换，或者是整条HA基因的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型不同毒株的对应序列之间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。
3.根据权利要求1或3所述甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：利用上述已进行过HA基因抗原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的反向基因操作系统，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感病毒。
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