CN105483127A - 检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物 - Google Patents

检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物。本发明所提供的引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物XHpaAT-F和引物XHpaAT-R组成；所述引物对乙由引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R组成；所述引物XHpaAT-F、所述引物XHpaAT-R、所述引物XHpaAH-F和所述引物XHpaAH-R的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4所示。实验证明，依据本发明提供的检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物可简单、快速、有效的鉴定待测菌株是否为检疫性黄单胞菌，准确性为100％，对黄单胞菌属内不同种的检疫性病原菌的检测或鉴定具有重要的应用。

Description

检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物。
背景技术
黄单胞菌属属于细菌域(Bacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，黄单胞菌目(Xanthomonadales)，黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)，是革兰氏阴性细菌。该属中大部分成员是植物病原菌，引起的植物病害遍布全世界，至少可以侵染124种单子叶植物，268种双子叶植物，给农业生产造成重大损失。目前已确认是不同的植物病原菌的黄单胞菌超过100种。
检疫性黄单胞菌是指黄单胞菌属中被我国定义为进境植物检疫性有害生物的植物病原菌，如胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodispv.betlicola)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonasaxonopodispv.citri)、木薯细菌性萎蔫病菌(Xanthomonasaxonopodispv.manihotis)、甘蔗流胶病菌(Xanthomonasaxonopodispv.vasculorum)、芒果黑斑病菌(Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae)、香蕉细菌性萎蔫病菌(Xanthomonascampestrispv.musacearum)、木薯细菌性叶斑病菌(Xanthomonascassavae)、草莓角斑病菌(Xanthomonasfragariae)、风信子黄腐病菌(Xanthomonashyacinthi)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)。这些植物病原菌所引起的病害危害十分严重，因此加强对其的检测鉴定技术研究具有重要意义，但由于这些病原菌属于同一属，具有较高的同源性，因此依据分离培养、菌落形态、生理生化反应、血清学反应等传统手段进行鉴定，一般耗时较长且操作复杂，灵敏度较低，不能满足口岸植物检疫的快速通关要求；同时现有的分子检测方法，包括常规PCR、实时荧光PCR等也很难有效的将这些检疫性黄单胞菌同时区分开来。因此，亟需一种简单、快速、有效的区分鉴定黄单胞菌属内不同种的检疫性病原菌的检测或鉴定手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何快速、有效的鉴定检疫性病原菌。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种成套引物。
本发明提供的成套引物，可由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲可由引物XHpaAT-F和引物XHpaAT-R组成；所述引物对乙可由引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R组成；
所述引物XHpaAT-F是如下A1)或A2)中的任一种单链DNA：
A1)序列表的序列1所示的单链DNA；
A2)与A1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAT-R是如下B1)或B2)中的任一种单链DNA：
B1)序列表的序列2所示的单链DNA；
B2)与B1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAH-F是如下C1)或C2)中的任一种单链DNA：
C1)序列表的序列3所示的单链DNA；
C2)与C1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAH-R是如下D1)或D2)中的任一种单链DNA：
D1)序列表的序列4所示的单链DNA；
D2)与D1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的引物XHpaAT-F、引物XHpaAT-R、引物XHpaAH-F和/或引物XHpaAH-R的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明设计的引物XHpaAT-F、引物XHpaAT-R、引物XHpaAH-F和/或引物XHpaAH-R的核苷酸序列具有85％或者更高同一性的核苷酸，且用于检测或鉴定检疫性黄单胞菌，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明序列表的序列1、序列表的序列2、序列表的序列3或序列表的序列4所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述成套引物的应用也属于本发明的保护范围。所述成套引物的应用可为如下a)或b)或c)：
a)制备用于检测检疫性黄单胞菌的试剂盒；
b)制备用于鉴定检疫性黄单胞菌的试剂盒；
c)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的检疫性黄单胞菌。
上述应用中，所述检疫性黄单胞菌可为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
含有所述成套引物的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法中，可包括将所述成套引物中各条引物分别单独包装的步骤。
含有所述成套引物的试剂盒在鉴定待测菌是否为候选的检疫性黄单胞菌中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述检疫性黄单胞菌可为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
本发明还提供了鉴定待测菌是否为候选的黄单胞菌的方法。
本发明所提供的鉴定待测菌是否为候选的黄单胞菌的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：提取待测菌的基因组DNA，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：
(d1)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的胡椒叶斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的非胡椒叶斑病菌；
(d2)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的柑橘溃疡病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的非柑橘溃疡病菌；
(d3)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性萎蔫病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性萎蔫病菌；
(d4)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的甘蔗流胶病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的非甘蔗流胶病菌；
(d5)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的芒果黑斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的非芒果黑斑病菌；
(d6)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的香蕉细菌性萎蔫病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的非香蕉细菌性萎蔫病菌；
(d7)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性叶斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性叶斑病菌；
(d8)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的草莓角斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的非草莓角斑病菌，；
(d9)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的风信子黄腐病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的非风信子黄腐病菌；
(d10)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻白叶枯病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻白叶枯病菌，；
(d11)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻细菌性条斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻细菌性条斑病菌；
(d12)如果PCR扩增产物不满足上述(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、(d9)、(d10)和(d11)中的任何一种情况，则待测菌为候选的非检疫性黄单胞菌；
所述检疫性黄单胞菌可为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
本发明所提供的鉴定待测菌是否为候选的黄单胞菌的方法，具体可为方法二，包括如下步骤(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)和(e12)：
(e1)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列9所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的胡椒叶斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的非胡椒叶斑病菌；
(e2)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列10所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的柑橘溃疡病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的非柑橘溃疡病菌；
(e3)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列12所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性萎蔫病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性萎蔫病菌；
(e4)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列14所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的甘蔗流胶病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的非甘蔗流胶病菌；
(e5)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列17所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的芒果黑斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的非芒果黑斑病菌；
(e6)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列18所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的香蕉细菌性萎蔫病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的非香蕉细菌性萎蔫病菌；
(e7)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列19所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性叶斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性叶斑病菌；
(e8)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列21所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的草莓角斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的非草莓角斑病菌，；
(e9)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列23所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的风信子黄腐病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的非风信子黄腐病菌；
(e10)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列24所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻白叶枯病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻白叶枯病菌；
(e11)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列25所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻细菌性条斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻细菌性条斑病菌；
(e12)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24或序列25所示的DNA区段，如果基因组DNA不含有序列表中序列9所示的DNA区段且不含有序列10所示的DNA区段且不含有序列12所示的DNA区段且不含有序列14所示的DNA区段且不含有序列17所示的DNA区段且不含有序列18所示的DNA区段且不含有序列19所示的DNA区段且不含有序列21所示的DNA区段且不含有序列23所示的DNA区段且不含有序列24所示的DNA区段或且不含有序列25所示的DNA区段，则待测菌为候选的非检疫性黄单胞菌；
所述检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
本发明还提供了一种检测待测检疫性黄单胞菌属于检疫性黄单胞菌中的哪个种的方法。
本发明所提供的检测待测检疫性黄单胞菌属于检疫性黄单胞菌中的哪个种的方法，包括如下步骤：
f1)提取待测检疫性黄单胞菌的基因组DNA，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；提取标准菌株群中的各个标准菌株的基因组DNA，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
所述标准菌株群由胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌组成；
f2)将待测检疫性黄单胞菌得到的PCR扩增产物与每个标准菌株得到的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测检疫性黄单胞菌与哪个标准菌株为同一类，该待测检疫性黄单胞菌与该标准菌株即属于同一个种。
实验证明，依据本发明提供的检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物可简单、快速、有效的鉴定待测菌株是否为检疫性黄单胞菌，准确性为100％，对黄单胞菌属内不同种的检疫性病原菌的检测或鉴定具有重要的应用。
附图说明
图1为实施例3构建的系统进化树。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
实施例1、引物的设计与合成
病原菌的Ⅲ型分泌系统对病原菌与寄主的相互作用起着至关重要的作用，编码Ⅲ型分泌系统的hrp(hypersensitiveresponse&pathogenicity)基因广泛存在于革兰氏阴性植物病原细菌中，其基因簇由hrc(hypersensitiveresponse&conserved)、hpa(hypersensitiveresponse&associated)、hrp、和一些转座子组成。通过预实验和序列比对，发现hpaA基因序列在种内较为保守，而在种间又具有一定的变异性，是很好的用于区分鉴定黄单胞菌属中不同种及致病变种的条形码基因。
根据检疫性黄单胞菌的hpaA基因设计两个引物对，分别为命名为引物对甲和引物对乙。其中引物对甲由引物XHpaAT-F和引物XHpaAT-R组成，引物对乙由引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R组成。
引物序列如下：
引物XHpaAT-F：5’-TCCTGAGCCGCCTGTTGT-3’(序列表中序列1)；
引物XHpaAT-R：5’-GATCCGTCGCATTTCTCCC-3’(序列表中序列2)；
引物XHpaAH-F：5’-GGATGGCATGGACGACGA-3’(序列表中序列3)；
引物XHpaAH-R：5’-TGCGCGAATCTCCTGAGC-3’(序列表中序列4)。
分别合成引物XHpaAT-F、引物XHpaAT-R、引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R。
实施例2、检测检疫性黄单胞菌的方法的建立
建立的方法如下：
1、提取待测菌的基因组DNA并作为模板，采用实施例1中合成引物对甲或引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系：待测样品的基因组DNA(6—50)ng、TaqPCRMastermix(天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为KT201-02)12.5μL、引物对甲(引物XHpaAT-F和引物XHpaAT-R各10pmol)或引物对乙(引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R各10pmol)，用去离子水补至25μL。
反应程序：94℃5min；94℃40S，55℃40S，72℃1min，35个循环；72℃10min。
2、完成步骤1后，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判定：
⑴如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为胡椒叶斑病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌不为胡椒叶斑病菌；
⑵如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为柑橘溃疡病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌不为柑橘溃疡病菌；
⑶如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为木薯细菌性萎蔫病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌不为木薯细菌性萎蔫病菌；
⑷如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为甘蔗流胶病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌不为甘蔗流胶病菌；
⑸如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为芒果黑斑病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌不为芒果黑斑病菌；
⑹如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为香蕉细菌性萎蔫病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌不为香蕉细菌性萎蔫病菌；
⑺如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为木薯细菌性叶斑病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌不为木薯细菌性叶斑病菌；
⑻如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为草莓角斑病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌不为草莓角斑病菌，；
⑼如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为风信子黄腐病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌不为风信子黄腐病菌；
⑽如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为水稻白叶枯病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌不为水稻白叶枯病菌；
⑾如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为水稻细菌性条斑病菌，如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物中不含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌不为水稻细菌性条斑病菌；
⑿如果采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物或采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物不满足上述⑴、⑵、⑶、⑷、⑸、⑹、⑺、⑻、⑼、⑽和⑾中的任何一种情况，则待测菌不为检疫性黄单胞菌。
实施例3、按照实施例2建立的方法鉴定58种供试菌株是否为检疫性黄单胞菌
58株供试菌株的基本信息见表1。其中检疫性黄单胞菌共11种，每种3株；非检疫性黄单胞菌共10种，25株。
菌株编号为LMG497、LMG578、LMG576、LMG539、LMG550、LMG553、LMG555、LMG693、LMG547、LMG671、LMG672、LMG673、LMG630和LMG655的供试菌株保藏于BCCM/LMGBacteriaCollection(网址为：http://bccm.belspo.be/index.php)，公众可以从该集存库获得。
菌株编号为NCPPB4412、NCPPB4372、NCPPB2375、NCPPB2376、NCPPB1925、NCPPB485、NCPPB2972、NCPPB211、NCPPB577、NCPPB1160、NCPPB1834、NCPPB301、NCPPB302、NCPPB796、NCPPB181、NCPPB2059、NCPPB2061、NCPPB942、NCPPB3078、NCPPB4386、NCPPB2597、NCPPB2567、NCPPB3168、NCPPB1822、NCPPB3743、NCPPB2095、NCPPB3242、NCPPB793、NCPPB1154、NCPPB2921和NCPPB1585的供试菌株保藏于NationalCollectionofPlantPathogenicBacteria(简称NCPPB，网址为：http://ncppb.fera.defra.gov.uk/)，公众可以从该集存库获得。
菌株编号为ATCC23380、ATCC13901、ATCC11648、ATCC11637、ATCC49084、ATCC29076、ATCC11766、ATCC19315和ATCC12612的供试菌株保藏于美国模式培养物集存库(简称ATCC，网址为ATCC:http://www.atcc.org/，地址为AmericanTypeCultureCollection(ATCC)10801UniversityBoulevardManassas,VA20110USA)，公众可从美国模式培养物集存库获得该菌株。
菌株编号为ICMP20547、ICMP20549、ICMP5740和ICMP2870的供试菌株保藏于InternationalCollectionOfMicro-organisms(简称ICMP，网址为：https://scd.landcareresearch.co.nz/)，公众可以从该集存库获得。
按照实施例2建立的方法鉴定58株供试菌株是否为检疫性黄单胞菌，并采用邻接法构建系统进化树。实验结果见表1和图1。
实验结果如下：
1、菌株编号为LMG497和NCPPB4412的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列5所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
2、菌株编号为LMG578、LMG576和NCPPB4372的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列6所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
3、菌株编号为LMG539、NCPPB2375和NCPPB2376的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列7所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
4、菌株编号为LMG550、LMG553和NCPPB1925的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列8所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
5、菌株编号为NCPPB485、NCPPB2972和LMG555的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列9所示的DNA区段，不含有序列表中序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为胡椒叶斑病菌。
6、菌株编号为ICMP20547、ICMP20549和NCPPB211的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列10所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为柑橘溃疡病菌。
7、菌株编号为LMG693和NCPPB577的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列11所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
8、菌株编号为ATCC23380、NCPPB1160和NCPPB1834的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列12所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为木薯细菌性萎蔫病菌。
9、菌株编号为NCPPB301和NCPPB302的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列13所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
10、菌株编号为ATCC13901、NCPPB796和NCPPB181的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列14所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为甘蔗流胶病菌。
11、菌株编号为ATCC11648、NCPPB2059和NCPPB2061的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列15所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
12、菌株编号为LMG547和NCPPB942的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列16所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
13、菌株编号为ATCC11637、ICMP5740和NCPPB3078的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列17所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为芒果黑斑病菌。
14、菌株编号为ATCC49084、ICMP2870和NCPPB4386的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列18所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为香蕉细菌性萎蔫病菌。
15、菌株编号为LMG671、LMG672和LMG673的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列19所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为木薯细菌性叶斑病菌。
16、菌株编号为NCPPB2597、NCPPB2567和NCPPB3168的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列20所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
17、菌株编号为ATCC29076、NCPPB1822和NCPPB3743的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列21所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为草莓角斑病菌。
18、菌株编号为ATCC11766和ATCC19315的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列22所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，鉴定其不是检疫性黄单胞菌。
19、菌株编号为ATCC12612、NCPPB2095和NCPPB3242的供试菌株，采用所述引物对甲没有得到PCR扩增产物，采用所述引物对乙得到的PCR扩增产物约为630bp(其中含有序列表中序列23所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列24和序列25所示的任何一种DNA区段)，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为风信子黄腐病菌。
20、菌株编号为NCPPB793、NCPPB1154和LMG630的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列24所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23和序列25所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为水稻白叶枯病菌。
21、菌株编号为LMG655、NCPPB2921和NCPPB1585的供试菌株，采用所述引物对甲得到的PCR扩增产物约为800bp(其中含有序列表中序列25所示的DNA区段，不含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23和序列24所示的任何一种DNA区段)，采用所述引物对乙没有得到PCR扩增产物，根据实施例2中的判断标准，将其鉴定为水稻细菌性条斑病菌。
结果表明，依据本发明提供的检测检疫性黄单胞菌的方法及其专用引物鉴定58株供试菌株，鉴定结果的准确性为100％。
表1.供试菌株的基本信息及其PCR扩增产物在序列表中的位置

Claims (10)

1.成套引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物XHpaAT-F和引物XHpaAT-R组成；所述引物对乙由引物XHpaAH-F和引物XHpaAH-R组成；
所述引物XHpaAT-F是如下A1)或A2)中的任一种单链DNA：
A1)序列表的序列1所示的单链DNA；
A2)与A1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAT-R是如下B1)或B2)中的任一种单链DNA：
B1)序列表的序列2所示的单链DNA；
B2)与B1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAH-F是如下C1)或C2)中的任一种单链DNA：
C1)序列表的序列3所示的单链DNA；
C2)与C1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段；
所述引物XHpaAH-R是如下D1)或D2)中的任一种单链DNA：
D1)序列表的序列4所示的单链DNA；
D2)与D1)限定的单链DNA片段具有85％以上的同一性的单链DNA片段。
2.权利要求1所述成套引物的制备方法，包括将权利要求1所述成套引物中各条引物分别单独包装的步骤。
3.权利要求1所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)：
a)制备用于检测检疫性黄单胞菌的试剂盒；
b)制备用于鉴定检疫性黄单胞菌的试剂盒；
c)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的检疫性黄单胞菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
5.含有权利要求1所述成套引物的试剂盒。
6.权利要求4所述试剂盒在鉴定待测菌是否为候选的检疫性黄单胞菌中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
8.一种鉴定待测菌是否为候选的黄单胞菌的方法，包括如下步骤：提取待测菌的基因组DNA，采用权利要求1所述成套引物中的所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断；
(d1)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的胡椒叶斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的非胡椒叶斑病菌；
(d2)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的柑橘溃疡病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的非柑橘溃疡病菌；
(d3)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性萎蔫病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性萎蔫病菌；
(d4)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的甘蔗流胶病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的非甘蔗流胶病菌；
(d5)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的芒果黑斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的非芒果黑斑病菌；
(d6)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的香蕉细菌性萎蔫病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的非香蕉细菌性萎蔫病菌；
(d7)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性叶斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性叶斑病菌；
(d8)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的草莓角斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的非草莓角斑病菌，；
(d9)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的风信子黄腐病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的非风信子黄腐病菌；
(d10)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻白叶枯病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻白叶枯病菌，；
(d11)如果PCR扩增产物中含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻细菌性条斑病菌，如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻细菌性条斑病菌；
(d12)如果PCR扩增产物不满足上述(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、(d9)、(d10)和(d11)中的任何一种情况，则待测菌为候选的非检疫性黄单胞菌；
所述检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
9.一种鉴定待测菌是否为候选的黄单胞菌的方法，包括如下步骤(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)和(e12)：
(e1)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列9所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的胡椒叶斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列9所示的DNA区段、待测菌为候选的非胡椒叶斑病菌；
(e2)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列10所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的柑橘溃疡病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列10所示的DNA区段、待测菌为候选的非柑橘溃疡病菌；
(e3)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列12所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性萎蔫病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列12所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性萎蔫病菌；
(e4)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列14所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的甘蔗流胶病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列14所示的DNA区段、待测菌为候选的非甘蔗流胶病菌；
(e5)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列17所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的芒果黑斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列17所示的DNA区段、待测菌为候选的非芒果黑斑病菌；
(e6)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列18所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的香蕉细菌性萎蔫病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列18所示的DNA区段、待测菌为候选的非香蕉细菌性萎蔫病菌；
(e7)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列19所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的木薯细菌性叶斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列19所示的DNA区段、待测菌为候选的非木薯细菌性叶斑病菌；
(e8)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列21所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的草莓角斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列21所示的DNA区段、待测菌为候选的非草莓角斑病菌，；
(e9)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列23所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的风信子黄腐病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列23所示的DNA区段、待测菌为候选的非风信子黄腐病菌；
(e10)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列24所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻白叶枯病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列24所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻白叶枯病菌；
(e11)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列25所示的DNA区段，如果基因组DNA中含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的水稻细菌性条斑病菌，如果基因组DNA中不含有序列表中序列25所示的DNA区段、待测菌为候选的非水稻细菌性条斑病菌；
(e12)检测待测菌的基因组DNA中是否含有序列表中序列9、序列10、序列12、序列14、序列17、序列18、序列19、序列21、序列23、序列24或序列25所示的DNA区段，如果基因组DNA不含有序列表中序列9所示的DNA区段且不含有序列10所示的DNA区段且不含有序列12所示的DNA区段且不含有序列14所示的DNA区段且不含有序列17所示的DNA区段且不含有序列18所示的DNA区段且不含有序列19所示的DNA区段且不含有序列21所示的DNA区段且不含有序列23所示的DNA区段且不含有序列24所示的DNA区段或且不含有序列25所示的DNA区段，则待测菌为候选的非检疫性黄单胞菌；
所述检疫性黄单胞菌为胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
10.一种检测待测检疫性黄单胞菌属于检疫性黄单胞菌中的哪个种的方法，包括如下步骤：
f1)提取待测检疫性黄单胞菌的基因组DNA，以权利要求1所述成套引物中的所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；提取标准菌株群中的各个标准菌株的基因组DNA，以权利要求1所述成套引物中的所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
所述标准菌株群由胡椒叶斑病菌、柑橘溃疡病菌、木薯细菌性萎蔫病菌、甘蔗流胶病菌、芒果黑斑病菌、香蕉细菌性萎蔫病菌、木薯细菌性叶斑病菌、草莓角斑病菌、风信子黄腐病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌组成；
f2)将待测检疫性黄单胞菌得到的PCR扩增产物与每个标准菌株得到的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测检疫性黄单胞菌与哪个标准菌株为同一类，该待测检疫性黄单胞菌与该标准菌株即属于同一个种。
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