CN110643579A - 槟榔坏死环斑病毒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种槟榔坏死环斑病毒，该病毒命名为槟榔坏死环斑病毒ANRSV‑XC1，藏编号为CCTCC NO：V201829。本发明还提供了该病毒的检测方法，包含三方面：确立了核酸检测所需要的引物序列；确立了检测反应种类；确立了检测反应体系和反应条件。本发明从槟榔叶片中分离到的病毒，与已报道的马铃薯Y病毒科病毒都有显著不同，为马铃薯Y病毒科的一个新病毒属，为研究槟榔坏死环斑病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。而且本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

Description

槟榔坏死环斑病毒及其检测方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及槟榔坏死环斑病毒及其检测方法。
背景技术
槟榔在海南是仅次于橡胶的第二大热带经济作物，被称为“绿金”，种植面积近140万亩，其产量占全国95％的份额，全省近230万农民种植槟榔并以此为生，其病虫害防治一直是政府、农户及科研机构最为关注的问题之一，而植物病毒病是目前病害中危害最大,防治最难的一类病害。而在最近的调研中，发现在定安、万宁、保亭等地，槟榔坏死环斑病毒病的发生率超30％，从槟榔叶片中分离到的病毒，经克隆测序并进入National Center forBiotechnology Information对比，发现其与已报道的马铃薯Y病毒科病毒都有显著不同，马铃薯Y病毒科是仅次于双生病毒科的第二大病毒科，该科病毒大多寄主范围广泛，常给农业生产带来严重危害。根据2017年International Committeeon Taxonomy of Viruses修订的分类系统，该科包括8个属，依据International Committeeon Taxonomy of Viruses的马铃薯Y病毒科属种划分的定义，该病毒可以作为马铃薯Y病毒科的一个新病毒属。
该病毒为线状病毒，长约800nm，宽约15nm，典型症状表现为病株中部和下部叶片出现褪绿环斑和坏死环斑，发病后期病斑蔓延扩展致使叶片坏死，影响植株生长。
病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外并未报道发现该属病毒，也无针对该属病毒的核酸检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种槟榔坏死环斑病毒及其检测方法。一方面该病毒为研究槟榔坏死环斑病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。另一方面本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。
本发明的第一个方面是提供了一种槟榔坏死环斑病毒，该病毒命名为槟榔坏死环斑病毒(Areca palm necrotic ring-spot virus)ANRSV-XC1，于2018年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V201829。该病毒基因组全序列已上传至National Centerfor Biotechnology Information，编号为MH395371。
本发明的第二个方面是提供一种如本发明第一个方面所述的槟榔坏死环斑病毒的检测方法：
针对病毒基因组中保守区域设计引物对，进行聚合酶链式反应，反应产物进行凝胶电泳检测，如果出现相应的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性；其中，所述引物对为：
上游引物ANRSV CP 390F：5’-GGTGTCAGATAATGGAACAAGT-3’，
下游引物ANRSV CP 830R：5’-CATGATCATAGCATGGCCAGT-3’；
相应的核酸电泳条带为440bp。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，聚合酶链式反应的反应体系和反应条件如下：
在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.5微升、2×Taq PCR Mix聚合酶链式反应混合液12.5微升(含有0.1U Taq Polymerase/μl、500μM dNTP each、20mMTris-HCl、100mMKCl、3mM MgCl2、其他稳定剂和增强剂)、所合成的浓度为10μmol/L的上游引物0.5微升、浓度为10μmol/L的下游引物0.5微升、需要检测的槟榔叶片总cDNA2微升；
然后将聚合酶链式反应体系密闭进行聚合酶链式反应，反应条件步骤为：第一步，94摄氏度3分钟；第二步，94摄氏度30秒；第三步，51.9摄氏度30秒；第四步，72摄氏度30秒；第五步，72摄氏度10分钟，其中第二步至第四步进行30个循环；
反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约440个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
本发明的第三个方面是提供一种用于检测如本发明第一个方面所述的槟榔坏死环斑病毒的引物对，所述引物对为：
上游引物ANRSV CP 390F：5’-GGTGTCAGATAATGGAACAAGT-3’，
下游引物ANRSV CP 830R：5’-CATGATCATAGCATGGCCAGT-3’。
本发明的第四个方面是提供一种用于检测如本发明第一个方面所述的槟榔坏死环斑病毒的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第三个方面所述的引物对。
本发明的第五个方面是提供如本发明第三个方面所述的引物对在检测如本发明第一个方面所述的槟榔坏死环斑病毒中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第三个方面所述的引物对在制备用于检测如本发明第一个方面所述的槟榔坏死环斑病毒中的试剂中的应用。
本发明从槟榔叶片中分离到的病毒，与已报道的马铃薯Y病毒科病毒都有显著不同，为马铃薯Y病毒科的一个新病毒属，为研究槟榔坏死环斑病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。而且本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。
附图说明
图1为槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)cDNA全序列与马铃薯Y病毒科各属具有代表性病毒的核苷酸序列同源性对比系统发育树。
图2为感染槟榔坏死环斑病毒病初期、中期、后期症状，左图为初期，中间两图为中期，右图为后期。
图3从槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)阳性样品PCR扩增产物电泳图，1泳道为阳性样品条带的位置(440bp)，100bp位置为引物二聚体。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。
本发明的病毒从槟榔叶片中分离到，该病毒命名为槟榔坏死环斑病毒(Arecapalm necrotic ring-spot virus)ANRSV-XC1，于2018年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201829。该病毒基因组全序列已上传至National Centerfor Biotechnology Information，编号为MH395371。
马铃薯Y病毒科是仅次于双生病毒科的第二大病毒科，该科病毒大多寄主范围广泛，常给农业生产带来严重危害。根据2017年International Committeeon Taxonomy ofViruses修订的分类系统，该科包括8个属。本发明的病毒经克隆测序并进入NationalCenter for Biotechnology Information对比，发现其与已报道的马铃薯Y病毒科病毒都有显著不同，依据International Committeeon Taxonomy of Viruses的马铃薯Y病毒科属种划分的定义，该病毒可以作为马铃薯Y病毒科的一个新病毒属(图1)。该病毒为线状病毒，长约800nm，宽约15nm，典型症状表现为病株中部和下部叶片出现褪绿环斑和坏死环斑，发病后期病斑蔓延扩展致使叶片坏死，影响植株生长(图2)。
病毒检测：
第一步(合成引物)：针对病毒基因组中保守区域设计引物对：
上游引物ANRSV CP 390F：5’-GGTGTCAGATAATGGAACAAGT-3’，
下游引物ANRSV CP 830R：5’-CATGATCATAGCATGGCCAGT-3’。
第二步(检测反应种类)：普通的聚合酶链式反应(通常，这类反应产物用核酸电泳进行检测)；目前，普通逆转录-聚合酶链式反应和荧光逆转录-聚合酶链式反应最有推广价值，本发明两种方式均可使用。
第三步(配置反应体系)：以普通-聚合酶链式反应为例，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.5微升、2×Taq PCR Mix聚合酶链式反应混合液12.5微升(含有0.1U TaqPolymerase/μl、500μM dNTP each、20mM Tris-HCl、100mM KCl、3mM MgCl2、其他稳定剂和增强剂)、第一步所合成的浓度为10μmol/L的上游引物0.5微升、浓度为10μmol/L的下游引物0.5微升、需要检测的槟榔叶片总cDNA 2微升；
然后将聚合酶链式反应体系密闭，置于聚合酶链式反应仪器(国内常称为PCR仪)进行聚合酶链式反应，反应条件步骤为：第一步，94摄氏度3分钟；第二步，94摄氏度30秒；第三步，51.9摄氏度30秒；第四步，72摄氏度30秒；第五步，72摄氏度10分钟，其中第二步至第四步进行30个循环；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约440个碱基对的核酸电泳条带(图3)，则判断为阳性，否则判断为阴性。
实际应用结果：对300份感染本发明的槟榔坏死环斑病毒ANRSV-XC1的阳性样品进行检测，以及300份未感染本发明的槟榔坏死环斑病毒ANRSV-XC1的阴性样品，用上述检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 槟榔坏死环斑病毒及其检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgtcagat aatggaacaa gt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgatcata gcatggccag t 21

Claims (7)

1.一种槟榔坏死环斑病毒，其特征在于，该病毒命名为槟榔坏死环斑病毒ANRSV-XC1，于2018年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201829。
2.一种如权利要求1所述槟榔坏死环斑病毒的检测方法，其特征在于，针对病毒基因组中保守区域设计引物对，进行聚合酶链式反应，反应产物进行凝胶电泳检测，如果出现相应的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性；其中，所述引物对为：
上游引物ANRSV CP 390F：5’-GGTGTCAGATAATGGAACAAGT-3’，
下游引物ANRSV CP 830R：5’-CATGATCATAGCATGGCCAGT-3’；
相应的核酸电泳条带为440bp。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，聚合酶链式反应的反应体系和反应条件如下：
在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.5微升、2×Taq PCR Mix聚合酶链式反应混合液12.5微升(含有0.1U Taq Polymerase/μl、500μM dNTP each、20mM Tris-HCl、100mMKCl、3mM MgCl2、其他稳定剂和增强剂)、所合成的浓度为10μmol/L的上游引物0.5微升、浓度为10μmol/L的下游引物0.5微升、需要检测的槟榔叶片总cDNA2微升；
然后将聚合酶链式反应体系密闭进行聚合酶链式反应，反应条件步骤为：第一步，94摄氏度3分钟；第二步，94摄氏度30秒；第三步，51.9摄氏度30秒；第四步，72摄氏度30秒；第五步，72摄氏度10分钟，其中第二步至第四步进行30个循环；
反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约440个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
4.一种用于检测如权利要求1所述槟榔坏死环斑病毒的引物对，其特征在于，所述引物对为：
上游引物ANRSV CP 390F：5’-GGTGTCAGATAATGGAACAAGT-3’，
下游引物ANRSV CP 830R：5’-CATGATCATAGCATGGCCAGT-3’。
5.一种用于检测如权利要求1所述槟榔坏死环斑病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的引物对。
6.如权利要求4所述的引物对在检测如权利要求1所述槟榔坏死环斑病毒中的应用。
7.如权利要求4所述的引物对在制备用于检测如权利要求1所述槟榔坏死环斑病毒中的试剂中的应用。
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