JP2023521867A - 改変インターロイキン２２ポリペプチド及びその使用 - Google Patents

改変インターロイキン２２ポリペプチド及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、一般に、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）によって媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。特に本開示は、インターロイキン１０受容体サブユニットβ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対する結合親和性が改変された新規ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを提供する。また、そのようなＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを産生するのに有用な組成物及び方法、並びにＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はＩＬ－２２によって媒介されるシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療のための方法も提供される。

Description

連邦政府が支援する研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＡＩ５１３２１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１１，９２２号に対する優先権の利益を主張する。上で参照した出願の開示は、任意の図面を含め、その全体が参照により明示的に本明細書に取り込まれる。
配列表の取り込み
添付の配列表の資料は、参照により本出願に取り込まれる。０７８４３０－５１６００１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前の付随する配列表テキストファイルは、２０２１年４月１２日に作成され、３１ＫＢである。
分野
本開示は、一般に、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）によって媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対する結合親和性が改変された新規ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを提供する。そのようなＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを産生するために有用な組成物及び方法、並びにＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はＩＬ－２２によって媒介されるシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療のための方法も提供される。
背景
健康状態及び疾患の治療のための治療用タンパク質を含有するバイオ医薬品又は医薬製剤の使用は、多くの製薬会社及びバイオテクノロジー会社にとって中心的な戦略である。例えばサイトカインファミリーのいくつかのメンバーは、癌の治療に有効であることが報告されており、癌免疫療法の開発に大きな役割を果たしている。従って、サイトカインファミリーは、その投与と生体同化を改善するための多くの臨床研究と努力の焦点となっている。
しかしながら、サイトカインを含む既存の治療アプローチの臨床的成功は限られている。これらの制限は、多くの場合、サイトカインのオフターゲット毒性と無効性によるものであり、これは主に、サイトカインが望ましい応答細胞と望ましくない応答細胞の両方に受容体を持っており、これらが、互いに相殺して望ましくない副作用につながるという事実による。近年、サイトカイン改変は有望な戦略として浮上しており、サイトカインを調整して、より望ましい活性と低毒性を備えた組換えサイトカインに到達するための様々な試みが行われている。
特に、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）は、その強力な免疫調節作用と、免疫系を抑制することなく組織を炎症関連損傷から保護するその能力とのために、免疫療法について特に臨床的関心を集めてきた。組換えＩＬ－２２の治療的投与は、現在多数の自己免疫疾患及び炎症性障害に対する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で試験されている。これらには、潰瘍性大腸炎、クローン病、糖尿病性足潰瘍、及び急性ＧｖＨＤが含まれる。ＩＬ－２２は、急性膵炎のマウスモデルでも有効性を示している。しかしＩＬ－２２は、いくつかの状況では、特に肝臓、皮膚、及び消化管において炎症性メディエーターの誘導を介して炎症を促進することも示されているため、その治療的及び臨床的有用性は限定されている。
従って、治療薬として使用するために、ＩＬ－２２の特性を改善するための追加のアプローチが必要である。特に、特定の下流の機能及び作用を他のものよりも選択的に活性化でき、例えばＩＬ－２２の多くの有益な特性を保持するが既知の炎症促進副作用は無いバリアントであって、自己免疫疾患や炎症性疾患を含む様々な関連疾患の治療における抗腫瘍薬又は免疫調節薬としてのこれらのバリアントの改良された使用をもたらす、バリアントが必要とされている。
概要
本開示は、一般に免疫学の分野に関し、特に、それを必要とする対象において、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）によって媒介されるシグナル伝達経路を調節するための組成物及び方法に関する。以下でより詳細に説明されるように、ＩＬ－２２を介するシグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能及び／又はＳＴＡＴ３媒介性のシグナル伝達の偏った（バイアス型）アゴニスト作用（biased agonism）を介して調節することができる。より具体的には、いくつかの実施形態において本開示は、ＩＬ－２２の天然のリガンド、例えばインターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０Ｒβ）に対して調節された結合親和性を有する新しいクラスのＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらすＩＬ－２２部分アゴニストを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、バイアス型(biased)ＩＬ－２２シグナル伝達、例えばＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下を付与するが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持するＩＬ－２２部分アゴニストを提供する。本開示はまた、そのようなＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを産生するのに有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節する方法、並びにＩＬ－２２受容体の下流のシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療方法も提供する。
１つの態様において、以下を含む組換えポリペプチドが本明細書に提供される：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。
開示された組換えポリペプチドの非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数アミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を低下させる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を増加させる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１のＤ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４９、Ｑ１１６、Ｒ１２４、及びＲ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；（ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；及び（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。
いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号１のＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。
１つの態様において、以下を含む組換えポリペプチドが本明細書に提供される：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号６のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を低下させる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を増加させる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号６のＥ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４８、Ｒ５５、Ｑ１１６、Ｅ１１７、Ｋ１２４、Ｑ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；（ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；及び（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達は、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達は、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下を含むが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、１：１．５～１：１０の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達対ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介機能は、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、約２０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ３シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。
１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、組換え核酸分子に関し、ここで核酸は、本開示のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
開示された核酸分子の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸配列は、異種核酸配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現カセット又は発現ベクターとしてさらに定義される。
１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は組換え細胞に関し、ここで組換え細胞は、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；及び（ｂ）本開示の組換え核酸のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞である。関連する態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本開示の少なくとも１つの組換え細胞及び培地を含む細胞培養物に関する。
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、ポリペプチドを産生するための方法に関し、ここで、この方法は、（ａ）本開示の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること、及び（ｂ）細胞が組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生するように、培地中で１つ又は複数の組換え細胞を培養すること、を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを構造的に修飾して、インビボで、例えば哺乳動物対象において、ポリペプチドの半減期を延長させ、及び／又は作用の持続時間を延長することをさらに含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、アシル化、アセチル化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。従って、関連する態様において、本開示の方法によって産生される組換えポリペプチドも本明細書に提供される。
１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は医薬組成物に関し、ここで医薬組成物は以下のうちの１つ又は複数を含む：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）医薬的に許容し得る担体。
開示された医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えポリペプチドと医薬的に許容し得る担体とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸と医薬的に許容し得る担体とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のポリペプチドをコードする核酸と医薬的に許容し得る担体とを含む組換え細胞を含む。
１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための方法に関し、この方法は、対象に以下のうちの１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示の核酸を含む組換えウイルス又は非ウイルスベクター、及び（ｅ）本開示の医薬組成物。
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象における疾患、障害、又は状態の治療のための方法に関し、ここで、この方法は、対象に以下のうちの１つ又は複数を含む組成物を投与することを含む：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えウイルス又は非ウイルスベクター；及び（ｅ）本開示の医薬組成物。
対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はそれを必要とする対象における状態の治療のための、開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、対象において組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達は、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの実施形態では、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達は、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、対象においてバイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下を含むが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、１：１．５～１：１０の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達とＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介機能は、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定すると、約２０％～約１００％低下している。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象において、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６から選択される炎症促進性遺伝子の発現を誘導する能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象においてＲｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１０、ＢＣＬ－２、サイクリン－Ｄ、クローディン－２（Claudin-2）、ＬＣＮ２、及びβ－デフェンシンから選択される遺伝子の発現を誘導する能力を実質的に保持している。いくつかの実施形態において、医薬組成物の投与は、対象におけるＴ細胞活性を阻害しない。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、上皮の保護及び再生を増強する。いくつかの実施形態において、状態は、炎症性疾患、免疫疾患、又は慢性感染症及び疾患でもある。いくつかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾癬性関節炎、糖尿病性足潰瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は急性膵炎である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－２２媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。
いくつかの実施形態において、組成物は、第１の治療として個別に、又は第２の治療（例えば免疫抑制剤（immunosuppressive agent）、免疫抑制剤（immunosuppressant）、又は抗炎症剤）と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、手術、及び疾患改変性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は付随して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療と同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は連続して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は第２の治療の前及び／又は後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は交代で施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、単一の製剤で一緒に施される。
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための、又はそれを必要とする対象における状態を治療するためのキットに関し、ここでキットは、本開示の組換えポリペプチド；本開示の組換え核酸；本開示の組換え細胞；及び本開示の医薬組成物のうちの１つ又は複数を含む。
前述の概要は、例示のみを目的としており、決して限定することを意図していない。本明細書に記載の例示的な実施形態及び特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、及び特徴は、図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。
図１Ａ～１Ｅは、本開示のいくつかの非限定的な実施形態に従って、指向性進化アプローチを介して、例示的な高親和性ＩＬ－２２を改変するために実施された実験の結果を概略的に要約する。図１Ａは、ヒトＩＬ－２２－ＩＬ２２Ｒ１部分複合体（ＰＤＢ ＩＤ：３ＤＬＱ）の構造を示し、マウスＩＬ－２２部位指向性の酵母ディスプレイライブラリーにおける無作為化のために選択された対応する残基を赤色で示す。図１Ｂは、酵母ディスプレイに基づくＩＬ－２２の親和性成熟の戦略の略図を示す。ＭＡＣＳ：磁気活性化細胞ソーティング。ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーティング。図１Ｃは、酵母ディスプレイ野生型ＩＬ－２２（ＷＴ）に結合する、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＳＡ－６４７）標識ＩＬ１０Ｒβ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、指向性進化の選択されたラウンド、及び最終の高親和性ＩＬ－２２クローン（ｓｕｐｅｒ－２２ａ）を示すヒストグラムを示す。これらの実験では、酵母は１μＭの非標識ｍＩＬ２２Ｒ１（ＥＣＤ）にあらかじめ結合された。図１Ｄは、親和性成熟ＩＬ－２２バリアントがＩＬ１０Ｒβへの結合の増強を示したことを示す。図１Ｅは、親和性成熟ＩＬ－２２バリアントが、増強されたＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘発し得ることを示す。データは、２つの独立した多重測定の平均値＋／－ＳＤである。
図２Ａ～２Ｅは、マウスＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒβ三元複合体の構造を示す。図２Ａ～２Ｃは、ＩＬ－２２－受容体複合体の２．６Å構造の３つの図を示し、ＩＬ－２２（ｓｕｐｅｒ－２２ａ）を黄色、ＩＬ２２Ｒ１を青色、及びＩＬ１０Ｒβをピンク色で示している。図２Ｄは、マウスＩＬ－２２－ＩＬ１０Ｒβ複合体とヒトＩＦＮ－λ－ＩＬ１０Ｒβ（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｔ５Ｗ）との構造的重ね合わせを示し、ＩＦＮ－λと比較してＩＬ－２２に結合した場合のＩＬ１０Ｒβの相対配向の約４０度の変化を示している。 図２Ｅは、ＩＬ１０Ｒβに結合したＩＬ－２２（黄色、左パネル）及びＩＦＮ－λ（緑色、右パネル）の表面を示し、ＩＬ－２２及びＩＦＮ－λの両方と重要な接触を形成するＩＬ１０Ｒβの３つの芳香族残基の異なる相対位置を示す。
図３Ａ～３Ｆは、本開示のいくつかの非限定的な実施形態による、バイアス型ＩＬ－２２受容体アゴニストの構造誘導設計を示す。図３Ｂ～３Ｃは、ＩＬ－２２－ＩＬ１０Ｒβ結合面の２つのクローズアップ図を示す。水素結合と塩橋は黒い破線で示されている。親和性成熟に起因するＩＬ－２２の変異残基はイタリック体で示されている。図３Ｄは、ＩＬ１０Ｒβ結合を破壊したＩＬ－２２バリアントが、ＳＴＡＴ３とＳＴＡＴ１シグナル伝達を切り離したことも示している。データは、３つの独立した多重測定の平均＋／－ＳＤであり、最大ＷＴ ＩＬ－２２シグナルのパーセントとして示されている。図３Ｅは、図３Ｄに示されるシグモイド用量応答曲線から計算されたホスホ－ＳＴＡＴ３及びホスホ－ＳＴＡＴ１の標準化されたＥｍａｘ値を示す。データは、３つの独立した多重測定の平均値＋／－ＳＤである。図３Ｆは、バイアス型ＩＬ－２２バリアントがＳＴＡＴ３の活性化を誘発できたが、ＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ５の活性化は誘発できなかったことを示す。１００ｎＭのＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間刺激した後、ＨＴ－２９細胞から調製された溶解物中の示されたタンパク質の免疫ブロット。
図４Ａ～４Ｉは、本開示のいくつかの非限定的な実施形態による例示的なバイアス型ＩＬ－２２バリアント（２２－Ｂ３）が、組織選択的シグナル伝達活性を誘発することを証明するために実施された実験からの結果を概略的に要約する。図４Ａは、インビボでの２２－Ｂ３活性の特性解析のための実験計画を示す。これらの実験では、マウス（１群あたり３匹）に、ＰＢＳ又は２００μｇの組換えＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３を投与し、示された器官を３０分後（タンパク質分析）、６時間後（ＲＮＡ分析）、又は２４時間後（血清分析）に単離した。図４Ｂ～４Ｅは、２２－Ｂ３が、組織特異的なホスホ－ＳＴＡＴ３及びホスホ－ＳＴＡＴ１シグナル伝達活性を誘発することを示す。示された器官からの組織溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、示されたタンパク質についての免疫ブロットを行った。皮膚のホスホＳＴＡＴ１シグナルは、すべての試料で検出限界より低かった。図４Ｆは、組織特異的な２２－Ｂ３シグナル強度がＩＬ１０Ｒβ発現レベルと相関することを示す。示された器官は対照マウスから単離され、ＩＬ２２Ｒ１とＩＬ１０Ｒβの相対的発現レベルがＲＴ－ｑＰＣＲによって分析された（ＧＡＰＤＨに対して標準化）。データは、３重測定した試料の平均＋／－ＳＥＭである。図４Ｇ～４Ｈは、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３が、インビトロでヒト細胞株において細胞型選択的シグナル活性を誘発することを示す。Ｐａｎｃ－１（図４Ｇ）又はＨｅｐＧ２（図４Ｈ）細胞を、ＰＢＳ又は１００ｎＭのＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間処理した。細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、示されたタンパク質について免疫ブロットを行った。Ｐａｎｃ－１細胞中のホスホＳＴＡＴ１シグナルは、すべての試料で検出限界より低かった。図４Ｉは、２２－Ｂ３がインビトロで肝細胞の中立的なアンタゴニストであることを示す。ＨｅｐＧ２細胞を、１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－２２及び示された濃度の２２－Ｂ３と共に２０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、示されたタンパク質について免疫ブロットを行った。
図５Ａ～５Ｅは、バイアス型ＩＬ－２２バリアント２２－Ｂ３が、インビボで組織保護遺伝子と炎症促進性ＩＬ－２２標的遺伝子の発現を切り離すことを証明するために行った実験からの結果を概略的に要約する。図５Ａ～５Ｂは、２２－Ｂ３が膵臓及び結腸において組織保護遺伝子発現を誘導することを示す。ＲＮＡを、ＰＢＳ又は２００μｇのＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３を６時間腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）して処理したマウスの膵臓及び結腸から単離した。標的遺伝子の相対的発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって分析された（ＧＡＰＤＨに対して標準化）。データは、２つの独立した生物学的多重測定の平均＋／－ＳＥＭであり、それぞれ３重測定で分析された（対応のないスチューデントのｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。図５Ｃ～５Ｅは、２２－Ｂ３が、結腸、皮膚、及び肝臓においていくつかの炎症促進性遺伝子の発現を誘導しないことを示す。ＲＮＡを、ＰＢＳ又は２００μｇのＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３を６時間ＩＰ注入して処理されたマウスの肝臓と皮膚（尾）から単離した。標的遺伝子の相対的発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって分析された（ＧＡＰＤＨに対して標準化）。データは、２つの独立した生物学的多重測定についての平均＋／－ＳＥＭであり、それぞれ３重測定で分析された（対応のないスチューデントのｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。
図６Ａ～６Ｄは、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３が、全身性炎症を誘発することなく急性膵炎から保護することを証明するために行った実験の結果を、概略的に要約する。図６Ａは、急性膵炎投薬計画の概略図である。図６Ｂは、２２－Ｂ３が急性膵炎において保護効果を保持していることを示す。マウス（１群あたり５匹）を、ＰＢＳ又は５０μｇのＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３のＩＰ注射により前処理した２０時間前及び２時間後に、セルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を１時間ごとに６回腹腔内注射して膵炎を開始させた。最後のセルレイン注射の１時間後に血清を分離し、膵臓アミラーゼとリパーゼのレベルを分析した（対応のないスチューデントのｔ検定、*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１）。 図６Ｃは、２２－Ｂ３がインビボで肝臓急性期応答タンパク質を誘導しないことを示す。マウス（１群あたり３匹）を、ＰＢＳ又は示された量のＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３で２４時間処理した。血清を分離し、ＳＡＡ－１／２及びハプトグロビンのレベルをＥＬＩＳＡで分析した（対応のないスチューデントのｔ検定、*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１）。図６Ｄは、マウスの膵臓（弱いバイアス型アゴニスト作用）、結腸（強いバイアス型アゴニスト作用）、皮膚（中立的な拮抗作用）、及び肝臓（中立的な拮抗作用）において、２２－Ｂ３によって示される示差的シグナル伝達活性を概略的に示す。
図７Ａは、ＩＬ－２２選択の各ラウンドの選択戦略を示し、使用したＩＬ１０ＲβＥＣＤの濃度及び選別方法を示す。ＭＡＣＳ：磁気活性化細胞ソーティング。ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーティング。図７Ｂは、無作為化の標的とされる６つの残基、ライブラリー作成で各部位に使用されるコドン、及びｓｕｐｅｒ２２ａ及びスーパー２２ｂの各位置に存在するアミノ酸を示す表である。図７Ｃは、ＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間刺激され、パラホルムアルデヒド／メタノールによる固定及び透過処理後にフローサイトメトリーによって分析されたＨＴ－２９（ヒト、結腸直腸）中の、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３（左パネル）及びホスホ－Ｙ７０１－ＳＴＡＴ１（右パネル）の用量応答曲線を示す。データは、２つの独立した多重測定の平均値＋／－ＳＤである。
図８Ａ～８Ｂは、精製されたＳｕｐｅｒ－２２ａ（図８Ａ）及びＳｕｐｅｒ－２２ｂ（図８Ｂ）結合ＩＬ－２２受容体複合体及び付随するクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのサイズ排除クロマトグラフィートレースを示す。結晶化試験に使用される画分は赤で示されている。 図８Ｃは、結晶化に使用されるＩＬ－２２、ＩＬ１０Ｒβ、及びＩＬ２２Ｒ１構築物に存在する突然変異を示す表である。図８Ｄは、三元複合体に存在するＩＬ２２Ｒ１とＩＬ１０Ｒβとの間のステム接触のクローズアップ図を示す。
図９Ａは、ＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間刺激され、パラホルムアルデヒド／メタノールによる固定及び透過処理後にフローサイトメトリーによって分析されたＨＴ－２９（ヒト、結腸直腸）細胞中の、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３（上）及びホスホ－Ｙ７０１－ＳＴＡＴ１（下）の用量応答曲線を示す。データは、２つの独立した多重測定の平均値＋／－ＳＤである。図９Ｂは、いくつかのバイアス型マウスＩＬ－２２バリアント（２２－Ｂ１～Ｂ５）に存在する突然変異を示す表である。図９Ｃは、野生型ヒトＩＬ－２２又は示されたヒトＩＬ－２２バリアントで２０分間刺激され、フローサイトメトリーによって分析されたＨＴ－２９細胞からのシグモイド用量応答曲線から計算されたホスホ－ＳＴＡＴ３及びホスホ－ＳＴＡＴ１の標準化されたＥmax値を示す。データは、２重測定の平均値＋／－ＳＤである。図９Ｄは、いくつかのバイアス型ヒトＩＬ－２２バリアント（ｈ２２－Ｂ１～Ｂ３）に存在する突然変異を示す表である。
図１０は、ヒトＩＬ－２２ポリペプチド（配列番号１）及びマウスＩＬ－２２ポリペプチド（配列番号６）の配列アライメントを示す。アライメントでは、整列された配列間で同一のアミノ酸又は保存されたアミノ酸置換が星印で識別される。ここで提供されるアライメント図は、プログラムＣＬＵＳＴＡＬバージョン１．２．４を使用して生成された。
図１１Ａ：ＨＴ－２９（ヒト結腸直腸癌）細胞を、様々な濃度の野生型又は変異型マウスＩＬ－２２で２０分間処理した。メタノール／ＰＦＡを使用して、細胞を固定し透過処理をして、蛍光標識抗ホスホＳＴＡＴ１（ＡＦ４８８）抗体又は抗ホスホＳＴＡＴ３（ＡＦ６４７）抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。用量応答曲線。データをシグモイド用量応答曲線に適合させて、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のＥｍａｘを計算できるようにした。バイアス型バリアントのＥｍａｘは、野生型ＩＬ２２のパーセントに対して標準化された。示されているデータは平均＋／－ＳＥＭである。図１１Ｂ：（Ａ）のデータを使用して得られた、各ＩＬ－２２バリアントについてのホスホ－ＳＴＡＴ３／ホスホ－ＳＴＡＴ１ Ｅｍａｘの比を示すグラフ。図１１Ｃ：野生型マウスＩＬ－２２と比較したマウスＩＬ－２２バリアント及び対応する突然変異のリスト。図１１Ｃは、Ａ及びＢに示されるバイアス型マウスＩＬ－２２バリアントに存在する突然変異を示す表である。
図１２Ａ～１２Ｂ：ＨＴ－２９（ヒト結腸直腸癌；図１３Ａ）細胞又はＨｅｐＧ２（ヒト肝臓；図１３Ｂ）細胞を、様々な濃度の野生型又は変異型マウスＩＬ－２２で２０分間処理した。メタノール／ＰＦＡを使用して、細胞を固定し透過処理して、蛍光標識抗ホスホＳＴＡＴ１（ＡＦ４８８）抗体又は抗ホスホＳＴＡＴ３（ＡＦ６４７）抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。用量応答曲線。データをシグモイド用量応答曲線に適合させて、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のＥｍａｘを計算できるようにした。バイアス型バリアントのＥｍａｘは、野生型ＩＬ２２のパーセントに対して標準化された。示されているデータは、３回の独立した多重測定の平均＋／－ＳＥＭである。図１２Ｃ：野生型ヒトＩＬ－２２と比較したヒトＩＬ－２２バリアント及び対応する突然変異のリスト。
図１３Ａは、ＨＴ－２９細胞におけるＪＡＫ１及びＴＹＫ２のリン酸化に対する、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３の作用を示す。１００ｎＭのＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間刺激されたＨＴ－２９細胞から調製された溶解物中の示されたタンパク質の免疫ブロット。図１３Ｂ及びＣは、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３によって誘導されたＩＬ－２２受容体のチロシンリン酸化の差異を示す。示されているＨＡ－ＩＬ２２Ｒα構築物を一時的に発現し、１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－２２で２０分間刺激したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から調製された溶解物及び抗ＨＡ免疫沈降物中の示されているタンパク質、又は示されているバリアントの免疫ブロット。図１３Ｄは、ＩＬ－２２Ｒαの下流のＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ１活性化の異なるメカニズムを利用することによって、ＩＬ－２２バリアントがバイアス型ＳＴＡＴシグナル伝達を誘導する方法のモデルである。
開示の詳細な説明
本開示は一般に、特に、対象においてインターロイキン２２（ＩＬ－２２）によって媒介されるシグナル伝達経路を選択的に調節するための組成物及び方法に関する。以下でより詳細に説明されるように、ＩＬ－２２媒介シグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能及び／又はＳＴＡＴ３媒介性のシグナル伝達のバイアス型アゴニスト作用を介して調節することができる。より具体的には、いくつかの実施形態において本開示は、ＩＬ－２２の天然リガンド、例えばインターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０Ｒβ）に対する調節された結合親和性を有するＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達を有するＩＬ－２２部分アゴニストを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達を有するＩＬ－２２部分アゴニストを提供し、例えばＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらすが、そのＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する。本開示はまた、そのようなＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを産生するのに有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節する方法、並びにＩＬ－２２の下流のシグナル伝達の混乱に関連する状態の治療方法も提供する
インターロイキン２２（ＩＬ－２２）は、Ｔｈ２２細胞、ＮＫ細胞、リンパ組織誘導因子（ＬＴｉ）細胞、樹状細胞、及びＴｈ１７細胞によって産生されるサイトカインのＩＬ－１０ファミリーのメンバーである。ＩＬ－２２はＩＬ－２２Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒβ受容体複合体に結合し、これは、上皮細胞、肝細胞、ケラチン産生細胞などの先天性細胞、及び真皮、膵臓、腸、呼吸器系を含むいくつかの器官のバリア上皮組織で発現される。ＩＬ－２２は上皮細胞に作用して、炎症に応答して組織の保護と再生を促進する。ＩＬ－２２は、免疫機能を抑制せずに炎症性損傷に対抗する能力により魅力的な治療標的となっているが、ＩＬ－２２は状況によっては炎症促進性になることがある。
本開示は、特に、ＩＬ－２２がその同族受容体、特にＩＬ－１０Ｒβとどのように相互作用するかについての新しい洞察に基づく新規ＩＬ－２２組成物を提供する。特に、以下に示す実験データは驚くべきことに、ＩＬ－１０Ｒβに対するＩＬ－２２結合部位における突然変異が、組織特異的に、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能及び／又はＳＴＡＴ３媒介性のシグナル伝達を選択的に行うことができるバイアス型アゴニストをもたらすことを明らかにした。さらに、これらのＩＬ－２２にバイアス型アゴニストは、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能を低下させるが、ＳＴＡＴ３媒介性の機能は実質的に保持することができる。ある場合には、本明細書に記載の実験データは、本開示のバイアス型ＩＬ－２２バリアントが、これらの適用のすべてにおいて、野生型（ＷＴ）組換えＩＬ－２２と少なくとも同程度に有効であり、皮膚や肝臓の炎症などの副作用が大幅に減少することを示す。従って、これらの分子は、自己免疫障害及び状態を治療するために使用することができる。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及び他の科学用語又は専門用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般的に理解されている意味を持つ用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいように本明細書で定義されており、本明細書でのそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと解釈するべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び方法の多くは、当業者によって充分理解されており、従来の方法論を使用して一般的に使用されている。
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示をしない限り、複数の参照を含む。例えば「細胞」という用語は、１つ又は複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書では、「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、及び「Ａ及びＢ」のすべての選択肢を含むために使用される。
用語「約」は、本明細書で使用される場合、その通常の意味は、およそである。およその程度が文脈から明確でない場合、「約」は、提供された値の±１０％以内、又は提供された値を含むすべての場合において、最も近い有効数字に丸められたことを意味する。範囲が指定されている場合、それらには境界値が含まれる。
本明細書で使用される「投与」及び「投与する」という用語は、特に限定されるものではないが、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、及び局所投与、又はこれらの組み合わせを含む投与経路による、生物活性組成物又は製剤の送達を指す。この用語には、特に限定されるものではないが、医療専門家による投与及び自己投与が含まれる。
「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」という用語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株だけでなく、培養中の転移又は継代の数に関係なく、そのような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫若しくは潜在的な子孫も指す。すべての子孫が親細胞と完全に同一というわけではないことを理解すべきである。これは、突然変異（例えば意図的又は偶然の突然変異）又は環境の影響（例えばメチル化やその他のエピジェネティックな修飾）のいずれかにより、次の世代で特定の修飾が発生する可能性があり、従って、子孫が実際には親細胞と同一ではない可能性があるためであるが、子孫が、元の細胞、細胞培養物、又は細胞株と同じ機能を保持する限り、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
本開示の対象の組換えポリペプチドの「有効量」、「治療有効量」、又は「医薬的有効量」という用語は、一般に、組成物が存在しない場合と比較して、組成物が記載された目的を達成する（例えばそれが投与される効果を達成する、疾患を治療する、シグナル伝達経路を減少させる、又は疾患若しくは健康状態の１つ又は複数の症状を減少させる）のに十分な量を指す。「有効量」の例は、疾患の症状の治療、予防、又は軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも呼ばれる。症状の「軽減」とは、症状の重症度又は頻度の低下、又は症状の排除を意味する。「治療有効量」を含む組成物の正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えばＬｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）； 及び Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。
本明細書で使用される「ＩＬ－２２」という用語は、天然であるか又は組換えであるかに拘わらず、野生型ＩＬ－２２を意味する。従って、ＩＬ－２２ポリペプチドは任意のＩＬ－２２ポリペプチドを指し、特に限定されるものではないが、組換え産生ＩＬ－２２ポリペプチド、合成的産生ＩＬ－２２ポリペプチド、細胞又は組織から抽出されたＩＬ－２２を含む。野生型ヒトＩＬ－２２前駆体のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、これは、１７９のアミノ酸残基のタンパク質であり、Ｎ末端に３３アミノ酸のシグナルペプチドを有し、これは除去されて１４６アミノ酸の成熟したタンパク質を生成することができる。成熟ヒトＩＬ－２２のアミノ酸配列を配列番号３４に示す。野生型マウス（Mus musculus）ＩＬ－２２前駆体のアミノ酸配列を配列番号６に示す。これは、１７９のアミノ酸残基のタンパク質であり、Ｎ末端に３３アミノ酸のシグナルペプチドを有し、これは除去されて、ヒトＩＬ－２２タンパク質と約７９％の配列同一性を共有する１４６アミノ酸の成熟したタンパク質を生成することができる。本開示の目的のために、すべてのアミノ酸の番号付けは、配列番号１（ヒトＩＬ－２２）又は配列番号６（マウスＩＬ－２２）に示されるＩＬ－２２タンパク質の前駆体ポリペプチド（又はプレタンパク質）配列に基づく。しかしながら、当業者は、組換えポリペプチド構築物を作製するために成熟タンパク質がしばしば使用されることを理解するであろう。成熟マウスＩＬ－２２のアミノ酸配列は配列番号３５に提供される。
本明細書で使用されるＩＬ－２２ポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ＩＬ－２２ポリペプチド、例えば野生型ＩＬ－２２ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入が存在するポリペプチドを指す。従って用語「ＩＬ－２２ポリペプチドバリアント」には、ＩＬ－２２ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアント又は代替的スプライスバリアントが含まれる。例えばポリペプチドバリアントは、親ＩＬ－２２ポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸の、類似又は相同アミノ酸又は非類似アミノ酸による置換を含む。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つ又はそれ以上の要素、例えばポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の物理的又は機能的連結を意味し、それらが意図した様式で作動することを可能にする。例えば目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えばプロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続的又は非連続的であり得ることが理解されるべきである。ポリペプチドの文脈において「作動可能に連結された」とは、記載されたポリペプチド活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば異なるドメイン）間の物理的連結（例えば直接的又は間接的に連結）を指す。本開示において、本開示の組換えポリペプチドの様々なドメインは、細胞内の組換えポリペプチドの適切な折り畳み、プロセシング、ターゲティング、発現、結合、及び他の機能特性を保持するために作動可能に連結され得る。本開示の組換えポリペプチドの作動可能に連結されたドメインは、連続的又は非連続的であり得る（例えばリンカーを介して互いに連結されている）。
本明細書で使用される用語「パーセント同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸又はタンパク質に関連して本明細書で使用される場合、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、以下に説明するデフォルトパラメータを使用して測定した場合、又は手動アライメント及び視覚的検査で測定した場合、同一であるか、又は同一のヌクレオチド又はアミノ酸の特定のパーセント（例えば比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性）を有する２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。例えばＮＣＢＩのウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照されたい。そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、配列の相補体にも言及するか、又は適用することができる。この定義にはまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、公開された技術及び広く利用可能なコンピュータプログラム、例えばＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３， １９９０）を使用して計算することができる。配列同一性は、ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ （１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ． ５３７０５） のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ などの配列解析ソフトウェアをデフォルトパラメーターで使用して測定することができる。
本明細書で使用される「医薬的に許容し得る賦形剤」という用語は、目的の化合物を対象に投与するための、医薬的に許容し得る担体、添加剤、又は希釈剤を提供する任意の適切な物質を指す。従って「医薬的に許容し得る賦形剤」は、医薬的に許容し得る希釈剤、医薬的に許容し得る添加剤、及び医薬的に許容し得る担体と呼ばれる物質を包含することができる。本明細書で使用される「医薬的に許容し得る担体」という用語には、特に限定されるものではないが、医薬投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などが含まれる。補助的活性化合物（例えば抗生物質及び追加の治療薬）も組成物に取り込むことができる。
本明細書で使用される「組換え」又は「改変」核酸分子という用語は、ヒトの介入によって改変された核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、これはインビトロのポリメラーゼ反応によって生成されたか、又はリンカーが結合されたか、又はクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに取り込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）例えば化学的又は酵素的技術（例えば化学的核酸合成の使用により、又は核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、連結、逆転写、転写、塩基改変（例えばメチル化を含む）、又は組換え（相同組換え及び部位特異的組換えを含む）を使用して、インビトロで合成又は修飾された；２）本来結合していない結合ヌクレオチド配列を含む；３）天然に存在する核酸分子配列に対して、１つ又は複数のヌクレオチドを欠くように、分子クローニング技術を使用して改変；及び／又は４）天然に存在する核酸配列に対して、１つ又は複数の配列変化又は再編成を有するように、分子クローニング技術を使用して操作されたもの、であり得る。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、これは、インビトロポリメラーゼ反応によって生成されたか、又はリンカーが結合されたか、又はクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。組換え核酸及び組換えタンパク質の別の非限定的な例は、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントである。
本明細書で使用される「個体」又は「対象」には、ヒト（例えばヒト個体）及び非ヒト動物などの動物が含まれる。いくつかの実施形態において、「個体」又は「対象」は、医師の管理下にある患者である。従って、対象は、関心のある疾患（例えば癌）及び／又は疾患の１つ又は複数の症状を有するか、又は有するリスクがある、又は有する疑いのあるヒト患者又は個体であり得る。対象はまた、診断時又はその後に関心のある状態のリスクがあると診断された個体であり得る。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、及び他の哺乳動物、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、及び非哺乳動物、例えば両生類、爬虫類などを含む。
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入又は輸送することができる核酸分子又は配列を指すために使用される。移入される核酸分子は、一般にベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。一般にベクターは、適切な制御要素と結合した場合に複製可能である。「ベクター」という用語には、クローニングベクター及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターが含まれる。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターであり、従ってインビトロ及び／又はインビボでＤＮＡ配列及び断片を発現することができる。ベクターは、細胞内での自律複製を指令する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターには、例えばプラスミド（例えばＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは遺伝子送達ベクターである。いくつかの実施形態において、遺伝子を細胞に移入するための遺伝子送達ビヒクルとしてベクターが使用される。
本明細書に記載される開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、「からなる（consisting）」、及び「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。本明細書で使用される「含む」は、「含む」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的又は無制限であり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で使用される「からなる」は、特許請求される組成物又は方法で指定されていない要素、工程、又は成分を排除する。本明細書で使用される「から本質的になる」は、特許請求される組成物又は方法の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。特に組成物の成分の説明又は方法の工程の説明における「含む」という用語の本明細書におけるいかなる記載も、記載された成分又は工程から本質的になる及びそれらからなる組成物及び方法を包含すると理解される。
例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などの見出しは、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、工程又は要素がアルファベット順又は番号順、又はそれらが提示された順序で実行されることを要求するものではない。
当業者によって理解されるように、書面による説明を提供することなどの、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲はまた、全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含する。記載された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解することを充分な記載し、可能にするものとして容易に認識できる。非限定例として、本明細書で議論される各範囲は、下３分の１、中間の３分の１、及び上３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などの全ての表現は、列挙された数を含み、これらは、上記で議論された下位範囲に分解され得る。最後に、当業者には理解されるように、範囲には個々のメンバーが含まれる。従って例えば１～３個の物品を有する群は、１、２、又は３個の物品を有する群を指す。同様に、物品数が１～５の群とは、物品数が１、２、３、４、又は５などの物品を有する群を指す。
いくつかの範囲は、「約」という用語が前に付いた数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近いか又は近似の数に対する文字通りの支持を提供するために使用される。ある数字が具体的に記載された数字に近いか、又は近似の数字であるかどうかを判断する際に、近いか又は近似の未記載の数字は、それが提示される文脈において、具体的に記載された数字と実質的に同等のものを提供する数字であり得る。
明確にするために、別個の実施形態に関連して説明される本開示のいくつかの特徴は、単一の実施形態では組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関連して説明されている本開示の様々な特徴は、別個に又は任意の適切な部分組合わせで提供され得る。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あらゆる組み合わせが個々に明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべての部分組合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのような部分組合わせのすべてが個別かつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
インターロイキン２２（ＩＬ－２２）と炎症性免疫反応
インターロイキン２２（ＩＬ－２２）は、サイトカインのＩＬ－１０ファミリーのメンバーであり、Ｔｈ２２細胞、ＮＫ細胞、リンパ組織誘導因子（ＬＴｉ）細胞、樹状細胞、及びＴｈ１７細胞によって産生される。ＩＬ－２２はＩＬ－２２Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒβ受容体複合体に結合し、この複合体は、上皮細胞、肝細胞、ケラチン産生細胞などの非造血細胞、並びに真皮、膵臓、腸、及び呼吸器系などを含むいくつかの器官のバリア上皮組織で発現される。
ＩＬ－２２は、粘膜免疫において重要な役割を果たし、細菌性病原体に付着しこれを取り除く初期の宿主防御を媒介することが報告されている。ＩＬ－２２は、上皮細胞からの抗菌ペプチドと炎症促進性サイトカインの産生を促進し、腸内の結腸上皮細胞の増殖と移動を刺激する。細菌が感染すると、ＩＬ－２２ノックアウトマウスは、腸上皮再生の障害、高負荷量の細菌、及び死亡率の上昇を示すことが以前に報告された。同様に、ＩＬ－２２ノックアウトマウスにインフルエンザウイルスが感染すると、体重が大幅に減少し、気管及び気管支上皮細胞の再生が障害された。従って、ＩＬ－２２は、微生物感染の抑制において炎症促進性の役割を果たし、並びに炎症応答における上皮再生において抗炎症性防御の役割も果たす。
炎症性免疫応答は、生物を感染や疾患から防御するのに不可欠である。しかし、免疫細胞の過剰な活性化は、バイスタンダー組織（bystander tissue）に損傷を与えることが多く、器官の機能不全、慢性炎症、及び自己免疫疾患の一因となる。これらの影響を防止及び軽減するために、免疫系は、特に免疫調節性サイトカイン及びその他の分泌因子の産生を通じて、炎症を抑制し、異常な組織損傷を防止する多くの調節メカニズムを進化させてきた。
１つの重要な分泌因子はサイトカインＩＬ－２２であり、これは組織の恒常性を維持する上で中心的な役割を果たす。炎症の最中に、ＣＤ４+Ｔ細胞や３型自然リンパ球（ＩＬＣ３）を含む複数のタイプの免疫細胞がバリア界面でＩＬ－２２を産生し、そこで上皮細胞に作用して組織の完全性を高め、再生を促進する。ＩＬ－２２は、膵臓、消化管、肝臓、及び胸腺を含む様々な組織に対してこれらの防御効果を発揮し、外因性ＩＬ－２２による治療は、膵炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及び急性肝障害のマウスモデルにおいて防御的である。さらに、ＩＬ－２２は、Ｌｇｒ５+腸幹細胞の生存と再生能力を促進することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を介する腸の損傷から防御する。免疫機能を抑制せずに炎症性組織の損傷を予防及び回復させるＩＬ－２２の固有の能力は、自己免疫疾患の魅力的な治療目標となり、コルチコステロイドやサイトカイン拮抗薬などの現在の治療法とは一線を画している。
これらの有益な機能にもかかわらず、ＩＬ－２２はまた、いくつかの状況においても病原性である可能性があり、最も顕著なのはＩＢＤ及び乾癬の場合である。ＩＬ－２２の炎症促進作用は、大部分は、皮膚、肝臓、及び消化管における好中球動員ケモカイン（例えばＣＸＣＬ１）の誘導、並びに炎症性Ｔｈ17細胞の活性化を促進する血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）－１／２などの急性期応答タンパク質の産生による。実際、外因性ＩＬ－２２の投与は、マウスとヒトの両方で、急性期応答タンパク質の血清レベルの有意な上昇を誘発する。従って、局所炎症と全身炎症の両方を引き起こすＩＬ－２２のこの可能性は、その臨床的有用性に重大な制限をもたらす。
機構的に、ＩＬ－２２は、高親和性サブユニットＩＬ２２Ｒ１と低親和性サブユニットＩＬ１０Ｒβからなるヘテロ二量体受容体を介してシグナル伝達する。ＩＬ１０Ｒβは遍在的に発現されるが、ＩＬ－２２Ｒ１は主に上皮細胞で発現され、ＩＬ－２２の標的細胞特異性を決定する。ＩＬ－２２は、ＩＬ２２Ｒ１に結合すると、ＩＬ２２Ｒ１とＩＬ１０Ｒβの二量体形成を促進し、細胞内の受容体関連キナーゼＪａｋ１とＴｙｋ２を結合させ、これらは、相互にリン酸化するだけでなく、ＩＬ２２Ｒ１の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）上のチロシンもリン酸化する。これらのホスホチロシンは、順にＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３転写因子を動員し、それらのリン酸化と活性化を促進する。ＩＬ－２２の下流にある組織保護及び再生遺伝子の発現はＳＴＡＴ３によって媒介されるが、ＩＬ－２２の炎症促進作用のいくつかはＳＴＡＴ１によるものと考えられており、これが、炎症促進性インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現を制御する。
下流のシグナル伝達応答を分離する機能選択的な又は「バイアス型(biased)」アゴニストは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）について広く特性解析されており、最近の研究は、そのようなアゴニストがサイトカイン受容体についても可能であることを示唆している。ただし、これらのアプローチは広範な構造情報に依存しており、これが、現在ＩＬ－２２受容体複合体について欠けているいる。これは主に、ＩＬ－２２が共有する受容体サブユニットであるＩＬ１０Ｒβに対する親和性が非常に低いためであり、これはインビトロでの複合体の構築を妨げる。
以下の実施例に記載されているように、指向性進化アプローチを使用して、ＩＬ１０Ｒβに対する親和性が増強されたＩＬ－２２バリアントを改変され、ＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ三元複合体の結晶構造を２．６Åの分解能まで解明することが可能になった。ＩＬ－１０Ｒβ界面を標的とするＩＬ－２２の構造誘導変異により、ＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３を介してシグナル伝達するバイアス型ＩＬ－２２バリアントが得られた。本明細書に開示される例示的なＩＬ－２２ポリペプチドバリアントである２２－Ｂ３も、インビボで組織選択的シグナル伝達応答を誘発し、膵臓及び結腸ではＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニストとして作用するが、皮膚及び肝臓では中立的なアンタゴニストとして作用する。特に２２－Ｂ３は、皮膚、肝臓、結腸で炎症メディエーターを誘発することなく、ＩＬ－２２の組織保護機能をインビボで保持し、従ってＩＬ－２２の主要な組織保護機能と炎症促進機能を切り離している。
サイトカインは、宿主の免疫応答を制御し、組織の恒常性を促進する上で多くの重要な役割を果たすが、治療薬としての使用を制限する可能性のある多面的効果又は逆効果もしばしば発揮する。その結果、サイトカイン及びサイトカイン受容体アンタゴニストは重要な臨床的成功を収めているが、サイトカイン受容体アゴニストについてそのような例ははるかに少ない。サイトカインＩＬ－２２は、組織や疾患の状況に応じて、有益な機能と有害な機能の両方を発揮できるサイトカインの代表的な例である。以下でより詳細に説明されるように、ＩＬ－２２の組織保護機能と炎症促進機能を効果的に切り離すＩＬ－２２の機能選択的なバリアントを開発するために、構造に基づくアプローチが使用されていて、ＩＬ－２２がどのように機能するかについての新しい知見が明らかになるが、改善されたサイトカインベースの治療法の開発への道も提供している。
ＩＬ－２２受容体複合体のこれまでの構造的特性解析を妨げる主な障壁は、サブユニット間、特にＩＬ－２２とＩＬ１０Ｒβとの間の極めて低い親和性相互作用の存在であった。ここでは、リガンド改変アプローチが使用して、三元受容体複合体に関する情報を得た。ここで提示されたＩＬ－２２受容体複合体の構造は、ＩＬ－１０スーパーファミリー内の受容体共有のメカニズムに関するいくつかの知見を提供する。ＩＬ－２２受容体複合体は、共有受容体サブユニットＩＬ１０Ｒβに結合したサイトカインの２番目に報告された構造であり、以前に解明されたＩＦＮ－λ複合体の構造と比較して、リガンド結合の異なるモードを明らかにしている（図２）。ＩＬ－２２及びＩＦＮ－λに加えて、ＩＬ１０ＲβはまたＩＬ－１０及びＩＬ－２６受容体にも存在し、これらのサイトカインによる受容体共有の根底にあるメカニズムに関連するこれらの複合体の構造的特性解析。
ＩＬ－２２／ＩＬ１０Ｒβ結合部位を分析することにより、ＩＬ－２２とのＩＬ１０Ｒβ結合界面でアミノ酸置換を有する一連のヒト及びマウスＩＬ－２２バリアントの生成が可能になり、その結果、ＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニスト作用を有するＩＬ２２バリアントが得られた．偏った活性を有する改変サイトカイン受容体リガンドの以前の例は、受容体トポロジーの変更に依存していたが、以下に説明される実験結果は、その受容体に対する天然のサイトカインの親和性の調節が、バイアス型アゴニスト作用を生成するのに十分であることを示す。機構的に、本開示のＩＬ２２バリアントは、ＷＴ ＩＬ－２２と比較してＩＬ２２Ｒ１のリン酸化を実質的に減少させ、こうしてＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の活性化の２つの異なるモードを利用している。ＳＴＡＴ１はＩＬ２２Ｒ１のＩＣＤ上のホスホチロシンに結合することによってＩＬ２２受容体に動員されるのに対し、ＳＴＡＴ３はホスホチロシン結合とは無関係にＩＬ２２Ｒ１と事前に会合することができ、従って受容体リン酸化が完全に存在しない場合でも活性化され得る（図３Ｆ）。
バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３のインビボでの特性解析は、ＩＬ１０Ｒβ発現レベルと相関する相対シグナル強度を有し、組織選択的シグナル伝達活性を明らかにした（図６Ｄ）。ＩＬ－２２はインビトロで肝細胞の表面上のＩＬ－２２Ｒ１に依然として結合することができるため（図４Ｉ）、これは改変された組織「標的化」の結果ではなく、機能的な組織選択性の例である。組織選択性の概念はＧＰＣＲ及び核内受容体の薬理学で十分に確立されており、最も顕著な例はエストロゲン受容体アゴニスト（Ｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎｎ， ２００３）であり、ここで示されたデータは、この概念をサイトカイン受容体シグナル伝達にも拡張している。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書に記載の実験データは、ＩＬ１０Ｒβに対する親和性とＩＬ１０Ｒβの発現レベルの組み合わせが、所定の細胞上でＩＬ－２２によって誘導されるシグナル伝達のタイプを決定することを示す。このシグナル強度は、完全なアゴニスト作用から中立的なアンタゴニズムまでの範囲のスペクトル上に存在し、中間のシグナル強度は、ＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３のリン酸化につながるバイアス型活性をもたらす。インビボでＩＬ－２２の組織保護機能及び炎症促進機能を切り離す２２－Ｂ３の能力は、その偏ったシグナル伝達活性と組織選択性の両方の組み合わせに起因すると思われる。例えば結腸でＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３を活性化することにより、２２－Ｂ３は、Ｒｅｇ３β／γやＭｕｃ１などのＳＴＡＴ３依存性組織保護遺伝子の発現を誘導する能力を保持するが、炎症促進性ＳＴＡＴ１標的遺伝子ＣＸＣＬ１を誘導しなくなる。ただし、ＳＡＡ－１／２などの急性期応答タンパク質はＳＴＡＴ３標的遺伝子であるため、これらのタンパク質の全身的な増加がないのは、肝臓中の２２－Ｂ３が完全に不活性なためである。２２－Ｂ３は皮膚と肝臓でＳＴＡＴ３を活性化できないため、これらの組織でＷＴ ＩＬ－２２の組織保護効果を保持していないことは注目に値する。本明細書に記載の実験データは、２２－Ｂ３又は同様のＩＬ－２２バリアントが、膵臓及び消化管の炎症性疾患の治療に治療的有用性を有し、皮膚及び肝臓の炎症に関連する副作用のリスクが大幅に低下していることを示す。
以下でより詳細に説明されるように、ＩＬ－２２シグナル伝達のこれらの相反する作用に対する機構的知見を得るために、酵母ディスプレイに基づく指向性進化を使用して高親和性ＩＬ－２２バリアントを改変していくつかの実験を行うと、そのヘテロ二量体受容体複合体に結合したＩＬ－２２の構造的特性解析が可能になった。ＩＬ－２２がその低親和性受容体サブユニットであるＩＬ１０Ｒβにどのように係合するかを明らかにすることにより、本明細書に記載のヘテロマーＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体の結晶構造が、ＩＬ－２２受容体の下流のシグナル伝達経路を調節できる、ＩＬ１０Ｒβ結合界面に１つ又は複数のアミノ酸置換を有するＩＬ－２２ポリペプチドバリアントの設計に、使用された。これらのＩＬ－２２バリアントのいくつかは、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３活性化の２つの異なるメカニズムを利用することにより、結腸上皮細胞中で強いバイアス型アゴニスト作用を示すことがわかった。特に、これらのバリアントの例示的なバリアントである２２－Ｂ３はまた、インビボの組織選択的シグナル伝達応答も誘発し、全身性炎症を誘発することなく、膵臓及び消化管における組織保護遺伝子の発現を促進した。
開示の構成
Ａ．組換えＩＬ－２２ポリペプチド
上で概説したように、本開示のいくつかの実施形態は、ＩＬ－２２受容体の下流のＳＴＡＴシグナル伝達を調節するように改変ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントであって、例えばそのＳＴＡＴ３媒介機能を組織特異的的に実質的に保持しながらＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能を付与することができる、ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントに関する。例えば本開示のいくつかの実施形態において、ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントは、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下をもたらすが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの他の実施形態において、本開示のＩＬ－２２ポリペプチドバリアントは、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下をもたらすが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、以下を含む組換えポリペプチドに関する：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びさらに（ｂ）配列番号１の配列中の１つ又は複数のアミノ酸置換。
本明細書に開示される組換えポリペプチドの非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１～３、２～５、３～６、又は４～７個のアミノ酸置換をさらに含む。この態様において例示的なＩＬ－２２ポリペプチドバリアントは、配列番号１の配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のアミノ酸の置換をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数の追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ４８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ５５からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。
本開示に従って、ＩＬ－２２ポリペプチドにおけるそのような置換は、そのような置換を欠く親ＩＬ－２２ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＩＬ１０Ｒβ及び／又はＩＬ－２２Ｒ１に対する結合親和性が改変されたＩＬ－２２バリアントをもたらす。例えば本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒβに対して上昇又は低下した親和性を有することができるか、又はＷＴ ＩＬ－２２の親和性と同一又は同様の、これらの受容体に対する親和性を有することができる。本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントはまた、ＩＬ－２２の別の位置に保存的修飾及び置換（例えばＩＬ－２２バリアントの二次又は三次構造に最小限の影響を有するもの）を含むことができる。そのような保存的置換には、ＤａｙｈｏｆｆによってＴｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ （１９７８）に、及び Ａｒｇｏｓ によって ＥＭＢＯ Ｊ， ８：７７９－７８５ （１９８９）記載されたものが含まれる。例えば次の群のいずれかに属するアミノ酸は保存的変化を表す：群Ｉ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；群ＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；群Ｖ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び群ＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドにおけるアミノ酸置換の非限定的な例が以下の表１及び２に提供される。
Figure 2023521867000002
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＤ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４９、Ｑ１１６、Ｒ１２４、及びＲ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；（ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；及び（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；（ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；（ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号１のＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び：配列番号１のＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。
１つの態様において、以下を含む組換えポリペプチドが本明細書に提供される：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びさらに（ｂ）配列番号６の配列中に１つ又は複数アミノ酸置換。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号６の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号６の配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、１～３、２～５、３～６、又は４～７個のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数の追加のアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ４８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ５５からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む、
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。
上述のように、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントはまた、ＩＬ－２２の他の位置に保存的修飾及び置換（例えばＩＬ－２２バリアントの二次又は三次構造に最小限の影響を有するもの）を含むことができる。そのような保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ １９７８（前出）及びＡｒｇｏｓ １９８９（前出）によって記載されたものが含まれる。例えば次の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す：群Ｉ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；群ＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；群Ｖ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び群ＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。
Figure 2023521867000003
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号６のＥ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４８、Ｒ５５、Ｑ１１６、Ｅ１１７、Ｋ１２４、Ｑ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；（ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；又は（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号６と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；（ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；又は（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；（ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；又は（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号６のＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６のＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個のアミノ酸置換をさらに含む。この態様による例示的なＩＬ－２２ポリペプチドバリアントは、配列番号６の配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のアミノ酸の置換を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドの配列におけるアミノ酸置換は、ＩＬ１０Ｒβに対する組換えＩＬ－２２ポリペプチドの結合親和性の調節をもたらす。ＩＬ－２２ポリペプチドの結合活性に関して「調節する」という用語は、ＩＬ１０Ｒβに対するポリペプチドの結合親和性の変化を指す。調節には、ポリペプチドの増加（例えば誘導、刺激）及び減少（例えば低下、阻害）の両方、又はポリペプチドの結合親和性に影響を与えるその他が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドの配列におけるアミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を低下させる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を増加させる。
本明細書に記載のＩＬ－２２ポリペプチドバリアントを含む本開示の組換えポリペプチドの結合活性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって測定することができる。例えば本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアント及びその受容体（例えばＩＬ－２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒβ）の結合活性は、スキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０７：２２０－２３９， １９８０）によって決定することができる。特異的結合はまた、特に限定されるものではないが、競合ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ及び／又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイを含む当該技術分野で公知の技術を使用して評価することができる。標的タンパク質に優先的に結合又は特異的に結合するポリペプチドは、当技術分野でよく理解されている概念であり、そのような特異的又は優先的結合を決定する方法も当技術分野で公知である。
目的のリガンド（例えばＩＬ－２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒβ）に結合する組換えＩＬ－２２ポリペプチドを選択するために、様々なアッセイ形式を使用することができる。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降法、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、ＫｉｎＥｘＡ、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）、及びウエスタンブロット分析は、受容体又はそのリガンド結合部分と特異的に反応するか、同族リガンド又は結合パートナーと特異的に結合するポリペプチドを同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。一般に、特異的又は選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍超、バックグラウンドの２０倍超、さらにより一般的にはバックグラウンドの５０倍超、バックグラウンドの７５倍超、バックグラウンドの１００倍超、より典型的にはバックグラウンドの５００倍超、さらにより典型的にはバックグラウンドの１０００倍超、及びさらにより典型的にはバックグラウンドの１０，０００倍超である。
当業者は、結合親和性がまた、２つの分子、例えばＩＬ－２２ポリペプチドとＩＬ１０Ｒβ受容体の間の非共有相互作用の強度の尺度として使用され得ることを理解するであろう。場合によっては、結合親和性は、一価の相互作用（固有の活性）を記述するために使用される。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（ＫＤ）の測定によって定量化することができる。次にＫＤは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、複合体形成及び解離の動態を測定することによって決定することができる。一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ｋａ（又はｋｏｎ）及び解離速度定数ｋｄ（又はｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによってｋａ及びｋｄに関連付けられる。解離定数の値は、周知されている方法によって直接決定することができ、例えばＣａｃｅｃｉ ｅｔ ａｌ． （Ｂｙｔｅ ９： ３４０－３６２， １９８４） に示される方法により、複雑な混合物についても計算することができる。例えばＫＤは、Ｗｏｎｇ ＆ Ｌｏｈｍａｎ （１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５４２８－ ５４３２） によって開示されたような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立することができる。標的受容体に対する本開示のＩＬ－２２ポリペプチドバリアントの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは当技術分野で公知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析、並びに実施例に示される他のアッセイが含まれる。ＩＬ－２２ポリペプチドバリアントの結合動態及び結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当技術分野で公知の標準アッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム又はＫｉｎＥｘＡを使用してに評価することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒβに対する本開示のＩＬ－２２ポリペプチドバリアントの結合親和性は、固相受容体結合アッセイ（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ＭＮ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ８６５：７１－９４， ２０１２）によって決定される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒβに対する本開示のＩｌ－２２ポリペプチドバリアントの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。以下でさらに詳細に説明するように、本開示の例示的なＩＬ－２２ポリペプチドバリアントである２２－Ｂ３は、インビボで組織選択的シグナル伝達応答を誘発し、膵臓及び結腸ではＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニストとして作用するが、皮膚及び肝臓では中立的なアンタゴニストとして作用する。特に、２２－Ｂ３バリアントは、皮膚、肝臓、及び結腸で炎症メディエーターを誘発することなく、ＩＬ－２２の組織保護機能をインビボで保持し、従ってＩＬ－２２の主要な組織保護機能と炎症促進機能を切り離す。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらし、これは、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を伴うが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの他の実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらし、これは、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を伴うが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、例えばＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３のリン酸化によって決定されるバイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ１リン酸化の、少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の低下を含む。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３リン酸化の、少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の低下を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、１つ又は複数のＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらす。適切に測定できるＳＴＡＴ１媒介性の機能に特定の制限はない。適切なＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の非限定的な例には、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員が含まれる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、約２０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、炎症促進性遺伝子の発現を誘導するポリペプチドの能力によって決定すると、１つ又は複数のＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらす。炎症促進性遺伝子の非限定的な例には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６が含まれる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２０と比較して、約２０％～約１００％、例えば約２０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約４０％～約８０％、約３０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％約７０％～約２０％～約６０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、又は約３０％～約１００％低下している。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。適切に評価できるＳＴＡＴ３介在機能に関して、特定の制限はない。適切なＳＴＡＴ３媒介機能の例には、特に限定されるものではないが、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、Ｒｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１０、ＢＣＬ－２、サイクリン－Ｄ、クローディン－２、ＬＣＮ２、又はβ－ディフェンシンなどのバイオマーカーの発現を誘導するポリペプチドの能力によって決定すると、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらすが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達対ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比が、約１：１．５～約１：１０、例えば約１：２～約１：５、約１：２～約１：７、約１：３～約１：８、約１：４～約１：１０、約１：４～約１：９、又は約１：４～約１：８の範囲である。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、ＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達とＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比が約１．５～３．２の範囲である。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ３シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。
Ｂ．核酸
１つの態様において、発現カセット及び発現ベクターを含む、本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む様々な核酸分子が本明細書で提供され、発現ベクターは、例えば宿主細胞又はエクスビボの無細胞発現系における組換えＩＬ－２２ポリペプチドのインビボ発現を可能にする調節配列などの、異種核酸配列に作動可能に連結されたこれらの核酸分子を含む。
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む核酸分子を含む、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子の両方を指す。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖）であり得る。核酸分子は、従来方ではないか又は修飾されたヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、交換可能にポリヌクレオチド分子の配列を指す。本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、参照によりＷＩＰＯ基準ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１～６を取り込む３７ＣＦＲ§１．８２中に、ヌクレオチド塩基及びアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示される。
本開示の核酸分子は、一般に約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、例えば約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約１Ｋｂ～約１５Ｋｂ、約２Ｋｂ～約１０Ｋｂ、又は約５Ｋｂ～約２５Ｋｂ、例えば約１０Ｋｂ～約１５Ｋｂ、約１５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約１０Ｋｂ、又は約１０Ｋｂ～約２５Ｋｂである核酸分子を含む、任意の長さの核酸分子であり得る。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、以下を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＬ－２２ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び配列番号１のＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドを、コードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドを、コードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；（ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；又は（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。
いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、以下を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＩＬ－２２ポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びさらに（ｂ）配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号６と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６のＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドを、コードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含むポリペプチドを、コードするヌクレオチド配列を含む：（ａ）Ｒ５５Ａ；（ｂ）Ｅ１１７Ａ；（ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；（ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；（ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；（ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；又は（ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１～５及び７～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号７～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、発現カセット又は発現ベクターに取り込まれる。発現カセットは、一般に、コード配列と、インビボ及び／又はエクスビボで、レシピエント細胞においてコード配列の正しい転写及び／又は翻訳を指令するための十分な調節情報とを含む遺伝物質の構築物を含むことが理解される。一般に、発現カセットは、所望の宿主細胞及び／又は個体をターゲティングするために、ベクターに挿入され得る。従って、いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットは、本明細書に開示される組換えポリペプチドのコード配列を含み、これは、プロモーターなどの発現制御要素、及び任意選択的に、コード配列の転写又は翻訳に影響を与える他の核酸配列のいずれか又は組み合わせに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は発現ベクターに取り込まれる。「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞間の転移のために設計された組換えポリヌクレオチド構築物を指し、形質転換の目的、例えば宿主細胞内への異種ＤＮＡの導入のために使用され得ることを、当業者は理解するであろう。従って、いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどのレプリコンであり得、挿入されたセグメントの複製をもたらすように、そこに別のＤＮＡセグメントが挿入され得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは組込みベクターであり得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであり得る。当業者には理解されるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の移動又は細胞のゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来の核酸要素を含む核酸分子（例えばトランスファープラスミド）を、又は核酸の移動を媒介するウイルス粒子を指すために、広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、核酸に加えて様々なウイルス成分を含み、時には宿主細胞成分も含む。ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞に移動させることができるウイルス又はウイルス粒子、又は移動された核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターとトランスファープラスミドには、主にウイルスに由来する構造的及び／又は機能的な遺伝要素が含まれている。いくつかの実施形態においてウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、レトロウイルス属であるレンチウイルスに主に由来するＬＴＲを含む、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。
従って、本明細書に開示される任意の組換えポリペプチド又はＩＬ－２２ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子の１つ又は複数を含むベクター、プラスミド、又はウイルスも本明細書に提供される。核酸分子は、例えばベクターで形質転換／形質導入された細胞においてそれらの発現を指示することができるベクター内に含まれ得る。真核細胞及び原核細胞での使用に適したベクターは、当技術分野で公知であり、市販されているか、又は当業者によって容易に調製される。
ＤＮＡベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２， 前述）及び他の標準的な分子生物学実験マニュアルに見いだすことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレイプローディング、弾道導入、ヌクレオポレーション、流体力学的ショック、及び感染がある。
本開示で使用できるウイルスベクターには、例えばバキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びウシパピローマウイルスベクターが含まれる（例えばＧｌｕｚｍａｎ （Ｅｄ．）， Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． を参照されたい）。
発現系の正確な成分は重要ではない。例えば本明細書に開示される組換えポリペプチドは、真核宿主、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、又はヒーラ細胞）などにおいて産生され得る。これらの細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を含む多くの供給源から入手できる。発現系を選択する際には、成分が互いに適合するように注意する必要がある。当業者は、そのような決定を下すことができる。さらに、発現系を選択する際にガイダンスが必要な場合、当業者は、Ｐ． Ｊｏｎｅｓ， “Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ２００９） を参照することができる。
提供される核酸分子は、天然に存在する配列、又は天然に存在する配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のために同じポリペプチド、例えば抗体をコードする配列を含み得る。これらの核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ、例えばホスホアミダイトベースの合成によって生成されるもの）、又はこれらのタイプの核酸内のヌクレオチドの組み合わせ又は修飾から構成され得る。さらに、核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えばセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。
核酸分子は、ポリペプチド（例えばＩＬ－２２ポリペプチドバリアント）をコードする配列に限定されない。コード配列（例えばＩＬ－２２ポリペプチドバリアントのコード配列）の上流又は下流に位置する非コード配列の一部又は全部を含めることもできる。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための日常的な操作に精通している。それらは、例えばゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施によって生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えばインビトロ転写によって産生され得る。
別の態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物、及び培地が本明細書に提供される。一般に、培地は、本明細書に記載の細胞を培養するための任意の適切な培地であり得る。多種多様な上述の宿主細胞及び種を形質転換するための技術は、当技術分野で公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。従って、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及びシステムは、当技術分野で公知である。
Ｃ．組換え細胞と細胞培養物
本開示の組換え核酸は、ヒトＴリンパ球などの宿主細胞に導入して、核酸分子を含む組換え細胞を産生することができる。本開示の核酸分子の細胞への導入は、当業者に公知の方法、例えばウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介核酸送達などの方法によって達成することができる。
従って、いくつかの実施形態において、核酸分子は、当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。例えば核酸分子は、宿主ゲノムに安定に取り込まれるか、エピソーム的に複製するか、又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞に存在することができる。従って、いくつかの実施形態において、核酸分子は、組換え宿主細胞内でエピソーム単位として維持及び複製される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、組換え細胞のゲノムに安定して組み込まれる。安定した組み込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術、又はより正確な技術、例えばガイドＲＮＡ指向のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いるＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼゲノム編集、又はタレン（ＴＡＬＥＮ）ゲノム編集（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）などを使用して達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞に存在する。
核酸分子は、ウイルスカプシド又は脂質ナノ粒子に封入するか、又は電気穿孔法などの当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達手段及び方法によって送達することができる。例えば細胞への核酸の導入は、ウイルス形質導入によって達成され得る。非限定的な例では、バキュロウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を改変して、ウイルス形質導入を介して標的細胞に核酸を送達することができる。いくつかのＡＡＶ血清型が記載されており、既知の血清型はすべて、複数の多様な組織型の細胞に感染する可能性がある。ＡＡＶは、毒性の証拠なしに、インビボで広範囲の種及び組織に形質導入することができ、比較的軽度の自然免疫応答及び適応免疫応答を生成する。
レンチウイルス由来ベクター系は、ウイルス形質導入を介する核酸送達及び遺伝子治療にも有用である。レンチウイルスベクターは、遺伝子送達媒体として次のようないくつかの魅力的な特性を提供する：（ｉ）宿主ゲノムへの安定したベクターの組み込みによる持続的な遺伝子送達；（ｉｉ）分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉｉ）重要な遺伝子療法及び細胞療法の標的細胞タイプを含む広範な組織親和性；（ｉｖ）ベクター形質導入後にウイルスタンパク質の発現がない；（ｖ）ポリシストロン配列又はイントロン含有配列などの複雑な遺伝要素を送達する能力；（ｖｉ）潜在的により安全な組み込み部位プロフィール；及び（ｖｉｉ）ベクトルの操作と産生のための比較的簡単なシステム。
いくつかの実施形態において、例えば宿主細胞のゲノムの一部に相同的な核酸配列を含むか、又は目的のポリペプチドの発現のための発現ベクターであり得る相同組換え用のウイルスベクター又はベクターであり得る、本願のベクター構築物を用いて、宿主細胞を改変（例えば形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）することができる。宿主細胞は、非形質転換細胞であるか、又は少なくとも１つの核酸分子ですでにトランスフェクトされた細胞のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態において、組換え細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はインビボである。いくつかの実施形態において、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロである。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、免疫系細胞、例えばリンパ球（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）、又は樹状細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＴH）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣＴＬ）、又は他のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫系細胞はＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から得られた試料に対して行われる白血球除去によって得ることができる。いくつかの実施形態において、対象はヒト患者である。適切な細胞株の非限定的な例には、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ５）細胞、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）、Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４６９）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）、及びＥＣ４細胞が含まれる。
別の態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物、及び培地が本明細書に提供される。一般に培地は、本明細書に記載の細胞を培養するための任意の適切な培地であり得る。多種多様な上述の宿主細胞及び種を形質転換するための技術は、当技術分野で公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。従って、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及びシステムは、当技術分野で公知である。
Ｄ．ＩＬ－２２ポリペプチドの産生方法
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組換えポリペプチドを産生するための様々な方法に関し、この方法は以下を含む：（ａ）本開示の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること；及び（ｂ）組換え細胞を培地中で培養して、組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを細胞が産生するようにすること。従って、本明細書に開示される方法によって産生される組換えポリペプチドもまた、本開示の範囲内である。
組換えポリペプチドを産生するための開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の１つ又は複数の特徴を含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドを産生する方法は、産生されたポリペプチドの構造を修飾して半減期を延長させることをさらに含む。
いくつかの実施形態において、修飾は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。例えば本明細書に開示される組換えポリペプチドのいずれも、組換えポリペプチド及び異種ポリペプチド（例えばＩＬ－２２でもそのバリアントでもないポリペプチド）を含む融合体又はキメラポリペプチドとして調製することができる。例示的な異種ポリペプチドは、インビボで組換えポリペプチドの循環半減期を延長させることができ、従って、本開示の組換えポリペプチドの特性をさらに増強することができる。様々な実施形態において、循環半減期を延長させる異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、又はＩｇＧ重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域であり得る。例示的なＦｃ領域は、補体結合及びＦｃ受容体結合を阻害する突然変異を含むことができるか、又はそれは溶解性であり得、例えば補体に結合し得るか、又は抗体依存性補体溶解（ＡＤＣＣ）などの別の機構を介して細胞を溶解することができる。
いくつかの実施形態において、「Ｆｃ領域」は、パパインによるＩｇＧの消化によって産生されるＩｇＧのＣ末端ドメインに相同的な天然又は合成ポリペプチドであり得る。ＩｇＧ Ｆｃの分子量は約５０ｋＤａである。本開示の組換え融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、又はそれが一部である融合ポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するそのより小さな部分を含むことができる。さらに、全長又は断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。すなわちそれらは、ポリペプチドの機能に影響するかも又は影響しないかもしれない突然変異を含み得る。以下でさらに説明するように、天然の活性が、必ずしもすべての場合に必要又は望ましいわけではない。いくつかの実施形態において、組換え融合タンパク質（例えば本明細書に記載のＩＬ－２２部分アゴニスト又はアンタゴニスト）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。
Ｆｃ領域は、「溶解性」又は「非溶解性」であり得るが、典型的には非溶解性である。非溶解性Ｆｃ領域は、典型的には、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ'１ｑ結合部位を欠いている。マウスＩｇＧ Ｆｃの高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含む。従って、Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異又は欠失させることによって破壊することができる。例えばＬｅｕ２３５をＧｌｕで置換すると、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体に結合する能力が阻害される。マウスのＣ'１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を変異又は欠失させることによって機能的に破壊することができる。例えばＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換すると、ＩｇＧ１ Ｆｃは抗体依存性補体溶解を指令できなくなる。対照的に、溶解性ＩｇＧ Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ'１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含み、Ｃ'１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を含む。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、これらの部位に野生型残基又は保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、抗体依存性細胞傷害又は補体指令細胞溶解（ＣＤＣ）のための細胞を標的にすることができる。ヒトＩｇＧの適切な変異も当技術分野で公知である。
他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチド、及びＦＬＡＧ配列などの抗原タグとして機能するポリペプチドを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、ビオチン化された特異性の高い抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される。いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドはＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。
他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチドと、Ａｇａ２ｐ凝集素サブユニットなどのＩＬ－２２ポリペプチドの発現を増強するか又は細胞局在化を指令するように機能する異種ポリペプチドとを含む。
他の実施形態において、本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチド及び抗体又はその抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを生成することができる。組換えＩＬ－２２ポリペプチドの抗体又は抗原結合成分は、標的化部分として働くことができる。例えばこれは、組換えＩＬ－２２ポリペプチドを細胞又は標的分子の特定のサブセットに局在化するために使用することができる。サイトカイン－抗体キメラポリペプチドを生成する方法は、当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態において、本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチドは１つ又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子で修飾して、その半減期を延長させることができる。本明細書で使用される「ＰＥＧ」という用語は、ポリエチレングリコール分子を意味する。典型的な形態では、ＰＥＧは末端ヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり、式ＨＯ－ＣＨ2ＣＨ2－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－ＣＨ2ＣＨ2－ＯＨを有し、ここで、ｎは約８～約４０００である。
一般に、「ｎ」は離散値ではなく、平均値の周りにほぼガウス分布を有する範囲を構成する。末端水素は、アルキル基又はアルカノール基などのキャッピング基で置換されていてもよい。ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有することができ、より好ましくはこれは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は、ペプチドと反応して共有結合を形成することができるリンカー部分に結合することができる。ＰＥＧの多数の誘導体が当技術分野に存在する。本開示の組換えＩＬ－２２ポリペプチドに共有結合したＰＥＧ分子は、約１０，０００、２０，０００、３０，０００、又は４０，０００ダルトンの平均分子量であり得る。ＰＥＧ化試薬は、直鎖状又は分枝状の分子でもよく、単独又はタンデムで存在することができる。本開示のＰＥＧ化ＩＬ－２２ポリペプチドは、ペプチドのＣ末端及び／又はＮ末端に結合したタンデムＰＥＧ分子を有することができる。本明細書で使用される「ＰＥＧ化」という用語は、上述したように、本開示のＩＬ－２２ポリペプチドなどの分子への、１つ又は複数のＰＥＧ分子の共有結合を意味する。
Ｅ．医薬組成物
本開示の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物は、医薬組成物を含む組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、一般に、本明細書に記載の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物、並びに医薬的に許容し得る賦形剤、例えば担体を含む。
従って、本開示の１つの態様は、医薬的に許容し得る担体及び以下のうちの１つ又は複数を含む医薬組成物に関する：（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）医薬的に許容し得る担体。
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、癌などの疾患を治療、予防、改善するため、又は疾患の発症を軽減又は遅延させるために製剤化される。
開示された医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えポリペプチドと医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え細胞と医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、本開示の組換えポリペプチドを発現する。新しい治療アプローチとしてインターロイキンを発現及び分泌するように遺伝子修飾された組換え細胞の例は、例えばＳｔｅｉｄｌｅｒ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ７， Ｊｕｌｙ ２００３ 及び Ｏｈ Ｊ．Ｈ ｅｔ ａｌ．， ｍＳｐｈｅｒｅ， Ｖｏｌ． ５， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ ２０２０ に既に記載されている。
いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸と医薬的に許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ウイルスカプシド又は脂質ナノ粒子に封入される。
注射用途に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的であるべきである。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、バクテリアや菌類などの微生物による汚染作用から防御して保存しなければならない。担体は、溶媒又は分散媒体でもよく、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物が含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持、及びドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、及び／又は塩化ナトリウムを含めるのが一般的であろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることに行われる。
無菌注射溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を無菌ビヒクルに取り込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体と、上に列挙したものからの必要な他の成分を含む。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは、有効成分の粉末に加えて、事前に無菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分を与える。
本開示の対象の組換えポリペプチドの全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜又は経皮投与の場合、透過されるバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られており、例えば経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレー又は座薬を使用して行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに処方される。
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、トランスフェクション又は感染により、特に限定されるものではないが、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ ４１８：６８９３， ２００２）， Ｘｉａ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： １００６－１０１０， ２００２）， 又は Ｐｕｔｎａｍ （Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５３： １５１－１６０， １９９６， ｅｒｒａｔｕｍ ａｔ Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ５３：３２５， １９９６）を含む当技術分野で公知の方法を使用して、投与することもできる。
いくつかの実施形態において、本開示の対象の組換えポリペプチドは、体内からの急速な排出から組換えポリペプチドを防御する担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 及び Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容し得る担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように調製することができる。以下により詳細に記載されるように、本開示の組換えポリペプチドはまた、ＰＥＧ化、アシル化、Ｆｃ融合、アルブミンなどの分子への結合などによって、延長された作用持続時間を達成するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、インビボ及び／又はエクスビボでの半減期を延長するためにさらに修飾することができる。本開示の組換えポリペプチドを修飾するのに適した既知の戦略及び方法論の非限定的な例には、（１）組換えポリペプチドがプロテアーゼと接触するのを防ぐポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの高溶解性高分子による、本明細書に記載の組換えポリペプチドの化学修飾、（２）本明細書に記載の組換えポリペプチドに、例えばアルブミンなどの安定なタンパク質を共有的に連結又は結合させること、を含む。従って、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、アルブミンなどの安定なタンパク質に融合することができる。例えばヒトアルブミンは、そこに融合したポリペプチドの安定性を高める最も効果的なタンパク質の１つとして知られており、そのような多くの融合タンパク質が報告されている。
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ又は複数のＰＥＧ化試薬を含む。本明細書で使用される「ＰＥＧ化」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に共有結合させることによってタンパク質を修飾することを指し、「ＰＥＧ化された」とはＰＥＧが結合したタンパク質を指す。約１０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトンまでの任意の範囲のサイズを有する一連のＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体を、様々な化学を使用して本開示の組換えポリペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約４０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール－プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ－酪酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ－コハク酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＳ）、ｍＰＥＧ－炭酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＣ）、ｍＰＥＧ－グルタル酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＧ）、ｍＰＥＧ－Ｎ－ヒドロキシル－スクシンイミド（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ－トレシレート、及びｍＰＥＧ－アルデヒドから選択される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬はポリエチレングリコールである。例えばＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した平均分子量２０，０００ダルトンのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した、平均分子量が約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した平均分子量が約４０ｋＤのポリエチレングリコールである。
従って、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、１つ又は複数のポリエチレングリコール部分で化学的に修飾、例えばＰＥＧ化されているか、又は同様の修飾、例えばＰＡＳ化されている．いくつかの実施形態において、ＰＥＧ分子又はＰＡＳ分子は、開示された組換えポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸側鎖に結合される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたポリペプチドは、１つのみのアミノ酸上のＰＥＧ又はＰＡＳ部分を含む。他の実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化ポリペプチドは、２つ又はそれ以上のアミノ酸上の、例えば２以上、５以上、１０以上、１５以上、又は２０以上の異なるアミノ酸残基に結合したＰＥＧ又はＰＡＳ部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＡＳ鎖は、２０００、２０００超、５０００、５，０００超、１０，０００、１０，０００超、１０，０００超、２０，０００、２０，０００超、及び３０，０００Ｄａである。ＰＡＳ化ポリペプチドは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介してＰＥＧ又はＰＡＳに（例えば連結基なしで）直接結合され得る。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤの範囲のポリエチレングリコールに共有結合される。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤの平均分子量であるポリエチレングリコールに共有結合される。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、平均分子量が約４０ｋＤのポリエチレングリコールに共有結合される。
部位特異的ＰＥＧ化部位の取り込み
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチド（例えばＩＬ－２２バリアント）は、例えば米国特許第７，０４５，３３７号；７，９１５，０２５号；Ｄｉｅｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４（２３）：５７４３－５７４５；Ｂｅｓｔ， Ｍ （２００９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（２８）： ６５７１－６５８４ に記載されているように、部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を促進する非天然のアミノ酸側鎖を有する非天然のアミノ酸の取り込みによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、例えば Ｄｏｚｉｅｒ ａｎｄ Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ （２０１５） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６（１０）： ２５８３１－２５８６４ に記載されているように、本開示の組換えポリペプチド内の種々の位置にシステイン残基を取り込んで、システイン側鎖を介して部位特異的ＰＥＧ化を促進することができる。
特定の実施形態において、本開示は、本開示の部位特異的ＰＥＧ化を可能にする１つ又は複数のアミノ酸（例えばシステイン又は非天然アミノ酸）の取り込みを含むＩＬ－２２バリアントポリペプチドを提供し、ここで、部位特異的ＰＥＧ化部位のためのアミノ酸置換は、ＩＬ－２２とＩＬ－２２受容体の成分、例えばＩＬ－１０Ｒβ又はＩＬ－２２Ｒ１との間の界面にはない。そのような場合、部位特異的アミノ酸修飾は、配列番号１又は配列番号６のアミノ酸残基４１～５８、９７～１１５、１２４～１３１以外のＩＬ－２２アミノ酸位置で取り込まれ、これらは、本明細書に記載の結晶構造において明らかにされたＩＬ－１０Ｒβ結合部位を包含する。上で考察したように、本開示の目的のためのすべてのアミノ酸の番号付けは、配列番号１（ヒトＩＬ－２２）又は配列番号６（マウスＩＬ－２２）に示されるＩＬ－２２タンパク質の前駆体ポリペプチド（又はプレタンパク質）配列に基づく。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１又は配列番号６の１つ又は複数の以下のアミノ酸位置４１～５８、９７～１１５、１２４～１３１の部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を可能にする部位特異的アミノ酸置換を含むＩＬ－２２バリアントポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２結合タンパク質（例えばＩＬ－１０Ｒβ又はＩＬ２２Ｒ１）と相互作用するＩＬ－２２バリアントの表面へのＰＥＧの結合により部位特異的ＰＥＧ化を使用して、ＩＬ－２２結合タンパク質（例えばＩＬ－１０Ｒβ又はＩＬ２２Ｒ１）によるＩＬ－２２の中和を調節又は除去することができる。ＩＬ－２２とＩＬ－２２結合タンパク質との間の相互作用に関与するＩＬ－２２内のそのようなアミノ酸残基の例には、特に限定されるものではないが、配列番号１又は配列番号６のアミノ酸残基５０～７３、１６６～１７６が含まれる。
部位特異的ＰＥＧ化部位の取り込み
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２タンパク質とＩＬ－１０Ｒβタンパク質との相互作用は、ＩＬ－２２界面の本明細書に記載のアミノ酸位置に部位特異的ＰＥＧ化を取り込むことによって調節することができる。配列番号１又は配列番号６のＤ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４９、Ｑ１１６、Ｒ１２４、及びＲ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基（すなわち、シグナルペプチドを欠く成熟ヒトＩＬ－２２タンパク質、すなわち配列番号３４又は配列番号３５の配列に従って番号付けした場合、残基Ｄ１０、Ｓ１２、Ｎ１３、Ｑ１６、Ｑ８３、Ｒ９１、及びＲ９５）に対応する１つ又は複数の位置における、部位特異的ＰＥＧ化を促進する非天然アミノ酸（又はシステイン残基）の取り込みは、ＩＬ－１０Ｒβタンパク質への調節された結合を有するＩＬ－２２バリアントポリペプチドを提供し、部分的アゴニスト活性を有するバリアントＩＬ－２２／ＩＬ－２２Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒβ受容体複合体をもたらす。ＰＥＧ分子が界面で取り込まれるような場合、ＩＬ－２２バリアントポリペプチドとＩＬ－１０Ｒβ又はＩＬ２２Ｒ１タンパク質との結合が完全に破壊されないように、従って活性が除去されないように、ＰＥＧは、典型的には、約１ｋＤａ、あるいは約２ｋＤａ、あるいは約３ｋＤａ、あるいは約４ｋＤａ、あるいは約５ｋＤａ、あるいは約６ｋＤａ、あるいは約７ｋＤａ、あるいは約８ｋＤａ、あるいは約９ｋＤａ、あるいは約１０ｋＤａから、あるいは約１２ｋＤａ、あるいは約１５ｋＤａ、あるいは約２０ｋＤａの低分子量ＰＥＧ種である。
製剤
本開示のＩＬ－２２バリアントポリペプチドは、そのようなＩＬ－２２バリアントポリペプチドの治療有効量を単独で又は１つ又は複数の追加の治療薬と組み合わせて、対象に投与することにより、炎症性疾患に罹患している哺乳動物対象における炎症性疾患を治療及び／又は予防するのに有用である。さらに、本開示は、そのようなＩＬ－２２バリアントポリペプチドの治療有効量を単独で又は１つ又は複数の追加の治療薬と組み合わせて、対象に投与することにより、炎症性疾患に罹患している哺乳動物対象における炎症性疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、特に限定されるものではないが、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び腸管の慢性炎症を特徴とする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の他の形態を含む、腸管（ＧＩ）の炎症性疾患の治療に有用である。クローン病は口から肛門までの腸管の領域に影響を与える可能性があるが、潰瘍性大腸炎は通常、大腸と直腸の炎症に関連している。
このような炎症性腸状態に対する従来の第一選択治療には、５－アミノサリチル酸が含まれ、必要に応じてコルチコステロイドと組み合わせて使用される。最近では、抗ＴＮＦアルファ抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ）、及びインテグリン受容体アンタゴニスト（例えばナタリズマブ、ベドリズマブ）、及びＩＬ２３アンタゴニスト（例えばウステキヌマブ）などの治療用タンパク質が開発されている。そのようなポリペプチドは慢性炎症性疾患の治療において顕著な有効性を提供するが、そのようなポリペプチドの従来の非経口（ＩＭ、ＩＶ、又はＳＱ）投与は、比較的少ない比率の薬剤で全身曝露をもたらす。これらの薬剤は炎症経路の特定の破壊を提供するが、非経口投与によるそのような薬剤への全身暴露は、免疫抑制を含む重大な全身的副作用と関連しており、結核、真菌感染症、尿路感染症、及びリンパ腫を含む、重大な生命にかかわる感染症に対する感受性が上昇する。そのような重大な全身毒性により、投与される薬剤の用量が制限され、その結果、影響を受けた組織が生物学的治療薬に最適に曝露されなくなる。
本開示のＩＬ－２２バリアントポリペプチドの選択的性質は、非経口投与された場合にそのような全身性副作用を軽減するが、場合によっては、腸管へのＩＬ－２２バリアントポリペプチドの直接投与を提供することが望ましい場合がある。
ＩＬ－２２バリアントポリペプチドの経口投与用製剤
本開示はさらに、哺乳動物対象における消化管の炎症性疾患を治療及び／又は予防する方法を提供し、この方法は、哺乳動物対象に、本開示のＩＬ－２２バリアントポリペプチドを含む組成物の治療的又は予防的に有効な量を、単独で又は１つ又は複数の追加の治療薬と組み合わせて投与することを含む。本開示はさらに、本開示のＩＬ－２２バリアントポリペプチドを含む経腸組成物を提供する。いくつかの実施形態において、経腸組成物は、ＩＬ－２２バリアントポリペプチドの医薬的に許容し得る製剤を含み、このような製剤は、上部ＧＩ管でのＩＬ－２２バリアントポリペプチドの分解に抵抗し、下部ＧＩ管で崩壊し、従って小腸、大腸、直腸、及び肛門を含む下部消化管へのＩＬ－２２バリアントポリペプチドの投与を促進し、及び特に限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎を含む下部消化管の炎症性疾患の治療を促進する。経口投与に適した例示的なポリペプチド製剤は当技術分野で公知であり、例えば Ｈａｍｍａｎ， ｅｔ ａｌ “Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇｓ” （２００５）． ＢｉｏＤｒｕｇｓ １９， １６５－１７７； Ｂｌｉｃｈｍａｎｎ， Ｐ． “Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ”（２０１２） に記載されている。すべての論文。１４８６。Ａｎｓｅｌｍｏ， ｅｔ ａｌ “Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ） （２０１９） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８， １９－４０ でレビューされた。
改変原核細胞の送達
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物対象の消化管にＩＬ－２２バリアントを投与するための方法を提供し、この方法は、対象に、組換え操作された原核細胞を含む医薬的に許容し得る組成物を投与する工程を含み、原核細胞は、１つ又は複数の発現制御配列に作動可能に連結された本開示のＩＬ－２２バリアントをコードする核酸配列を含み、従って、ＩＬ－２２バリアントは組換え原核細胞で発現され、及び組換え操作された原核細胞からの分泌又は溶菌によりＩＬ－２２バリアントは消化管に放出されるか、又は原核細胞の表面に提示される。ＩＬ－２２の投与のために組換え操作された細菌細胞の例は、Ｌｉｎ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２２． Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １６， １４８ （２０１７） で公知市。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２バリアントを発現する改変細菌細胞は、経口的に、典型的には水性懸濁液中で、又は経直腸的（例えば浣腸）に投与され得る。
腸内フローラへの原核ウイルスの送達
１つの実施形態において、本開示は、ＩＬ－２２バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え操作された原核生物ウイルス（例えばバクテリオファージ）を提供する。別の実施形態において、本開示は、哺乳動物対象の腸管の炎症性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、対象に、ＩＬ－２２バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え操作された原核生物ウイルス（例えばバクテリオファージ）の医薬的に許容し得る製剤の治療有効量を投与することを含み、核酸配列は、ウイルスの宿主原核細胞中で機能する１つ又は複数の発現制御配列に作動可能に連結されており、従って、原核ウイルスが原核細胞に感染すると、ＩＬ－２２バリアントが宿主細胞で発現されるようになる。１つの実施形態において、バクテリオファージは、感染後に細菌細胞の溶菌経路を誘導して、ＩＬ－２２バリアントの局所放出と腸粘膜へのＩＬ－２２バリアントの送達をもたらすような溶菌性ファージである。
本明細書で使用される用語「原核ウイルス」、「バクテリオファージ」、及び「ファージ」は、細菌に感染し細菌内で複製する様々な細菌ウイルスのいずれかを説明するために、本明細書では交換可能に使用される。広範囲の細菌細胞を選択できる多種多様なバクテリオファージが同定されており、科学文献で広く特性解析されている。バクテリオファージは、感染しやすい細菌細胞において顕著な選択性を示すため、バクテリオファージは、典型的には、発現のための腸内フローラの標的細菌を考慮して選択される。多種多様な細菌細胞のいずれかに対する組換え操作されたバクテリオファージの生成のための開始材料として適切なバクテリオファージの試料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．） から入手可能である。ファージゲノムの操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓから入手可能）に記載されているように当技術分野で公知の組換え核酸の標準的操作法に従って行われ、及び従来の試薬は、様々な実験室材料供給元から入手することができる。
感染部位へのＩＬ－２２バリアントの送達は、対象の腸内フローラの原核細胞に感染できるバクテリオファージによって行われ、このバクテリオファージは、組換え技術を使用して、ＩＬ２２バリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結された標的原核細胞において活性のあるプロモーターを含む発現カセットを導入するように修飾されており、発現カセットはバクテリオファージゲノムの非必須領域に挿入されているため、組換え操作されたバクテリオファージによる標的細菌細胞のトランスフェクション後に、ＩＬ２２バリアントポリペプチドが標的細菌細胞で発現される。例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）細胞を標的とするバクテリオファージの場合、発現カセットは黄色ブドウ球菌プロモーターを使用して、黄色ブドウ球菌特異的バクテリオファージの非必須領域に挿入されたＩＬ２２バリアントの発現を駆動するであろう。バクテリオファージゲノムの非必須領域の同定は、そのようなファージの既知のゲノム構成及びコード配列によって容易に同定される。多種多様な細菌で活性のある原核プロモーター配列は、当技術分野で周知である。プロモーター配列は、天然に存在する配列を切り出して、又は標的細菌細胞の天然に存在する原核プロモーター配列に対応する核酸配列の配列決定及び合成を通じて得ることができる。例えば Ｅｓｔｒｅｍ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ： Ｓｕｂｓｉｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＵＰ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ； Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３（１６）： ２１３４－２１４７ を参照されたい。
コドン最適化
ＩＬ－２２バリアントのアミノ酸配列及び対応するコード核酸配列は本明細書に提供され、核酸配列は、遺伝子コードの縮重に基づいて当業者によって生成され得る。本発明の１つの実施形態において、ＩＬ－２２バリアントの哺乳動物配列は、細菌細胞標的環境での発現のために、発現のために最適化されたコドンを使用することにより最適化される。細菌細胞発現に最適な好ましいコドンを使用してＩＬ－２２バリアントをコードする合成核酸配列を構築するための技術は、バクテリオファージゲノムの天然タンパク質をコードするためのコドン使用及びそれらの相対的存在量の共通性を、当技術分野で周知されている技術により解析するコンピューターによる方法によって決定することができる。細菌環境におけるコドン最適化配列の生成には、コドン使用データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）を使用することができる。さらに、ある生物の配列を異なる宿主生物の最適なコドン使用に変換するためには、種々のソフトウェアツール、例えば ＪＣａｔ Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ （ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ）， Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ） 又は Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ ｏｎｌｉｎｅ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ （ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ） を利用することができる。このような合成配列は、合成核酸分子を構築するための当技術分野で周知されている技術によって構築することができ、様々な商用販売業者から入手することができる。
ファージベクターのＰＡＭモチーフの削除
いくつかの実施形態において、腸内細菌叢における組換えベクターからのＩＬ－２２ポリペプチドの発現を促進するために、本発明の組換え原核ベクターを修飾して、細菌宿主細胞の防御機構を回避又は阻害することができる。細菌宿主は、ファージを不活性化する二本鎖ＤＮＡ切断を導入するＣａｓ９エンドヌクレアーゼなどのバクテリオファージ感染を防ぐための防御機構を発達させてきた。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはゲノムを調査して、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡに結合するために不可欠なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を特定する。ＰＡＭ配列はＣａｓ９機能に不可欠であるため、原核ウイルスからＣａｓ９配列を除去すると、対象の腸内細菌叢に内在するＣａｓ９エンドヌクレアーゼがＩＬ－２２バリアントをコードする侵入ファージを中和する能力が、最小限に抑えられる。
ＩＬ－２２バリアントポリペプチドを発現する改変制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
いくつかの実施形態において、本開示はさらに、組換え操作されたＴｒｅｇ細胞を提供する。Ｔｒｅｇは発現カセットを含み、発現カセットは、シグナルペプチドを任意選択的に含む、ＩＬ２２バリアントをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、シグナルペプチドと結合している時に任意選択的に分泌された形態で、ＩＬ２２バリアントをコードする核酸配列の転写及び翻訳を指令することができる、Ｔｒｅｇ細胞において機能する発現制御配列に作動可能に連結されている。本明細書で使用される「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」という用語は、特に限定されるものではないが、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含む他のＴ細胞の応答を抑制することができるタイプのＣＤ４＋Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット（ＣＤ２５）、及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現によって特性解析される（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２， ５３１－６２ （２００４））。改変Ｔｒｅｇ細胞及びその調製プロセスは当技術分野で周知されている。例えば Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｒｅ ｗｅｌｌ ｋｎｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ． Ｓｅｅ， ｅ．ｇ． ＭｃＧｏｖｅｒｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ （２０１７）． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：１５１７； Ｓｃｏｔｔ， Ｄ． Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ （２０２０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６：１０３）、及び Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ （２０１８） Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２（９）：２３５）に記載されているＣＡＲ Ｔｒｅｇを含む。
ウイルスベクターを介したＩＬ－２２の投与
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２２バリアントは、ＩＬ－２２バリアントをコードする核酸配列を含む発現ベクターを哺乳動物対象に接触させることによって、対象に投与され得る。発現ベクターはウイルスベクターでも非ウイルスベクターでもよい。「非ウイルスベクター」という用語は、自律的に複製する染色体外環状ＤＮＡ分子であって、正常なゲノムとは異なり、標的細胞におけるコード配列の発現をもたらすことができる非選択的条件下での細胞生存に必須ではない分子を指す。プラスミドは、非ウイルスベクターの例である。標的細胞のトランスフェクションを促進するために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取り込みを促進する条件下で、非ウイルスベクターに直接曝露することができる。哺乳動物細胞による外来核酸の取り込みを促進する条件の例は、当技術分野で周知されており、特に限定されるものではないが、化学的手段（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）， Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、高塩分、磁場（電気穿孔法）が含まれる。
１つの実施形態において、非ウイルスベクターは、非ウイルス送達系で提供され得る。非ウイルス送達系は典型的には、核酸カーゴを有する標的細胞の形質導入を促進するための複合体であり、核酸は、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）、界面活性剤、生物学的物質（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁性鉄）、及び合成ポリマー（ＰＬＧ、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ）などの物質と複合体を形成する。非ウイルス送達系の多数の実施形態が当技術分野で周知されており、脂質ベクター系（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４：１７３－２０６）；ポリマー被覆リポソーム（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，２１３，８０４号， １９９３年５月２５日発行；Ｗｏｏｄｌｅ， ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，０１３，５５６号， １９９１年５月７日発行）；カチオン性リポソーム（Ｅｐａｎｄ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，２８３，１８５号、１９９４年２月１日発行；Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．Ａ．， 米国特許第５，５７８，４７５号、１９９６年１１月２６日発行；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，２７９，８３３号、１９９４年１月１８日発行；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，３３４，７６１号、１９９４年８月２日発行）が含まれる。
別の実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであってもよい。本明細書で使用する用語ウイルスベクターは、通常の意味で使用され、タンパク質合成又はエネルギー生成メカニズムを持たない偏性細胞内寄生体のいずれかを指し、一般に、外因性導入遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために使用されるエンベロープを持つか又はエンベロープを持たない動物ウイルスのいずれかを指す。ウイルスベクターは、複製能あり（例えば実質的に野生型）、条件付き複製能あり（特定の条件下で複製するように改変）、又は複製能なし（ウイルスの欠失機能を補完できる細胞株の非存在下では、実質的に複製できない）であり得る。ウイルスベクターは、それを「選択的に複製する」ように、すなわち、特定の細胞型又は表現型の細胞状態、例えば癌性で、優先的に複製するように、特定の修飾を有することができる。本発明の実施に有用なウイルスベクター系には、例えば天然又は組換えウイルスベクター系が含まれる。本発明の実施に有用なウイルスの例には、組換えにより修飾されたエンベロープ化された又はエンベロープ化されていないＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。例えばウイルスベクターは、ヒト又はウシのアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス）、シンドビスウイルス、及びレトロウイルス（特に限定されるものではないが、ラウス肉腫ウイルスを含む）、及びＢ型肝炎ウイルスのゲノムに由来し得る。典型的には、目的の遺伝子をそのようなベクターに挿入して、典型的にはウイルスゲノム配列を用いて遺伝子構築物のパッケージングを可能にし、続いて感受性宿主細胞を感染させて目的の遺伝子を発現させる。
追加のポリペプチド治療薬との併用療法を容易にするために、発現ベクターは、ＩＬ２２バリアントポリペプチドに加えて、１つ又は複数のポリペプチドをコードし得る。本発明の実施におけるように複数のポリペプチドを発現する場合、各ポリペプチドは発現制御配列（モノシストロン性）に作動可能に連結されてもよく、又は複数のポリペプチドが単一の発現制御配列の制御下で発現されるポリシストロン性構築物によってコードされてもよい。１つの実施形態において、ターゲティング抗原をコードする発現ベクターは、任意選択的に、１つ又は複数の免疫学的モジュレーターをさらにコードすることができる。本発明の実施に有用な免疫学的モジュレーターの例には、特に限定されるものではないが、サイトカインが含まれる。発現されたサイトカインは、細胞内発現に向けられるか、又は細胞外提示又は分泌のためのシグナル配列とともに発現され得る。
発現ベクターは、任意選択的に、「レスキュー」遺伝子をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供することができる。「レスキュー遺伝子」は核酸配列であり、その発現は、細胞を外的要因による死滅に対して感受性にするか、又は細胞の毒性状態を引き起こし、従って細胞が死滅する。レスキュー遺伝子を提供すると、形質導入された細胞の選択的な細胞死滅が可能になる。従って、レスキュー遺伝子は、形質導入細胞の望ましくない拡散又は複製可能なベクター系の影響を防ぐために、構築物が哺乳動物対象の細胞に取り込まれる場合、追加の安全対策を提供する。１つの実施形態において、レスキュー遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（例えば、Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，６３１，２３６号、１９９７年５月２０日発行、及びＦｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，６０１，８１８号、１９９７年２月１１日発行、を参照）であり、ここで、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的死滅を受けやすい。
開示の方法
本明細書に記載の治療用組成物、例えば組換えポリペプチド、ＩＬ－２２ポリペプチドバリアント、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物のいずれか１つを投与して、癌及び慢性感染症のような関連疾患の治療において患者を治療することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ＩＬ－２２ポリペプチドバリアント、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物は、ＩＬ－２２シグナル伝達に関連する１つ又は複数の自己免疫疾患又は状態に、罹患しているか、罹患している疑いがあるか、又は状態を発症するリスクが高い可能性がある個体を、治療する方法で使用するための治療薬に取り込むことができる。例示的な自己免疫疾患又は状態には、特に限定されるものではないが、癌、免疫疾患、及び慢性感染症が含まれる。いくつかの実施形態において、個体は医師の管理下にある患者である。
従って、１つの態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための方法に関し、この方法は以下の１つ又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む：（ａ）本開示のポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、この方法は、本開示の組換えポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象における状態の治療のための方法に関し、この方法は、以下の１つ又は複数を含む組成物を対象に投与することを含む：（ａ）本開示のポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示の医薬組成物。いくつかの実施形態において、この方法は、本開示の組換えポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、開示された医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。本開示の組換えポリペプチドは、経口又は吸入により投与され得るが、非経口経路により投与される可能性が高い。非経口投与経路の例には、例えば静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口投与に使用される溶液又は懸濁液には、次の成分が含まれ得る：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又はその他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩、及び張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば一塩基性及び／又は二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、又は水酸化ナトリウムを用いて（例えば約７．２～７．８、例えば７．５のｐＨに）調整することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与バイアルに封入することができる。
本開示のそのような対象組換えポリペプチドの投与量、毒性、及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的操作によって、例えばＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ50（集団の５０％で治療効果のある用量）について、決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が一般的に適している。毒性の副作用を示す化合物が使用されることがあるが、、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意して、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、従って副作用を軽減する必要がある。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲を調製する際に使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるＩＣ50（例えば症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように調製され得る。このような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本開示の対象組換えポリペプチドの治療有効量（例えば有効用量）は、選択されるポリペプチドに依存する。例えば約０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の単回用量を投与することができる。いくつかの実施形態において、約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇを投与することができる。いくつかの実施形態において、６００，０００ＩＵ／ｋｇが投与される（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイによって決定することができ、国際単位（ＩＵ）で表される）。組成物は、１日１回以～週１回以上まで（１日おきに１回を含む）投与することができる。当業者は、特に限定されるものではないが、疾患の重症度、以前の治療、一般的な健康状態及び／又は対象の年齢、及び他の存在する疾患を含む、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与える特定の要因を理解するであろう。さらに、本開示の対象組換えポリペプチドの治療有効量による対象の治療は、一回の治療又は一連の治療を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、８時間ごとに５日間投与、続いて２～１４日間、例えば９日間の休止期間、続いて８時間ごとに５日間投与される。
対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又はそれを必要とする対象における状態の治療のための、開示された方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドを含む組成物と比較して、対象において組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達を付与する。実施例でより詳細に記載されるように、本開示の例示的なＩＬ－２２ポリペプチドバリアントである２２－Ｂ３は、インビボで組織選択的シグナル伝達応答を誘発し、膵臓及び結腸ではＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニストとして作用するが、皮膚及び肝臓では中立的なアンタゴニストとして作用する。特に２２－Ｂ３バリアントは、皮膚、肝臓、及び結腸で、炎症メディエーターを誘発することなくＩＬ－２２の組織保護機能をインビボで保持し、こうしてＩＬ－２２の主要な組織保護機能と炎症促進機能を切り離す。従っていくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－２２ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらし、これは、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を伴うが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
従って、いくつかの実施形態において、投与された組成物は、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を伴う組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらすが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達は、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、例えばＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３のリン酸化によって決定すると、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドを含む組成物と比較して、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ１リン酸化の少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の低下を含む。いくつかの実施形態において、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、ＳＴＡＴ３リン酸化の少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の低下を含む。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、１つ又は複数のＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらす。ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の非限定的な例には、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員が含まれる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定すると、約２０％～約１００％低下している。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、炎症促進性遺伝子の発現を誘導するポリペプチドの能力によって決定すると、１つ又は複数のＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらす。炎症促進性遺伝子の非限定的な例には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６が含まれる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能は、アミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２０と比較して、約２０％～約１００％、例えば約２０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約４０％～約８０％、約３０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、又は約３０％～約１００％低下している。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。ＳＴＡＴ３介在機能の例には、特に限定されるものではないが、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存が含まれる。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、Ｒｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１０、ＢＣＬ－２、サイクリン－Ｄ、クローディン－２、ＬＣＮ２、又はβ－ディフェンシンなどのバイオマーカーの発現を誘導するポリペプチドの能力によって決定すると、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下をもたらすが、そのＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、約１：１．５～約１：１０、例えば約１：２～約１：５、約１：２～約１：７、約１：３～約１：８、約１：４～約１：１０、約１：４～約１：９、又は約１：４～約１：８の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達対ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比率をもたらす。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、約１．５～３．２の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達対ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比率をもたらす。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ１シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ３シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象においてＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６から選択される炎症促進性遺伝子の発現を誘導する能力の低下を付与する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象においてＲｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１０、ＢＣＬ－２、サイクリン－Ｄ、クローディン－２、ＬＣＮ２、及びβ－デフェンシンから選択される遺伝子の発現を誘導する能力を実質的に保持している。いくつかの実施形態において、医薬組成物の投与は、対象におけるＴ細胞活性を阻害しない。
いくつかの実施形態において、投与された組成物は、上皮保護及び再生を増強する。
いくつかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾癬性関節炎、糖尿病性足潰瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は急性膵炎である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ＩＬ－２２媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある。
追加の治療法
上述のように、本明細書に記載の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、細胞培養物、及び／又は医薬組成物のいずれか１つを、例えば免疫抑制性物質、免疫抑制剤又は抗炎症剤剤などの１つ又は複数の追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。１つ又は複数の追加の治療薬と「組み合わせた」投与には、同時（同時）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の追加の治療薬、免疫抑制剤、又は抗炎症剤は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、手術、及び疾患改変性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）からなる群から選択される。様々な種類の抗炎症剤を使用することができる。非限定的な例には、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン受容体アンタゴニスト、可溶性受容体、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、キナーゼ阻害剤、Ｓ１Ｐアゴニスト、及びＰＤＥ４アンタゴニストが含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、炎症性免疫応答を抑制する組成物、例えば抗炎症剤の投与をさらに含む。適切な抗炎症剤には、特に限定されるものではないが、ＴＮＦアンタゴニスト（例えばアダリムマブ、インフリキシマブ）、ＩＬ－２３アンタゴニスト（例えばウステキヌマブ）、ＩＬ－１７アンタゴニスト（例えばセクキヌマブ）、ＩＬ－１アンタゴニスト（例えばアナキンラ）、ＩＬ－６アンタゴニスト（例えばトシリズマブ）、ＩＬ－１２アンタゴニスト（例えばウステキヌマブ）、ＩＬ－２アンタゴニスト（例えばダクリズマブ）、インテグリンアンタゴニスト（例えばベドリズマブ）、コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、アミノサリチル酸塩（例えばメサラミン、バルサアジド、オルサラジン）、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、クロロキン、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン、タクロリムス）、アバタセプト、リツキシマブ、ＪＡＫ阻害剤（例えばトファシチニブ）、ＰＤＥ４阻害剤（例えばアプレミラスト）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えばシロリムス）、Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト（例えばオザニモド）が含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、Ｗｎｔアゴニスト又はノッチアゴニストなどの組織再生因子を含む組成物の投与をさらに含む。
従って、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、組成物は、第１の治療として個別に、又は第２の治療と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療は、ＤＭＡＲＤ、免疫療法、ホルモン療法からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は付随して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は、第２の治療と同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、連続して施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は、第２の治療の前に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は、第２の治療の後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療は、第２の治療の前及び／又は後に施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、ローテーションで施される。いくつかの実施形態において、第１の治療と第２の治療は、単一の製剤で一緒に施される。
キット
また、本明細書に提供及び記載されるＩＬ－２２部分アゴニスト、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物、並びにそれらを作製及び使用するための説明書を含むキットも、本明細書に提供される。例えば本明細書では、いくつかの実施形態において、以下の１つ又は複数を含むキットが提供される：本開示の組換えポリペプチド、本開示のＩＬ－２２部分アゴニスト、本開示の組換え核酸、本開示の組換え細胞、又は本開示の医薬組成物、及びそれらの使用説明書。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、提供された組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物のうちの任意の１つを個体に投与するために使用される１つ又は複数の注射器（プレフィルドシリンジを含む）及び／又はカテーテル（プレフィルドシリンジを含む）、及びそれらの使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ又は複数の追加の治療薬を有することができ、治療薬は、所望の目的のために、例えば細胞の活性を調節するために、標的癌細胞を阻害するために、又はそれを必要とする個体の疾患を治療するために、他のキット成分と同時に又は連続して投与することができる。
上述のキットのいずれも、１つ又は複数の追加の試薬をさらに含むことができ、そのような追加の試薬は以下から選択することができる：希釈緩衝液、復元溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター、陰性対照ポリペプチド、陽性対照ポリペプチド、組換えポリペプチドのインビトロ産生のための試薬。いくつかの実施形態において、キットの成分は別々の容器に入れることができる。いくつかの他の実施形態において、キットの成分は単一の容器で一緒にすることができる。例えば本開示のいくつかの実施形態において、キットは、１つの容器（例えば無菌ガラス又はプラスチックバイアル）内に、本明細書に記載の組換えＩＬ－２２ポリペプチド、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物の１つ又は複数、及び別の容器（例えば滅菌ガラス又はプラスチックバイアル）中にさらなる治療薬を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法を実施するために、キットの成分の使用説明書をさらに含むことができる。例えばキットは、キット中の医薬組成物及び剤形に関する情報を含む添付文書を含むことができる。一般に、そのような情報は、患者及び医師が、同封の医薬組成物及び剤形を効果的かつ安全に使用するのに役立つ。例えば本開示の組み合わせに関する以下の情報を添付文書に提供することができる：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメーター、適応症及び使用法、禁忌、警告、注意事項、有害反応、過剰投与、適切な用量及び投与方法、供給方法、適切な保管条件、参考文献、製造業者／販売業者の情報、及び知的所有権情報。
いくつかの実施形態において、キットは、方法を実施するためにキットの成分を使用するための説明書をさらに含むことができる。方法を実施するための説明書は、一般に適切な記録媒体に記録される。例えば使用説明書は、紙やプラスチックなどの基材に印刷することができる。使用説明書は、添付文書としてキット内に、キット又はその成分の容器のラベル（例えばパッケージ又は部分パッケージに関連している）などに存在し得る。説明書は、適切なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスク、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在し得る。場合によっては、実際の説明書はキットに含まれていないが、リモートソースから（インターネット経由などで）説明書を取得する手段が提供され得る。この実施形態の例はウェブアドレスを含むキットであり、ここでは、説明書を見ることができ、及び／又はそこから説明書をダウンロードすることができる。説明書と同様に、説明書を取得するためのこの手段は、適切な基板に記録することができる。
本開示で言及されたすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が、参照により取り込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に参考文献が引用されていることは、先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の議論は、その著者が主張していることを述べているのであり、本出願人は、引用された文書の正確性と妥当性に異議を唱える権利を留保する。本明細書では、科学雑誌の記事、特許文書、及び教科書を含む多くの情報源が言及されているが、この参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。
本明細書における一般的な方法の議論は、例示のみを目的とするものである。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、それらは本出願の精神及び範囲内に含まれるものである。
本発明の実施は、特に他に明記しない限り、当業者に周知されている分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。このような手法は、以下の文献に詳細に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｗ． （２０１２）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （４ｔｈ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及び Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． Ｗ． （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （一緒に“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”と呼ぶ）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． （１９８７）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ （２０１４年までの増刊を含む）； Ｂｏｌｌａｇ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ； Ｈｕａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ， Ｉ． （１９９７）． Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ： Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｄｏｙｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ； Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ． Ｂ．， Ｆｅｒｒｅｅ， Ｆ． ＆ Ｇｉｂｂｓ， Ｒ． （１９９４）． ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｂｏｓｔｏｎ： Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ； Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， Ｅ． Ａ． （２０１４）． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．）． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ， （２０１４年までの増刊を含む）；及び Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ． Ｃ． （２００３）． Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ＮＬ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．（これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれる）。
追加の実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示されるが、これらは例示として提供され、決して本開示又は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
一般的な実験手順
タンパク質の産生と精製
酵母結合試験及び親和性成熟のために、マウスＩＬ２２Ｒ１（１６～２２８）及びＩＬ１０Ｒβ（２０～２２０）のＥＣＤを、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチド、Ｃ末端３Ｃ切断部位、続いてビオチンアクセプターペプチドタグ（ＢＡＰタグ、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷ、配列番号：３３）、及び６ｘＨｉｓタグを有するｐＡｃＧＰ６７ａバキュロウイルスベクターにクローニングした。バキュロウイルス保存株は、バキュロサファイア（ＢａｃｕｌｏＳａｐｐｈｉｒｅ）ＤＮＡ（Ｏｒｂｉｇｅｎ）及びｐＡｃＧＰ６７－Ａ ＤＮＡをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）に同時トランスフェクションして調製した。次に、ウイルスを使用してイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｈｉ５）細胞を感染させた。感染の４８時間後にバキュロウイルス感染Ｈｉ５細胞の上清からタンパク質を精製し、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ）でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。タンパク質をヘペス緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で維持した。ＩＬ１０Ｒβ ＥＣＤを、Ｃ末端ＢＡＰタグでＢｉｒＡリガーゼを使用して部位特異的にビオチン化し、サイズ排除クロマトグラフィーによって再精製した。
結晶学的試験のために、親和性成熟ＩＬ－２２の完全グリコシル化Ｓｕｐｅｒ－２２ｂ及び糖変異体（ｇｌｙｃｏｍｕｔａｎｔ）Ｓｕｐｅｒ－２２ａバージョン、並びに糖変異体バージョンＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０ＲβＥＣＤの（図８Ａ）を、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチドとＣ末端６ｘＨｉｓタグとを有するｐＡｃＧＰ６７ａバキュロウイルスベクターにクローニングし、発現させ、上記のように精製した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ）でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＳＥＣ後、個々のタンパク質をモル比１：１：１．２のＩＬ－２２：ＩＬ２２Ｒ１：ＩＬ１０Ｒβで、カルボキシペプチダーゼＡ及びＢの存在下で一晩インキュベートした後、Ｓ２００カラム（ＧＥ）でＳＥＣにより精製した。
シグナル伝達実験のために、マウスＩＬ－２２バリアントを、Ｎ末端ＨＡシグナルペプチドとＣ末端６ｘＨｉｓタグとを含むｐＤ６４９哺乳動物発現ベクターにクローニングした。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、ＤＮＡを一時的にＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、細胞上清を採取し、タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）で、次にＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でヘペス緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、３０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で精製した。インビボ試験では、ＮｏＥｎｄｏＨＣ Ｃｏｌｕｍｎキット（Ｐｒｏｔｅｕｓ）を使用してエンドトキシンを除去し、エンドトキシンの除去を Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｑｕａｎｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して確認した。
酵母ディスプレイ、ライブラリ組立、及び親和性成熟
Ｃ末端Ｍｙｃタグを含有するマウスＩＬ－２２（残基３４～１７９）を、ｐＣＴ３０２ベクターを使用して、Ａｇａ２へのＣ末端融合体としてエス・セレビッシェ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００株の表面に提示した。縮重コドン（ＮＮＫ）を使用するプライマー組立ＰＣＲによって、予想されるＩＬ１０Ｒβ接触部位に６つのランダム化残基を含む変異型ｍＩＬ－２２ライブラリを作成した。酵母ライブラリーの電気穿孔、レスキュー、及び拡張を、既に記載されているように実行した（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。最終ライブラリーは、約６．５×１０8個の酵母形質転換体を含有した。
ライブラリーの選択は、既に記載されたように、いくつかの修飾を加えて行った。簡単に述べると、最初の選択（ラウンド１～４）は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を使用して行った。ラウンド１及び２では、それぞれ５×１０9個及び１×１０8個の細胞を１μＭ ｍＩＬ２２Ｒ１中で予備インキュベートし、４００ｎＭビオチン化ＩＬ１０Ｒβで予備コートした常磁性ストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で選択した。ＩＬ１０Ｒβ結合クローンをＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離した。ラウンド３では、１．０×１０8個の酵母を１μＭ ｍＩＬ２２Ｒ１で予備インキュベートし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７に結合したストレプトアビジンで標識した５００ｎＭ単量体ビオチン化ＩＬ１０Ｒβで染色及び選択した。ＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を抗Ｃｙ５／抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７ マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と組み合わせて使用して、ＩＬ１０Ｒβ結合クローンを単離した。ラウンド４及び５では、２色蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してライブラリー選択を実行し、細胞表面でのタンパク質発現により見かけの親和性を標準化した。酵母ライブラリーを、１μＭ ｍＩＬ２２Ｒ１、続いて１００ｎＭ及び１０ｎＭのビオチン化ｍＩＬ１０Ｒβを、それぞれラウンド４及び５で用いて予備インキュベートした。細胞をＰＢＥ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ｍＩＬ１０Ｒβ結合）及び抗ｃ－Ｍｙｃ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ｍＩＬ－２２バリアント細胞表面発現）を用いて４℃で１５分間、同時標識した。Ａｌｅｘａ６４７+Ａｌｅｘａ４８８+酵母を、ＳＨ８００Ｓセルソーター（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して精製した。選択の最後に、各ラウンドの選択後ライブラリーを同時に拡張し、異なる濃度のビオチン化ｍＩＬ１０Ｒβとともに４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＥで２回洗浄し、次に蛍光標識ストレプトアビジンで４℃で１０分間染色して、フローサイトメトリーにより高親和性クローンの濃縮を評価した。さらに、１００μＬのラウンド５後のライブラリを使用して、製造元の説明書に従って、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してライブラリＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをＤＨ５α大腸菌に形質転換し、播種して個々のクローンの配列を決定した。
相対的な結合親和性を測定するために、個々のクローンを酵母表面に提示し、１μＭのｍＩＬ２２Ｒ１及び漸増濃度のビオチン化ｍＩＬ１０Ｒβとともにインキュベートした。次に、細胞をストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７で１５分間染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
結晶化、データ収集、及び精製
精製後、ＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ハンギングドロップ蒸気拡散によって、０．２Ｍ酒石酸カリウムナトリウム、１５％ＰＥＧ３３５０、及び０．１Ｍヘペス、ｐＨ７．８を含む等量のリザーバー溶液と混合した１μｌのタンパク質を用いて２０℃で、完全グリコシル化「Ｓｕｐｅｒ－２２ｂ」複合体の結晶を成長させた。続いてこれらの結晶を、１μｌの糖変異体「Ｓｕｐｅｒ－２２ａ」複合体を含むハンギングドロップに微量接種し、等量の０．２Ｍ酒石酸ナトリウムカリウム、１２．５％ＰＥＧ３３５０、及び０．１Ｍヘペス、ｐＨ８．０と２０℃で混合した。結晶を採取し、２５％グリセロールを含む母液で凍結保護した。
回折データは、先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ））ビームライン２３１Ｄ－Ｂで収集された。２．６Åのデータセットは、ＸＤＳを使用して積分、及びスケーリングした（Ｋａｂｓｃｈ， ２０１０）後、対称性に関連する反射をａｉｍｌｅｓｓでマージした（Ｅｖａｎｓ， ２０１１； Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。フェーズは、ヒトＩＬ－２２、ＩＬ－２２Ｒ１（ＰＤＢ ＩＤ：３ＤＧＣ）及びＩＬ１０Ｒβ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＱＭ）の結晶構造を検索モデルとして使用して、Ｐｈａｓｅｒ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７）を用いる分子置換によって解決された。モデル構築は、Ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８）での逆空間リファインメントの反復ラウンドと、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）での手動モデル構築を使用して実行された。すべてのデータ処理工程は、ＳＢｇｒｉｄ（Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）を通じて提供されたプログラムを使用して実行された。データ収集とリファインメントのための統計量を以下の表３に示す。タンパク質－タンパク質及びタンパク質－リガンドの界面は、ＰＤＢｅＰＩＳＡを使用して解析された（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉｃｋ， ２００７）。すべての構造図は ＣｈｉｍｅｒａＸを使用して作成された（Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。
Figure 2023521867000004
細胞培養
ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）、Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４６９）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）、及びＥＣ４（Ｄ． Ｆｅｌｓｈｅｒからの寄贈）細胞はすべて、１０％ｖ／ｖ 胎児牛血清、ペニシリン－ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｎＭヘペス、及び２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補足したＤＭＥＭ（ダルベッコー改変イーグル培地）で増殖させた。細胞は、５％ＣＯ２で３７℃に維持された。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を無血清Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ）で増殖させ、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。
ホスホフローシグナル伝達アッセイ
ＨＴ－２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、野生型又は変異型ＩＬ－２２で３７℃で２０分間刺激した後、パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温で１０分間固定した。細胞を氷冷メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて－２０℃で３０分間処理することにより、細胞内染色のための透過処理をした。次に細胞を、１：５０希釈の所望の抗体と共に、室温で１時間、ａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中でインキュベートした。刺激されていない試料のバックグラウンド蛍光を、すべての試料から差し引いた。ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、データを取得した。ＭＦＩ値は、各実験内の最大ＷＴ ＩＬ－２２値に標準化され、Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）でプロットした。「シグモイド用量反応」解析を使用して、用量応答曲線を作成した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８マウス抗Ｓｔａｔ１（ｐＹ７０１）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７マウス抗Ｓｔａｔ３（ｐＹ７０５）抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ から購入した。
免疫沈降とウエスタンブロット
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるシグナル伝達及び免疫沈降実験のために、０．６×１０6個の細胞を、フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコーティングされた６ウェル培養皿に播種した。２４時間後、細胞を、ＦｕＧｅｎｅ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＨＡタグ付きＩＬ２２Ｒ１、野生型又はＹｔｏＦ変異型体を含むｐＬＶ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏベクターでトランスフェクトした。
トランスフェクションの４８時間後、細胞をＩＬ－２２（野生型又は変異型）で３７℃で２０分間処理した。次に、細胞を氷冷ＰＢＳで１回すすぎ、直ちにトリトン溶解緩衝液（１％トリトン、２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１錠のＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、及び１錠のＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）（緩衝液１０ｍｌあたり））で溶解した。細胞溶解物を、微量遠心分離機で４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより清澄化した。抗ＨＡ免疫沈降のために、磁性抗ＨＡビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を溶解緩衝液で３回洗浄した。次に、２０マイクロリットルの抗ＨＡビーズを清澄化した細胞溶解物に添加し、４℃で２時間回転させながらインキュベートした。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄した。免疫沈降したタンパク質と細胞溶解物を、ＳＤＳ試料緩衝液を加えて５分間煮沸することで変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、イムノブロッティングで分析した。
ウエスタンブロットベースのシグナル伝達アッセイのために、ＨＴ－２９細胞（１×１０6細胞／ウェル）、ＨｅｐＧ２細胞（０．６×１０6細胞／ウェル）、及びＰａｎｃ－１細胞（０．６×１０6細胞／ウェル）を、６ウェル培養皿に播種した。２４時間後、細胞をＩＬ－２２（野生型又は変異型）で３７℃で２０分間処理し、溶解物を調製し、上述したように分析した。
インビボシグナル伝達、ＲＴ－ＰＣＲ、及び血清分析
インビボのシグナル伝達実験のために、Ｃ５ＢＬ／６Ｊマウスに、２００μＬのＰＢＳ又はＩＬ－２２バリアント（２００μｇ／マウス）を腹腔内注射で投与した。３０分後、マウスを安楽死させ、膵臓、結腸、肝臓、及び尾の皮膚組織を単離し、液体窒素で急速冷凍した。組織を乳鉢と乳棒で液体窒素中で破壊し、５０ｍｇの組織を、１０ｍＬあたり１錠のＰｈｏｓＳＴＯＰ （Ｒｏｃｈｅ）と１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補足した氷冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）で溶解した。ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）による遠心分離によって、溶解物をさらにホモジナイズした。特定の組織の各試料のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって標準化された後、ＳＤＳ試料緩衝液で変性され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離され、免疫ブロットによって分析された。
マウス組織における遺伝子発現分析のために、Ｃ５ＢＬ／６Ｊマウスに、２００μＬのＰＢＳ又はＩＬ－２２バリアント（２００μｇ／マウス）を腹腔内注射で投与した。６時間後、マウスを安楽死させ、組織を上述したように処理及びホモジナイズした。製造元の説明書に従って、ＲＮＡｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、各組織からＲＮＡを分離した。ｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）によるｃＤＮＡ生成のために、各試料に１μｇのＲＮＡを使用した。相対的な遺伝子発現は、比較Ｃｔ法を使用するＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎベースの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定され、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化された。すべての試料は３重測定された。以下のマウスｑＰＣＲプライマーが設計され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文した。
ＧＡＰＤＨ：５’ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＡＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＡＧ３’ （配列番号１５）、及び ５’ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＧＧ ＴＧＴ Ｇ３’ （配列番号１６）。
ＩＬ２２Ｒ１：５’ＣＴＣ ＧＴＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＣＣ Ｔ３’ （配列番号１７）、及び ５’ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＴＡ Ｇ３’ （配列番号１８）。
ＩＬ１０Ｒβ：５’ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＡＧ ＧＡＴ３’ （配列番号１９）、及び ５’ＡＣＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＴ３’ （配列番号２０）。
Ｒｅｇ３β：５’ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ３’ （配列番号２１）、及び ５’ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＣＣＴ３’ （配列番号２２）。
Ｒｅｇ３ｇ：５’ＧＡＴ ＴＣＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＧＡ ＴＧＴ３’ （配列番号２３）、及び ５’ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＴＧ３’ （配列番号２４）。
ＭＵＣ１：５’ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＣＴＧ３’ （配列番号２５）、及び ５’ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＧＴＧ ＡＡＴ ＡＣＣ３’ （配列番号２６）。
ＣＸＣＬ１： ５’ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ３’ （配列番号２７）、及び ５’ＣＣＡ ＡＡＣ ＣＧＡ ＡＧＴ ＣＡＴ ＡＧＣ ＣＡ３’ （配列番号２８）。
ＩＬ－６：５’ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴ３’ （配列番号２９）、及び ５’ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＧＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＡＧ Ａ３’ （配列番号３０）。
ＩＬ－１β：５’ＣＴＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＧＣ ＴＧ３’ （配列番号３１）， ５’ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＣ Ｇ３’ （配列番号３２）。
急性期応答タンパク質の血清分析のために、Ｃ５ＢＬ／６Ｊマウスに、２００μＬのＰＢＳ又はＩＬ－２２バリアント（マウス１匹あたり２μｇ又は２００μｇ）を腹腔内注射により投与した。２４時間後、心臓穿刺によって血液を得て、２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離することによって血清を分離した。ＳＡＡ－１／２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びハプトグロビン（Ｒ＆Ｄ）のレベルを、製造元の説明書に従ってＥＬＩＳＡによって測定した。各試料は３重測定された。
急性膵炎モデル
１００μｌのセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を１時間に１回、６時間注射することにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに急性膵炎を誘発した。対照マウスには、同じ時点で１００μｌのＰＢＳを注射した。マウスは、最初のセルレイン注射の２０時間前と２時間前に、ＰＢＳ又は５０μｇ／マウスのＩＬ－２２（野生型又は２２－Ｂ３）を腹腔内注射して前処理した。最後のセルレイン注射の１時間後に、顎下穿刺によって採血し、２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離することによって血清を分離した。膵臓リパーゼとアミラーゼの血清レベルは、スタンフォード獣医サービスセンター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｃｅｎｔｅｒ）によって分析された。
実施例２
指向性進化による高親和性ＩＬ－２２の改変
この実施例は、本開示のいくつかの非限定的な実施形態に従って、指向性進化アプローチによって、例示的な高親和性ＩＬ－２２を改変するために実施された実験の結果を記載する。構造試験のために三元系ＩＬ－２２受容体複合体の組立を安定させるために、ＩＬ－２２／ＩＬ１０Ｒβ相互作用を親和性成熟させる酵母表面ディスプレイが使用された（Ａｎｇｅｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。マウスＩＬ－２２の６つのアミノ酸位置が無作為化のために選択された部位特異的ライブラリーが設計された。これらのアミノ酸は、ＩＬ２２Ｒ１に結合したＩＬ－２２の部分複合体構造並びにインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ）－γとの相同性の情報に基づいて、ＩＬ１０Ｒβ結合界面に近接していると予測された（例えば図１Ａを参照）。この変異型ＩＬ－２２ライブラリーは、ＩＬ２２Ｒ１の非標識細胞外ドメイン（ＥＣＤ）にあらかじめ結合された酵母の表面にディスプレイされ、ＩＬ１０ＲβのＥＣＤを用いて選択された（例えば図１Ｂを参照）。このプロセスは、インビトロ進化の５ラウンドにわたって繰り返され、ＩＬ１０Ｒβ結合の漸進的な改善をもたらした（例えば図１Ｃ及び図７Ａを参照）。
それぞれが、Ｓｕｐｅｒ－２２ａ及びＳｕｐｅｒ－２２ｂと名付けられた野生型マウスＩＬ－２２に対して５つの変異を含む２つの高親和性クローンを、最終酵母集団から選択した（例えば図７Ｂを参照）。両方のクローンは、酵母の表面に提示された場合、ＩＬ１０ＲβＥＣＤへの有意に改善された結合を示した（例えば図１Ｄを参照）。図１Ｄに示されるように、親和性成熟したＩＬ－２２バリアントは、ＩＬ１０Ｒβへの結合の増強を示した。ＷＴ ＩＬ－２２又は親和性成熟クローンＳｕｐｅｒ－２２ａ及びＳｕｐｅｒ－２２ｂをディスプレイする酵母におけるＳＡ－６４７－ＩＬ１０ＲβＥＣＤの結合力価が示されている。これらの実験では、酵母は１μＭの非標識ｍＩＬ２２Ｒ１ＥＣＤにあらかじめ結合されていた。
さらに、両方のクローンは培養細胞において増強された活性を示し、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３のリン酸化によって決定すると、マウス及びヒトの上皮由来細胞株の両方で約５～１０倍低下したＥＣ50を示した（例えば図１Ｅ及び７Ｃを参照）。図１Ｅに示されるように、親和性成熟したＩＬ－２２バリアントは、増強されたＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘発することができた。これらの実験では、ＷＴ ＩＬ－２２又は指示されたバリアントで２０分間刺激され、パラホルムアルデヒド／メタノールによる固定及び透過処理後にフローサイトメトリーによって分析された、ＥＣ４（マウス、肝臓）細胞におけるホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３の用量応答曲線が得られた。すなわち、これらの改変高親和性ＩＬ－２２バリアントは、ＩＬ１０Ｒβへの実質的に改善された結合を示したが、両方の受容体サブユニットを機能的に二量体化する能力は保持した。
実施例３
ヘテロマーＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体の結晶構造
この実施例は、ヘテロマー受容体複合体ＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβの結晶構造を決定するために行った実験の結果を記載しており、これは、ヘテロマー受容体複合体のサイトカイン－受容体相互作用のそれぞれを駆動する化学を解明するのに役立つ。
ＷＴ ＩＬ－２２とは対照的に、上記の実施例２に記載の両方の高親和性ＩＬ－２２クローン（Ｓｕｐｅｒ－２２ａ及びＳｕｐｅｒ－２２ｂ）は、ゲル濾過中の共泳動によって評価されるように、ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０Ｒβとの安定な三元複合体を形成した（図８Ａ及び８Ｂ）。ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０Ｒβの糖変異体バリアントに結合した完全グリコシル化Ｓｕｐｅｒ－２２ｂを含む複合体は、回折の少ない結晶を生成することが観察され、これは最終的に、Ｓｕｐｅｒ－２２ａの糖変異体バリアントを含む複合体の結晶化を促進するためのシード保存株として使用された（例えば図７Ｃ参照）。これらの結晶は２．６Åの分解能で回折し、部分的なＩＬ－２２－ＩＬ２２Ｒ１複合体（ＰＤＢ ＩＤ：３ＤＧＣ、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８）及び単量体ＩＬ１０Ｒβ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＱＭ、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）の既に報告された構造に由来するモデルを使用する分子置換により、構造が決定された。
ＩＬ－２２／ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ三元複合体の全体的な構造は、他のクラス２サイトカイン受容体複合体のものと類似しており、３つの異なる結合界面（部位１～３、図２Ａ～２Ｃ）からなることが観察された。部位１では、ＩＬ２２Ｒ１の両方のクラス２ホモロジー領域（Ｃ２ＨＲ）ドメイン（Ｄ１及びＤ２）からの複数のループが、ＩＬ－２２ヘリックスＡ及びＥ、並びにループＬ２と係合し、ＩＬ－２２表面の９６１Å2を埋めている。親和性の低い部位２の接触部は、ＩＬ１０ＲβのＤ１とＤ２の両方によって形成され、これらは、Ｄ２のＬ５及びＬ６とともに、主にＤ１のループＬ２、Ｌ３、及びＬ４を介して、ＩＬ－２２と係合する。ＩＬ１０ＲβのＬ５は、ＩＬ－２２ヘリックスＡの底部と広範な接触部を形成し、ループＬ２、Ｌ３、及びＬ４はヘリックスＣと係合する（図２Ａ及び２Ｂ）。最後に、部位３は、ＩＬ２２Ｒ１とＩＬ１０ＲβのＤ２ドメイン間の受容体－受容体「ステム接触部」からなり、３つの水素結合接触部のみと４２１Å2の埋もれた表面積とを有するより小さい界面を形成する（例えば図８Ｄを参照）。
ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０Ｒβの両方は、他のヘテロ二量体受容体複合体との関連で、ＩＬ－１０スーパーファミリーの追加のサイトカインに結合する共有受容体サブユニットである。以前はＩＬ２２Ｒ１は、ＩＬ－２４及びＩＬ２０Ｒβとの複合体で結晶化されており、ＩＬ１０Ｒβは、ＩＦＮ－λ及びＩＦＮλＲ１との複合体で結晶化されている。本明細書に示されるＩＬ－２２受容体構造は、これらの関連する複合体とのいくつかの注目すべき違いを明らかにしている。特に、ＩＬ１０ＲβとＩＬ－２２の間で形成される部位２の接触部は、ＩＦＮ－λ複合体中で観察されるものとは大幅に異なる。ＩＦＮ－λ結合構造では、ＩＬ１０Ｒβは主にＩＦＮ－λのヘリックスＣのＮ末端に係合し、サイトカインの「前部」を留めているように見えるが、ＩＬ１０ＲβはヘリックスＣの中央部分を介してＩＬ－２２に係合している。サイトカインリガンドの重ね合わせによって２つの複合体を整列させると、異なる結合様式が容易に観察でき、複合体間のＩＬ１０ＲβＤ１ドメインの約４０°の相対的回転を示している（図２Ｄ）。これら２つの複合体におけるＩＬ１０Ｒβの配向の変化はまた、ＩＬ１０Ｒβにおける３つの芳香族残基であるＴｙｒ５９、Ｔｙｒ８２、及びＴｒｐ１４３の相対的位置の変化をもたらし、これが、両方の構造においてリガンドとの重要な接触部を形成する（図２Ｅ）。
これらの実験では、ＩＬ１０Ｒβに対するＩＬ－２２の親和性が比較的低いにもかかわらず、この固有の部位２接触部が、ＩＬ－２２表面の７２３Å2を埋める広範な界面を形成することが観察された。この界面の拡大図は、ＩＬ１０Ｒβとの相互作用を媒介するＩＬ－２２のいくつかの重要な残基を明らかにしている（図３Ａ及び３Ｂ）。
特に、ＩＬ－２２のヘリックスＡ上で、２２－Ａｒｇ５５はＲβ－Ｇｌｕ１４１と塩橋を形成し、これが同時に２２－Ａｓｎ５４上の隣接するＮ結合グリカン修飾と接触する（図３Ａ）。さらに、ヘリックスＡ上の２２－Ｔｙｒ５１は、Ｒβ－Ｌｙｓ８１とＲβ－Ｇｌｕ１３９の両方との水素結合、並びにＲβ－Ｔｒｐ１４３との垂直パイスタッキング相互作用を含む、ＩＬ１０Ｒβとの複数の接触を行う。さらに、ヘリックスＣ中の２２－Ｇｌｕ１１７及び２２－Ｌｙｓ１２４は、ＩＬ１０ＲβのループＬ３及びＬ４中のＲβ－Ｌｙｓ８１、Ｒβ－Ａｓｐ８４、及びＲβ－Ｇｌｕ１０９とイオン接触部を形成する（図３Ａ及び３Ｂ）。ヘリックスＣのＣ末端近くで、ループＬ１の２２－Ｇｌｎ４８は、Ｄ２ドメイン中のＲβ－Ａｓｐ１５０と追加の水素結合を形成する。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、上記の接触部に加えて、本明細書に記載の結晶構造は、酵母ディスプレイで選択された突然変異に由来する親和性増強の基礎を明らかにする（例えば図７Ｂを参照）。特に、Ｓｕｐｅｒ－２２ａにおけるＳ４５Ｒ突然変異は、ＷＴ ＩＬ－２２におけるＲβ－Ｇｌｎ１９８との水素結合接触部と思われるものを、図３Ｂに示される構造で観察されるＲβ－Ａｓｐ１９７との塩橋に変換することが観察された。さらに、Ｑ９６Ｓ突然変異はＲβ－Ｔｙｒ８２と水素結合接触部を形成するが、Ｑ１１６Ｗ突然変異は主にインドール窒素を介して、Ｒβ－Ｓｅｒ８０の側鎖と水素結合接触部を形成している（図３Ａ）。特に、Ｅ４３ＨとＱ１２８Ｋの両方がＩＬ－２２内の他の残基とのみ接触しているように見え、１０Ｒβ界面でループＬ１の方向を安定化させている可能性がある（図３Ｂ）。全体として、理論に拘束されるものではないが、Ｓｕｐｅｒ－２２ａの親和性を増強する変異は、新規の接触部位を作成するのではなく、主にＷＴ ＩＬ－２２とＩＬ１０Ｒβの間で作成された既存の極性接触部を改善しているようである。
実施例４
バイアス型ＩＬ－２２受容体アゴニストの構造誘導設計
この実施例は、上記の実施例３に記載のヘテロマーＩＬ－２２／Ｌ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体の結晶構造に基づいて、バイアス型ＩＬ－２２受容体アゴニストを設計するために行った実験を記載する。
これらの実験では、ＩＬ１０Ｒβ結合部位を標的とするアミノ酸置換を有する一連のＩＬ－２２バリアントを設計し、結腸上皮由来ＨＴ－２９細胞においてＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ１の活性化を誘導する能力について評価した。図３Ｄに示すように、ＩＬ１０Ｒβ結合を部分的に破壊したＩＬ－２２バリアントは、ＳＴＡＴ３の活性化を誘発する能力を保持していたが、ＳＴＡＴ１活性化の大幅な低下を誘導した。これらの実験では、ＷＴ ＩＬ－２２又は示されたバリアントで２０分間刺激され、パラホルムアルデヒド／メタノールによる固定と透過処理の後にフローサイトメトリーで分析されたＨＴ－２９細胞における、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３（左パネル）及びホスホ－Ｙ７０１－ＳＴＡＴ１（右パネル）の用量応答曲線が得られた。データは、３つの独立した多重測定の平均＋／－ＳＤであり、最大のＷＴ ＩＬ－２２シグナルのパーセントとして示される。図３Ｅは、図３Ｄに示されるシグモイド用量応答曲線から計算されたホスホ－ＳＴＡＴ３及びホスホ－ＳＴＡＴ１の標準化されたＥｍａｘ値を示す。特に、接触残基Ｇｌｕ１１７の変異は、驚くべきことに、単独（Ｅ１１７Ａ、「２２－Ｂ１」）又はＡｓｎ４６との組み合わせ（Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ、「２２－Ｂ２」）のいずれかで、ＳＴＡＴ３活性化のわずかな低下のみをもたらしたが、ＳＴＡＴ１シグナル伝達のほぼ完全な無効化（図３Ｄ～３Ｆ）をもたらした。アミノ酸置換Ｑ１１６Ａ、Ｋ１２４Ａ、Ｑ１２８Ａ、及びＳ４５Ｅを含む複合体バリアント（「２２－Ｂ３」）は、さらに大きなレベルのバイアス型アゴニスト作用を誘発し、ＳＴＡＴ３ではＷＴ ＩＬ－２２Ｅmaxの１００％を保持したが、ＳＴＡＴ１ではわずかに約３０％のみ保持した（図３Ｃ～３Ｆ）。Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ（「２２－Ｂ４」）及びＱ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ（「２２－Ｂ５」）を含む関連するＩＬ１０Ｒβ結合バリアントも、バイアス型アゴニスト作用をもたらしたが、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３活性化の両方の大きな全体的低下をもたらした（図９Ａ）。まとめるとこれらの結果は、ＩＬ１０Ｒβ結合界面を部分的に破壊するＩＬ－２２の変異が不釣り合いにＳＴＡＴ１の活性化を弱め、ＳＴＡＴ３にバイアス型シグナル伝達をもたらすことを示す。
ＩＬ１０Ｒβに対するＩＬ－２２の親和性の低下がバイアス型アゴニスト作用をもたらす機構を理解するために、ＨＡタグ付きＩＬ２２Ｒ１を一時的に発現させることによって、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるＩＬ－２２受容体シグナル伝達を復元した（図１３Ｂ）。図１３Ｂに示されるように、バイアス型ＩＬ－２２バリアントは、ＷＴ ＩＬ－２２と比較して、ＩＬ２２Ｒ１チロシンリン酸化レベルの顕著な低下を誘発し、これはＳＴＡＴ１シグナル伝達の消失と相関したが、ＳＴＡＴ３活性化には無視できる影響しかなかったことが観察された。さらに、ＩＣＤのすべてのチロシン残基を欠くＩＬ２２Ｒ１バリアント（ＩＬ２２Ｒ１－ＹｔｏＦ）を発現する細胞では、ＷＴ ＩＬ－２２がＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３の顕著な活性化を誘導し、従って野生型ＩＬ２２Ｒ１に対してバイアス型アゴニストのシグナル伝達プロファイルに似ていることが観察された（図１３Ｃ）。この観察結果は、受容体のリン酸化の非存在下でも、ＳＴＡＴ３のプールがＩＬ２２Ｒ１と事前に会合しており（図１３Ｃ）、受容体のリン酸化依存及び非依存メカニズムの両方を介して、ＳＴＡＴ３の活性化を可能にすることを示す以前の報告と一致する（図１３Ｄ）。対照的に、ＳＴＡＴ１の活性化には受容体のリン酸化が厳密に必要であると思われる（図１３Ｂ～Ｄ）。まとめるとこれらの結果は、部分的にＩＬ１０Ｒβ結合親和性に欠陥のあるＩＬ－２２バリアントが受容体のリン酸化レベルを顕著に低下させ、これは、ＳＴＡＴ３活性化の２つの異なるモードのために、ＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３の強力な活性化を引き起こすのに十分であるというモデルを支持している（図１３Ｄ）。
実施例５
バイアス型ＩＬ－２２バリアント２２－Ｂ３は組織選択的シグナル伝達を誘発する
この実施例は、本開示のいくつかの非限定的な実施形態による例示的なバイアス型ＩＬ－２２バリアント（２２－Ｂ３）が、組織選択的シグナル伝達活性を誘発することを証明するために行われた実験を説明する。
これらの実験では、インビボでＩＬ－２２受容体の下流のＳＴＡＴシグナル伝達に偏りを起こす作用を評価するために、マウスに、最初にＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３を単回高用量の注射により投与し、続いて、３０分後にいくつかのＩＬ－２２応答性組織におけるＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ１応答を分析した（図４Ａ）。膵臓では、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３が、ＷＴ ＩＬ－２２と比較してＳＴＡＴ３の完全な活性化と、ＳＴＡＴ１の強力ではあるがわずかに低下した活性化を誘導し、従ってこの組織では弱いＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニスト作用を示すことが観察された（図４Ｂ）。しかし、結腸では、２２－Ｂ３もＳＴＡＴ３の完全な活性化を保持したが、ＳＴＡＴ１の検出可能なリン酸化を誘導しなかった（図４Ｃ）。従って、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３は、結腸において強力なバイアス型アゴニストとして機能し、上記のインビトロでＨＴ－２９細胞において得られた結果と一致する（図３Ｆ）。注目すべきことに、ＷＴ ＩＬ－２２とは異なり、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３は、ＳＴＡＴ３のリン酸化によって評価されるように、皮膚又は肝臓において検出可能なシグナル伝達活性を誘発しなかった（例えば図４Ｄ及び４Ｅを参照）。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、２２－Ｂ３における変異がＩＬ１０Ｒβとの相互作用を弱めるように設計されていることを考えると、ＩＬ１０Ｒβ発現の差は、ＷＴ ＩＬ－２２のそれと比較して２２－Ｂ３シグナル伝達に不釣り合いに影響を与える可能性があるという仮説が立てられ、これは、組織全体のシグナル伝達の観察された差を説明している。実際、これらの４つのマウス組織におけるＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０Ｒβ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析により、２２－Ｂ３シグナル伝達の強度がＩＬ１０Ｒβ発現とよく相関し、これは膵臓で最も高く、続いて結腸、皮膚、及び肝臓の順であることが明らかになった（図４Ｆ）。同様の細胞型特異性パターンがインビトロのヒト細胞株でも観察され、バリアント２２－Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３はすべて、膵臓細胞由来のＰＡＮＣ－１細胞でＳＴＡＴ３シグナル伝達を保持していたが、肝臓由来のＨｅｐＧ２細胞ではＳＴＡＴ３もＳＴＡＴ１の活性化もを誘発しなかった（図４Ｇ、４Ｈ、及びＳ４Ａ）。特に、２２－Ｂ３は、ＨｅｐＧ２細胞においてＷＴ ＩＬ－２２によるシグナル伝達をブロックすることもできることが観察され、２２－Ｂ３がこれらの細胞においてＩＬ２２Ｒ１に結合する能力を保持し、従ってアンタゴニストとして作用することが証明された（図４Ｉ）。従って、ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３は、インビトロ及びインビボで組織タイプ全体で異なるシグナル伝達挙動を誘発し、組織における異なるＩＬ１０Ｒβ発現の差のために、膵臓では弱いバイアスのアゴニストとして、結腸では強いバイアス型アゴニストとして、皮膚と肝臓では中立的なアンタゴニストとして、挙動する。
実施例６
２２－Ｂ３はインビボでＩＬ－２２の組織保護機能と炎症促進機能を切り離す
この実施例は、バイアス型ＩＬ－２２バリアントである２２－Ｂ３が、組織保護と炎症促進性ＩＬ－２２標的遺伝子のインビボでの発現を切り離すことを証明するために行った実験の結果を記載する。
これらの実験は、ＳＴＡＴ活性化の偏り及びＩＬ－２２組織特異性の改変が、インビボで標準的なＩＬ－２２標的遺伝子の発現に、どの程度影響するかという問題に対処するために設計された。これらの実験では、ＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３の単回注射の６時間後に、マウスの膵臓、結腸、皮膚、及び肝臓からＲＮＡを単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲによる既知のＩＬ－２２標的遺伝子の相対的な発現を分析した。
膵臓において、２２－Ｂ３は、この組織においてＳＴＡＴ３を介して正常にシグナル伝達する２２－Ｂ３の能力（図４Ｂ）に一致して、再生膵島由来タンパク質Ｒｅｇ３β及びＲｅｇ３γをコードする組織保護遺伝子の顕著なアップレギュレーションを、ＷＴ ＩＬ－２２と同程度まで誘導することが観察され（図５Ａ）、この組織においてＳＴＡＴ３を介して普通にシグナル伝達する２２－Ｂ３の能力に一致していた（図４Ｂ）。結腸において２２－Ｂ３はまた、Ｒｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、及びＭｕｃｉｎ１の発現を駆動する能力を保持していた（図５Ｂ）。しかし、ＷＴ ＩＬ－２２とは異なり、２２－Ｂ３は、好中球動員ケモカインＣＸＣＬ１（ＩＢＤの遺伝的マウスモデルにおけるＩＬ－２２の炎症促進作用に一部関与するＳＴＡＴ１標的遺伝子）の結腸性発現を誘導しなかった（図５Ｃ）。さらに、ＷＴ ＩＬ－２２は、皮膚におけるＣＸＣＬ１及び炎症促進性サイトカインＩＬ－６の発現を上昇させたが、２２－Ｂ３はこれらの遺伝子のいずれに対しても検出可能な影響を及ぼさなかった（図５Ｄ）。同様に、ＷＴ ＩＬ－２２とは異なり、２２－Ｂ３は肝臓で炎症促進性遺伝子ＣＸＣＬ１及びＩＬ－１βの発現を誘導しなかった（図５Ｅ）。従って、２２－Ｂ３は、膵臓及び結腸で重要な組織保護遺伝子の発現を誘導する能力を保持しているが、結腸、皮膚、及び肝臓でいくつかの炎症促進性遺伝子の発現を誘導する能力を消失している。
遺伝子発現における２２－Ｂ３誘導性変化が、疾患の場で、ＩＬ－２２の保護作用を駆動するのに十分であるかどうかを試験するために、追加の実験を行い、ここで、２２－Ｂ３は、急性膵炎のマウスモデルにおいてその効力が測定された。これらの実験では、セルレイン（膵臓の炎症を促進し、血中の膵臓酵素のレベルを上昇させるコレシストキニン類似体）の１時間ごとに６回の注射により急性膵炎を誘導する２０時間前と２時間前に、マウスを、ＷＴ ＩＬ－２２又は２２－Ｂ３の２回の注射で前処理した（例えば図６Ａ参照）。重要なことに、２２－Ｂ３は、発症直後にＰＢＳ処置対照と比較した膵臓リパーゼ及びアミラーゼの血清レベルによって測定されるように、ＷＴ ＩＬ－２２と同程度まで疾患重症度を有意に緩和した（図６Ｂ）。
上述のように、ＩＬ－２２の治療的使用に対する主要な潜在的制限は、マウス及びヒトの両方において肝急性期応答タンパク質（ＡＰＰ）の血清レベルを上昇させるその能力である。全身性炎症のマーカーとして機能する以外に、ＳＡＡ－１／２などのＡＰＰは、Ｔh１７に媒介される炎症性疾患にも寄与する可能性がある。以前の報告と一致して、本明細書に提示された実験データは、健康なマウスではＷＴ ＩＬ－２２を１回注射するだけで、ＡＰＰのＳＡＡ－１／２及びハプトグロビンの血清レベルを劇的に上昇させるのに十分であることを示していた（例えば図６Ｃ参照）。しかし注目すべきことに、２２－Ｂ３の投与は、高用量であっても、ＳＡＡ－１／２又はハプトグロビンレベルに対して検出可能な影響を及ぼさなかった（図６Ｃ）。まとめるとこれらのデータは、２２－Ｂ３シグナル伝達が、ＩＬ－２２の組織保護機能をインビボで保持するのに十分であるにもかかわらず、ＩＬ－２２に関連する既知の局所及び全身の炎症誘発効果の多くをもはや誘導しないことを示す。
実施例７
ヒト及びマウスＩＬ－２２部分アゴニストはＳＴＡＴ３にバイアス型アゴニスト作用を誘発する
この実施例は、ＩＬ－１０Ｒβ結合界面におけるＩＬ－２２のいくつかの突然変異がＳＴＡＴ３にバイアス型シグナル伝達をもたらすことを証明するために行われた実験を記載する。
図１１Ａに示されるように、ＨＴ－２９（ヒト結腸直腸癌）細胞を、様々な濃度の野生型又は改変マウスＩＬ－２２バリアントで２０分間処理した。メタノール／ＰＦＡを使用して細胞を固定し透過処理をして、蛍光標識抗ホスホＳＴＡＴ１（ＡＦ４８８）又は抗ホスホＳＴＡＴ３（ＡＦ６４７）抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。データをシグモイド用量応答曲線に適合させて、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のＥｍａｘを計算できるようにした。バイアス型バリアントのＥｍａｘは、野生型ＩＬ２２のパーセントに対して標準化された。示されているデータは平均＋／－ＳＥＭである。図１１Ｂは、（Ａ）からのデータを使用して、各ＩＬ－２２バリアントについてのホスホ－ＳＴＡＴ３／ホスホ－ＳＴＡＴ１ Ｅｍａｘの比を示す。図１１Ｃは、野生型マウスＩＬ－２２に対するマウスＩＬ－２２バリアント及び対応する突然変異のリストである。
実施例８
ＩＬ－２２部分アゴニストによって誘発されるＳＴＡＴ３シグナル伝達とＳＴＡＴ１シグナル伝達の比率は、ＩＬ－２２部分アゴニスト間で異なる
この実施例は、改変ヒトＩＬ－２２バリアントも、結腸直腸由来ＨＴ２９細胞においてＳＴＡＴ３に偏ったシグナル伝達を誘発するが、肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞では不活性であることを示すために実施された実験を記載する。
図１２Ａ～１２Ｂに示されるように、ＨＴ－２９（ヒト結腸直腸癌；図１２Ａ）又はＨｅｐＧ２（ヒト肝臓；図１２Ｂ）細胞を、様々な濃度の野生型又は変異型マウスＩＬ－２２で２０分間処理した。メタノール／ＰＦＡを使用して細胞を固定し透過処理して、蛍光標識抗ホスホＳＴＡＴ１（ＡＦ４８８）又は抗ホスホＳＴＡＴ３（ＡＦ６４７）抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。用量応答曲線。データをシグモイド用量応答曲線に適合させて、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のＥｍａｘを計算できるようした。バイアス型バリアントのＥｍａｘは、野生型ＩＬ２２のパーセントに対して標準化された。データは、３回の独立した多重測定の平均＋／－ＳＥＭである。野生型ヒトＩＬ－２２に対する例示的なヒトＩＬ－２２バリアント及び対応する突然変異の要約を、図１２Ｃに提供する。
本開示の具体的な代替物が開示されているが、様々な修飾及び組み合わせが可能であり、それらは、添付の特許請求の範囲の真の精神及び範囲内であると企図されることが理解されるべきである。従って、本明細書に提示された正確な要約及び開示を限定する意図はない。
参考文献
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Ｏｈ Ｊｅｅ－Ｈｗａｎ， Ｓｃｈｕｅｌｅｒ Ｌ． Ｋａｔｈｒｙｎ， Ｄｏｎｎｉｅ Ｓ． Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ， Ｌａｕｒａ Ｍ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｃｈｉ－Ｌｉａｎｇ Ｅｒｉｃ Ｙｅｎ， Ｍａｒｋ Ｐ． Ｋｅｌｌｅｒ， Ａｌａｎ Ｄ． Ａｔｔｉｅ， Ｊａｎ－Ｐｅｔｅｒ ｖａｎ Ｐｉｊｋｅｒｅｎ． （２０２０）． Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２２ ｂｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｉｅｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ． ｍＳｐｈｅｒｅ， Ｖｏｌ． ５， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ ２０２０．
Ｌｏｔｈａｒ Ｓｔｅｉｄｌｅｒ， Ｓａｂｉｎｅ Ｎｅｉｒｙｎｃｋ， Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｈｕｙｇｈｅｂａｅｒｔ，Ｖｅｅｒｌｅ Ｓｎｏｅｃｋ， Ａｎ Ｖｅｒｍｅｉｒｅ， Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｄｄｅｅｒｉｓ， Ｅｒｉｃ Ｃｏｘ， Ｊｅａｎ Ｐａｕｌ Ｒｅｍｏｎ ａｎｄ Ｅｒｉｋ Ｒｅｍａｕｔ． （２００３）． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ７， Ｊｕｌｙ ２００３．
Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ， Ｔ．Ｃ．， Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｒ．Ｗ．， Ａｆｏｎｉｎｅ， Ｐ．Ｖ．， Ｍｏｒｉａｒｔｙ， Ｎ．Ｗ．， Ｚｗａｒｔ， Ｐ．Ｈ．， Ｈｕｎｇ， Ｌ．Ｗ．， Ｒｅａｄ， Ｒ．Ｊ．， ａｎｄ Ａｄａｍｓ， Ｐ．Ｄ． （２００８）． Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＨＥＮＩＸ ＡｕｔｏＢｕｉｌｄ ｗｉｚａｒｄ． Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６４， ６１－６９．
Ｗｉｎｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｂａｌｌａｒｄ， Ｃ．Ｃ．， Ｃｏｗｔａｎ， Ｋ．Ｄ．， Ｄｏｄｓｏｎ， Ｅ．Ｊ．， Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．， Ｅｖａｎｓ， Ｐ．Ｒ．， Ｋｅｅｇａｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ， Ｅ．Ｂ．， Ｌｅｓｌｉｅ， Ａ．Ｇ．， ＭｃＣｏｙ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ． Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６７， ２３５－２４２．
Ｙｏｏｎ， Ｓ．Ｉ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｂ．Ｃ．， Ｌｏｇｓｄｏｎ， Ｎ．Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ｂ．Ｄ．， Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ， Ａ．， Ｒａｄａｅｖａ， Ｓ．， Ｈａｌｌｏｒａｎ， Ｂ．Ａ．， Ｇａｏ， Ｂ．， ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｒ． （２０１０）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｈａｒｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ＩＬ－ １０Ｒ２ ｃｏｍｍｏｎ ｃｈａｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ： １９９３） １８， ６３８－６４８．

Claims (82)

  1. 組換えポリペプチドであって、
    配列番号１のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    配列番号１のＸ４３、Ｘ４９、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、組換えポリペプチド。
  2. 前記アミノ酸配列が、配列番号１のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
  3. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を低下させる、請求項１又は２に記載の組換えポリペプチド。
  4. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、前記組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を増加させる、請求項１又は２に記載の組換えポリペプチド。
  5. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  6. 配列番号１のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む、請求項５に記載の組換えポリペプチド。
  7. 前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  8. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  9. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１のＤ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４９、Ｑ１１６、Ｒ１２４、及びＲ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  10. 配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換：
    （ａ）Ｒ５５Ａ；
    （ｂ）Ｅ１１７Ａ；
    （ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；
    （ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；
    （ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ｄ／Ｒ１２８Ａ；
    （ｆ）Ｄ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；
    （ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ；及び
    （ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｒ１２４Ａ／Ｒ１２８Ａ、
    に対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド
  11. 配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びＤ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｙ、及びＲ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  12. 組換えポリペプチドであって、
    配列番号６のアミノ酸配列を有するインターロイキン２２（ＩＬ－２２）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、
    配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ１１６、Ｘ１２４、及びＸ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、組換えポリペプチド。
  13. 前記アミノ酸配列が、配列番号６のＸ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置に追加のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１２に記載の組換えポリペプチド。
  14. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、前記組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を低下させる、請求項１２又は１３に記載の組換えポリペプチド。
  15. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、前記組換えＩＬ－２２ポリペプチドのＩＬ１０Ｒβ結合親和性を増加させる、請求項１２又は１３に記載の組換えポリペプチド。
  16. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号６のＸ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、及びＸ１１７からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  17. 配列番号６のアミノ酸残基Ｘ１１６、Ｘ１２４、Ｘ１２８に対応する位置のアミノ酸置換の組み合わせをさらに含む、請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
  18. 前記アミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸残基Ｘ５５又はＸ１１７に対応するアミノ酸置換を含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  19. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  20. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号６のＥ４３、Ｓ４５、Ｎ４６、Ｑ４８、Ｒ５５、Ｑ１１６、Ｅ１１７、Ｋ１２４、Ｑ１２８からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する位置にある、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  21. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び以下のアミノ酸置換：
    ａ）Ｒ５５Ａ；
    ｂ）Ｅ１１７Ａ；
    ｃ）Ｎ４６Ａ／Ｅ１１７Ａ；
    ｄ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；
    ｅ）Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ｄ／Ｑ１２８Ａ；
    ｆ）Ｅ４３Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；
    ｇ）Ｓ４５Ｅ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ；及び
    ｈ）Ｑ４８Ａ／Ｑ１１６Ａ／Ｋ１２４Ａ／Ｑ１２８Ａ、
    に対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  22. 配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びＥ４３Ｈ、Ｅ４３Ｒ、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｇ、Ｑ４９Ｓ、Ｑ４９Ｇ、Ｑ１１６Ｗ、Ｑ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｙ、及びＱ１２８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  23. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  24. 前記組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達が、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する、請求項２３に記載の組換えポリペプチド。
  25. 前記組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達が、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する、請求項２３又は２４に記載の組換えポリペプチド。
  26. 前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  27. 前記バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達が、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下を含むが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する、請求項２６に記載の組換えポリペプチド。
  28. 前記バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達が、１：１．５～１：１０の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達とＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比を含む、請求項２６又は２７に記載の組換えポリペプチド。
  29. 前記ＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項２８に記載の組換えポリペプチド。
  30. 前記ＳＴＡＴ３媒介機能が、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存からなる群から選択される、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  31. 前記ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能が、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員からなる群から選択される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  32. 前記ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定すると、約２０％～約１００％低下している、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子。
  34. 前記核酸配列が異種核酸配列に作動可能に連結されている、請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 前記核酸分子が、発現カセット又は発現ベクターとしてさらに定義される、請求項３３又は３４に記載の核酸分子。
  36. 以下：
    ａ）請求項１～３２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
    ｂ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸、
    を含む、組換え細胞。
  37. 前記組換え細胞が真核細胞である、請求項３６に記載の組換え細胞。
  38. 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の組換え細胞。
  39. 請求項３６～３８のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え細胞と培地とを含む細胞培養物。
  40. 以下：
    ａ）請求項１～３２のいずれか１項に記載の１つ又は複数の組換え細胞を提供すること；及び
    ｂ）前記細胞が、前記組換え核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生するように、１つ又は複数の組換え細胞を培地中で培養すること、
    を含む、ポリペプチドを産生するための方法。
  41. 前記産生されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記産生されたポリペプチドを構造的に修飾して半減期を延長させることをさらに含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記修飾が、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法によって産生される組換えポリペプチド。
  45. 以下：
    ａ）請求項１～３２及び４４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
    ｂ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸；
    ｃ）請求項３６～３８のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
    ｄ）医薬的に許容し得る担体、
    を含む、医薬組成物。
  46. 請求項１～３２及び４４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドと、医薬的に許容し得る担体とを含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸と、医薬的に許容し得る担体とを含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  48. 対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節する方法であって、以下：
    ａ）請求項１～３２及び４４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
    ｂ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸；
    ｃ）請求項３６～３８のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
    ｄ）請求項４５～４７に記載の医薬組成物、
    を含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  49. 状態の治療方法を必要とする対象の状態の治療方法であって、以下：
    ａ）請求項１～３２及び４４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
    ｂ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸；
    ｃ）請求項３６～３８のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
    ｄ）請求項４５～４７に記載の医薬組成物、
    を含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  50. 前記投与された組成物が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、対象において組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす、請求項４８又は４９に記載の方法。
  51. 前記組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達が、皮膚におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する、請求項５０に記載の組換えポリペプチド。
  52. 前記組織選択的ＩＬ－２２シグナル伝達が、肝臓におけるＩＬ－２２シグナル伝達の低下を含むが、膵臓及び／又は消化管におけるＩＬ－２２シグナル伝達は実質的に保持する、請求項５０又は５１に記載の組換えポリペプチド。
  53. 前記投与された組成物が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換を欠く参照ＩＬ－２２ポリペプチドと比較して、対象においてバイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達をもたらす、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達が、ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能の低下を含むが、ＳＴＡＴ３媒介機能は実質的に保持する、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記バイアス型ＩＬ－２２シグナル伝達が、１：１．５～１：１０の範囲のＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達とＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の比を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
  56. 前記ＳＴＡＴ１媒介シグナル伝達及び／又はＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＳＴＡＴ３媒介機能が、組織保護、組織再生、細胞増殖、及び細胞生存からなる群から選択される、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能が、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員からなる群から選択される、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能が約２０％～約１００％低下する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＳＴＡＴ１媒介性の炎症促進機能が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナル伝達アッセイ、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記投与された組成物が、対象において、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６から選択される炎症促進性遺伝子の発現を誘導する能力の低下をもたらす、請求項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記投与された組成物が、対象において、Ｒｅｇ３β、Ｒｅｇ３γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ１０、ＢＣＬ－２、サイクリン－Ｄ、クローディン－２、ＬＣＮ２、及びβ－ディフェンシンから選択される遺伝子の発現を誘導するその能力を実質的に保持する、請求項４８～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記医薬組成物の投与が対象におけるＴ細胞活性を阻害しない、請求項４８～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記投与された組成物が上皮保護及び再生を増強する、請求項４８～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記状態が免疫疾患又は慢性感染症である、請求項４８～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記免疫疾患が自己免疫疾患である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、異栄養性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾癬性関節炎、及び糖尿病性足潰瘍からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記自己免疫疾患が急性膵炎である、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記対象が哺乳動物である、請求項４８～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記哺乳動物がヒトである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記対象が、ＩＬ－２２媒介シグナル伝達に関連する状態を有するか、又は有する疑いがある、請求項４８～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記組成物が、第１の治療として個別に又は第２の治療と組み合わせて、対象に投与される、請求項４８～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記第２の治療が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、又は毒素療法からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第１の治療及び前記第２の治療が付随して投与される、請求項７２～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記第１の治療が前記第２の治療と同時に投与される、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記第１の治療及び前記第２の治療が連続して投与される、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記第１の治療が前記第２の治療の前に投与される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記第１の治療が前記第２の治療の後に投与される、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記第１の治療が前記第２の治療の前及び／又は後に投与される、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記第１の治療と前記第２の治療が順番に投与される、請求項７２～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記第１の治療と前記第２の治療が単一の製剤で一緒に投与される、請求項７２～７３のいずれか１項に記載の方法。
  82. 対象におけるＩＬ－２２媒介シグナル伝達を調節するための又はそれを必要とする対象における状態を治療するためのキットであって、以下：
    ａ）請求項１～３２及び４４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
    ｂ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載の組換え核酸；
    ｃ）請求項３６～３９のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
    ｄ）請求項４５～４７のいずれか１項に記載の医薬組成物、
    を含む、キット。
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