CN108949916B

CN108949916B - 油菜黑胫病菌特异性序列及lamp检测引物和应用

Info

Publication number: CN108949916B
Application number: CN201810987708.9A
Authority: CN
Inventors: 李国庆; 杜然; 杨龙; 张静; 吴明德
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN108949916A

Abstract

本发明属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用，本发明提供了L.biglobosa的特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到112 fg/μL的L.biglobosa基因组DNA，为油菜黑胫病菌的田间检测、口岸快速高通量检验检疫等提供了很好的工具。

Description

油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用。

背景技术

油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernando et al.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。小球腔菌属(Leptosphaeria)真菌包括两个近缘种：Leptosp haeria maculans和L.biglobosa(Shoemaker and Brun.,2001)(Kaczmarek.,2009)。前者主要分布于加拿大、澳大利亚、欧洲等地，侵染部位在油菜茎基部，会造成茎基腐从而茎秆倒伏，对油菜生产危害严重，造成的损失大；后者全球均有分布，严重侵染十字花科作物，主要引起茎上部病斑，危害油菜生产(Fitt et al.,2006b)。L.maculans具有极强的致病力，是造成世界各地油菜产量损失的重要原因，为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010)(周圆等，2016)。

这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(West et al.,2001)，而我国目前仅报道了Leptosphaeria biglobosa，尚没有发现L.maculans。自2006年以来，随着我国油菜种植面积的减少，对进口油菜籽的需求量逐年攀升，极大增加了该病菌传入的几率(陈明爱等，2008)。目前，我国从欧洲、加拿大和澳大利亚等油菜主产区进口300多万t油菜籽，同时也从欧洲各国及日本、新西兰等国家进口十字花科蔬菜种子，这些地区均有油菜茎基溃疡病菌的分布记录(孙颖等，2015)。2010年湖北出入境检验检疫局在加拿大进境的油菜籽中首次检出油菜茎基溃疡病菌(L.maculans)(王振华等，2010)。油菜黑胫病菌的检测方法只有形态学观察法、聚合酶链式反应(PCR)检测方法和发病症状观察法。但由于，现存的检测方法周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、准确性低等劣势，难以满足口岸的高通量快速检测要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于口岸检测油菜黑胫病菌显得尤为重要。

目前对于油菜黑胫病菌的分子检测仅有PCR方法(Liu et al.,2006)，Liu根据L.biglo bosa和L.maculans的ITS序列(利用引物ITS4和ITS5扩增L.maculans菌株UK7以及L.biglobosa菌株UK5,UK21和UK28获得)，利用L.biglobosa和L.maculansITS上一段相同的碱基序列设计一条共同反向引物，另外分别设计两条共向引物，结果根据扩增得到的片段大小，将两菌区分，但其特异性不足，在进行实际PCR扩增操作时，常会将其他物种的全基因组DNA也扩增出与L.biglobosa同样大小的基因片段。因此，在L.biglobosa的分子检测上仍需要进行完善。

核酸扩增技术是一种重要的分子检测手段，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisother mal amplification，LAMP)是一种新型的快速核酸扩增方法(Notomi et al.,2000)，该方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DN A聚合酶在等温条件(65℃左右)孵育30-60min，即可完成核酸扩增反应，可使目的DN A在短时间内从数份扩增至10⁹份(Nagamine et al.,2002)，还可以通过设计两条环引物使反应速度提升。LAMP扩增过程中会产生大量的焦磷酸根离子，会与体系中镁离子结合形成白色的焦磷酸酶沉淀(Mori et al.,2001)，从而可以肉眼直接观察，同时可以在反应结束的体系中加入SYBR Green I核酸染料，阳性反应会变成荧光绿色，而阴性则保持橙色不变(T omotada et al.,2003)。LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、简便快捷、检测周期短和仪器设备要求低等优点，目前已经被广泛应用于临床、食品安全、农业等的检测领域，植物上主要应用于植物病毒、细菌、真菌病害及转基因等的检验检疫工作，该技术具有很高的应用价值。

LAMP为特异性检测油菜黑胫病菌提供了新的思路，但LAMP引物设计对靶基因的GC含量要求很高，并非所有的序列都适合设计LAMP引物，同时，在实际操作过程中也发现，并非设计出的6条LAMP引物就适合进行扩增。有时候环引物的加入反而会使扩增的特异性变差。因此，最终的LAMP扩增效果取决于目的片段的选取以及LAMP引物的有效设计。

针对上述问题，本发明筛选出了油菜黑胫病菌(L.biglobosa)特异性序列，该序列在油菜黑胫病菌中特异性存在，能对近缘种进行很好的区分；同时针对该序列，设计了油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的特异性LAMP检测引物，该引物具备良好的特异性和灵敏性，具有极大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜黑胫病菌特异性序列在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对油菜黑胫病菌特异性序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还有一个目的在于提供了针对菜黑胫病菌特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3:GTTACTGACGCTGACTGC、FIP:GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT、BIP:TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC、LB:GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：

油菜黑胫病菌特异性序列在制备油菜黑胫病菌(L.biglobosa)检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示，只要该序列应用于L.biglobosa的检测，都属于本发明的保护内容。

针对油菜黑胫病菌特异性序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。只要针对该序列设计的引物用于油菜黑胫病菌的检测，都属于本发明的保护内容。

以上所述的应用中，优选的，针对该特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3:GTTACTGACGCTGACTGC、FIP:GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT、BIP:TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC、LB:GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了L.biglobosa的特异性检测靶标，在申请日之前，还从未有此相关报道。该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种能很好的区分，避免了假阳性的产生。

2.针对L.biglobosa的特异性序列设计了LAMP引物，与其他常规的6条LAMP引物不同，本发明提供的LAMP引物仅为5条，加入LF引物反而会影响扩增的特异性，利用该5条引物可以在缩短反应时间的同时保证引物组的特异性。本发明提供的LAMP引物可以检测到112fg/μL的L.biglobosa基因组DNA，而常规的PCR(Lbig F：ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA和LmacR：GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG)只能检测到11.2pg/μL。

3.本发明的提供的检测引物相比具有特异好、灵敏度高、稳定性强和快速简便的优点，在检测过程中很好地控制了假阳性的出现，同时又可以精确检测到L.biglobosa的存在。这为油菜黑胫病菌的田间检测、口岸快速高通量检验检疫等提供了很好的工具。

附图说明

图1为油菜黑胫病菌LAMP检测引物特异性检测可视化图及凝胶电泳图；

其中上图：1-21管：21株L.biglobosa菌株(包括4株L.biglobosa‘brassicae’菌株和4株L.biglobosa'canadensis'菌株)(具体顺序见表1)，22-23管：2株近源菌L.maculans(包括1株L.maculans'brassicae'菌株)，24-33管：10株在油菜上分离得到的病原真菌(依次是：Phoma sp、Phoma macrostoma、Phoma sp、Phoma glomerata、Phoma herbarum、Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Colletotrichum sp、Alternaria alternata、Chaetomiumgl obosum，)，第34管：阴性对照；

下图：凝胶电泳图：泳道M:100bp DNA Ladder，泳道1：Leptosphaeria biglobosaHGHCT2-2，泳道2-13：对应表1中的22-33号菌株，泳道14：阴性对照，水；

图2为油菜黑胫病菌LAMP检测引物灵敏度检测可视化图及凝胶电泳图；

上图为油菜黑胫病菌L.biglobosa的检测可视化图，其中1-9管的油菜黑胫病菌L.biglobosaDNA浓度分别为：112ng/μl、11.2ng/μl,1.12ng/μl,112pg/μl,11.2pg/μl,1.12pg/μl,112fg/μl,11.2fg/μl,1.12fg/μl，第10管:阴性对照；

下图为油菜黑胫病菌L.biglobosa的扩增产物凝胶电泳图，其中泳道M:100bp DNALadder，1-9：112ng/μl、11.2ng/μl,1.12ng/μl,112pg/μl,11.2pg/μl,1.12pg/μl,112fg/μl,11.2fg/μl,1.12fg/μl的油菜黑胫病菌L.biglobosa的基因组DNA，10:阴性对照。

图3为油菜黑胫病菌特异性LAMP检测引物检测田间油菜茎秆可视化图及凝胶电泳图；

上图：1-7管：田间采集发病油菜茎秆DNA，8-13管:未显症状油菜茎秆DNA；

下图：泳道M:100bp DNA Ladder,1-7:田间采集发病油菜茎秆DNA，8-13:未显症状油菜茎秆DNA。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料，如未特别说明均为公众可获得的。

实施例1：

油菜黑胫病菌特异性序列(SEQ ID NO.1)或针对该序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌(L.biglobosa)检测试剂中的应用：

针对SEQ ID NO.1所示序列，设计了LAMP引物，如下：

F3:TAGGTGAACCTGCGGAAG

B3:GTTACTGACGCTGACTGC

FIP:GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT

BIP:TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC

LB:GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。

LAMP扩增体系如下：

Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase购买自New England Biolabs公司。

LAMP扩增程序如下：

65℃反应40min；80℃灭活5min

在反应产物中加入1000×SYBR Green I，阳性反应显示荧光绿色，表明有油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的存在；阴性对照保持橙色。

实施例2：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa)LAMP引物特异性检测及灵敏度检测：

油菜黑胫病菌(L.biglobosa)LAMP引物特异性检测：

利用实施例1所述的方法，申请人对表1中所述菌株进行了LAMP检测，表1中的菌株包括21株L.biglobosa(包括亚种L.biglobosa‘brassicae’和L.biglobosa'canadensis')，2株近源菌L.maculans(包括亚种L.maculans'brassicae')以及10株在油菜上分离得到的病原真菌(如：Phoma sp、Phoma macrostoma、Phoma glomerata、Phoma herbarum、Botrytiscinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Colletotrichum sp、Alternaria alternata、Chaetomiumglobosum，)

表1

油菜黑胫病LAMP引物灵敏性检测

将油菜黑胫病菌(HGHCT2-2)的基因组DNA进行10倍浓度梯度稀释，用本发明提供的LAMP引物检测其灵敏性。结果表明，该组引物可以检测到最低浓度为112fg/μL的油菜黑胫病菌DNA，灵敏性较强(图2)。

实施例3：油菜黑胫病菌LAMP特异性检测引物的田间应用

在全国冬油菜产区(湖北赤壁、江苏南京、云南曲靖、四川成都、河南信阳、安徽徽州、陕西汉中、湖南怀化、浙江宁波、贵州贵阳等地)采集发病的油菜茎秆，从中随机选取7株油菜黑胫病明显发病的茎秆和6株未显症状的油菜茎秆，对发病组织提取DNA，用本发明提供的LAMP引物进行LAMP检测，结果显示，7株发病油菜茎秆上均检测到了油菜黑胫病菌的存在，而6株未显症状的油菜茎秆上检测到5株油菜茎秆也有油菜黑胫病菌的存在，只有1株未检测到该病菌的存在(图3)，将5株未显症状检测结果为阳性的油菜茎秆保湿培养于25℃的环境中，7天以后观察到有黑胫病典型的褐色病斑出现，表明此LAMP引物可以用于检测油菜病组织中的L.biglobosa。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cccttctatc aggggattgg tgtcagcagt 60

tgagcctttg gcttaatttc tgtccctttc ctttctgatt ctacccatgt tttttgcgta 120

ctatttgttt ccttggtggg cttgcctgcc aaaaggacaa ttcaaaccac ttgtaattgc 180

agtcagcgtc agtaacaatg taataattac aactttca 218

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

taggtgaacc tgcggaag 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gttactgacg ctgactgc 18

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ggaaagggac agaaattaag ccaaaattac ccttctatca ggggat 46

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tctgattcta cccatgtttt ttgcgaatta caagtggttt gaattgtc 48

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gtgggcttgc ctgccaaaa 19

Claims

1.检测SEQ ID NO.1所示多核苷酸的试剂在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用，所述的油菜黑胫病菌为L. biglobosa；所述的试剂为LAMP引物组：

F3: TAGGTGAACCTGCGGAAG、B3: GTTACTGACGCTGACTGC、FIP: GGAAAGGGACAGAAATTAAGCCAAAATTACCCTTCTATCAGGGGAT、BIP: TCTGATTCTACCCATGTTTTTTGCGAATTACAAGTGGTTTGAATTGTC、LB: GTGGGCTTGCCTGCCAAAA。