CN112458209B - 一种玉米致死性坏死病多重rpa检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病毒检测方法领域，特别涉及一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，包括样品的核酸提取，反转录，RPA反应特异性检测，电泳，判断样品是否携带MCMV和SCMV两种病毒。本发明的方法特异性良好，灵敏度较高，反应时间短。

Description

一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法
技术领域
本发明属于植物病毒检测方法领域，特别涉及一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法。
背景技术
甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，主要由蚜虫以非持久性方式传播，也可汁液和种子传播。SCMV侵染植物后在叶片表面形成花叶症状，也可造成植株矮化，引起玉米矮花叶病。玉米矮花叶病属于世界性病毒病害，其中甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的优势株系。
玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，主要由汁液、介体甲虫、蓟马传播，也可种传。MCMV侵染植物后可造成寄主植物叶片褪绿、斑驳，也可造成坏死斑点、卷曲、叶尖坏死、矮化等症状。MCMV是我国重要的检疫性有害生物。在我国，MCMV和SCMV复合侵染引起玉米致死性坏死病(Maize lethal necrosis disease,MLND)，造成玉米产量损失惨重。
目前，检测SCMV的方法主要有血清学检测、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等；MCMV的检测方法主要有血清学检测、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)等。血清学检测方法是一种用于常规检测的有效方法，但是该方法需要特异性的抗体，制作抗体过程繁琐、费时较长。利用分子生物学建立的RT-PCR、RT-LAMP方法检测结果更为快速、灵敏，但所需要的检测设备和探针试剂成本较高。
RPA(Recombinase polymerase amplification)是一种新型的DNA等温扩增技术，可以灵敏、特异、快速地扩增模板DNA，也可现场检测植物病毒，目前尚未发现利用RPA技术同时检测两种植物病毒的报道。
发明内容
本发明提供的一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，特异性良好，灵敏度较高，反应时间短，使得整个检测方法高效、便捷、省时。
本发明提供了一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，包括以下步骤：
S1，提取样品的总RNA；
S2，对S1提取的总RNA进行反转录；
S3，RPA反应特异性检测：用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物进行RPA扩增；
所述甘蔗花叶病毒的特异性RPA引物为SCMV-F，SCMV-R，玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物为MCMV-F和MCMV-R；
SCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.1所示；
5’-CAAGATATATCAAACACTAGAGCAACTAAG-3’
SCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.2所示；
5’-GAAGTCATTTCATAGAAATCGAAAGCATAC-3’
MCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.3所示；
5’-CTCTCCGATTACATGTTATCAATACCCACTG-3’
MCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.4所示。
5’-CACAATGAATCGTCCTGGGGAATACATTTG-3’
S4，对RPA产物纯化后进行电泳检测；
S5，判断样品是否携带MCMV和SCMV两种病毒，若携带则检测到玉米致死性坏死病。
进一步的，S3中，所述RPA扩增具体为：向含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，去离子水6.4μl，上、下游引物各2.4μl，模板cDNA各1μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl，充分混匀后于38℃的水浴锅中反应30min，然后将PCR产物进行纯化。
进一步的，引物终浓度为0.4μmol/L，醋酸镁溶液浓度为280mmol/L。
进一步的，S5中，甘蔗花叶病毒扩增条带为388bp，玉米褪绿斑驳病毒扩增条带为206bp。
进一步的，S5中，判断标准为：电泳结果中，若只检测到大小为206bp的一条条带，则说明检测到玉米褪绿斑驳病毒；
若只检测到大小为388bp的一条条带，则说明检测到甘蔗花叶病毒；
若同时检测到206bp和388bp的两条条带，则说明检测到玉米褪绿斑驳病毒和甘蔗花叶病毒两种病毒，即检测到玉米致死性坏死病；
若无目标条带，则未检出以上两种病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明提供一种玉米致死性坏死病诊断及病原物检测的多重RPA方法，通过对核酸提取、RPA反应条件优化，改良为一套快速高效的诊断和检测方法，该检测方法在38℃恒温条件下只需要30min即可得到诊断和检测结果，RPA设备简单，金属浴即可满足反应条件，且灵敏性和特异性与PCR相当，并且其产物可以测序鉴定，也可以通过在反应中加入相应探针鉴定，从而保证其特异性，非常适合基层及发病现场病原体快速检测。
2、本发明建立了同时快速检测SCMV和MCMV的RPA方法，RPA方法特异性良好，灵敏度较高，还具有高效、便捷、省时的优点，为田间和基层实验室快速诊断玉米致死性坏死病和同时检测SCMV和MCMV提供了一种新方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同反应时间下获得的DNA扩增结果。
其中，M为8,000bp DNA Marker；
泳道1-5分别为10，20，30，40，50min反应时间。
图2为SCMV和MCMV的RPA反应的特异性验证；
其中，M为8,000bp DNA Marker；
1-8分别为：SCMV和MCMV复合侵染的玉米叶片、SCMV侵染的玉米叶片、MCMV侵染的玉米叶片、MaYMV侵染的玉米叶片、RBSDV侵染的玉米叶片、SrMV侵染的玉米叶片、健康玉米叶、ddH2O。
图3为RPA反应灵敏度检测；
其中，M：8,000bp DNA Marker；1-9：模板分别为109、108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/微升的SCMV与MCMV混合质粒；10：以ddH2O为模板的阴性对照；
图3(A)为RPA检测结果，图3(B)为PCR检测结果。
图4为田间样品的检测结果；
其中，M：8,000bp DNA Marker；泳道1为阳性对照，泳道1为ddH2O，泳道2为健康玉米叶、泳道3为阳性对照(SCMV和MCMV复合侵染的玉米叶片)泳道4-10为田间样品玉米叶片；
图4(A)表示RPA检测结果，图4(B)表示PCR检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
一，SCMV和MCMV的特异性引物的确定：
参考SCMV基因组(GenBank号：KT736022.1、KR611106.1、AY042184.1、AJ310109.1、AJ271085.1、AJ310111.1、AJ310106.1、AJ421461.1、AJ421463.1AJ310107.1)和MCMV基因组(GenBank号：MH645620.1、X14736.2、EU358605.1、MK491605.1、MN756483.1、MK684213.1、MK684203.1、MK684201.1、MF467375.1、MH205605.1)序列，根据RPA引物的设计原则，利用软件及人工修正设计同时检测SCMV和MCMV的特异性RPA引物对SCMV-F/SCMV-R和MCMV-F/MCMV-R，引物序列见表1；
所述甘蔗花叶病毒的特异性RPA引物为SCMV-F，SCMV-R，玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物为MCMV-F和MCMV-R；
SCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.1所示；
5’-CAAGATATATCAAACACTAGAGCAACTAAG-3’
SCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.2所示；
5’-GAAGTCATTTCATAGAAATCGAAAGCATAC-3’
MCMV-F的引物序列如SEQ ID NO.3所示；
5’-CTCTCCGATTACATGTTATCAATACCCACTG-3’
MCMV-R的引物序列如SEQ ID NO.4所示。
5’-CACAATGAATCGTCCTGGGGAATACATTTG-3’
表1同时检测SCMV和MCMV的特异性RPA引物
Figure BDA0002814912350000051
二，玉米样品核酸的快速提取，具体过程如下：
在洗净灭菌的研钵中放入0.1g样品材料加液氮研磨，再加入1mL Trizol Reagent试剂混匀，将以上匀浆样本转移到2ml RNase-free的离心管中，加盖好后剧烈震荡混匀，室温放置5min；加入0.2mL氯仿，上下颠倒混匀15s，室温放置5min；4℃，12,000rpm，离心10min，将上层无色水相转入新的1.5ml RNase-free离心管；加入等体积异丙醇(约400-500μL)，混匀，室温静置10min；4℃，12,000rpm，离心10min；小心弃去上清，得到胶状RNA沉淀；加入1mL 75％无水乙醇(RNase-free ddH2O配置)，混匀，使RNA与乙醇充分接触；4℃，7,500rpm，离心5min；小心弃去上清液；置于空气中3-5min，干燥RNA沉淀；加入适量RNase-free ddH2O溶解，待浓度测定和电泳检测后于-80℃保存；
所述样品材料为以SCMV和MCMV侵染的玉米叶片；
通过超微量分光光度计检测，总RNA的浓度为857.3-1183.6ng/μl；总RNA的A260/A280和A260/A230的比值分别1.93-2.06和1.76-1.93；
三，反转录
取总核酸2μl(约2μg RNA)为模板，加入0.5μl Oligo dT(0.5μg/μl)、0.5μl随机引物(0.5μg/μl)和1μl dNTPs(10mM)，DEPC水定容至14.5μl，70℃反应5min，冰上放置3-5min；加入4μl 5×反转录buffer、0.5μl Ribonuclease Inhibitor(40U/μl)和1μl M-MLV反转录酶(200U/μl)，混匀后42℃水浴1h。获得的cDNA置于-20℃保存；
四，RPA反应时间的优化
以总RNA反转录制备的cDNA为模板，采用SCMV-F/SCMV-R和MCMV-F/MCMV-R进行RPA扩增。RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管(TwistAmp Basickits，Twist)中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μl，去离子水6.4μl，上、下游引物各2.4μl(终浓度为0.4μmol/L)，模板cDNA各1μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/L)。将RPA扩增体系充分混匀，置于38℃的水浴锅中分别反应10min、20min、30min、40min、50min。RPA反应结束后，PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果。
结果表明，如图1所示，在10min的反应后，出现了两条清晰的预期大小的条带(206bp、388bp)，DNA条带的密度分析表明，30min反应后获得的DNA产率是20min反应的2倍，而40min和50min的产物之间没有显著差异，因此，将30min作为所有常规RT-RPA检测的反应时间。
五，RPA反应特异性检测
为验证RPA反应体系的特异性，分别以水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked-dwarf virus,RBSDV)，玉米黄花叶病毒(Maize yellow mosaic virus,MaYMV)及高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)侵染的玉米材料为对照进行RPA扩增；
采用1.5％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，利用凝胶成像系统观察电泳结果，对RPA反应体系的特异性进行验证。
结果表明，非目的病原物侵染的玉米材料不能扩增出条带，说明本发明设计的检测体系特异性强。
六，RPA反应灵敏度检测
将RPA特异性引物扩增得到的产物连接到T载体上进行测序，测序正确后提取质粒，SCMV的质粒浓度1.22*1011拷贝/微升，MCMV的质粒浓度3.88*1010拷贝/微升，将SCMV和MCMV的质粒稀释混合成浓度为109拷贝/微升后分别稀释为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/微升，以稀释的质粒为模板进行RPA检测，确定最低检测限度，并同时使用PCR反应进行比较。
结果表明，RPA方法可检测102拷贝/微升浓度模板的MCMV和SCMV，比PCR方法灵敏度高10倍。
七，RPA在田间样品中的应用
按照上述方法对采自田间的部分样品进行RT-RPA检测；同时，以普通RT-PCR法对同一批样品进行平行检测，并对结果进行观察比对分析并记录。
结果表明，7份样品中，3份检测为SCMV和MCMV复合侵染，诊断为MLND；2份检测为SCMV或MCMV单独侵染，2份检测为无SCMV或MCMV侵染，检测结果与PCR结果一致。
多重RPA检测引物扩增得到的病毒序列如下：
由SCMV-F和SCMV-R引物序列扩增得到的SCMV病毒序列如SEQ ID NO.5所示；
由MCMV-F和MCMV-R引物序列扩增得到的MCMV病毒序列如SEQ ID NO.6所示；
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caagatatatcaaacactagagcaactaag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagtcatttcatagaaatcgaaagcatac 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctctccgatt acatgttatc aatacccact g 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacaatgaatcgtcctggggaatacatttg 30
<210> 5
<211> 390
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 5
gaagtcattt catagaaatc aaaagcatac cgcgctaagc tatagtcggtgagatttcgc 60
tgaagaccgt atcttggcat gtatcgctct gtagagtttc ggtactctatatacgcttca 120
gctgcatcac taaaatgatg cattatctgt cggaaagttg gagatgcgttctcaatgact 180
ggctttaatg ggaaaaccct ttgttcgtct ccgtccatca tcgtccaatttccgtttatg 240
tttggtgagc aaccattttc gatgcaccat accatgagac cactcatgacaactgtcatt 300
tgtgtgtcat caatttcgta ctccttcttt atggcatcgt accatctatcaaactcttcc 360
ttagttgctctagtgtttgatatatcttga 390
<210> 6
<211> 208
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 6
ctctccgatt acatgttatc aatacccact ggggtggagg atgttgccaggatcgtgccc 60
tcagctacaa tagctctgaa gaacagaggg ccatccattg tcatgccacagaaccgcact 120
gtgttcaggt gtatacaggc tggtcagttt gctgcattgg gcagcgccgctgacaagcaa 180
atgtattccccaggacgattcattgtga 208

Claims (4)

1.一种玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取样品的总RNA；
S2，对S1提取的总RNA进行反转录；
S3，RPA反应特异性检测：用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物进行RPA扩增；
所述甘蔗花叶病毒的特异性RPA引物为SCMV-F，SCMV-R，玉米褪绿斑驳病毒的特异性RPA引物为MCMV-F和MCMV-R；
SCMV-F的引物序列如SEQ ID NO. 1所示；
SCMV-R的引物序列如SEQ ID NO. 2所示；
MCMV-F的引物序列如SEQ ID NO. 3所示；
MCMV-R的引物序列如SEQ ID NO. 4所示；
S4，对RPA产物纯化后进行电泳检测；
S5，判断样品是否携带MCMV和SCMV两种病毒，若携带则检测到玉米致死性坏死病；
具体判断标准为：电泳结果中，若只检测到大小为206bp的一条条带，则说明检测到玉米褪绿斑驳病毒；
若只检测到大小为388bp的一条条带，则说明检测到甘蔗花叶病毒；
若同时检测到206bp和388bp的两条条带，则说明检测到玉米褪绿斑驳病毒和甘蔗花叶病毒两种病毒，即检测到玉米致死性坏死病；
若无目标条带，则未检出以上两种病毒。
2.如权利要求1所述的玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，其特征在于，S3中，所述RPA扩增具体为：向含有冻干酶粉的0.2 ml TwistAmp 反应管中加入再水化缓冲液 29. 5μl，去离子水6.4 μl，上、下游引物各2.4 μl，模板cDNA 各1 μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl，充分混匀后于38℃的水浴锅中反应30min，然后将RPA产物进行纯化。
3.如权利要求2所述的玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，其特征在于，引物终浓度为0.4 μmol /L，醋酸镁溶液浓度为280 mmol /L。
4.如权利要求1所述的玉米致死性坏死病多重RPA检测方法，其特征在于，S5中，甘蔗花叶病毒扩增条带为388bp，玉米褪绿斑驳病毒扩增条带为206bp。
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