CN111455077A - 芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用 - Google Patents

芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用 Download PDF

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欧雄常
杨倩
李国平
姚全胜
吴婧波
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Abstract

本发明公开了芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用，属于微生物分子生物学领域，具体步骤为：RNA提取；反转录cDNA合成；根据16s核糖体RNA基因、DNA促旋酶B亚基基因、甘油酸‑3‑磷酸脱氢酶合成基因、热休克蛋白编码基因和转录因子σ70编码基因5个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物；荧光定量分析；数据分析后筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。本发明为研究XCM侵染芒果叶片不同时间基因表达水平奠定良好基础，将有助于XCM侵染芒果叶片不同时间基因表达研究中获得可靠的标准化qRT‑PCR数据；首次将gyrB和GAPHD基因作为内参基因用于XCM侵染芒果叶片不同时间基因表达分析，解决了现有XCM定量PCR检测中没有内参基因的现状。

Description

芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用，属于微生物分子生物学领域，具体涉及芒果细菌性角斑病病菌XCM侵染芒果叶片的荧光定量内参基因及其引物和应用。
背景技术
芒果为漆树科芒果属植物，与菠萝、香蕉并称为世界三大热带水果。芒果在生产过程中各种病害的发生直接影响芒果的产量和质量。由柑橘黄单胞菌芒果致病变种引起的芒果细菌性角斑病近两年在我国各芒果产区呈现突发和爆发态势，主栽的凯特、红芒6号和桂热82号等芒果品种，易感染细菌性角斑病。如遇有持续高温、强降雨的气候条件下，或在果实高产、树势较弱的果园中发生尤为严重。该病的最大特点是果实染病后，果面布满斑点，失去商品价值，严重时可造成落果失收，且该病一旦发生后即使利用化学农药控制住其进一步蔓延，但染病的果面上的斑点却无法去除，因而果实商品价值大打折扣。分析病菌的重要致病基因在侵染芒果时的表达模式，完善病菌的致病机理可为防治策略的制定提供重要的理论依据。
实时荧光定量聚合酶链式扩增反应的特点是灵敏度高、特异性强、重复性好，在RNA低丰度的转录分析中优势明显。进行RT-PCR时需使用内参基因对试验数据进行校正，以消除样品间因RNA提取效率、纯度及不同完整性造成的误差，但内参基因在不同试验条件下转录水平存在明显的差异，影响RT-PCR分析的准确性。理想的内参基因要求不受任何内、外源因素的影响，在不同的试验因素与环境下均能稳定表达。然而，目前尚未有内参基因可以在不同条件下皆可稳定表达，因此在进行RT-PCR试验前，筛选出特定试验条件下表达稳定的内参基因至关重要。
发明内容
本发明目的是开发一种适合于XCM侵染芒果叶片不同时间(3h、6h、12h、24h、48h和72h)中的内参基因及其特异性引物，为实现功能基因精确定量提供可靠保证；克服了现有技术利用传统单一的内参基因导致不能对目的基因进行准确标准化，进而出现检测结果准确性降低甚至出现错误的问题。
本发明的第一个目的是提供XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因。所述的XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因，为内参基因gyrB和GAPHD，所述的内参基因gyrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的内参基因GAPHD的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。
本发明的第二个目的是提供上述XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因的特异性引物。所述的XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因的特异性引物，所述的内参基因gyrB的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的内参基因GAPHD的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是所提供的内参基因还可以为其他黄单胞菌属的研究提供参考价值。
所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。
所述的内参基因gyrB和GAPHD作为XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因的应用，所述的内参基因gyrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的内参基因GAPHD的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述的特异性引物作为XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量特异性引物的应用，所述的内参基因gyrB的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；所述的内参基因GAPHD的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选，所述的应用，荧光定量PCR体系为10μl，包含
Figure BDA0002463735830000021
Tip Green qPCRSuperMix 5.0μl、Nuclease-free water 3.0μl、cDNA 1.0μl和正向引物和反向引物(10μM)各0.5μl。荧光定量PCR反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸30秒，45个循环。
所述的XCM侵染芒果叶片的时间分别为接种3h、6h、12h、24h、48h和72h。
本发明将各候选内参基因qRT-PCR数据导入到geNorm、NormFinder和BestKeeper软件中分析，筛选出gyrB和GAPHD是XCM侵染芒果叶片不同时间中最稳定的一对内参基因组合。本发明提供的内参基因组合能为XCM功能基因的精确定量提供有力支持，因而具有重要的应用价值。
本发明利用qRT-PCR技术，建立了XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因的筛选方法及应用，从而获得在此条件下稳定表达的内参基因，并开发了相应的特异性引物。利用此方法筛选出来的内参基因，能够用于快速准确地检测出XCM侵染芒果时相关基因表达水平，弥补了传统未经过评估的单一内参基因作为标准化因子可能导致实验结果准确性不高的问题。通过此方法筛选出来的内参组合精确度和可信度更高，能得到更为可靠的结论，这有助于推动XCM致病机理的研究，并对芒果抗病基因选择、抗病育种奠定理论基础。
附图说明
图1是5个候选内参基因片段的PCR扩增产物检测结果；图中M为DNA分子量标记，1-5分别是16s rRNA、gyrB、GAPHD、danK和rpoD；
图2是5个候选内参基因的熔解曲线；
图3是5个候选内参基因qRT-PCR分析的Ct值；
图4是geNorm软件分析5个内参基因的表达稳定值；
图5是geNorm软件分析所需内参基因的数目；
图6是利用筛选到的XCM内参基因gyrB和GAPHD计算cel基因在XCM侵染芒果叶片不同时间的表达量变化。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明做详细说明，这些实施例仅用来对本发明做进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
筛选XCM侵染芒果叶片不同时间稳定表达的内参基因组合
1.根据发明人实验室获得的XCM全基因组数据和根据NCBI中黄单胞菌属内参基因序列信息，初步筛选表达相对较为稳定5个XCM选内参基因，其基因名分别为：16s rRNA、gyrB、GAPHD、danK和rpoD；针对上述候选基因，设计相应扩增引物；
2.提取接种XCM后3h、6h、12h、24h、48h和72h芒果叶片(吸取叶片表面的菌液同时切取接种处1cm2大小的叶片)上总的RNA；
3.组织样品的cDNA的合成：
(1)将模板RNA在冰上解冻；随机引物，5×TIANScript Ⅱ RTase Buffer、SuperPure dNTPs混合液和RNase-free ddH2O在室温(15-25℃)条件下解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体；
(2)按照下表1的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配置混合液：
表1反转录预混合体系
Figure BDA0002463735830000041
(3)65℃孵育5分钟，然后置于冰上2分钟；
(4)在上述反应液的基础上继续加入下表2所列的反转录组分；
表2反转录后续体系
Figure BDA0002463735830000042
(5)25℃下孵育10分钟；
(6)42℃孵育60分钟；
(7)85℃加热5分钟终止反应，置于冰上进行后续实验或者-80℃冷冻保存；
每个样品做三次生物学重复，由此制备得到各个样品的cDNA。
4.以上述获得的cDNA作为扩增模板，利用PCR检测引物的特异性，PCR反应体系为25μl，包含2×Taq-Plus PCR Forest Mix 12.5μl、ddH2O 9.5μl、混合第一链cDNA 1μl和上下游引物(10μM)各1μl。反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测5个候选内参基因片段的PCR扩增产物，结果如图1所示。说明候选内参基因的引物的均具有很好的特异性。纯化PCR产物，测序验证所扩增的片段是否为目标序列；
5.以XCM侵染芒果叶片不同时间的cDNA为模板，对5个内参基因在qRTPCR仪器上进行反应。在qRT-PCR仪仪上选择SYBR Green法进行反应。荧光定量PCR反应体系为10μl，包含
Figure BDA0002463735830000043
Tip Green qPCR SuperMix 5.0μl、Nuclease-free water 3.0μl、cDNA 1.0μl和上下游引物(10μM)各0.5μl。反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸30秒，45个循环。反应结束后进行熔解曲线分析。将各样品的cDNA模板按照相同分量进行混合，然后以5倍比例稀释成6个梯度，则得到混合的cDNA模板浓度分别是1、1/5、1/25、1/125、1/625和1/3125倍。每个反应重复3次，经qRT-PCR获得数据，建立标准曲线，分析确定每对引物的扩增效率。5个内参基因的基因名、引物序列(依次对应为SEQ IDNO.1-10))、扩增长度(对应扩增片段核苷酸序列依次对应为SEQ ID NO.11-15)和扩增效率如列表3中所示。5个候选内参基因的熔解曲线如图2所示；
表3候选内参基因、引物序列及扩增产物信息
表3
Figure BDA0002463735830000051
6.利用qRT-PCR检测所有样本的Ct值，通过geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算各候选基因在XCM侵染芒果叶片不同时间表达稳定性，并对内参基因的表达稳定性排序。利用geNorm软件分析得出GAPHD和rpoD稳定性最高，M值均为0.122，是最稳定的一对内参基因，V2/3的比值为0.063。NormFinder软件分析5个候选内参基因表达稳定性的顺序依次为：gyrB(0.092)>danK(0.169)>GAPHD(0.188)>rpoD(0.235)>16srRNA(0.581)。Bestkeeper程序分析5个候选内参基因的SD值都在0.86-0.79之间，均属较稳定性。综合三个软件结果发现gyrB和GAPHD稳定性最好。其中，内参基因gyrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，内参基因gyrB的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；内参基因GAPHD的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，内参基因GAPHD的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
实施例2
对XCM中cel基因表达量变化进行计算
选择最稳定表达的2个内参基因(gyrB和GAPHD)，对目的基因cel在XCM侵染芒果叶片不同时间表达量的变化分别进行计算。结果如图5所示，发现利用2个最稳定的内参基因gyrB和GAPHD及其组合对基因的定量最准确。
本发明筛选出XCM侵染芒果叶片不同时间合适的内参基因组合是gyrB和GAPHD。与传统单一的内参基因方法相比，检测相关基因的表达水平准确性更高。本研究筛选到的内参基因组合对后续基因表达研究提供了可靠保证。
表4是NormFinder程序分析5个内参基因的表达稳定值
表4
Figure BDA0002463735830000061
表5是Bestkeeper分析5个候选内参基因
表5
Figure BDA0002463735830000062
序列表
<110> 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
<120> 芒果细菌性角斑病菌内参基因、引物、筛选方法及应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagcacctg tggctggata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccaggatg tcgtaatgga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgaaggca cagagcgaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatagcccca ctcgttgtcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcctgggt ggcgaagatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggttcact tcggtctgct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatggattg gtgccttcgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggcggtctc cttagagttc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgccgaaacc ctgttgctc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcttggcga tggcgatttc 20
<210> 11
<211> 192
<212> DNA
<213> 柑橘黄单胞芒果致病变种(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)
<400> 11
acgcgttgtc agagcacctg tggctggata tctggcgcga cggcttccac taccagcagg 60
aatacgcgct gggcgagccg cagtacccgc tcaagcagct ggaagcctcg accaagcgcg 120
gtaccacgct gcgcttcaag ccgtccgtgg ccatcttcag cgacgtcgag ttccattacg 180
acatcctggc gc 192
<210> 12
<211> 176
<212> DNA
<213> 柑橘黄单胞芒果致病变种(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)
<400> 12
atcgcctcaa agtgaaggaa cagagccgcg ctggtgttgt tcctgcgatc gctgttgttc 60
cactgcctgc tcttgcgtgc ggtcctgcgc tagtcgttgg ttgatagatt ccagttgcgc 120
gaagctgtct tgaacaggcc gctgtgcggc ttcggccgtt ggcatatgag cgcgca 176
<210> 13
<211> 173
<212> DNA
<213> 柑橘黄单胞芒果致病变种(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)
<400> 13
ccgccgcttc ctgggtggcc tcgtagcgca cgccgatcga ggccagggtt tccatcaggt 60
cgacctgggt gtcgagcatg gccagcacct ggccaccacc gcgtcgcaga ccaccacttc 120
gtcgcgcgcc agggcgtcgc gatgcagatc tccgacactt cgccatagac cgg 173
<210> 14
<211> 151
<212> DNA
<213> 柑橘黄单胞芒果致病变种(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)
<400> 14
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaaccgtga gacaggtgct gcatggctgt 60
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctt 120
agttgccagc acgtaatggt gggaactcta a 151
<210> 15
<211> 197
<212> DNA
<213> 柑橘黄单胞芒果致病变种(Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae)
<400> 15
gcacccgatg ccgaaaccct gttgctcaac gatggcaaca ccggcaaccg cgaggttgac 60
gacaccgcag ccgaagaagc tgccgccgcg ctgaccgcgc tcgacaccga aggtggccgc 120
accaccgacc cggtgcgcat gtacatgcgc gaaatgggca cggtcgagct gctgacccgc 180
gaaggcgaaa tcgccat 197

Claims (10)

1.芒果细菌性角斑病菌内参基因，其特征在于：所述的内参基因为gyrB和GAPHD，所述的内参基因gyrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的内参基因GAPHD的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
SEQ ID NO.11：
Figure FDA0002463735820000011
SEQ ID NO.12：
Figure FDA0002463735820000012
2.权利要求1所述的芒果细菌性角斑病菌内参基因的特异性引物，其特征在于：所述的内参基因gyrB的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内参基因GAPHD的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示；
SEQ ID NO.1：AGAGCACCTGTGGCTGGATA；
SEQ ID NO.2：CGCCAGGATGTCGTAATGGA；
SEQ ID NO.3：AGTGAAGGCACAGAGCGAAG；
SEQ ID NO.4：AATAGCCCCACTCGTTGTCG。
3.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于：所述的内参基因在制备荧光定量试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2所述的芒果细菌性角斑病菌内参基因的特异性引物，其特征在于：所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。
6.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于：所述的内参基因gyrB和GAPHD作为XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量内参基因的应用。
7.根据权利要求2所述的芒果细菌性角斑病菌内参基因的特异性引物，其特征在于：所述的特异性引物作为XCM侵染芒果叶片不同时间的荧光定量PCR特异性引物的应用。
8.根据权利要求7所述的特异性引物，其特征在于：所述的荧光定量PCR体系为10μl，包含
Figure FDA0002463735820000021
Tip Green qPCR SuperMix 5.0μl、Nuclease-free water 3.0μl、cDNA1.0μl和正向引物和反向引物各0.5μl。
9.根据权利要求7所述的特异性引物，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸30秒，45个循环。
10.根据权利要求6所述的内参基因，其特征在于：所述的XCM侵染芒果叶片的时间分别为接种3h、6h、12h、24h、48h和72h。
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