CN101838705A - 一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法，包括以下步骤：分离病健交界处菌群，提取DNA后，利用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，根据条带情况鉴定菌株是否属于洋葱伯克氏菌群；对每个菌株的PCR产物进行酶切，获得限制性酶切图谱，初步确定菌株的种；利用相应种的特异性引物进行PCR扩增，凝胶电泳分离后根据条带情况判断菌株的种；假如凝胶未呈现条带，则对该菌株前一次PCR产物进行测序，得到其recA序列，构建分子系统树，确定该菌株的种。本发明方法能够用准确地检测发病水果和蔬菜上存在Bcc菌，并明确Bcc菌群中的各个种，以便对危险性细菌采取有效的措施。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法。
背景技术
洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)是一类广泛存在于土壤、水、植物表面和医院环境的革兰氏阴性细菌，同时也是一类表型相似而基因型不同的细菌菌群，由17个种组成，分别为B.cepacia，Burkholderia multivorans，Burkholderia cenocepacia，Burkholderiastabilis，Burkholderia vietnamiensis，Burkholderia dolosa，Burkholderiaambifaria，Burkholderia anthina，Burkholderia pyrrocinia，Burkholderiaubonensis，Burkholderia lateens，Burkholderia diffusa，Burkholderiaarboris，Burkholderia seminalis，Burkholderia metallica，Burkholderiacontaminans和Burkholderia lata。该菌最初在洋葱上发现能引起洋葱酸皮病，自上个世纪80年代以来，该菌作为人体条件致病菌被广泛报道，能导致免疫力低下的病人感染发病，尤其能引起囊性肺纤维化(CF)患者死亡。随后，该菌又被报道能引起各种蔬菜和水果的病害，如生菜的腐烂，香蕉的果指尖腐病，杏果腐病等，因此，Bcc在蔬菜和水果上的存在引起了广泛关注。
据研究，Bcc的不同种对人体的危险性不同，引起CF病人感染的Bcc菌中，90％为Burkholderia multivorans和Burkholderia cenocepacia两个种。因此，除了检测蔬菜和水果上是否存在Bcc外，种的鉴定也很关键。传统检测和鉴定采用病原菌分离、革兰氏染色、生理生化反应特性测定、BIOLOG、脂肪酸等鉴定方法，周期长，过程繁琐，且检测结果不一定可靠，不仅不能将Bcc菌与一些相近属种区分开来，更加难以区分Bcc的各个种。PCR技术作为一种现在流行的病原检测和鉴定手段，可有效地对这一复杂的菌群进行检测和鉴定。
发明内容
本发明提供了一种蔬菜或水果上洋葱伯克氏菌群的检测和种的鉴定方法，解决了传统方法周期长，过程繁琐，检测结果不可靠的问题。
一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)的检测及种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取有腐烂症状的蔬菜或水果的病健交界处组织，在无菌水中捣碎后，涂布于PCAT平板上，培养后挑取乳白色的单菌落，纯化后提取菌株的DNA；
(2)以每个菌株的DNA为模板，利用引物BCR1和引物BCR2进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现1043bp的条带，说明该菌株属于洋葱伯克氏菌群；
(3)用内切酶HaeIII对经鉴定属于洋葱伯克氏菌群的菌株的PCR产物进行酶切，获得限制性酶切图谱，初步确定菌株的种；
(4)以初步确定种的菌株的DNA为模板，利用相应种的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现条带，则确定该菌株的种与初步确定的种一致；
(5)假如凝胶未呈现条带，则对该菌株步骤(2)中的PCR产物进行测序，得到其recA序列，构建分子系统树，确定该菌株的种。
优选地，所述的步骤(1)提取菌株DNA的方法如下：
将菌体置于细胞裂解液中，于92～97℃加热10～20min，用双蒸水或TE稀释，所述的细胞裂解液包括重量百分比为0.25％的SDS和0.05mol/LNaOH，利用该裂解液提取DNA操作方便，省时。
优选地，所述的步骤(2)中PCR扩增反应条件为：
94℃预变性3min后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
优选地，所述的步骤(3)中15μl酶切体系包括：
PCR产物 10μL
10×buffer 1.5μL
HaeIII内切酶 1μL
ddH2O 2.5μL。
本发明方法能够用最短的时间准确地检测发病水果和蔬菜上存在存在Bcc菌，并明确Bcc菌群中的各个种，以便对危险性细菌采取有效的措施。
附图说明
图1为实施例1中分离的23株细菌的DNA电泳图谱；
图2为实施例2中15株洋葱伯克氏菌的限制性酶切图谱；
图3为实施例3中15株洋葱伯克氏菌利用特异性引物进行PCR扩增所得产物的电泳图谱；
图4为实施例4中由2株未确定种的洋葱伯克氏菌的recA基因序列与37株参考菌株的recA基因序列构成的系统树；
图5为实施例5中2株葱伯克氏菌的ST型和141株参考菌株的ST型构成的系统树。
具体实施方式
实施例1
取德清某果园里果腐杏的病健交界处的组织少许，于40μL无菌水中捣碎，用灭菌波棒将悬浮液涂布在PCAT平板上，于28℃培养。2d后，从PCAT平板上挑取长出来的23个乳白色单菌落，纯化，编号为Bca01～Bca23。
提取经纯化后的细菌菌落1～2个，置于细胞裂解液(包括重量百分比为0.25％的SDS，0.05mol/L NaOH)中，于95℃加热15min，然后向细胞溶解液中加入180μL双蒸水，于-20℃保存，所制得溶液即作为DNA模板。
以上述提取的DNA为模板，利用洋葱伯克氏菌recA基因的特异性引物BCR1和BCR2进行PCR扩增。
引物BCR1：5’-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3’
引物BCR2：5’-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3’
PCR扩增20μL反应体系包括：
引物BCR1 0.2μL、引物BCR2 0.2μL、2xTaq PCR StarMix 10μl、ddH2O8.5μl。
PCR扩增反应条件：
94℃预变性3min后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
取扩增后的PCR产物5μL，1％的琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后取凝胶置于EB溶液中染色20min，然后置于紫外凝胶成像仪上观察结果，结果如图1所示。能扩增出条带的15个菌Bca01～Bca15则属于洋葱伯克氏菌群，不能扩增出条带的8个菌Bca16～Bca23不属于Bcc群。
用传统的鉴定方法BIOLOG和脂肪酸分析对这23个菌株进行鉴定，BIOLOG鉴定结果显示，Bca01～Bca15与B.cepacia的相似值在0.62～0.68之间，Bca16～Bca23与Pantoea.Agglomerans的相似值在0.66～0.72之间；脂肪酸分析结果显示，Bca01～Bca15与B.cepacia的相似值在0.52～0.58之间，Bca16～Bca23与Pantoea.Agglomerans的相似值在0.44～0.57之间.可以将Bca01～Bca15鉴定为Bcc群。由此可以确定用PCR方法鉴定的准确性。
实施例2
把15个确定属于洋葱伯克氏菌群的菌株的PCR产物用HaeIII酶切，15μl酶切体系包括：
PCR产物 10μL
10×buffer 1.5μL
HaeIII内切酶 1μL
ddH2O 2.5μL。
酶切如图2所示，与Mahenthiralingam等(2000)和Dalmastri等(2005)报道的基因型酶切图谱进行分析比较，初步确定，Bca01～Bca077个菌株属于B.cenocepacia IIIA，Bca08～Bca015 8个菌株属于B.cenocepaciaIIIB。
实施例3
利用B.cenocepacia IIIA和IIIB的特异性引物，分别以实施例1提取的7个鉴定为B.cenocepacia IIIA的菌株和8个鉴定为B.cenocepacia IIIB菌株的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系和反应条件与实施例1相同。
取扩增后的PCR产物5μL，1％的琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后取凝胶置于EB溶液中染色20min，然后置于紫外凝胶成像仪上观察结果，结果如图3所示。Bc01～Bc07对B.cenocepacia IIIA的特异性引物表现出阳性扩增，Bc08～Bc13对B.cenocepacia IIIB的特异性引物表现出阳性扩增，与酶切结果一致；Bc14和Bc15对B.cenocepacia IIIB的特异性引物未表现出阳性扩增，与酶切结果不一致。由此可以断定Bc01～Bc07属于B.cenocepacia IIIA，Bc08～Bc13属于B.cenocepacia IIIB。
17种洋葱伯克氏菌的酶切图谱总共有9个，也就是说部分洋葱伯克氏菌基因型的限制性酶切图谱相同，它们的特异性引物如下表所示：
实施例4
取酶切结果和特异性引物扩增表现不一致的2个菌株Bc14和Bc15的实施例1的PCR产物，测序后得到它们的recA序列，分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，利用Chromas软件打开，进行整理，去掉多余的碱基，利用DNAStar软件获得目的序列，并与已报到的37条Bcc各种的参考菌株的recA序列用软件MEGA4.0构建分子系统树。如图4中所示。Bc14和Bc15以100％的自举置信值与B.seminalis的参考菌株聚在一起，说明其属于B.seminalis。
实施例5
为了进一步验证菌株Bc14和Bc15是否属于B.seminalis，对这两个菌株进行多位点序列分型(MLST)分析，分别测得它们atpD，gltB，gyrB，recA，lepA，phaC和trpB7个基因序列，发现Bc14和Bc15的这7个基因中供MLST分析的部分序列相同，并与Bcc的MLST数据库(http://pubmlst.org/bcc)里的序列进行比对。与数据库里的相同等位基因的序列完全一致的序列即被赋予一个与之相同基因序号，与数据库的相同等位基因的序列不完全一致的序列即为新发现的等位基因序列，将其提交于Bcc的MLST数据库获得一个基因序号。菌株Bc14和Bc15的atpD，gltB，gyrB，recA，lepA，phaC和trpB的7个基因序号分别为atpD-146、gltB-326、gyrB-471、recA-214、lepA-166、phaC-260和trpB-332。
将这7个等位基因的基因序号提交于Bcc的MLST数据库获得一个等位基因谱，等位基因谱也称为序列型或ST(Sequence Type)，本实验所获得的ST序号为ST-572。
ST-572的7个等位基因在Bcc的MLST数据库里连接成一个长度为2,773bp的序列，此序列与已报到的141条Bcc各种的参考菌株的ST序列列用软件MEGA4.0构建分子系统树，如图5中所示，ST-572以100％的自举置信值与B.seminalis的ST型聚在一起，说明这2个菌株属于B.seminalis。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
<120>一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
<400>1
tgaccgccga gaagagcaa 19
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<212>DNA
<213>洋葱伯克氏菌(Burkholdrria cepacia)
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ctcttcttcg tccatcgcct c 21
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<211>19
<212>DNA
<213>洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
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gctcgacgtt caatatgcc 19
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<213>洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
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tcgagacgca ccgacgag 18
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<211>19
<212>DNA
<213>洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
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gctgcaagtc atcgctgaa 19
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<211>18
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tacgccatcg ggcatgct 18
<210>7
<211>1043
<212>DNA
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<400>7
tgtccgccga gaagagcaag gcgctggcgg ccgcactcgc gcagatcgag aagcagttcg 60
gcaaggggtc gatcatgcgg atgggcgacg gcgaagcggc cgaggacatc caggtcgtct 120
ccacgggctc gctgggtctc gacatcgcgc tgggcgtcgg cggcctgccg cgcggccggg 180
tggtcgagat ctacggtccg gaatcgtcgg gtaaaaccac gctcacgctg caggtcattg 240
ccgaactgca gaagctgggc ggcaccgcgg cgttcatcga cgccgagcac gcgctcgacg 300
tccaatacgc gtcgaagctc ggcgtgaacg tgccggaact gctgatctcg cagccggaca 360
ccggcgagca ggcgctcgaa atcaccgatg cgctggtgcg ctcgggctcg atcgacatga 420
tcgtcatcga ctcggtcgcg gcactcgtgc cgaaggccga aatcgaaggc gagatgggcg 480
attcgctgcc gggtctgcag gcccgcctga tgtcgcaggc gctgcgcaag ctgaccggca 540
cgatcaagcg cacgaactgc ctcgtgatct tcatcaacca gatccggatg aagatcggcg 600
tgatgttcgg caacccggaa accacgacgg gcggcaacgc gctgaagttc tatgcgtcgg 660
tgcgtctcga catccgccgg atcggctcga tcaagaagaa cgacgaggtg atcggcaacg 720
aaacccgcgt gaaggtcgtc aagaacaagg tgtcgccgcc gttccgcgaa gcgattttcg 780
acatcctgta tggcgaaggc atttcgcgcc agggcgagat catcgatctc ggcgtgcagg 840
cgaagatcgt cgacaaggcg ggcgcctggt acagctacaa cggcgagaag atcggccagg 900
gcaaggacaa cgcgcgtgaa tccctgcgtg aaagtccgga aatcgcacgc gagatcgaaa 960
accgcatccg cgaatcgctc ggtgtcgcca gcatgcccga tggcgtagtc ggcaacgaag 1020
ccgaggcgat ggacgaagaa gag 1043
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<212>DNA
<213>洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
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tggtcgagat ctacggtccg gaatcgtcgg gtaaaaccac gctcacgctg caggtcattg 240
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gcaaggacaa cgcgcgtgaa ttcctgcgtg aaaatccgga aatcgcacgc gagatcgaaa 960
gccgcatccg cgaatcgctc ggtgtcgcca gcatgcccga tggcgtagtc ggcaacgaag 1020
ccgaggcgat ggacgaagaa gag 1043
Claims (4)
1.一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取有腐烂症状的蔬菜或水果的病健交界处组织，在无菌水中捣碎后，涂布于PCAT平板上，培养后挑取乳白色的单菌落，纯化后提取菌株的DNA；
(2)以每个菌株的DNA为模板，利用引物BCR1和引物BCR2进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现1043bp的条带，说明该菌株属于洋葱伯克氏菌群；
(3)用内切酶HaeIII对经鉴定属于洋葱伯克氏菌群的菌株的PCR产物进行酶切，获得限制性酶切图谱，初步确定菌株的种；
(4)以初步确定种的菌株的DNA为模板，利用相应种的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现条带，则确定该菌株的种与初步确定的种一致；
(5)假如凝胶未呈现条带，则对该菌株步骤(2)中的PCR产物进行测序，得到其recA序列，构建分子系统树，确定该菌株的种。
2.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)提取菌株DNA的方法如下：将菌体置于细胞裂解液中，于92～97℃加热10～20min，用双蒸水或TE稀释，所述的细胞裂解液包括重量百分比为0.25％的SDS和0.05mol/L NaOH。
3.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：
94℃预变性3min后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中15μl酶切体系包括：
PCR产物 10μL
10×buffer 1.5μL
HaeIII内切酶 1μL
ddH2O 2.5μL。
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2010
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100922 |