CN111172326A - 一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用 - Google Patents

一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外检测rhTSG‑6抗病毒活性的方法及rhTSG‑6在抗病毒药物中的应用。采用牛肾上皮细胞(MDBK)，但不限于仅用此种细胞作为测定细胞，水疱性口炎病毒(VSV)，但不限于仅用此种病毒作为攻击病毒以检测rhTSG‑6的抗病毒活性，本发明方法用于检测rhTSG‑6抗病毒活性时，能准确客观地显示出TSG‑6的抗病毒活性的有无及效价，有效地解决了对rhTSG‑6抗病毒活性的观察及评价难题。该方法具有操作相对简便、结果明确易判断等特征。

Description

一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒 药物中的应用
技术领域
本发明属于病毒学与生物技术领域，具体涉及一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用。
背景技术
肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6，TSG-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白，是由间充质干细胞或基质细胞(MSCs)对炎症信号的反应产生的，在多种炎症性疾病或类炎症性病理过程中呈高表达。现已知，TSG-6介导了许多免疫调节和组织修复过程，具有抗炎和组织保护作用，是一个正调节的功能蛋白。大量研究表明，TSG-6具有抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的表达，抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。随着相关研究进展，TSG-6的抑炎功能逐渐受到生物医药领域的日益重视。本发明首次发现，重组人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性。
发明内容
本发明提供了一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用。本方法及其应用基于rhTSG-6能够保护MDBK细胞，但不限于此种细胞免受VSV病毒，但不限于此种病毒侵害作用的现象作为检测结果体系。本方法能准确客观地观察与检测rhTSG-6抗病毒活性，重复性及准确度均高。经本方法验证，rhTSG-6抗VSV病毒的效价高达1000.00U/mL。
本发明提供的检测rhTSG-6抗病毒活性的方法以rhTSG-6抑制病毒致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)现象作为检测其活性的结果，即以每毫升rhTSG-6检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒的攻击的稀释度的倒数定为rhTSG-6单位(或称效价)，常以单位(U)表示。该结果经用结晶紫对存活的MDBK细胞染色观察后，根据着色深浅，按Reed-Muench公式计算出所测rhTSG-6的抗病毒活性。
本发明采取的技术方案为：
一种检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，以牛肾上皮细胞(MDBK细胞)作为测定细胞，水疱性口炎病毒(VSV)作为攻击病毒来检测rhTSG-6的抗病毒活性。
进一步地，所述MDBK细胞还可替换为ST、PK-15、Vero、Hela和HF细胞等，即本方法也不局限于用MDBK细胞或ST细胞进行活性检测，也可选用其他细胞进行检测。所述VSV病毒还可替换为TGEV、PEDV、HCMV、HSV、VZV、RSV及流感病毒和禽流感病毒等。即本方法也不局限于用VSV病毒进行活性检测，也可选用其他病毒进行检测。
所述检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，具体包括以下步骤：
(1)将rhTSG-6经稀释液依次进行二倍递增梯度稀释，共做10个稀释梯度，稀释后的rhTSG-6依次加入相应96孔细胞板中；
(2)将MDBK单层细胞悬液做相应稀释，然后加入含rhTSG-6的细胞板孔中，培养长至均匀的单层细胞，并设置细胞对照组和病毒对照组；
(3)弃上清，向每孔中加入VSV病毒液，细胞对照孔加维持液，进行培养；
(4)观察并统计各稀释梯度CPE孔数和无CPE孔数，根据Reed-Muench法计算rhTSG-6的效价。
步骤(1)中，所述稀释液为10％FBS的DMEM培养基；细胞对照组和病毒对照组只加稀释液。
步骤(1)中，稀释后的rhTSG-6按照100μL/孔量加入到96孔细胞板中。
步骤(1)中，每个稀释梯度做至少4个复孔。
步骤(2)中，制备的MDBK单细胞悬液的稀释要点为，稀释至细胞密度为4.0×105～6.0×105/mL；稀释后的MDBK单细胞悬液按照100μL/孔量加入到含rhTSG-6细胞板的相应孔中。
步骤(2)中，所述培养的条件为37℃、5％CO2条件下培养18～24小时
步骤(3)中，VSV病毒液的加入量为100TCID50/孔；所述维持液为含3％FBS的DMEM培养基，所述培养的条件为37℃、5％CO2条件下培养18～24小时。
本发明还提供了rhTSG-6在抗VSV病毒药物中的应用，通过检测rhTSG-6具有抗VSV病毒活性的结果判定与抗病毒活性的效价验证rhTSG-6具有抗病毒的活性。即可通过上述试验的结果来判定rhTSG-6抗病毒活性的有无及效价；根据检测，所述rhTSG-6的抗VSV病毒的效价可高达1000.00U/mL。
本发明首次发现了rhTSG-6在体内外均具有抗病毒活性。且提供了一种在体外细胞上能准确客观地观察与检测rhTSG-6抗病毒活性的方法，填补了相关领域的空白。
附图说明
图1为不同状态下的MDBK细胞的显微照片；a为正常MDBK细胞(即细胞对照组)，b为VSV感染MDBK细胞(即病毒对照组)，c为加入rhTSG-6并经VSV攻毒后的MDBK细胞；
图2为MDBK/VSV系统检测rhTSG-6抗病毒活性的CPE结晶紫染色后的观察结果；
图3为Western Blot鉴定rhTSG-6蛋白结果；其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rhTSG-6样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
rhTSG-6蛋白的制备
(1)对根据Genebank中已报道的如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示的重组人TSG-6基因进行密码子优化，使用化学合成的方法获得如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示重组人TSG-6基因，优化前密码子适应指数(CAI)为0.73，优化后CAI为0.97。其编码的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。
(2)将步骤(1)所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21大肠杆菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组人TSG-6重组菌；
(3)挑取重组人TSG-6重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养，后在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中放大培养2～3h后，测OD值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mM IPTG，30℃诱导表达5h，收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200mL的PBS重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过含、洗涤、变性和复性，复性产物即为重组人TSG-6蛋白粗制品。
所述洗涤、变性和复性的方法为：
①洗涤：使用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，2mol/L尿素，1mmol/LEDTA，0.5％TritonX-100，pH为8.0)以1∶20的湿重体积比对包涵体(10g)进行重悬，洗涤2h，12000r/min离心20min取沉淀，再重复洗涤一次；
②变性：称量洗涤后沉淀湿重(4.8g)，再用溶解缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，7mol/L盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，pH为8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(240ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；
③稀释复性：配制复性缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，1mmol/L GSH，0.2mmol/L GSSG，pH8.0)进行复性。取溶解后的蛋白溶液，12000r/min离心20min取上清，加入等体积的复性缓冲液(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h；再加入复性缓冲液稀释至原体积的4倍(加500ml复性缓冲液)，4℃静置3h；最后加入复性缓冲液稀释至原体积的5倍(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h。
(5)重组人TSG-6蛋白粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱，用Elutionbuffer(50mMTris-Cl、500mM咪唑pH 8.0)梯度洗脱，收集显示出重组人TSG-6蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节pH至5.0，使用1M NaCl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为重组人TSG-6蛋白纯品，经Western blot鉴定，如图3所示，经纯化后的蛋白能与兔抗人TSG-6多克隆抗体发生特异性反应，在45kD左右处出现特异性条带，且特异性高；
其中Western blot鉴定方法为：以Abcam公司兔抗人TSG-6多克隆抗体为一抗(1：500稀释)，以中杉金桥公司HRP标记山羊抗兔IgG为二抗(1：50000稀释)。
实施例2
VSV病毒毒种制备及毒力检定
VSV病毒由安徽医科大学微生物学教研室提供，任何来源的VSV病毒均可适用于本发明。
本发明所用的VSV病毒液的培养及效价测定过程如下：
(a)先将VSV病毒的毒种接种至MDBK细胞上反复常规传代三次。收集该培养物的上清液离心，取上清液即为VSV病毒毒种。
(b)再将MDBK细胞制备成单细胞悬液后，以营养液稀释至4.0～6.0×105/mL铺板96孔板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养至细胞长满单层；
(c)在西林瓶中将VSV病毒液做10倍递增系列稀释，即从10-1～10-10；将稀释好的病毒液接种至长满MDBK细胞单层的96孔细胞板中，每个稀释度接种8孔，100μL/孔；
(d)设正常细胞对照两纵排，即更换为2％FBS的DMEM培养液(稀释液)；
(e)逐日观察记录结果，观察1～2d。病变程度“++”及以上判断为CPE(cytopathiceffect/细胞病变)孔，否则判为无CPE孔。病变程度用以下符号表示：“-”表示无细胞病变；“+”表示25％以下的细胞有病变；“++”表示25％～50％的细胞有病变；“+++”表示50％～75％的细胞有病变；“++++”表示75％～100％的细胞有病变；结果如表1所示；
表1
Figure BDA0002391614840000071
(f)按Reed-Muench法计算TCID50。
病毒液特定稀释度时的CPE孔数：从最低稀释度出现的CPE孔时逐个累加至该特定稀释度时的CPE孔数，如稀释度为10-1的CPE孔数为稀释度为10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1时的CPE孔数逐个累加，即0+1+3+7+8＝19。
病毒液特定稀释度时的无CPE孔数：从最高稀释度无CPE孔时逐个累加至该特定稀释度时的无CPE孔数，如稀释度为10-2的无CPE孔数为稀释度为10-1、10-2时的无CPE孔数的累加，即0+0＝0。如稀释度为10-3的无CPE孔数为稀释度为10-1、10-2、10-3时的无CPE孔数的累加，即0+0+1＝1。
距离比例＝(高于50％病变率百分数－50％)/(高于50％病变率百分数－低于50％病变率百分数)＝(91.6-50)/(91.6-40)＝0.8
lgTCID50＝距离比例×稀释系数的对数+高于或等于50％的细胞病变抑制率的稀释度的对数＝0.8×(-1)+(-3)＝3.8
TCID50＝10-3.8/0.1mL。含义：即病毒稀释103.8倍接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例3
检测rhTSG-6蛋白对VSV病毒在宿主细胞MDBK中的抗病毒活性(rhTSG-6蛋白的IC50)。包括以下步骤：
(1)将rhTSG-6经稀释液依次进行2倍梯度稀释，做10个稀释梯度，稀释后的rhTSG-6按100μL/孔加入96孔细胞板中，并设置细胞对照组和病毒对照组，细胞对照和病毒对照只加稀释液，所述稀释液为10％FBS的DMEM培养基；细胞对照组和病毒对照组只加稀释液；
(2)将MDBK单层细胞稀释为细胞密度4.0～6.0×105/mL的细胞悬液，按每孔100μL加入至含rhTSG-6的细胞板孔中，培养长至均匀的单层细胞；
(3)弃上清，向每孔中按照100TCID50/孔加入VSV病毒液，细胞对照孔加维持液，于37℃、5％CO2条件下培养18～24小时；
(4)在倒置显微镜下观察细胞病变，统计各稀释度CPE孔和无CPE孔数。病毒对照75％以上细胞出现病变(“++++”)时判定结果。病变程度“++”及以上判断为CPE孔，否则判为无CPE孔。病变程度用以下符号表示：“-”表示无细胞病变；“+”表示25％以下的细胞有病变；“++”表示25％～50％的细胞有病变；“+++”表示50％～75％的细胞有病变；“++++”表示75％～100％的细胞有病变；结果如表2所示；
表2
Figure BDA0002391614840000081
Figure BDA0002391614840000091
(5)根据Reed-Muench法计算rhTSG-6的抗病毒活性。能保护半数细胞免受攻击病毒破坏的rhTSG-6最高稀释度的倒数，即为rhTSG-6抗病毒活性。
距离比例＝(高于50％病变率百分数－50％)/(高于50％病变率百分数－低于50％病变率百分数)＝(74.1-50)/(74.1-37.5)＝0.67
rhTSG-6抑制50％的细胞病变的最高稀释度对数＝高于或等于50％的细胞病变抑制率的稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数；
即：lg(抑制50％的细胞病变的最高稀释度)＝-2.41+0.67×(-0.3)＝-2.61
可抑制50％的细胞病变的最高稀释度＝10-2.61＝407.4-1
即此批次rhTSG-6稀释到1︰407.4时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”侵害；本例待测样本的IC50为407.4。
实施例4
rhTSG-6抗VSV病毒活性评价
按照实施例3中的步骤，对10批次的rhTSG-6在MDBK细胞中的抗VSV病毒活性进行测试。
10批次rhTSG-6对VSV在宿主细胞MDBK和ST细胞中的半数抑制浓度IC50(ng/ml)如表3所示。
表3
批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
IC<sub>50</sub> 407.4 520.1 322.0 388.0 337.7 449.8 511.2 496.2 470.5 458.4.
如上表表明，制备多批次rhTSG-6蛋白，其对VSV病毒的抑制作用均较稳定，活性较高。
上述参照实施例对一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 芜湖天明生物技术有限公司
<120> 一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 优化前的TSG-6基因
<400> 1
tggggattca aggatggaat ttttcataac tccatatggc ttgaacgagc agccggtgtg 60
taccacagag aagcacggtc tggcaaatac aagctcacct acgcagaagc taaggcggtg 120
tgtgaatttg aaggcggcca tctcgcaact tacaagcagc tagaggcagc cagaaaaatt 180
ggatttcatg tctgtgctgc tggatggatg gctaagggca gagttggata ccccattgtg 240
aagccagggc ccaactgtgg atttggaaaa actggcatta ttgattatgg aatccgtctc 300
aataggagtg aaagatggga tgcctattgc tacaacccac acgcaaagga gtgtggtggc 360
gtctttacag atccaaagca aatttttaaa tctccaggct tcccaaatga gtacgaagat 420
aaccaaatct gctactggca cattagactc aagtatggtc agcgtattca cctgagtttt 480
ttagattttg accttgaaga tgacccaggt tgcttggctg attatgttga aatatatgac 540
agttacgatg atgtccatgg ctttgtggga agatactgtg gagatgagct tccagatgac 600
atcatcagta caggaaatgt catgaccttg aagtttctaa gtgatgcttc agtgacagct 660
ggaggtttcc aaatcaaata tgttgcaatg gatcctgtat ccaaatccag tcaaggaaaa 720
aatacaagta ctacttctac tggaaataaa aactttttag ctggaagatt tagccactta 780
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 优化后的TSG-6基因
<400> 2
tggggtttta aagatggcat ttttcataat agcatctggc tggaacgcgc cgccggcgtt 60
tatcatcgtg aagcccgtag tggcaaatat aaactgacct atgcagaagc caaagcagtg 120
tgcgaatttg aaggcggtca tctggcaacc tataaacagc tggaagcagc ccgtaaaatt 180
ggctttcatg tgtgcgcagc cggttggatg gccaaaggtc gcgtgggcta tccgattgtg 240
aaaccgggcc cgaattgcgg ttttggcaaa accggtatta ttgattatgg tattcgtctg 300
aatcgtagtg aacgttggga tgcctattgt tataatccgc atgcaaaaga atgcggtggc 360
gtttttaccg atccgaaaca gatttttaaa agcccgggct ttccgaatga atatgaagat 420
aatcagatct gctactggca tattcgtctg aaatatggtc agcgcattca tctgagtttt 480
ctggattttg atctggaaga tgatccgggc tgcctggcag attatgttga aatctatgat 540
agctatgacg atgttcatgg ttttgtgggt cgctattgtg gtgacgaact gccggatgat 600
attattagta ccggcaatgt gatgaccctg aaatttctga gtgatgccag cgtgaccgca 660
ggcggttttc agattaagta tgttgcaatg gaccctgtga gcaaaagcag ccagggcaaa 720
aataccagta ccaccagtac cggtaataag aattttctgg ccggtcgctt tagtcatctg 780
taa 783
<210> 3
<211> 260
<212> PRT
<213> 重组人TSG-6的氨基酸序列
<400> 3
Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Arg
1 5 10 15
Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu
20 25 30
Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu
35 40 45
Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val
50 55 60
Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val
65 70 75 80
Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr
85 90 95
Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn
100 105 110
Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln Ile
115 120 125
Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile Cys
130 135 140
Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe
145 150 155 160
Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr Val
165 170 175
Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr
180 185 190
Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met
195 200 205
Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Gln
210 215 220
Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Ala Ser Lys Ser Ser Gln Gly Lys
225 230 235 240
Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Phe Leu Ala Gly Arg
245 250 255
Phe Ser His Leu
260

Claims (9)

1.一种体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，以牛肾上皮细胞(MDBK细胞)作为测定细胞，水疱性口炎病毒(VSV)作为攻击病毒来检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(rhTSG-6)的抗病毒活性。
2.根据权利要求1所述的体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，所述MDBK细胞还可替换为ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、Hela细胞或HF细胞；所述水疱性口炎病毒还可替换为TGEV、PEDV、HCMV、HSV、VZV、RSV、流感病毒或禽流感病毒。
3.根据权利要求1或2所述的检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将rhTSG-6经稀释液依次进行二倍递增梯度稀释，共做10个稀释梯度，稀释后的rhTSG-6依次加入相应96孔细胞板中；
(2)将MDBK单层细胞悬液做相应稀释，然后加入含rhTSG-6的细胞板孔中，培养长至均匀的单层细胞，并设置细胞对照组和病毒对照组；
(3)弃上清，向每孔中加入VSV病毒液，细胞对照孔加维持液，进行培养；
(4)观察并统计各稀释梯度CPE孔数和无CPE孔数，根据Reed-Muench法计算rhTSG-6的效价。
4.根据权利要求3所述的用于体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀释液为10％FBS的DMEM培养基；细胞对照组和病毒对照组只加稀释液。
5.根据权利要求3所述的用于体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，稀释后的rhTSG-6按照100μL/孔的量加入到96孔细胞板中。
6.根据权利要求3所述的用于体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，将MDBK单层细胞悬液稀释至细胞密度为4.0×105～6.0×105个/mL；稀释后的MDBK单层细胞悬液按照100μL/孔的量加入到含rhTSG-6的细胞板孔中。
7.根据权利要求3所述的用于体外检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，步骤(3)中，VSV病毒液的加入量为100TCID50/孔；所述维持液为含2％FBS的DMEM培养基；所述培养的条件为37℃、5％CO2条件下培养18～24小时。
8.rhTSG-6在抗VSV病毒药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的rhTSG-6在抗VSV病毒药物中的应用，其特征在于，以权利要求1-7任意一项所述的方法来检测rhTSG-6的抗VSV病毒活性。
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