CN108588250A

CN108588250A - 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的lamp引物及其检测方法

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Publication number: CN108588250A
Application number: CN201810668421.XA
Authority: CN
Inventors: 吴秀芹; 洪纤纤; 杨敏; 姚榕; 罗金燕; 陈磊; 安千里; 李斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: CN108588250B

Abstract

本发明公开了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法，属于生物技术领域。所述的LAMP引物，包括2条外引物、2条内引物和1条环化引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑5所示。本发明提供的LAMP引物对西瓜细菌性果斑病菌的检出具有特异性，检测灵敏度达到1.72×10²fg/μL；利用本发明提供的检测方法，能够简单快速地对西瓜细菌性果斑病菌进行检测，结果肉眼可判断，且在LAMP反应前加入显色剂，大大降低了污染的可能性，适用于基层农业部门及相关检测部门的田间现场检测。

Description

一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法。

背景技术

瓜类细菌性果斑病是西瓜和甜瓜种植中危害最严重的毁灭性种传病害，病原菌是西瓜嗜酸菌Acidovorax avenae subsp.citrulli(Aac)，属世界性检疫病害。该病害自20世纪80年代中在我国报道以来，在全国大部分地区相继发生，造成的危害大、损失重，蔬果减产甚至绝收，给生产带来巨大威胁，近年已成为国内外西甜瓜生产亟待解决的突出问题，该病害已被列为我国进境检疫性有害生物和全国农业植物检疫性有害生物。

现有的检测技术主要包括传统的生理生化鉴定、Biolog全自动鉴定系统、脂肪酸鉴定、血清学检测和基于PCR方法的分子生物学检测如直接PCR、nested-PCR、荧光PCR等。但这些检测技术也存在操作复杂、耗时较长，严重依赖仪器设备且需要一定的专业操作技能等缺点，难以进行现场检测，不利于在基层和田间推广。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年发展起来的应用于微生物快速检测的分子生物学技术，主要原理是利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶的链置换作用完成DNA扩增，同时释放出焦磷酸根离子，与Mg²⁺结合生成肉眼可视的白色焦磷酸镁沉淀。LAMP具有特异性强、等温高效、敏感性高、操作简单和不需要昂贵的仪器等优点，非常适合现场的快速检测，已被用于检测寄生虫、螺血吸虫、线虫、真菌、病毒和细菌等多种动植物病原。LAMP具有广阔的应用前景，目前主要的制约因素是污染造成的假阳性和引物设计要求高。

针对西瓜果斑病菌，国内外研究人员已初步建立了LAMP检测体系，但其设计引物的专化性和灵敏度都仍需提高，LAMP反应体系需要进一步完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的LAMP引物，实现对西瓜细菌性果斑病菌方便、快速、准确地检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过对西瓜嗜酸菌Acidovorax avenae subsp.citrulli(Aac)与近似种的基因组序列同源性分析，寻找适合设计LAMP引物的高保守性和强特异性的基因，确定瓜类细菌性果斑病菌的编码胞外溶解结合蛋白的看家基因ugpB(登录号为Aave_0609)为该检疫性病原的靶标基因。

利用在线软件设计LAMP引物，本发明提供了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物，包括2条外引物(F3和B3)、2条内引物(FIP和BIP)和1条环化引物(LB)，其核苷酸序列分别为：

F3：5'-TGGTGAACTTGATGCCGATG-3'(SEQ ID NO.1)；

B3：5'-ACCGGCATCACCGTCAA-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP：5'-CGCTACGGCAAGATGATGAGCCGGGGTTGGTCCATTCCTTG-3'(SEQ ID NO.3)；

BIP：5'-CAGCCGTCGTAGATGGACTTGCACGACCTCATCCAGGAAGG-3'(SEQ ID NO.4)；

LB：5'-GAGGTCTGCAGCTTCTCGA-3'(SEQ ID NO.5)。

本发明还提供了一种包含所述的LAMP引物的检测试剂盒。所述的检测试剂盒内除了包括上述LAMP引物，还包括缓冲液、BST DNA聚合酶、显色剂。

本发明提供的LAMP引物可应用到西瓜细菌性果斑病菌Acidovorax avenaesubsp.citrulli的检测中，对于农业生产中田间病害的早期诊断及西瓜细菌性果斑病菌的监控、防治具有重要的实用价值。

本发明还提供了一种检测西瓜细菌性果斑病菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)采用所述的LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；

(3)LAMP扩增反应结果判断：

如肉眼观察到反应产物呈翠绿色或凝胶成像仪观察到反应产物有荧光，则该反应为阳性，说明待测样品中具有西瓜细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli；

如肉眼观察到反应产物呈橙色或凝胶成像仪未观察到荧光现象，则该反应为阴性，说明待测样品中不含有西瓜细菌性果斑病菌。

作为优选，所述的LAMP反应体系以25μL体系计，包括：RM缓冲液12.5μL、8 000U/mL的BST酶1μL、40μmol/L FIP和BIP各1μL、20μmol/L LB 1μL、5μmol/L B3和F3各1μL、钙黄绿素显色剂1μL、DNA模板2μL、灭菌双蒸水3.5μL。

本发明所选用的染料为钙黄绿素显色剂，可在LAMP反应前加入，大大降低了污染的可能性。如SYBR Green等需要在LAMP反应后加入的染料，加重了污染可能性；而反应前将显色液滴在盖上，反应完成后将其弹入的操作又不易控制。

LAMP反应的条件为60-65℃反应30-90min，80℃保温5-10min。作为优选，LAMP反应条件为恒温63℃反应60min。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明提供的LAMP引物对西瓜细菌性果斑病菌的检出具有特异性，检测灵敏度达到1.72×10²fg/μL。

(2)利用本发明提供的检测方法，能够简单快速地对西瓜细菌性果斑病菌进行检测，结果肉眼可判断，且在LAMP反应前加入显色剂，大大降低了污染的可能性，适用于基层农业部门及相关检测部门的田间现场检测。

附图说明

图1为LAMP检测西瓜果斑病菌特异性结果图，(A)为凝胶成像结果，(B)为肉眼观察的结果，其中1为蒸馏水、2为燕麦嗜酸菌燕麦亚种Acidovorax avenae subsp.avenae、3为青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum、4为水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonasoryzae pv.oryzae、5为丁香假单胞菌Pseudomonas syringae，6-10为西瓜果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli。

图2为LAMP检测西瓜果斑病菌灵敏度结果图，(A)为凝胶成像结果，(B)为肉眼观察的结果，其中1-7依次代表DNA模板浓度为1.72×10⁷fg/μL、1.72×10⁶fg/μL、1.72×10⁵fg/μL、1.72×10⁴fg/μL、1.72×10³fg/μL、1.72×10²fg/μL、1.72×10¹fg/μL。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

西瓜果斑病环介导等温扩增(LAMP)检测特异性引物的设计及引物特异性验证

(1)西瓜果斑病菌LAMP检测特异性引物的设计

从NCBI数据库下载西瓜果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli及其近似种的基因组序列，同源性分析寻找适合设计LAMP引物的高保守性和强特异性的基因，确定瓜类细菌性果斑病菌的编码胞外溶解结合蛋白的看家基因ugpB(登录号为Aave_0609)为该检疫性病原的靶标基因。

利用在线设计软件Primer Explorer V4设计特异性较高的LAMP引物，如SEQ IDNO.1-5所示，序列由杭州擎科生物技术有限公司合成。

(2)供试菌株基因组DNA的提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。分别提取燕麦嗜酸菌燕麦亚种菌株Acidovorax avenae subsp.avenae、青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum、水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae、丁香假单胞菌Pseudomonassyringae，西瓜果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli的基因组DNA。

(3)西瓜果斑病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

LAMP反应体系25μL，其中DNA模板1μL、RM缓冲液12.5μL、8000U/mL的BST酶1μL、40μmol/L FIP和BIP各1μL、20μmol/L LB 1μL、5μmol/L B3和F3各1μL、钙黄绿素显色剂1μL、DNA模板2μL、灭菌双蒸水3.5μL；

LAMP反应条件为恒温63℃反应60min。

(4)反应结果判定

LAMP扩增反应的结果可以通过肉眼或凝胶成像仪来判定，具体判定标准如下：肉眼观察到反应产物呈翠绿色，则该反应为阳性，肉眼观察到反应产物呈橙色，则该反应为阴性；凝胶成像仪观察到反应产物有荧光，即有焦磷酸镁白色沉淀生成，则该反应为阳性，凝胶成像仪未观察到荧光现象，则该反应为阴性。

如图1所示，西瓜果斑病菌基因组为模板的PCR管经LAMP扩增反应后均有光亮并呈现荧光绿色，其它来自不同属的对照菌株及双蒸水空白对照的PCR管都没有光亮并呈现橙色，说明均未发生扩增反应。结果显示本试验所设计的LAMP引物在检测瓜类细菌性果斑病菌时具有较强的特异性。

实施例2

西瓜果斑病环介导等温扩增(LAMP)检测灵敏度测定

用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定西瓜果斑病菌的基因组DNA浓度，然后用双蒸水对基因组DNA进行10倍梯度稀释(10^-1～10^-7)，并取2μL不同稀释度的DNA作为模板分别进行LAMP扩增。

结果如图2所示，LAMP检测瓜类细菌性果斑病菌体系的检测灵敏度可以达到1.72×10²fg/μL。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtgaactt gatgccgatg 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accggcatca ccgtcaa 17

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctacggca agatgatgag ccggggttgg tccattcctt g 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagccgtcgt agatggactt gcacgacctc atccaggaag g 41

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggtctgca gcttctcga 19

Claims

1.一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物，其特征在于，包括2条外引物、2条内引物和1条环化引物，其核苷酸序列分别为：

F3：5'-TGGTGAACTTGATGCCGATG-3'；

B3：5'-ACCGGCATCACCGTCAA-3'；

FIP：5'-CGCTACGGCAAGATGATGAGCCGGGGTTGGTCCATTCCTTG-3'；

BIP：5'-CAGCCGTCGTAGATGGACTTGCACGACCTCATCCAGGAAGG-3'；

LB：5'-GAGGTCTGCAGCTTCTCGA-3'。

2.一种包含权利要求1所述的LAMP引物的检测试剂盒。

3.如权利要求1所述的LAMP引物在检测西瓜细菌性果斑病菌Acidovorax avenaesubsp.citrulli及田间病害的早期诊断中的应用。

4.一种检测西瓜细菌性果斑病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)采用权利要求1所述的LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；

(3)LAMP扩增反应结果判断：

如肉眼观察到反应产物呈翠绿色或凝胶成像仪观察到反应产物有荧光，则该反应为阳性，说明待测样品中含有西瓜细菌性果斑病菌；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LAMP反应体系以25μL体系计，包括：RM缓冲液12.5μL、8 000U/mL的BST酶1μL、40μmol/L FIP和BIP各1μL、20μmol/L LB 1μL、5μmol/L B3和F3各1μL、钙黄绿素显色剂1μL、DNA模板2μL、灭菌双蒸水3.5μL。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，LAMP反应条件为恒温63℃反应60min。