CN104263841B

CN104263841B - 马铃薯中黑胫病菌的实时荧光lamp检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN104263841B
Application number: CN201410545032.XA
Authority: CN
Inventors: 朱杰华; 杨志辉; 胡连霞; 赵冬梅; 杨毅清
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2014-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-10-15
Also published as: CN104263841A

Abstract

本发明提供了一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒，采用6条特异性引物对马铃薯中黑胫病菌进行实时荧光LAMP检测方法，不仅可实现肉眼观察和荧光呈色结果的判定，同时可通过实时荧光LAMP分析仪实现对马铃薯黑胫病菌检测过程的全程实时监控。

Description

马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒。

背景技术

马铃薯黑胫病(PotatoBlackLeg)现在仍然是冷凉地区马铃薯生产上一种主要的细菌性病害，病原是果胶杆菌属的黑胫病菌Pectobacteriumatrosepticum(Pca)(以前是Erwiniacarotovorasubsp.atroseptica)。Pca是可以导致马铃薯块、茎腐烂的革兰氏阴性的植物病原细菌，它的寄主范围仅限于马铃薯。该病是通过种薯带菌传播，马铃薯种薯中黑胫病菌存在肉眼无法诊察的潜伏侵染，这种潜伏侵染逐代累积逐渐表现症状造成危害，因此检测黑胫病菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。

各国把马铃薯黑胫病菌列为重要植物检疫对象，田间症状识别一直是马铃薯黑胫病监测的重要手段，然而这种方法常受到环境条件、寄主本身和其它病害所引起的症状的干扰，使检测的准确性受到限制。传统的马铃薯黑胫病菌分离方法耗时较长，至少需半个月，而且灵敏度较低；国际推荐方法为双层抗体夹心的方法(DASI)，它的检测范围是每mL富极培养基中含10²～10⁶Eca细胞；PCR方法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以普及和推广。因此，研究对种薯中黑胫病菌的快速灵敏检测的方法具有非常重要的意义。吸取了前人传统生理学检测方法、免疫学和分子生物学为基础的快速检测马铃薯黑胫病菌的经验，研究开发了马铃薯黑胫病菌的实时荧光改良环介导等温扩增(Real-timefluorescenceimprovedLAMP)试剂盒。

最早将LAMP技术开发成商品化检测试剂盒的是日本荣研化学株式会社，它的产品主要用于环境和食品安全方面的检测，包括沙门氏菌，大肠杆菌检测、单核细胞增多性李斯特氏菌检测等。国内首先开发出LAMP检测试剂盒的是广州华峰生物科技有限公司，其产品包括6种食源微生物检测试剂盒和18种病原微生物检测试剂盒原型。但到目前为止，还未见到实时荧光改良LAMP检测马铃薯种薯中黑胫病菌的试剂盒的报道。LAMP结果判定可通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，但容易因视觉差异，可能造成误判；添加荧光染料SYBRGreenI进行呈色，容易造成扩增产物的污染，而造成误判；进行琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，费时费力。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种方便快捷且高特异性高灵敏度的马铃薯中黑胫病菌的检测方法及试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法，所述方法具体包括以下步骤：

1)提取待检样品基因组DNA作为LAMP检测反应的模板；

2)配制反应液，构建检测体系；

所述的反应液包括：

步骤1)提取的DNA模板；

两条外引物：F3：5’-AACGATGGTTTCCAGGAAA-3’，

B3：5’-ACTTCGGATCCGGCACTT-3’；

两条内引物：FIP:5’-TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3’，

BIP:5’-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3’；

两条环引物：LF:5’-CGGCCAAGTGTGTACCA-3’，

LB:5’-GATGCGCGCGAAGGGCT-3’；

3)等温扩增反应：将所述反应液离心混匀，进行等温扩增反应；

4)结果判断：根据通过实时荧光分析仪，实时观察荧光曲线扩增情况。

若通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，或添加荧光染料SYBRGreenI进行呈色，或通过琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带进行判定时，在步骤3)等温扩增反应之后对酶进行灭活处理即可。酶灭活处理条件为，80℃，10min灭活。

进一步地，所述检测体系为25μL荧光改良LAMP反应体系，包括：两条内引物各1.28μM，两条外引物各0.32μM，两条环引物0.64μM，2μLDNA模板。

更进一步地，所述检测体系为25μL荧光改良LAMP反应体系，还包括0.6mMdNTP，0.4M甜菜碱，1mMMgSO₄，10×BstDNA聚合酶反应缓冲液，8U的BstDNA聚合酶大片段，0.5μLSYBRGreenI。

在本发明具体实施方式中，所述检测体系为25μL荧光改良LAMP反应体系：由两条内引物(FIP和BIP)各1.28μM，两条外引物(F3和B3)各0.32μM，两条环引物(LF和LB)0.64μM，0.6mMdNTP，0.4M甜菜碱(Sigma，St.Louis，Mo.)，1mMMgSO₄，10×BstDNA聚合酶反应缓冲液(NewEnglandBiolabs，MA)(20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％TritonX-100)，8U的BstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，0.5μLSYBRGreenI(1：200稀释)，2μLDNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。

作为优选，所述等温扩增反应于61℃反应40min。

进一步地，所述步骤1)包括：

步骤(1)制备待检样品溶液；

步骤(2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA。

其中，所述步骤(1)制备待检样品溶液具体为：将待测马铃薯切块，经70％酒精作用1-3min，用灭菌去离子水冲洗3次后，加1mL灭菌去离子水，在无菌研磨管中研磨成匀浆，瞬时离心后，静置10min，取上清液于离心管，作为待检样品溶液。

其中，所述步骤(2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA具体为：

A、取待检样品溶液1mL，11000rpm/min离心1min，弃上清；

B、加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，11000rpm/min离心1min，弃上清；重复操作一次；

C、加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，100℃，10-15min，冷却至室温，11000rpm离心1min，取上清，-20℃冷冻保存，备用。

进一步地，所述步骤4)的判断方法为：实时观察荧光曲线扩增情况，有S荧光曲线，即扩增，样品判定为阳性；无S荧光曲线，即无扩增，样品判定为阴性。

作为优选，所述实时荧光LAMP检测方法还包括以灭菌的双蒸水为阴性对照。

本发明还提供了一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括：

两条外引物：F3：5’-AACGATGGTTTCCAGGAAA-3’，

B3：5’-ACTTCGGATCCGGCACTT-3’；

两条内引物：FIP:5’-TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3’，

BIP:5’-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3’；

两条环引物：LF:5’-CGGCCAAGTGTGTACCA-3’，

LB:5’-GATGCGCGCGAAGGGCT-3’。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法方便快捷：将反应液、酶、引物等混合均匀，40min便可观察结果，仅2h，就能完成从样品处理，DNA提取到检测出结果的全过程；特异性高：利用多条引物扩增目的基因的特异区域，确保扩增的准确性；灵敏度高；最低可检测出4.2个拷贝的基因，是相应普通LAMP的10²倍，是相应普通PCR的10⁴倍。克服了前人马铃薯黑胫病菌检测方法复杂、花费高和效率低等诸多问题。

本发明所述的马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法不仅可实现肉眼观察和荧光呈色结果的判定，同时可通过实时荧光LAMP分析仪实现对马铃薯黑胫病菌检测过程的全程实时监控，从而使扩增和检测一管一步完成，具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中LAMP反应的肉眼可视结果；

其中：管1，未加环引物LAMP反应的阳性结果；管2，未加环引物LAMP反应的阴性对照；管3，加环引物LAMP反应的阳性结果；管4，加环引物LAMP反应的阴性对照。

图2为本发明实施例2中LAMP反应的电泳分析结果；

其中：泳道M，100bpDNA分子质量标准；泳道1，未加环引物LAMP反应的阳性结果；泳道2，未加环引物LAMP反应的阴性对照；泳道3，加环引物LAMP反应的阳性结果；泳道4，加环引物LAMP反应的阴性对照。

图3为本发明实施例1中SYBRGreenI染料在LAMP扩增产物中的颜色反应；

其中：管1，未加环引物LAMP反应的呈色结果；管2，未加环引物LAMP反应的阴性对照；管3，加环引物LAMP反应的呈色结果；管4，加环引物LAMP反应的阴性对照。

图4为本发明实施例2中实时荧光改良LAMP检测Pca纯培养的灵敏度试验结果。

图5为本发明实施例2中实时荧光改良LAMP检测马铃薯中黑胫病菌的检出限试验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

对检索到马铃薯黑胫病菌(LMG2374)gyrB序列Genebank(登录号JF311590.1)进行同源性分析，确定种保守区。运用引物设计软件primerexplorerV4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)进行LAMP引物设计，通过DNAMAN对引物进行分析，挑选出6条引物：

两条外引物:F3：5’-AACGATGGTTTCCAGGAAA-3’,

B3：5’-ACTTCGGATCCGGCACTT-3’。

两条内引物:FIP:5’-TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3’，

BIP:5’-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3’。

两条环引物：LF:5’-CGGCCAAGTGTGTACCA-3’，

LB:5’-GATGCGCGCGAAGGGCT-3’。

实施例1

1、马铃薯中黑胫病菌菌体的收集：

将待测感染黑胫病菌的马铃薯薯块(4mm见方)0.1g经70％酒精作用1-3min，用灭菌去离子水冲洗3次后，加1mL灭菌去离子水，在无菌研磨管中研磨成匀浆，瞬时离心后，静置10min，取上清液于离心管，作为待检样品溶液。

2、裂解法提取基因组DNA：

取样品溶液1mL，11000rpm/min离心1min，弃上清，加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，11000rpm/min离心1min，弃上清，重复操作一次，加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，100℃，10-15min，冷却至室温，11000rpm离心1min，取上清，-20℃冷冻保存，备用。

3、25μL荧光改良LAMP反应体系：

25μL荧光改良LAMP反应体系：由内引物(FIP和BIP)各1.28μM，外引物(F3和B3)各0.32μM，环引物(LF和LB)各0.64μM，0.6mMdNTP，0.4M甜菜碱(Sigma，St.Louis，Mo.)，1mMMgSO₄，10×BstDNA聚合酶反应缓冲液(NewEnglandBiolabs，MA)(20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％TritonX-100)，8U的BstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，0.5μLSYBRGreenI(1：200稀释)，2μLDNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。同时，灭菌的双蒸水代替DNA模板作阴性对照。普通LAMP反应体系中将环引物和SYBRGreenI用灭菌的双蒸水代替。

4、扩增与检测结果判定

①可通过实时荧光分析仪(ESEQuantTubeScanner)，设置61℃，反应40min。实时观察荧光曲线扩增情况，有S荧光曲线，即扩增，样品判定为阳性；无S荧光曲线，即无扩增，样品判定为阴性。

②可通过LAMP反应体系于63℃水浴锅中反应40min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10min终止反应，离心2min，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀：有白色焦磷酸镁沉淀，有扩增，样品判定为阳性；无白色焦磷酸镁沉淀，无扩增，样品判定为阴性。

③可通过LAMP反应体系于63℃水浴锅中反应40min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10min终止反应，可添加荧光染料SYBRGreenI进行呈色，由橙色变成绿色，发生了LAMP反应，样品判定为阳性；仍保持SYBRGreenI的橙色不变，表明未发生LAMP反应，样品判定为阴性。

④还可通过LAMP反应体系于63℃水浴锅中反应40min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10min终止反应进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，出现典型的梯形条带，即发生了LAMP反应，样品判定为阳性；未出现典型的梯形条带，即未发生LAMP反应，样品判定为阴性。

5、实验结果：

①LAMP产物的可视结果：

LAMP反应终止后，即可通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，判断检测结果。如图1所示。

②LAMP扩增的凝胶成像结果：

取LAMP扩增产物5μL，与1μL的loddingbuffer混合均匀，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，110V电泳40min后，利用凝胶成像系统观察结果并成像。如图2所示，出现大小不同的区带组成的梯形条带，以证实是否发生了LAMP反应，而且带环引物的LAMP反应条带比未加环引物的LAMP反应条带亮。

③LAMP产物的呈色反应：通过添加荧光染料，SYBRGreenI进行呈色，从而检测扩增反应是否发生，管1，3反应结束时混合液的颜色会由橙色变成绿色，发生了LAMP反应；管2，4用灭菌的双蒸水代替黑胫病菌DNA模板，反应结束时混合液的颜色就会保持SYBRGreenI的橙色不变，表明未发生LAMP反应。如图3所示。

实施例2

1、实时荧光改良LAMP检测Pca纯培养的特异性试验：

本发明共检测了13株菌，以验证引物的特异性，它们分别是4株马铃薯黑胫病菌菌株、6株马铃薯其它细菌性病害菌株和3株分离自马铃薯田间土壤中的细菌，具体内容见表1。

表1试验用菌株

只有马铃薯黑胫病菌菌株扩增出荧光曲线，其它9株马铃薯病害实验室分离和保存的细菌均未扩增出荧光曲线。同时对扩增产物进行溶解曲线试验，观察到马铃薯黑胫病菌扩增的荧光曲线对应的溶解曲线只有单温度(单峰)，且出锋位置均在85.0-86.0℃，证明实时荧光LAMP扩增的马铃薯黑胫病菌产物是特异性扩增产物，试验结果有效。

2、实时荧光改良LAMP检测Pca纯培养的灵敏度试验：

进行实时荧光改良LAMP、普通LAMP和PCR的灵敏度试验。ESEQuantTubeScanner实时监测的荧光扩增曲线，如图4所示。至4.2×10⁰copies/反应时，有荧光扩增曲线；能检测到马铃薯黑胫病菌，至4.2×10^-1copies/反应时，没有荧光扩增曲线，未检测到马铃薯黑胫病菌，实时荧光改良LAMP检测Pca纯培养的基因拷贝数为4.2×10⁰copies/反应。

3、实时荧光改良LAMP检测马铃薯中黑胫病菌基因组DNA的检出限：

马铃薯模拟样品中黑胫病菌的活菌数分别为2.2×10⁶CFU/mL-2.2×10^-1CFU/mL，其对应基因组DNA的浓度为1.8×10¹ng/μL-1.8×10⁰fg/μL，换算成拷贝数为3.28×10⁶copies/μL-3.28×10^-1copies/μL。将拷贝数为3.28×10⁶copies/μL-3.28×10^-1copies/μL的DNA模板，各取2μL进行实时荧光改良LAMP的检出限试验。ESEQuantTubeScanner实时监测的荧光扩增曲线如图5所示，至6.56×10⁰copies/反应时，能检测到马铃薯黑胫病菌，有荧光扩增曲线。至6.56×10^-1copies/反应时，就检测不到马铃薯黑胫病菌了，没有荧光扩增曲线。即实时荧光改良LAMP检测马铃薯黑胫病菌DNA的检出限是6.56copies/反应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)提取待检样品基因组DNA作为LAMP检测反应的模板；

2)配制反应液，构建检测体系；

所述的反应液包括：

由步骤1)提取的DNA模板；

两条外引物：F3：5’-AACGATGGTTTCCAGGAAA-3’，

B3：5’-ACTTCGGATCCGGCACTT-3’；

两条内引物：FIP:5’-TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3’，

BIP:5’-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3’；

两条环引物：LF:5’-CGGCCAAGTGTGTACCA-3’，

LB:5’-GATGCGCGCGAAGGGCT-3’；

3)等温扩增反应：将所述反应液离心混匀，于61℃进行等温扩增反应；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测体系为25μL荧光改良LAMP反应体系，包括：两条内引物各1.28μM，两条外引物各0.32μM，两条环引物0.64μM，2μLDNA模板。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测体系为25μL荧光改良LAMP反应体系，还包括0.6mMdNTP，0.4M甜菜碱，1mMMgSO₄，10×BstDNA聚合酶反应缓冲液，8U的BstDNA聚合酶大片段，0.5μLSYBRGreenI。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应于61℃反应40min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括：

步骤(1)制备待检样品溶液；

步骤(2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)制备待检样品溶液具体为：将待测马铃薯切块，经70％酒精作用1-3min，用灭菌去离子水冲洗3次后，加1mL灭菌去离子水，在无菌研磨管中研磨成匀浆，瞬时离心后，静置10min，取上清液于离心管，作为待检样品溶液。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)通过热裂解法提取待检样品基因组DNA具体为：

取待检样品溶液1mL，11000rpm/min离心1min，弃上清；

加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，11000rpm/min离心1min，弃上清；重复操作一次；

加入100μL灭菌去离子水悬浮沉淀，100℃，10-15min，冷却至室温，11000rpm离心1min，取上清，-20℃冷冻保存，备用。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的判断方法为：实时观察荧光曲线扩增情况，有S荧光曲线，即扩增，样品判定为阳性；无S荧光曲线，即无扩增，样品判定为阴性。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以灭菌的双蒸水为阴性对照。

10.一种马铃薯中黑胫病菌的实时荧光LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

两条外引物：F3：5’-AACGATGGTTTCCAGGAAA-3’，

B3：5’-ACTTCGGATCCGGCACTT-3’；

两条内引物：FIP:5’-TCAGCGTACGGGTCATCGCCAACAATATTCCGCAGCGTGATG-3’，

BIP:5’-ATCCAAAATCAGCGCGACCGGTCACAGACACCACAGCAATC-3’；

两条环引物：LF:5’-CGGCCAAGTGTGTACCA-3’，LB:5’-GATGCGCGCGAAGGGCT-3’。