CN100999729A - 牛γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了牛γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定，本发明密码子优化后的牛γ－干扰素基因序列、构建了表达牛γ－干扰素的重组杆状病毒rBac－BoIFN－γ，采用抗BoIFN－γ单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测，表明BoIFN－γ在重组杆状病毒rBac－BoIFN－γ感染的昆虫细胞中获得表达。抗病毒活性试验显示，结果表明：重组BoIFN－γ在重组杆状病毒rBac－BoIFN－γ感染的昆虫细胞中获得良好表达，并具有高效抗病毒活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，涉及牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早，研究最多的细胞因子。根据IFN的细胞来源和结合受体不同，将IFN分为I型和II型。I型IFN主要有α、β两个亚型，分别主要由淋巴细胞和成纤维细胞产生[1]，它们作用于同一受体，可抑制病毒DNA复制和蛋白质合成，活化NK细胞，促进MHC I类分子提呈抗原。II型IFN为γ-干扰素，主要由T细胞和NK细胞产生[2]，与I型IFN相比有多种免疫学活性，具有促进MHC II类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强辅助T细胞和细胞毒性T细胞的产生等诸多免疫调节活性，既可以单独作为生物制剂应用于疾病的防治，也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果[3～4]。
1986年Douglas等以人γ-干扰素基因为探针从牛的cDNA文库中克隆出牛γ干扰素基因[5]，此后国内外学者利用基因工程技术生产重组BoIFN-γ的研究也开始兴起。与原核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰，表达重组蛋白更接近天然结构。国内外研究表明，牛γ-干扰素(Bovine interferon-γ，BoIFN-γ)在抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛白血病病毒以及副流感-3型的试验中均取得了良好效果[6～8]。我国每年因牛病毒疾病的爆发给养牛业带来巨大损失，研制出具有抗病毒活性和免疫调节活性的基因工程重组BoIFN-γ在牛病防治上具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的：采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BACBaculovirus Expression System)对BoIFN-γ全基因进行了高表达，构建含有BoIFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达出具有高效抗病毒活性的重组BoIFN-γ。
为了达到本发明的目的，采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System，由美国Gibco brl公司开发)对IFN-γ全基因进行了表达：构建含有IFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达IFN-γ，通过间接IFA和间接ELISA方法，证实目的蛋白在昆虫细胞中获得表达。并分别采用VSV*GFP-MDBK细胞系统通过感染复制抑制试验测定重组牛IFN-γ抗病毒活性，达到2×105IU/ml。
发明效果：
(1)目的蛋白表达的高效性：选用昆虫细胞优势密码子对GENEBANK中提交的牛IFN-γ基因序列进行密码子优化，以便目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中高效表达；
(2)目的蛋白获得的时效性：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中重组病毒的筛选是在大肠杆菌中进行，利用抗性基因和PCR筛选，并采用杆状病毒穿梭载体技术，如此大大缩短了病毒纯化和鉴定的时间，使原来的几个月时间缩短到几周，大大缩短了实验时间；
(3)杆状病毒表达系统是目前颇受欢迎的一种表达系统，它可以进行多种翻译后修饰作用，包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端酰胺化和信号肽的切割、转运，所表达蛋白在结构和功能上与天然蛋白比较接近。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组IFN-γ进行了多种翻译后加工和修饰作用，产物和天然IFN-γ一样可以进行分泌型表达，具有较高的生物学活性。
(4)生物安全性：杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠。
(5)制备方便，成本低廉：重组杆状病毒感染的昆虫细胞能分泌表达IFN-γ，只需经过离心灭活等简单处理程序即可以直接应用于畜禽疾病的临床应用。
(6)抗病毒活性检测方法准确可靠：采用VSV*GFP-MDBK细胞系统通过感染复制抑制试验测定重组IFN-γ抗病毒活性。传统的干扰素抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定，通过肉眼或显微镜观察噬斑的数量而确定其活性单位，本实验采用的重组VSV*GFP可以在感染宿主细胞内表达绿色荧光蛋白，通过观察荧光强度和数量，便可确定其感染和复制情况，因此通过测定其荧光强度和数量就可以确定干扰素的活性单位，使得干扰素活性的测定更加准确和简便。
附图说明
图1是IFA检测重组BoIFN-γ在重组杆状病毒感染细胞中的表达图。
图2是间接ELISA检测重组BoIFN-γ在重组杆状病毒感染细胞上清中的表达曲线图。
图3是重组杆状病毒表达BoIFN-γ抑制VSV*GFP在MDBK细胞上复制表达图
图4是鼠抗BoIFN-γ免疫血清阻断重组BoIFN-γ抗病毒活性试验结果图。
具体实施方式
实施例1：
1材料和方法
1.1材料
pMD-18T-BoIFN-γ质粒(BoIFN-γ基因完整ORF克隆于EcoRV位点)、原核表达质粒pET-30a(+)、供体质粒pFastBacTM1(Invitrogen)、sf9细胞系、DH10Bac感受态细胞(Invitrogen)、MDBK细胞均由本实验室保存。Grace’s培养基、DMEM培养基、转染试剂(Cellfectin Reagent)购于Invitrogen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。引物(BoIFN-γ-f、BoIFN-γ-r；M13-48f、M13-47r)由上海博亚生物有限公司合成。表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV*GFP由本实验室构建、滴定并保存。
1.2抗BoIFN-γ单克隆抗体的制备：
以原核表达载体构建引物
BoIFN-γ-f(5’CTCCGGATCAGATTCCAGGGCCAGTT3’)和
BoIFN-γ-r(5’CATGCCGTCGACTCGACTATTATACAT 3’)扩增BoIFN-γ不包含信号肽序列的469bp基因片段，将PCR扩增目的片段EcoR I和Sal I限制酶双酶切后克隆于原核表达质粒pET-30a(+)EcoR I和Sal I位点，BoIFN-γ蛋白表达框架与His标签融合。转化BL21，IPTG诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白表达，Ni化琼脂糖柱纯化。原核表达重组BoIFN-γ作为抗原分别按每小鼠10ug剂量腹腔和后肢肌肉注射免疫，三次免疫后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞，经3次有限稀释，最终获得1株稳定分泌抗BoIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，-20℃保存备用。
1.3重组杆状病毒的构建：
EcoR I和Sal I双酶切pMD-18T-BoIFN-γ，将编码BoIFN-γ基因DNA克隆至pFastBacTM1，构成pFastBacTM1-BoIFN-γ。将pFastBacTM1-BoIFN-γ转化DH10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-BoIFN-γ，制备阳性重组基因组克隆DNA，采用CellfectinRReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献[10]进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC 3’)为引物PCR验证BoIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-BoIFN-γ。扩增种毒，进行效价滴定后，于4℃保存备用。
1.4间接免疫荧光检测BoIFN-γ表达
上述rBac-BoIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释抗BoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗。PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。
1.5间接ELISA检测BoIFN-γ表达：
收取rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞上清作为抗原，以Na2CO3、NaHCO3(pH＝9.6)缓冲液分别做1∶5、1∶10、1∶20、1∶40稀释，按每孔100ul包被96孔ELISA板(Costar)，4℃过夜；10％脱脂乳封闭；以抗BoIFN-γ单克隆抗体为一抗，并将其做1∶102～1∶107系列稀释；1∶2500稀释HPR标记山羊抗鼠IgG为二抗；另设1∶5稀释野生杆状病毒感染细胞上清包被阴性对照；PBST洗涤，底物OPD作用15min，2M硫酸终止反应后，测定OD490nm(Bio-Rad，Benchmark plus)。每个稀释度至少设3个平行孔，取平均值。1.6重组BoIFN-γ抗病毒活性测定：
按文献[11]，用VSV*GFP-MDBK细胞系统测定重组BoIFN-γ抗病毒活性，以2×104cells/孔密度将MDBK铺于24孔板，待细胞贴壁后，加入2×10～2×106不同稀释度的重组BoIFN-γ(rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞上清)，37℃作用过夜。100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1小时后换完全培养液，24小时后荧光显微镜观察结果，以荧光亮度为对照孔50％的最高稀释度为一个单位(IU)。
1.7重组BoIFN-γ抗病毒活性阻断试验
以2×104cells/孔密度将MDBK细胞铺于24孔板，待细胞贴壁后，取100IU的重组BoIFN-γ与不同稀释度的鼠抗BoIFN-γ免疫血清室温作用1小时，同时设非免疫鼠血清与100IU的重组BoIFN-γ作用组做对照，将混合液体作用MDBK细胞过夜，100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1小时后换完全培养液，24小时后荧光显微镜观察结果。
2结果
2.1重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ的构建与鉴定
为构建表达BoIFN-γ基因的重组杆状病毒，首先将BoIFN-γ基因亚克隆至pFastBacTM1，构建供体质粒pFastBacTM1-BoIFN-γ，EcoR I和Sal I双酶切后获得约4760bp和550bp两个片段，与理论预期值相符。将pFastBacTM1-BoIFN-γ转化至DH10Bac，经蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组穿梭质粒rBacmid-BoIFN-γ。进一步提取重组质粒rBacmid-BoIFN-γ转染sf9细胞救获重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ，提取病毒基因组DNA，以M13-48f和M13-47r为引物PCR扩增出特异的2.8kb的产物，表明BoIFN-γ基因在杆状病毒中获得重组。
2.2间接IFA检测BoIFN-γ在昆虫细胞的表达
分别以rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞，至细胞病变达90％时收集细胞悬液制备涂片，再分别以1∶100抗BoIFN-γ单克隆抗体和相同稀释倍数的正常小鼠腹水为一抗进行间接IFA检测。结果抗BoIFN-γ单克隆抗体检测rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞均显示强阳性荧光信号(图1A)，而1∶100稀释正常小鼠腹水则荧光信号阴性(图1B)；以野生型杆状病毒感染sf9细胞悬液制备涂片，1∶100倍稀释抗BoIFN-γ单克隆抗体荧光信号也为阴性(图1C)。结果表明BoIFN-γ在昆虫细胞活得表达。
2.3间接ELISA检测BoIFN-γ在昆虫细胞的表达
收取rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞上清作为抗原，分别以1∶5、1∶10、1∶20和1∶40进行稀释，按每孔100u1包被96孔ELISA板，以10倍系列稀释的抗BoIFN-γ单克隆抗体为一抗；1∶2500倍稀释HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗；底物OPD作用15min，2M硫酸终止反应后，测定OD490nm。结果rBac-BoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清5倍、10倍、20倍稀释ELISA结果相近，而40倍稀释OD490nm值明显降低。并且血清1000倍稀释后P/N值仍大于2.0，表明BoIFN-γ在昆虫细胞中获得表达(图2)。
2.4 BoIFN-γ抗病毒活性测定：
利用VSV*GFP-MDBK细胞系统测定重组BoIFN-γ抗病毒活性，以不同浓度重组BoIFN-γ作用MDBK细胞过夜，感染VSV*GFP，24小时后荧光显微镜观察。结果显示：未加重组BoIFN-γ的对照孔出现大量荧光(图3D)，2×104倍稀释重组BoIFN-γ可以完全抑制VSV*GFP的复制，无荧光出现(图3A)，2×105和2×106倍稀释BoIFN-γ可部分抑制VSV*GFP的复制，2×105倍稀释孔的荧光亮度约为对照组的一半(图3B，3C)，测得重组BoIFN-γ活性为2×105IU/ml。(图3中的A：2×10-4稀释B：2×10-5稀释C：2×10-6稀释D：空白对照)
2.5重组BoIFN-γ抗病毒活性阻断试验：
利用VSV*GFP-MDBK细胞系统间接证实BoIFN-γ抗病毒活性，用不同稀释度的鼠抗BoIFN-γ免疫血清与100IU的重组BoIFN-γ室温下反应1小时，作用MDBK细胞过夜，感染VSV*GFP，24小时后荧光显微镜观察。结果表明：重组杆状病毒表达BoIFN-γ的抗病毒活性可以有效地被鼠抗BoIFN-γ免疫血清阻断。完全阻断100IU的VSV*GFP的感染性的有效稀释倍数为64，非免疫鼠血清则完全不能阻断重组BoIFN-γ的抗病毒活性(图4) 。
3讨论：
γ-干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性，人γ-干扰素在临床疾病的防治中早有应用，动物γ-干扰素作为生物制剂或疫苗佐剂也具有较好的应用前景，许多国家已经将动物细胞因子的开发利用作为研究重点。γ-干扰素基因在正常情况下处于抑制状态，只有在某些刺激因子的刺激下才能表达，产量低、纯化困难、成本比较高，难以大量制备，随着基因工程技术的迅速发展，可以利用该技术大量制备γ-干扰素。
传统的干扰素抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定，通过噬斑的数量而确定其活性单位，本研究采用的重组VSV*GFP可以在宿主细胞内复制，并表达绿色荧光蛋白，通过观察荧光强度和数量，即可确定其感染和复制情况。因此，使用VSV*GFP作为攻击病毒，在MDBK细胞上测定重组BoIFN-γ抗病毒活性时，采用测定荧光强度或数量代替传统的噬斑数量计数而确定其活性单位，使得干扰素抗病毒活性的测定更加准确和简便。
本研究构建了含有信号肽序列的BoIFN-γ基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞可高效表达重组BoIFN-γ。以鼠抗BoIFN-γ免疫血清为一抗，间接免疫荧光和间接ELISA证实重组BoIFN-γ蛋白在昆虫细胞中获得表达，并发现进行间接IFA检测BoIFN-γ表达时，荧光主要集中在细胞膜上，胞浆中荧光相对较少，同时利用含有BoIFN-γ基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞上清包被酶标板，进行ELISA试验，结果同样表明，细胞培养上清含有大量重组BoIFN-γ，从而证明大部分重组BoIFN-γ在信号肽的引导下分泌到细胞培养上清中，采用VSV*GFP在MDBK的感染复制抑制试验初步研究了重组BoIFN-γ抗病毒活性。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统采用杆状病毒穿梭载体技术大大缩短了病毒纯化和鉴定的时间，使原来的几个月的时间缩短到几周。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组BoIFN-γ进行了多种翻译后修饰，接近于天然BoIFN-γ，具有较高的生物学活性。而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠，经过简单处理即可以直接应用于畜禽疾病的临床治疗。
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序列表
Bovine IFN-γ碱基序列：
序列号：NM 174086(此为GENEBANK中的原序列号)1(此为优化得到的本发明中的序列号)
序列长度： 510 bp
序列类型： 核酸
链数： 双链
拓扑学： 直链状
序列种类：DNA
起源生物： 牛
生物：真核生物；多细胞动物；脊索动物门；脊椎动物；哺乳类；真兽亚纲；反刍亚目；牛族
序列特征：
表示特征的记号： CDS
存在位置： 10-510
决定特征的方法： 和已知的对比
表示特征的记号： 信号多肽
存在位置： 10-78
决定特征的方法： 和已知的对比
表示特征的记号： 寡肽
存在位置： 79-510
决定特征的方法： 和已知的对比
GCCGCCACC
AAGTACACCTCCTACTTCCTGGCCCTGCTGCT
...................10
GTGCGGCCTGCTGGGCTTCTCCGGCTCCTACGGCCAGGGCCAG
...............................................................................................79
TTCTTCCGCGAGATCGAGAACCTGAAGGAGTACTTCAACGCCTCCTCC
CCCGACGTGGCCAAGGGCGGCCCCCTGTTCTCCGAGATCCTGAAG
AACTGGAAGGACGAGTCCGACAAGAAGATCATCCAGTCCCAGATCGT
GTCCTTCTACTTCAAGCTGTTCGAGAACCTGAAG GACAACCAGGTGAT
CCAGCGCTCCATGGACATCATCAAGCAGGACATGTTCCAGAAGTTCCT
GAACGGCTCCTCCGAGAAGCTGGAGGACTTCAAGAAGCTGATCCAGA
TCCCCGTGGACGACCTGCAGATCCAGCGCAAGGCCATCAACGAGCTG
ATCAAGGTGATGAACGACCTGTCCCCCAAGTCCAACCTGCGCAAGCG
CAAGCGCTCCCAGAACCTGTTCCGCGGCCGCCGCGCCTCCATG
..........................................................................................................510
Bovine IFN-γ氨基酸序列(166aa)
MKYTSYFLALLLCGLLGFSGSYGQGQFFREIENLKEYFNASSPDVAKGGP
LFSEILKNWKDESDKKIIQSQIVSFYFKLFENLKDNQⅥQRSMDIIKQDMF
QKFLNGSSEKLEDFKKLIQIPVDDLQIQRKAINELIKVMNDLSPKSNLRKR
KRSQNLFRGRRASM
Claims (2)
1、牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于将GeneBank中提交的牛γ-干扰素基因序列进行密码子优化并人工合成得到pMD-18T-BoIFN-γ，EcoRI和SalI双酶切pMD-18T-BoIFN-γ，将编码BoIFN-γ基因DNA克隆至pFastBacTM1，构成pFastBacTM1-BoIFN-γ；将pFastBacTM1-BoIFN-γ转化DH10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-BoIFN-γ，制备阳性重组基因组克隆DNA，采用CellfectinRReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，通过杆状病毒系统高水平表达和纯化具生物活性的牛白细胞介素-18；进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)为引物PCR验证BoIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-BoIFN-γ；
上述rBac-BoIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照；分别以1∶100稀释抗BoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗；PBST，0.05％Tween20，洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。
2、根据权利要求1所述的牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于其抗病毒活性的测定采用VSV*GFP-MDBK细胞系统测定重组BoIFN-γ抗病毒活性，以2×104cells/孔密度将MDBK铺于24孔板，待细胞贴壁后，加入2×10～2×106不同稀释度的重组BoIFN-γ(rBac-BoIFN-γ感染sf9细胞上清)，37℃作用过夜；100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1小时后换完全培养液，24小时后荧光显微镜观察结果，以荧光亮度为对照孔50％的最高稀释度为一个单位(IU)。
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2006
- 2006-12-27 CN CN 200610130621 patent/CN100999729A/zh active Pending
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