CN113699257A

CN113699257A - 一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法

Info

Publication number: CN113699257A
Application number: CN202110951400.0A
Authority: CN
Inventors: 范一灵; 王淑娟; 宋明辉; 杨燕; 秦峰; 杨美成
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-11-26

Abstract

本发明提供了一种洋葱伯克霍尔德菌复合体(BCC)的特异性检测靶点和恒温快速检测方法。该特异性检测靶点为secY基因，根据该基因设计了RPA引物组合物，其包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ IDNo.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：CAGGGCAACGGAAGATCACGCAGTACACGCGG[FAM‑dT]A[THF][BHQ1‑dT]TCACCGTGGTGCTCG[C3Spacer]。基于上述，本发明开发了特异性的BCC的高通量、快速筛查和检测方法；该方法准确性高、特异性强、灵敏度高，适用于医疗机构、药品和医疗器械生产企业、化妆品生产企业和相关检测机构的日常筛查工作。

Description

一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法。

背景技术

洋葱伯克霍尔德复合体细菌(Burkholderia cepacia Complex，BCC)是一类革兰氏阴性、非发酵需氧性表型相近的变形菌门β亚纲细菌总称，可在严苛、低营养的环境中存活。近些年发现，BCC可引起菌血症、尿路感染、脓毒性关节炎、腹膜炎、诱发囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)和慢性肉芽肿病等呼吸系统病的重要条件病原体，可导致感染人群和免疫缺陷病人群的高死亡率。由于BCC具有多种毒力因子、天然的抑菌剂和抗生素的多重耐药性，也是导致医疗机构和护理机构内部感染的重要病原菌之一。在药品、护理产品、化妆品、食品和消毒剂等以水为主要基质的产品中都发现污染BCC，并导致了世界范围的产品召回和院内感染事件。非无菌药品中72％的产品召回是由不可接受微生物导致的，其中由BCC造成的非无菌产品召回比例达到22％。美国药典已将BCC列为非无菌药品中不可接受微生物(objectionable organism)。

目前，已知BCC内已有20多个种，其中常见种按基因型分成9个群，即genomovar I-IX，分别为B.cepacia(genomovar I)、B.multivorans(genomovar II)、B.cenocepacia(genomovar III)、B.stabilis(genomovar IV)、B.vietnamiensis(genomovar V)、B.dolosa(genomovar VI)、B.ambifaria(genomovar VII)、B.anthina(genomovar VIII)和B.pyrrocinia(genomovar IX)。传统的培养法需要4-7天才培养能得到供鉴定用的BCC菌落，通过增菌培养后的血清学、生化反应、色谱或质谱、红外光谱等方法对BCC进行鉴定，方法耗时费力。由于BCC及其近缘种属内细菌的表型特性十分接近，针对微生物表型检测的方法缺乏相应的灵敏性和准确性，因此，快速、灵敏的筛选方法在BCC的检测中显得尤为重要。而采用特异性基因靶点检测的分子检测方法更具优势等。与传统变温检测的方法相比，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)可在较低温度(38℃-42℃)以恒温扩增方式检测目标核酸，给致病菌的核酸快速检测提供了反应温度低、检测时间短的高灵敏快速方法。

BCC检测常用的基因位点为16S rDNA、recA、fur和hisA基因，这些基因在不同BBC菌种内有较大的多态性，更适用于菌株的基因分型。目前，缺少用于快速筛查BCC的基因突变位点少、且相对保守的特异性基因靶点。随着测序技术的快速发展，微生物蛋白组和基因组序列资源越来越丰富，使得通过比较基因组学的方法可以更方便、更精确的筛选和确定目标微生物的特异性检测靶点。因此，有必要通过最新的目标基因挖掘策略，寻找新的适用于BCC快速检测的分子靶点，减少潜在的假阴性和假阳性检测结果，新的靶点挖掘也有助于对BCC中特异性蛋白和致病机理研究提供较好的基础。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点，为secY基因。

本发明的第二方面是提供secY基因作为检测靶点在检测洋葱伯克霍尔德菌复合体中的应用。

本发明的第三方面是提供上述特异性检测靶点的扩增引物组合物，其包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：

CAGGGCAACGGAAGATCACGCAGTACACGCGG[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]TCACCGTGGTGCTCG[C3Spacer]。

进一步地，引物组合物包括序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.7的引物对，或序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的引物对。

本发明的第四方面是提供包括上述引物组合物的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测试剂盒。

进一步地，上述试剂盒还包括反应预混液A、缓冲液B和灭菌纯化水。

本发明的第五方面是提供采用上述引物组合物或试剂盒的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测方法，该检测方法采用荧光RPA技术。

进一步地，上述检测方法采用的扩增体系为20μL，包括反应预混液A 10μL，10μmol/L上下游引物和探针各1μL，DNA模板1μL，含350mmol/L醋酸镁溶液的缓冲液B 2μL，余量为水。

进一步地，上述检测方法采用的反应条件为：39℃恒温反应20min，每30s采集一次荧光信号，共40个循环。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1.本发明首次发现的secY基因对BCC具有良好的特异性，可有效区分BCC与其他相关近似种。采用计算机模拟对已知的22种BCC蛋白组序列和基因组序列的验证，和对常见的9种BCC的检测和人工污染试验，证实了secY基因的特异性和荧光RPA方法的可靠性。

2.荧光RPA反应在镁离子存在的条件下，在39℃迅速启动，20min内完成，可实现高通量和便捷化的测试结果。荧光RPA法可在20min内检测BCC菌体灵敏度为5.6×10³CFU/mL，基因组检测灵敏度为12pg/μL。方法的包容性和排他性均为100％。

3.以人工污染的12批药品和21批化妆品对荧光RPA方法进行评价。与标准的培养法相比，荧光RPA方法的相对正确度和相对检出水平均为100％，在人工污染样品中可检测约1CFU/样品的BCC污染。

综上，本发明通过对不同BCC菌株蛋白组的比较，筛选出特异性检测靶点secY基因，并提供了针对该基因的荧光RPA引物与探针，开发了特异性的BCC的高通量、快速筛查和检测方法；该方法准确性高、特异性强、灵敏度高，适用于医疗机构、药品和医疗器械生产企业、化妆品生产企业和相关检测机构的日常筛查工作。

附图说明

图1是本发明一实施例中挖掘洋葱伯克霍尔德菌复合体特异性蛋白质的流程图；

图2是本发明一实施例中伯克霍尔德菌属细菌的SecY蛋白进化树分析结果；

图3是本发明一实施例中用不同引物组合对B.cepacia CICC 10857基因组核酸的荧光RPA扩增结果；

图4是本发明一实施例中荧光RPA检测B.cepacia CICC 10857基因组核酸灵敏度试验结果；

图5是本发明一实施例中荧光RPA检测B.cepacia CICC 10857菌体的灵敏度试验结果。

具体实施方式

本发明采用蛋白组学比较技术，发现了BCC特异性蛋白及其编码基因SecY，开发了针对常见BCC菌株的高特异性和高灵敏度的恒温快速荧光RPA检测技术，适用于药品和化妆品日常快速筛选和风险控制。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明则采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明则使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

以下实施例所采用的菌株及其核酸提取方法如下：

试验所用测试菌株共58株，分别来自于美国模式菌种收集中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、广东省微生物菌种保藏中心(GIM)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)和上海市食品药品检验研究院收集的从病人、药品生产环境以及化妆品产品中分离的微生物(如下表1)。上述微生物菌种接种于胰酪大豆胨液体培养基中(Tryptic Soy Broth，TSB)(Merck)，置36±1℃过夜培养。所有分离微生物均采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Autoflex max，Bruker)和自动生化鉴定仪(VITEC 2Compact，Biomerieux)确认。取TSB增菌培养物1mL至离心管中，选用细菌基因组提取试剂盒(DNeasyBlood and Tissue Kit，QIAGEN)，按说明书操作，最后将提取的基因组核酸溶解于TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)100μL中，置-20℃保存。用核酸蛋白定量检测仪(BioPhotometer Plus，Eppendorf)测定核酸浓度。

表1.试验所用测试菌株

注：“*”表示由上海市食品药品检验研究院收集。

实施例1

本实施例通过编写Python脚本命令，基于大数据下微生物蛋白组比对，挖掘洋葱伯克霍尔德菌复合体特异性蛋白质及其基因编码序列，具体的实验步骤和结果如下：

参考图1，通过美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)公共数据库下载得到341株伯克霍尔德菌属微生物(Burkholderia sp.)的蛋白组序列信息。其中，有78株微生物属于目标BCC，263株属于非目标BCC的其他伯克霍尔德菌微生物。选用BCC中9种常见的种，即基因型genomovar I-IX为目标(见表1)，对其特异性蛋白序列进行筛选比对。

通过编写Python脚本命令采用DIAMOND软件(version 0.9.26)将341株微生物的蛋白质序列进行第一次两两比对(E value参数设置为1×10^-10、Identify参数设置为98)，剔除与9种常见BCC蛋白组中序列匹配率低的蛋白质序列。将第一次比对得到的蛋白质序列通过python脚本采用DIAMOND软件进行第二次比对(E value参数设置为1×10^-10、Identify参数设置为98)，筛选得到在9种常见BCC菌种中都存在的蛋白质序列，即BCC的核心同源蛋白质序列。对所获同源序列通过Gene Bank网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)上BLAST软件确认序列的特异性。

通过上述批量化程序比对、筛选，仅得到有1条满足筛选条件的属于BCC高特异性蛋白序列。该特异性蛋白为前蛋白质转位酶亚单位(preprotein translocase subunit)SecY(蛋白编号AMU05241.1)，包含449个氨基酸，在功能上与细菌细胞膜的转运通道相关。经NCBI BLASTp分析，该蛋白共有约437个保守氨基酸。在GeneBank数据库中收录的20种BCC中均含有SecY蛋白的编码基因secY基因(如下表2)。

表2在GeneBank数据库中收录的含secY基因的BCC菌种

将20种BCC和9种非BCC的SecY蛋白序列通过MEGA X采用N-J法(Neighbor-Joining)做进化树分析，BCC所属细菌聚类在一个分支内，SecY蛋白序列可有效区分BCC和非BCC菌株(图2)。

实施例2

本实施例提供针对secY基因的扩增引物和探针以及洋葱伯克霍尔德菌复合体的重组酶聚合酶等温检测方法。

1.从GeneBank数据库中下载筛选得到的特异性蛋白序列对应的基因序列，并将上述序列采用MEGA X软件进行比对，寻找相对保守区域，根据序列比对信息，标出简并碱基。采用Primer Premier 5.0软件按TwistDx公司RPA设计原则分别设计上下游引物和探针(表2)。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表3.试验所用的引物和探针核酸序列

从GeneBank数据库中获得secY基因序列，在相对保守区域，根据序列比对信息，标出简并碱基，确定上下游引物及探针的结合位点，预测的核酸扩增产物大小见表4。

表4.不同引物组合预测的RPA扩增产物大小

2.采用上述引物和探针的洋葱伯克霍尔德菌复合体的重组酶聚合酶等温检测方法，采用荧光RPA技术，具体的方法如下：

荧光RPA反应选用荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物科技有限公司)。在干粉反应管中加入29.5μL反应预混液A，取10μL反应预混液A，上下游引物和探针(10μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，缓冲液B(含340mmol/L醋酸镁溶液)2μL，加灭菌纯化水配成20μL反应体系。充分混匀，置荧光定量PCR仪(480II，Roche)中39℃恒温反应20min，每30s采集一次荧光信号，共40个循环。每次反应均分别设置阴性和阳性对照。

采用荧光RPA方法检测试验菌株B.cepacia CICC 10857基因组核酸(图3)。根据荧光信号强弱及出峰时间筛选较为适宜的引物对。其中，引物对F1-R4、F3-R4、F4-R4和F6-R4的荧光扩增效果较好。以下实施例选用F6-R4引物对进行测试。

验证实施例1

本实施例验证实施例2提供的荧光RPA方法的包容性、排他性和灵敏度，具体的实验方法和结果如下：

1.荧光RPA方法的包容性和排他性

采用F6/R4引物对组合对试验菌株基因组核酸进行荧光RPA检测，目标菌secY基因的判断与菌种确认的基因信息一致，非目标菌基因组核酸测试结果均为阴性(见上表1)。荧光RPA方法可有效检测常见的九种BCC菌种，方法包容性和排他性均为100％。

2.荧光RPA方法的灵敏度

2.1对B.cepacia CICC 10857的基因组核酸进行10倍梯度系列稀释，浓度分别为1.2×10⁵pg/μL、1.2×10⁴pg/μL、1.2×10³pg/μL、1.2×10²pg/μL、1.2×10¹pg/μL、1.2pg/μL、1.2×10^-1pg/μL和1.2×10^-2pg/μL，用以考察荧光RPA方法检测基因组核酸的灵敏度。该方法可在20min内分别以引物F6/R4组合(图4)检测BCC基因组核酸的灵敏度均为12pg/μL。

2.2对B.cepacia CICC 10857的TSB培养物进行10倍梯度系列稀释，菌体浓度分别为5.6×10⁸CFU/mL、5.6×10⁷CFU/mL、5.6×10⁶CFU/mL、5.6×10⁵CFU/mL、5.6×10⁴CFU/mL、5.6×10³CFU/mL、5.6×10²CFU/mL，用以考察荧光RPA方法检测菌体细胞的灵敏度。荧光RPA方法可在20min内以引物F6/R4组合检测BCC菌体的灵敏度为5.6×10³CFU/mL(图5)。

验证实施例2

本实施例采用实施例2提供的荧光RPA方法对人工污染样品进行检测，以评估该方法的准确性，具体的实验方法和结果如下：

(1)前处理：取12批药品和21批化妆品样品，分别取样加入一定浓度的目标BCC的菌悬液进行人工污染实验。其中，药品样品取10g(固体和半固体)、10mL(液体)或100cm²(贴膏剂)，分别加入90mL pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液混匀，制成1：10的供试液；化妆品样品取10g或10mL，按《化妆品卫生规范》(2007年版)制备1：10的供试液。上述每种供试液制备3份进行人工污染，每份人工污染的接种量分别约为10CFU、1CFU和小于1CFU。

(2)参考方法的检验，药品样品按《美国药典》43版(USP 43)<60>非无菌产品微生物限度检查法洋葱伯克霍尔德菌复合体检验，化妆品样品按《进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》(SN/T 4684-2016)检验。在参考方法经第一步增菌后，取各培养物1mL至无菌离心管中，10000×g离心1min；弃去上清液，加入500μL生理盐水，重悬，置100℃煮沸10min后室温冷却，取上清液即为样品基因组核酸溶液，并进行荧光RPA检验。剩余培养物按相应产品的参考方法检测。

(3)将荧光RPA方法的检测结果与参考方法的检测结果进行比较，按ISO 16140-2:2016的要求，计算方法的相对正确度(Relative trueness，RT)和相对检出水平(Relativelevel of detection study，RLOD)。

采用标准检测方法(参考方法)和荧光RPA法(替代方法)分别对33种样品的3个不同浓度人工污染及样品自身开展对比测试，共计对132份样品进行检测，结果见表5。

表5.采用标准检测法和荧光RPA法检测人工污染样品中BCC的结果

替代方法和参考方法所得检测结果均一致，其中，对污染水平约为10CFU的样品检测结果均为阳性。在污染水平约为1CFU和0.1CFU的样品测试中，有27个样品的结果为阴性，其余39份检测结果为阳性。在污染水平约为0.1CFU样品中，获得的部分阳性率为24.0％(8/33)。将检测结果按ISO 16140-2:2016中参考方法和替代方法的试验结果进行汇总(表6)。计算荧光RPA法的相对正确度和相对检出水平均为100％，方法未见假阳性和假阴性结果。

表6.荧光RPA法和标准检测方法的试验结果比较

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市食品药品检验研究院

<120> 一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物F1（Artificial Sequence）

<400> 1

catcctgggc atgttcaaca tgttctcggg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物F2（Artificial Sequence）

<400> 2

cccgtgccgg gcatcgatcc ggatcaactg 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物F3（Artificial Sequence）

<400> 3

catcgatccg gatcaactgg ckaagctgtt c 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物F4（Artificial Sequence）

<400> 4

tcctgggcat gttcaacatg ttctcgggyg gc 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物F5（Artificial Sequence）

<400> 5

tcgccgcagc tcgargcgct gaagaaggaa gg 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物F6（Artificial Sequence）

<400> 6

cacgatctty gcgctgggga tcatgccgta c 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物R4（Artificial Sequence）

<400> 7

ccagcgcrgc cgcgataccg aaygcctgga ag 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物R5（Artificial Sequence）

<400> 8

cccggctggt tttccagcgc rgccgcgata c 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物R6（Artificial Sequence）

<400> 9

cacgaccgtc gtcaghcgga acagcatgcc g 31

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 探针（Artificial Sequence）

<400> 10

cagggcaacg gaagatcacg cagtacacgc ggatcaccgt ggtgctcg 48

Claims

1.一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点，其特征在于，为secY基因。

2.secY基因作为检测靶点在检测洋葱伯克霍尔德菌复合体中的应用。

3.一种如权利要求1所述的特异性检测靶点的扩增引物组合物，其特征在于，包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：

4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，包括序列为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.7的引物对，序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.4和SEQ IDNo.7的引物对，或序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的引物对。

5.一种包括如权利要求3或4所述的引物组合物的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应预混液A、缓冲液B和灭菌纯化水。

7.一种采用如权利要求3或4所述引物组合物或如权利要求6所述试剂盒的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测方法，其特征在于，采用荧光RPA技术。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用的扩增体系为20μL，包括反应预混液A 10μL，10μmol/L上下游引物和探针各1μL，DNA模板1μL，含280mmol/L醋酸镁溶液的缓冲液B 2μL，余量为水。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用的反应条件为：39℃恒温反应20min，每30s采集一次荧光信号，共40个循环。