CN101220376A - 猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定 - Google Patents

Abstract

本发明公开了密码子优化后的猪γ－干扰素基因序列、猪γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定，构建了表达猪γ－干扰素的重组杆状病毒rBac－PoIFN－γ，采用抗PoIFN－γ单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测，表明PoIFN－γ在重组杆状病毒rBac－PoIFN－γ感染的昆虫细胞中获得表达。抗病毒活性试验显示，结果表明：重组PoIFN－γ在重组杆状病毒rBac－PoIFN－γ感染的昆虫细胞中获得良好表达，并具有高效抗病毒活性。

Description

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，涉及猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早，研究最多的细胞因子。根据IFN的细胞来源和结合受体不同，将IFN分为I型和II型。I型IFN主要有α、β两个亚型，分别主要由淋巴细胞和成纤维细胞产生^[1]，它们作用于同一受体，可抑制病毒DNA复制和蛋白质合成，活化NK细胞，促进MHC I类分子提呈抗原。II型IFN为γ-干扰素，主要由T细胞和NK细胞产生^[2]，与I型IFN相比有多种免疫学活性，具有促进MHC II类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强辅助T细胞和细胞毒性T细胞的产生等诸多免疫调节活性，既可以单独作为生物制剂应用于疾病的防治，也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果^[3～4]。PoIFN-γ全基因为501个碱基，编码166个氨基酸，前20个氨基酸为信号肽，后146个氨基酸为成熟多肽，含有两个糖基化位点^[5]。国内外研究表明，PoIFN-γ在抑制猪口蹄疫病毒，蓝耳病病毒和非洲猪瘟病毒的试验中均取得了良好效果^[6～8]。

1990年Dijikmans等首先克隆出PoIFN-γ基因，此后国内外学者利用基因工程技术生产rPoIFN-γ的研究也开始兴起。迄今为止，PoIFN-γ基因已在大肠杆菌^[9]、毕赤酵母^[10]、和兔肾细胞^[11]等细胞中获得表达。与原核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰，表达重组蛋白更接近天然结构。为此，本研究采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System)对PoIFN-γ全基因进行了表达，构建含有PoIFN-γ完整开放阅读框(ORF)的重组杆状病毒，感染sf9细胞表达出具有高效抗病毒活性的rPoIFN-γ。我国是养猪大国，每年因病毒性疾病的爆发给养猪业带来巨大损失，研制出具有抗病毒活性和免疫调节活性的基因工程rPoIFN-γ在猪病防治上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的：采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BACBaculovirus Expression System)对PoIFN-γ全基因进行了高表达，构建含有PoIFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达出具有高效抗病毒活性的重组PoIFN-γ。

为了达到本发明的目的，采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System，由美国Gibco brl公司开发)对IFN-γ全基因进行了表达：构建含有IFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达IFN-γ，通过间接IFA和间接ELISA方法，证实目的蛋白在昆虫细胞中获得表达。并分别采用VSV*GFP-PK15细胞系统通过感染复制抑制试验测定重组猪IFN-γ抗病毒活性，达到2×10⁴IU/ml。

发明效果：

(1)目的蛋白表达的高效性：选用昆虫细胞优势密码子对GENEBANK中提交的猪IFN-γ基因序列进行密码子优化，以便目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中高效表达；

(2)目的蛋白获得的时效性：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中重组病毒的筛选是在大肠杆菌中进行，利用抗性基因和PCR筛选，并采用杆状病毒穿梭载体技术，如此大大缩短了病毒纯化和鉴定的时间，使原来的几个月时间缩短到几周，大大缩短了实验时间；

(3)杆状病毒表达系统是目前颇受欢迎的一种表达系统，它可以进行多种翻译后修饰作用，包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端酰胺化和信号肽的切割、转运，所表达蛋白在结构和功能上与天然蛋白比较接近。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组IFN-γ进行了多种翻译后加工和修饰作用，产物和天然IFN-γ一样可以进行分泌型表达，具有较高的生物学活性。

(4)生物安全性：杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠。

(5)制备方便，成本低廉：重组杆状病毒感染的昆虫细胞能分泌表达IFN-γ，只需经过离心灭活等简单处理程序即可以直接应用于畜禽疾病的临床应用。

(6)抗病毒活性检测方法准确可靠：采用VSV*GFP-PK15细胞系统通过感染复制抑制试验测定重组IFN-γ抗病毒活性。传统的干扰素抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定，通过肉眼或显微镜观察噬斑的数量而确定其活性单位，本实验采用的重组VSV*GFP可以在感染宿主细胞内表达绿色荧光蛋白，通过观察荧光强度和数量，便可确定其感染和复制情况，因此通过测定其荧光强度和数量就可以确定干扰素的活性单位，使得干扰素活性的测定更加准确和简便。

附图说明

图1是IFA检测重组PoIFN-γ在重组杆状病毒感染细胞中的表达图。

图2是间接ELISA检测重组PoIFN-γ在重组杆状病毒感染细胞上清中的表达曲线图。

图3是重组杆状病毒表达PoIFN-γ抑制VSV*GFP在PK15细胞上复制表达图

图4是鼠抗PoIFN-γ免疫血清阻断重组PoIFN-γ抗病毒活性试验结果图。

具体实施方式

实施例1：

1材料和方法

1.1材料

质粒PUC57-PoIFN-γ(PoIFN-γ基因插在Sma I位点)、原核表达质粒pET-30a(+)、供体质粒pFastBac^TM1(Invitrogen)；DH_10Bac感受态细胞(Invitrogen)，sf9细胞系，PK-15细胞，骨髓瘤细胞(SP2/0)均由本实验室保存。Grace’s培养基，DMEM培养基；转染试剂(Cellfectin Reagent)购于Invitrogen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自Sigma公司。引物(PoIFN-γ-f、PoIFN-γ-r；M13-48f、M13-47r)由上海博亚生物有限公司合成。表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV *GFP由本实验室构建、滴定并保存。

1.2抗PoIFN-γ单克隆抗体的制备：

以原核表达载体构建引物

(PoIFN-γ-f 5’TCTCGAATTCCAGGCCCCCTTCTTCA 3’；PoIFN-γ-r5’CCTACTGTCGACATATTGGAGGCACG 3’)扩增PoIFN-γ不包含信号肽序列的455bp基因片段，将PCR扩增目的片段EcoR I和Sal I限制酶双酶切后克隆于原核表达质粒pET-30a(+)EcoR I和Sal I位点，PoIFN-γ蛋白表达框架与His标签融合。转化BL21，IPTG诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白表达，Ni化琼脂糖柱纯化。原核表达重组PoIFN-γ蛋白作为抗原按10ug/只的剂量腹腔和后肢肌肉注射免疫BALB/c小鼠，首免弗氏完全佐剂乳化，二免、三免弗氏不完全佐剂乳化，间隔时间三周，第三次免疫后(采血分离血清，制备鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清)，加强免疫一次后三天取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞，经3次有限稀释，最终获得1株稳定分泌抗PoIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，测定效价，-20℃保存备用。

1.3表达rPoIFN-γ重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ的构建与鉴定

Sal I和Kpn I双酶切pUC57-PoIFN-γ，将编码PoIFN-γ完整ORF克隆至供体质粒pFastBac^TM1，构建pFastBac^TM1-PoIFN-γ(pFast-PoIFN-γ)。将pFast-PoIFN-γ转化至DH_10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ，制备高纯度阳性重组穿梭质粒，采用Cellfectin^RReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献^[12]进行重组病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，以M13-48f、M13-47r为引物PCR验证PoIFN-γ基因在重组病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-PoIFN-γ。扩增种毒，进行效价滴定后，4℃保存备用。

1.4间接免疫荧光检测PoIFN-γ表达

上述rBac-PoIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释抗PoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗。PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。

1.5间接ELISA检测PoIFN-γ表达：

收取rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞上清作为抗原，以Na₂CO₃、NaHCO₃(pH＝9.6)缓冲液分别做1∶5、1∶10、1∶20、1∶40稀释，按每孔100ul包被96孔ELISA板(Costar)，4℃过夜；10％脱脂乳封闭；以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗，并将其做1∶10²～1∶10⁷系列稀释；1∶2500稀释HPR标记山羊抗鼠IgG为二抗；另设1∶5稀释野生杆状病毒感染细胞上清包被阴性对照；PBST洗涤，底物OPD作用15min，2M硫酸终止反应后，测定OD_490nm(Bio-Rad，Benchmark plus)。每个稀释度至少设3个平行孔，取平均值。

1.6重组PoIFN-γ抗病毒活性测定：

按文献^[13]，用VSV*GFP-PK-15细胞系统测定rPoIFN-γ抗病毒活性，以2×10⁴cells/孔密度将PK-15细胞铺于24孔板，待细胞贴壁后，加入2×10～2×10⁶不同倍数稀释rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞的培养上清(rPoIFN-γ)和2×10～2×10⁶不同倍数稀释野生杆状病毒感染细胞的培养上清，37℃作用过夜，并设空白对照。100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1h后换完全培养液，24h后荧光显微镜观察结果，以荧光亮度为对照组50％的最高稀释度为一个抗病毒单位(IU)。

1.7重组PoIFN-γ抗病毒活性阻断试验

以2×10⁴cells/孔密度将PK-15细胞铺于24孔板，待细胞贴壁后，取100IU的rPoIFN-γ与不同稀释度的鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清室温作用1h，同时设非免疫小鼠血清与100IU的rPoIFN-γ作用对照组，将混合液体作用PK-15细胞过夜，100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1h后换完全培养液，24h后荧光显微镜观察结果。

2结果

2.1重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ的构建与鉴定

为构建表达PoIFN-γ基因的重组杆状病毒，首先将PoIFN-γ完整ORF克隆至供体质粒pFastBac^TM1，构建pFast-PoIFN-γ，EcoR I和HindIII双酶切后获得约4700bp和560bp两个片段，与理论预期值相符。将pFastBac^TM1-PoIFN-γ转化至DH_10Bac，经蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ。进一步提取重组质粒rBacmid-PoIFN-γ转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ，提取病毒基因组DNA，以M13-48f和M13-47r为引物进行PCR鉴定，扩增出特异的2.8kb的产物，表明PoIFN-γ基因在杆状病毒中获得重组。

2.2间接IFA检测rPoIFN-γ的表达

分别以rBac-PoIFN-γ和野生杆状病毒感染sf9细胞，至细胞病变达90％时收集细胞制备涂片，再分别以1∶100抗PoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的注射SP2/0小鼠腹水为一抗进行间接IFA检测。结果抗PoIFN-γ单克隆抗体检测rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞均显示强荧光信号，并且荧光主要集中在细胞膜上(图1A)，而1∶100稀释注射SP2/0小鼠腹水则荧光信号阴性(图1B)；以野生型杆状病毒感染sf9细胞制备涂片，1∶100稀释抗PoIFN-γ单克隆抗体荧光信号也为阴性(图1C)，结果表明rPoIFN-γ在sf9细胞中获得表达。

2.3间接ELISA检测rPoIFN-γ的表达

收取rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞上清作为抗原，分别以1∶5、1∶10、1∶20和1∶40进行稀释，按每孔100ul包被96孔ELISA板，以10倍系列稀释的抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗；1∶2500倍稀释HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗；底物OPD作用15min，2M硫酸终止反应后，测定OD_490nm。结果表明：rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清5倍、10倍、20倍稀释ELISA OD_490nm值相近，而40倍稀释OD_490nm值明显降低，并且血清1000倍稀释后P/N值仍大于2.0(图2)，表明rPoIFN-γ在sf9细胞中获得表达。

2.4间接ELISA检测rPoIFN-γ的表达

收取rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞上清作为抗原，分别以1∶5、1∶10、1∶20和1∶40进行稀释，按每孔100ul包被96孔ELISA板，以10倍系列稀释的抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗；1∶2500倍稀释HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗；底物OPD作用15min，2M硫酸终止反应后，测定OD_490nm。结果表明：rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清5倍、10倍、20倍稀释ELISA OD_490nm值相近，而40倍稀释OD_490nm值明显降低，并且血清1000倍稀释后P/N值仍大于2.0(图2)，表明rPoIFN-γ在sf9细胞中获得表达。

2.5重组PoIFN-γ抗病毒活性阻断试验

利用VSV*GFP-PK-15细胞系统间接证实rPoIFN-γ抗病毒活性，用不同稀释度的鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清与100IU的rPoIFN-γ室温下结合1h，作用PK-15细胞过夜，感染VSV*GFP，24h后荧光显微镜观察。结果表明：rPoIFN-γ的抗病毒活性可以有效地被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清阻断。完全阻断100IU的VSV*GFP感染性的有效稀释倍数为128，非免疫鼠血清则完全不能阻断rPoIFN-γ的抗病毒活性(图4)。

3讨论

γ-干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性，人γ-干扰素在临床疾病的防治中早有应用，动物γ-干扰素作为生物制剂或疫苗佐剂也具有较好的应用前景，许多国家已经将动物细胞因子的开发利用作为研究重点。γ-干扰素基因在正常情况下处于抑制状态，只有在某些刺激因子的刺激下才能表达，产量低、纯化困难、成本比较高，难以大量制备，随着基因工程技术的迅速发展，可以利用该技术大量制备γ-干扰素。

本研究构建了含有PoIFN-γ完整ORF的重组杆状病毒，感染sf9细胞有效表达出rPoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗，间接IFA和间接ELISA证实rPoIFN-γ在sf9细胞中获得良好表达，进行间接IFA检测PoIFN-γ表达时，发现荧光主要集中在细胞膜上，胞浆中荧光相对较少。同时利用rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞培养上清为包被抗原进行间接ELISA试验的OD_490nm明显高于以rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞裂解物，结果表明，细胞培养上清含有大量rPoIFN-γ，rPoIFN-γ在信号肽的引导下被分泌到细胞培养上清中，为以后rPoIFN-γ的提纯提供便利。

传统的IFN抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定，通过噬斑的数量而确定其活性单位，本研究采用的重组VSV*GFP可以在宿主细胞内复制，并表达绿色荧光蛋白，通过观察荧光强度和数量确定其感染和复制情况，即可测定rPoIFN-γ的抗病毒活性。因此，使用VSV*GFP作为攻击病毒，在PK15细胞上测定rPoIFN-γ抗病毒活性时，采用测定荧光强度或数量代替传统的噬斑数量计数而确定其活性单位，使得IFN抗病毒活性的测定更加准确和简便。采用VSV*GFP在PK15的感染复制抑制试验初步研究了rPoIFN-γ抗病毒活性，并证实rPoIFN-γ具有高效抗病毒活性，rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞上清抗病毒效价可达2×10⁴IU/ml，而相同倍数稀释的野生杆状病毒感染细胞上清不具有抗病毒活性，仅在20倍稀释时能非特异性的部分抑制VSV*GFP在PK15中的复制。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统采用杆状病毒穿梭载体技术大大缩短了病毒纯化和鉴定的时间，使原来的几个月时间缩短到几周。重组杆状病毒感染sf9细胞表达的rPoIFN-γ进行了多种翻译后修饰，接近于天然PoIFN-γ，具有较高的生物学活性，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠，经过简单处理即可以直接应用于畜禽疾病的临床治疗。

参考文献

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序列表

Porcine IFN-γ碱基序列：

序列号：DQ 839398(此为GENEBANK中的原序列号)

        1(此为优化得到的本发明中的序列号)

序列长度：515bp

序列类型：核酸

链数：双链

拓扑学：直链状

序列种类：mRNA

起源生物：猪

生物：真核生物；多细胞动物；脊索动物门；脊椎动物；哺乳类；真兽亚纲；

      猪

序列特征：

表示特征的记号：CDS.

存在位置：10-510

决定特征的方法：和已知的对比

表示特征的记号：信号多肽

存在位置：10-69

决定特征的方法：和已知的对比

表示特征的记号：寡肽

存在位置：70-510

决定特征的方法：和已知的对比

GCCGCCACCATGTCCTACACCACCTACTTCCTGGCCTTCCAGCT

..........................10

GTGCGTGACCCTGTGCTTCTCCGGCTCCTACTGCCAGGCCCCCT

......................................................................70

TCTTCAAGGAGATCACCATCCTGAAGGACTACTTCAACGCCTCCACCT

CCGACGTGCCCAACGGCGGTCCCCTGTTCCTCGAGATCCTGAAGAACT

GGAAGGAGGAGTCCGACAAGAAGATCATCCAGTCCCAGATCGTGTCC

TTCTACTTCAAGTTCTTCGAGATCTTCAAGGACAACCAGGCCATCCAG

CGCTCCATGGACGTGATCAAGCAGGACATGTTCCAGCGCTTCCTGAAC

GGCTCCTCCGGCAAGCTGAACGACTTCGAGAAGCTGATCAAGATCCC

CGTGGACAACCTGCAGATCCAGCGCAAGGCCATCTCCGAGCTGATCA

AGGTGATGAACGACCTGTCCCCCCGCTCCAACCTGCGCAAGCGCAAG

CGCTCCCAGACCATGTTCCAGGGCCAGCGTGCCTCCAAGTAATACTG

....................................................................................................510

Porcine IFN-γ氨基酸序列(166aa)

MSYTTYFLAFQLCVTLCFSGSYCQAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPL

FLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQR

FLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRS

QTMFQGQRASK

Claims (2)

1.猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于将GeneBank中提交的猪γ-干扰素基因序列进行密码子优化并人工合成得到PUC57-PoIFN-γ(PoIFN-γ基因插在Sma I位点)，Sal I和KpnI双酶切PUC57-PoIFN-γ，将编码PoIFN-γ基因DNA克隆至pFastBac^TM1，构成pFastBac^TM1-PoIFN-γ；将pFastBac^TM1-PoIFN-γ转化DH_10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组杆状病

毒基因组克隆rBacmid-PoIFN-γ，制备阳性重组基因组克隆DNA，采用Cellfectin^RReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献^[12]介绍的方法，进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)为引物PCR验证PoIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-PoIFN-γ；

上述rBac-PoIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释抗PoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗；PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。

2.根据权利要求1所述的猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于其抗病毒活性的测定采用VSV*GFP-PK15细胞系统测定重组PoIFN-γ抗病毒活性，以2×10⁴cells/孔密度将PK15铺于24孔板，待细胞贴壁后，加入2×10～2×10⁶不同稀释度的重组PoIFN-γ(rBac-PoIFN-γ感染sf9细胞上清)，37℃作用过夜。100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1小时后换完全培养液，24小时后荧光显微镜观察结果，以荧光亮度为对照孔50％的最高稀释度为一个单位(IU)。

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