CN107287316B - 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法 - Google Patents

甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107287316B
CN107287316B CN201710554037.2A CN201710554037A CN107287316B CN 107287316 B CN107287316 B CN 107287316B CN 201710554037 A CN201710554037 A CN 201710554037A CN 107287316 B CN107287316 B CN 107287316B
Authority
CN
China
Prior art keywords
specific
pcr
scar
beet
beet cyst
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710554037.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107287316A (zh
Inventor
彭焕
张瀛东
彭德良
李新
黄文坤
孔令安
冯晓东
赵守歧
刘慧�
吴伟
张熠
高海峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201710554037.2A priority Critical patent/CN107287316B/zh
Publication of CN107287316A publication Critical patent/CN107287316A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107287316B publication Critical patent/CN107287316B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明为“甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR‑PCR分子检测方法”，属植物线虫分子检测技术领域。甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记，具有如SEQ NO1所示的核苷酸序列。甜菜孢囊线虫快速SCAR‑PCR分子检测方法是基于甜菜孢囊线虫RAPD特异性区设计的一组甜菜孢囊线虫特异性引物HsSF和HsSR，能够特异性的从甜菜孢囊线虫中PCR扩增出长度为922bp的片段，该特异性引物和检测方法的检测阈值为1/256头二龄幼虫和10‑3白孢囊，由此本发明的引物HsSF和HsSR及其检测方法特异性强、灵敏度高、快速、准确。在甜菜孢囊线虫病的早期诊断和田间检测预警等方面具有很高的应用价值。

Description

甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR-PCR分子检测 方法
技术领域
本发明属植物线虫分子检测技术领域，涉及甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性SCAR标记引物序列和快速SCAR-PCR分子检测方法。
技术背景
甜菜孢囊线虫(Heterodera schachtii Schmidt)是全世界重要检疫性有害生物，对甜菜具有毁灭性危害(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，中华人民共和国农业部第862号公告(2007-05-29))。1850年Schacht首次在德国报道(Franklin,M.T..Heterodera schachtii.CIH Descriptions of plant parasitic nematodes,Set1,No.1.St Albans,UK,Commonwealth Institute of Helminthology,1972:4.)。到目前为止已在全世界的美洲、欧洲、亚洲等50多个国家或地区有分布，22个国家将该线虫列为检疫对象(Steele A E.Nematode parasites of sugar beets[M]//Nickle W R.Plant andinsect nematodes.New York:Marcel Dekker,1984:507-569)。甜菜胞囊线虫是甜菜上危害最严重的病原生物之一，可导致甜菜产量损失25％-50％，严重侵染时损失更大。19世纪下半叶，欧洲因其严重危害，导致甜菜大幅减产，对欧洲甜菜生产造成毁灭性破坏许多糖厂倒闭。甜菜孢囊线虫寄主范围非常广泛，包括23个科95个属的218种植物，对甜菜、油菜和白菜、菠菜等农作物造成严重的经济损失(Steel AE.The host range of the sugar beetnematode Heterodera schachtii Schmidt[J].Journal of American Society of SugarBeet Technology.1965,13:1965,573-603.)。研究表明，当土壤中该线虫幼虫的群体密度达到每克土18条时，可使菠菜减产40％、甘蓝减产35％、大白菜减产24％。在欧洲每年的经济损失已经超过了9000万欧元，德国西部种植甜菜每年达44万hm2，其中每年约有1/4多的甜菜面积遭受该线虫危害，一般造成每公顷5～35t的产量损失，严重威胁着当地甜菜生产和制糖业(Müller J.The economic importance of Heterodera schachtii in Europe[J].Helminthologia,1999,36:205–213)。
甜菜孢囊线虫是我国重要进境检疫性有害生物(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007)。随着经济全球化和我国一带一路战略的实施，人员交流和国际贸易的日益频繁，我国每年从甜菜孢囊线虫疫区国家进口大量的甜菜种子和加工原料，与我国新疆周边接壤的哈萨克斯坦、吉尔吉斯坦、乌兹别克斯坦等国家均有发生危害，该线虫随加工原料和进口种子的杂质传带传入我国的风险极高(彭德良，彭焕，刘慧.国外甜菜孢囊线虫发生危害、生物学和控制技术研究进展.植物保护,2015,41:1-7)。MAXENT与GARP两种生态位模型对甜菜孢囊线虫传入我国的适生区的预测结果表明，该线虫可在我国17个省市生存，我国内蒙古南部、新疆西部、河北中南部、山西东北部、宁夏、甘肃北部是该线虫入侵的高风险区(李建中，彭德良，刘淑艳.潜在外来入侵甜菜孢囊线虫在中国的适生性风险分析[J].植物保护,2008,34(5):90-94.)。目前我国的甜菜主要种植区域为内蒙古、新疆、甘肃等省市区，甜菜孢囊线虫暴发的风险极大。该线虫病害一旦传入我国，将对的我国甜菜生产构成了严重威胁，对该线虫做出快速准确的鉴定和诊断是当前兵团甜菜生产急需解决的关键问题之一。
以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为植物线虫的快速诊断和检测提供了强有力的工具。特异性引物PCR分子检测技术在植物线虫的分子检测中取得了很大的发展，可以通过一次PCR测验即可检测出样本中的一个或多个植物线虫的种群，可以极大的缩短检测时间，提高检测效率。在植物线虫的快速分子检测中，RAPD是立足于PCR发展起来的一项分子标记技术。它以不同的基因组DNA为模板，以单一的随机寡聚核苷酸作引物，通过PCR反应，产生不连续的DNA产物。由于不同基因组DNA序列存在差异，其不同区段上可与引物同源互补的位点不同，扩增产物的数量、大小也不同，因而表现出多态性。RAPD标记具有效率高、样品用量少、灵敏度高、成本较低和检测容易等优点。但RAPD标记也有缺点：由于它所用的引物较短，并采用较低的退火温度，使其重复性差，易产生非特异性的条带；同时，RAPD为显性标记，无法区分个体是纯合的还是杂合的。解决的办法是将其转为SCAR(sequencecharacterized amplified region)标记。SCAR标记是Paran等发展的一种新型分子标记(Paran I,Michelmore R W.Development of reliable PCR-based markers linked todowny midew risistence genes in Jettnce[J].Theor Appl Genet,1993,85:985-993)，由RAPD技术衍生而来,代表一个在基因组遗传上确定的位点。通过对目的片段的克隆与测序,并对序列进行分析后设计出一对互补到原片段两端的碱基的引物,用此引物对原来的模板DNA进行扩增,特征序列扩增区域(SCARs)被特异扩增。这些特征序列扩增区域或维持原来片段的显性分离行为,或转换为共显性标记。该方法与RAPD相比具有如下优点：①由于使用较长的引物和高退火温度，因此具有高稳定性；②有可以将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性。采用SCAR标记方法建立了松材线虫检测技术，克服了传统的形态鉴定需时长、鉴定难度大、存在错检或漏检以及不能对幼虫和雄虫进行鉴定等不足,实现了对松材线虫幼虫、雌雄成虫的任意大小片段均可进行定性鉴定的目标(陈凤毛，叶建仁，吴小芹等.松材线虫两种实用分子检测技术.北京林业大学学报.2011,33(4)：149-152)。Williamson[9]等通过对M.hapla和M.incognita全DNA的RAPD分析,筛选出具有M.hapla种鉴定特征的特异性扩增片段,经克隆、测序后,设计了一对20bp的特异性引物,准确鉴定了M.hapla(Williamson V M,Caswell-Chen E,Westerdahl B,et al.A PCR assay identifyand distinguish single juveniles of M.hapla and M.incognita[J].Journal ofNematology,1997,29:9～15)。Zijlstra等利用SCAR标记成功鉴定了南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，而且所获得的标记能特异性鉴定各个龄期的根结线虫(CarolienZijlstra,Dorine T.H.M.Donkers-Venne and Mireille Fargette.Identification ofMeloidogyne incognita,M.javanica and M.arenaria using sequence characterisedamplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology.2000，2(7),：847-853；CarolienZijlstra.Identification of Meloidogyne chiwoodi,M.falax and M.hapla based onSCAR-PCR:a powerful way of enabling reliable identification of populations orindividuals that share common traits.European journal of plant pathology,1997,106:283-290)。
在孢囊线虫检测中，SCAR特异性标记应用到多种重要孢囊线虫种类检测中。Fullanodo等(1999)用随机引物OPG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段，分别设计出马铃薯金线虫和白线虫的SCAR特异性标记引物，分别扩增获得长度为315bp马铃薯金线虫的特异性片段和798bp的马铃薯白线虫的特异性片段(Fullaondo A，BarrenaEj Viribay M，BarrenaI,Salazar A，Ritter E.Identification Of Potato CystNematode Species Globoderarostochiensis And G.Pallida By PCR Using SpecificPrimer Combinations.Nematology1999，1:157-163)。欧师琪等2008采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI，PCR扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特异性引物SCNF1和SCNR1相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫(Ou，S.Q.，Peng D.L(Ou S Qj Peng D L，Li Y，MoensM.Identification OfHeterodera Glycines Using PCR With Sequence Characterisedamplified Region(SCAR)Primers.Nematology 2008，10(3):397-403)。Peng等采用RAPD技术，开发出小麦孢囊线虫的快速分子检测技术(Huan Peng,Xiaoli Qi,Deliang Peng*,Haibo Long,XufengHe,Wenkun Huang,Wenting He.(2013)Sensitive and direct detection of Heteroderafilipjevi in soil and wheat roots by species-specific SCAR-PCR assays.PlantDisease.97:1288-1294.)。
甜菜孢囊线虫作为一种甜菜孢囊线虫的毁灭性病害，同时也是多个国家的检疫性有害生物，其分子鉴定已经成为研究热点之一。甜菜孢囊线虫的鉴定，通常以孢囊形态学差异来区别，鉴定过程耗时、费力、对专业要求高，且单头幼虫水平上不能达到要求。近年来国内外开展了利用分析rDNA-ITS区域的RFLP图谱和序列,能有效地鉴定和分辨了更多的农业重要孢囊线虫种或近缘种。总的来说，ITS-RFLP图谱分析和ITS序列对Heterodera线虫种鉴定最有效。一种或几种限制性酶(AluI，AvaI，Bsh1236I，BsuRI，CfoI，MvaI和RsaI)酶切ITS产物能区分出重要的孢囊线虫(Subbotin S A,Sturhan D,Waeyenberge L,etal.Heterodera riparia sp.n.(Tylenchida:Het eroderidae)from common nettle,Urticadioica L.,and rDNA-RFLP separation of s pecies from theH.humuligroup.Russian Journal of Nematology,1997,5(2):143-157)。国外采用PCR-RAPD和AFLP技术对甜菜孢囊线虫不同群体进行了遗传多样性的研究(Caswell-chen E P,Williamson V M,Wu F F.Random amplified polymorphic DNA analysis of Heteroderacruciferae and H.schachtii populations[J].Journal of Nematology,1992,24:343-351；Madani M,Kyndt T,Colpaert N,et al..Polymorphism among sugar beet cystnematode Heterodera schachtii populations as inferred from AFLP and ITS rRNAgene analyses[J].Russian Journal of Nematology,2007,15:117-128.),Tanha等(2003)等通过对甜菜孢囊线虫ITS序列的分析，开发了PCR-ITS-RFLP检测甜菜孢囊线虫的技术，采用MvaI能将甜菜孢囊线虫和其他孢囊线虫区分开(Tanha,M.Z.,Subbotin,S.A.,Mones,M.(2003).Molecular identification of cyst-forming nematodes(Heteroderidae)from Iran and a phylogeny based on the ITS sequences ofrDNA.Nematology 5,99-111.)。Amiri等(2002)根据ITS序列的差异，开发了一条甜菜孢囊线虫的特异性引物SHF6，它和ITS下游通用引物rDNA2组合，进行特异性PCR分子检测，能够从甜菜孢囊线虫中扩增出长度分别为255bp的特异性片段，大大加快的检测速度(Amiri S,Subbotin S A,Moens M.Identification of the beet cyst nematode Heteroderaschachtii by PCR[J].European Journal of Plant Pathology,2002,108:497–506.)。在此基础上，Madani等(2005)对上述引物进行了优化设计出一组real time PCR的检测引物SH6Mod和SH4，采用SYBR green I荧光染料能有有效的检测甜菜孢囊线虫(Madani M,Subbotin S,Moens M.Quantitative detection of the potato cyst nematodes,Globodera pallida,and the beet cyst nematode,Heterodera schachtii,using real-time PCR with SYBR Green I dye[J].Molecular Cellular Probes,2005，19:81-86.)。但是该技术也存在也一定的弊端，由于ITS差异部分有限，因而检测体系的退火温度过低(45℃)，在实际检测中会造成一定程度的误判。同时分子检测技术需要有专业的设备和专业的操作人员，同时对于孢囊线虫从土壤中的分离也是个繁琐的过程，不适合高通量、大规模的甜菜孢囊线虫检测。
国内外已有甜菜孢囊线虫基于核糖体DNA的ITS区域的快速检测技术的研究报道，由于ITS差异部分有限，且检测体系的退火温度过低(45℃)，在实际检测中会造成一定程度的误判。目前暂无基于基因组DNA的甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物和特异性检测甜菜孢囊线虫的报道。
发明内容
本发明的主要发明内容是提供一种特异性SCAR标记的全长序列，特异性SCAR标记的特异性引物和快速SCAR-PCR分子检测方法及其应用，为甜菜孢囊线虫的快速分子检测、早期诊断和辅助鉴定甜菜孢囊线虫等服务。
甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
根据上述特异性SCAR标记设计的一组特异性引物，分别为：
HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，
HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。
甜菜孢囊线虫快速SCAR-PCR分子检测方法，其特征在于：其PCR的反应体系中包含一组特异性引物为HsSF和HsSR，其核苷酸序列为：
HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，
HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。
PCR的反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，ddH2O 32.6μl，引物HsSF和HsSR(20μMol/L)各1.5μl，exTaq酶(5U/μl,Takara)0.4μl，模板DNA 1μl，总计50μl。
PCR反应扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
所述SCAR-PCR分子检测为一步双重PCR检测，所述PCR的反应体系中还含有通用引物。
所述通用引物序列为：
D2A:5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，
D3B:5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。
本发明利用RAPD技术，获得了基于甜菜孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列SEQ ID NO1，利用该SCAR标记的保守序列设计出其特异性引物，用于PCR检测出目标线虫。
本发明待测的植物线虫包括来源于德国、比利时和土耳其的甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大麦孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、玉米孢囊线虫、十字花科孢囊线虫、爱沙尼亚孢囊线虫、仙人掌皮线虫和孢囊线虫等18个孢囊线虫群体。
本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HsSF和HsSR(即SEQ ID NO2和SEQ IDNO3)。利用甜菜孢囊线虫特异性引物HsSF和HsSR，在PCR扩增条件下，所有甜菜孢囊线虫群体都获得了922bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则无法扩增获得特异性SCAR标记片段。本发明选用核糖体引物D2A和D3B。与上述特异性引物HsSF和HsSR相结合，利用一步双重PCR方法检测甜菜孢囊线虫，在PCR扩增条件下，甜菜孢囊线虫群体都获得了922bp的特异性SCAR标记片段和780bp片段，而其它线虫类则没有922bp的特异性SCAR标记片段，只有780bp片段，增加了可靠性。甜菜孢囊线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值为1/256头二龄幼虫和10-3白孢囊。由此可以确定本发明构建的甜菜孢囊线虫特异性引物HsSF和HsSR及其检测方法特异性强、灵敏度高、快速、准确。
本发明应用特异性SCAR-PCR检测技术检测甜菜孢囊线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性内切酶技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的甜菜孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对甜菜孢囊线虫田间土壤样品及甜菜孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
附图说明
图1：扩增甜菜孢囊线虫的随机引物筛选。
M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000),引物编号1-15分别为：OPA-01、OPA-02、OPA-3、OPA-04、OPA-05、OPA-06、OPA-09、OPA-13、OPA-18、OPB-15、OPC-06、OPD-13、OPG-06、OPG-08、OPK-16
图2：用随机引物OPA06扩增甜菜孢囊线虫和大豆孢囊线虫的RAPD的特异性DNA片段结果，M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-3为甜菜孢囊线虫群体(编码为Hs01，Hs02，Hs03)，5-8分别为大豆孢囊线虫群体(编码为Hg01，Hg02，Hg03和Hg04)；9为阴性对照；
图3：不同稀释浓度的单孢囊DNA灵敏度检测结果
M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-8分别为1、1/10、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6条白孢囊DNA和CK阴性对照。
图4：不同稀释浓度的单条J2线虫DNA灵敏度检测结果
M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-8分别为1、1/4、1/16、1/64、1/256、1/1024条甜菜孢囊线虫二龄幼虫DNA和CK阴性对照。
图5：甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)结合一步双重PCR检测几种孢囊线虫的结果。
M为标准DNA分子标记(DNA marker 100bp)；1-4为甜菜孢囊线虫群体(编码为Hs01，Hs02，Hs03，Hs04)，5-6大豆孢囊线虫(编号为Hg01，Hg02)7-8禾谷孢囊线虫(Ha01，Ha02)9-10菲利普孢囊线虫(Hf01，Hf02)11宽阴门孢囊线虫(Hl)12旱稻孢囊线虫(He)13玉米孢囊线虫(Hz)14十字花科孢囊线虫(Hc)15爱沙尼亚孢囊线虫(Ce)16仙人掌皮线虫(Cc)17挪威小麦孢囊线虫(Ha03)，18孢囊线虫(CN)，19CK。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明的实验选用的材料：
4个甜菜孢囊线虫群分别从德国、比利时和土耳其等地收集，2个大豆孢囊线虫群体、2个禾谷孢囊线虫群体、2个菲利普孢囊线虫群体、旱稻孢囊线虫、玉米孢囊线虫、十字花科孢囊线虫、爱沙尼亚孢囊线虫、仙人掌皮线虫等为申请人所在长期从山东省、青海省、河南省、甘肃省、北京等地收集保存，其他线虫群体为本实验室工作人员收集(见表1)，上述样本实验室均有保存，可以对公众发放。
表1供试孢囊线虫群体样品代码及来源
Figure BDA0001345244550000071
Figure BDA0001345244550000081
主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker购自TaKaRa公司，限制性内切酶(Biolabs)购自NEB公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；PMD 18-Tvector(TaKaRa,Dalian,China)购自北京六合通商贸有限公司。
实施例1:甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段、特异性引物
1.1甜菜孢囊线虫DNA的提取
挑取单个孢囊，放入装有10μl无菌水的0.2ml的PCR管中，-20℃冰箱中冷冻1h后，用消毒的玻璃棒将孢囊磨碎后，加入7μl的10×的PCR缓冲液，3μl蛋白酶K溶液(600mg/ml)，然后在-20℃下冷冻2h。随后将其置于65℃下温育1.5h；接着在95℃10min，冰上冷却后，0000rpm下离心1min，取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。
1.2甜菜孢囊线虫特异性RAPD标记引物的筛选
根据文献报道，遴选15个Operon系列的含10个碱基的随机引物OPA-01、OPA-02、OPA-3、OPA-04、OPA-05、OPA-06、OPA-09、OPA-13、OPA-18、OPB-15、OPC-06、OPD-13、OPG-06、OPG-08、OPK-16(见表2)进行扩增。从扩增结果来看，随机引物OPA06扩增效果好，获得的特异性片段稳定，因此选用OPA06对甜菜谷孢囊线虫群体和其他孢囊线虫群体的DNA进行扩增，开发甜菜孢囊线虫群体的特异性SCAR标记。
表2本发明所使用引物代码和序列
Figure BDA0001345244550000082
Figure BDA0001345244550000091
RAPD-PCR反应体系:10×PCR-buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物OPA06为1.0μl，Taq DNA多聚酶0.25μl(5U/ml)，模板DNA1.0μl，灭菌重蒸水补足25μl。在EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。
PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，35℃30s,72℃1min,10个循环；94℃30s；37℃1min；72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5X TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1小时，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。如图1。
用随机引物OPA06经过多次RAPD扩增多态性较稳定，从图1中可以看出用随机引物OPA06扩增甜菜孢囊线虫群体获得955bp的DNA片段(图2中1-3泳道)。
1.3、甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物开发和验证。
使用DNA回收试剂盒将随机引物OPA06扩增甜菜孢囊线虫获得的955bp的RAPD特异性DNA片段进行回收和纯化，连接到PMD18-T Vector载体上，转化到E.coli中进行克隆，将PCR鉴定为阳性克隆的重组质粒委托大连宝生物公司进行序列测定(见SEQ ID NO1)。
根据甜菜孢囊线虫RAPD特异性的DNA片段序列测序结果，采用Primer5.0软件设计了一对特异性SCAR标记引物，分别命名为HsSF和HsSR，
HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，
HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。
实施例2：甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物的灵敏度检测
提取单条甜菜孢囊线虫二龄幼虫DNA，采用4倍稀释法，将DNA稀释成1、1/4、1/16、1/64、1/256、1/1024倍后的甜菜孢囊线虫二龄幼虫的DNA，同时提取甜菜孢囊线虫单孢囊的DNA，采用10倍稀释法，对DNA进行稀释得到1/10、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6条甜菜孢囊线虫孢囊的DNA，各取1μl甜菜孢囊线虫DNA做模板用特异性引物HsSF和HsSR进行PCR扩增，以检验特异性引物的灵敏度。
PCR的反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，ddH2O 32.6μl，引物HsSF和HsSR(20μMol/L)各1.5μl，exTaq酶(5U/μl,Takara)0.4μl，模板DNA 1μl，总计50μl。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
图3的结果表明，从1-1/256条线虫都能够扩增出清晰的条带(图3，泳,1-5)，而图4的结果说明，单孢囊DNA稀释成10-3倍后，仍能够检测到特性的条带(图4，泳,1-3)，这说明甜菜孢囊线虫SCAR特异性引物及检测方法的具有极高的灵敏度.
实施例3：甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(D2A和D3B)一步双重PCR方法检测甜菜孢囊线虫
本发明将构建的甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记引物HsSF和HsSR与通用引物D2A和D3B置于同一个PCR反应中，HsSF和HsSR特异性扩增甜菜孢囊线虫基因组DNA的SCAR标记片段，引物D2A和D3B用于扩增rDNA基因的片段。建立了甜菜孢囊线虫一步双重PCR技术。采用上述PCR扩增体系和扩增条件，对表1中的18个孢囊线虫群体进行检测。
图5结果表明，从4个甜菜孢囊线虫群体中，能够检测获得922bp和780bp的两个片段，而从大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、玉米孢囊线虫、十字花科孢囊线虫、爱沙尼亚孢囊线虫、仙人掌皮线虫等等14个群体(图5中5-18泳道)仅扩增到D2D3区780bp DNA片断，而没有甜菜特异性SCAR标记的922段。说明本发明所构建的SCAR标记引物与通用引物一步双重PCR方法对甜菜孢囊线虫具有很高的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 甜菜孢囊线虫的特异性SCAR标记以及快速SCAR-PCR分子检测方法
<130> PP17089－ZWB
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 922
<212> DNA
<213> 特异性SCAR标记
<400> 1
ggaccctgac gaccagaata aaaatgggtc aaatcagagt gttccacaaa atattaccaa 60
gaaaaaggaa gaattaaaaa ccagcagtga tccaactcat tcattttcaa cgtctccggc 120
tccattgcga gtgtctaacc aaactacaat agcacaagca cagcaaataa cacctgctca 180
aaaaagtgaa actaaaacac catcatcgat tagtgaggtg aaacggaagg aaattggccc 240
accgccaaaa caaagaaatg aaaaaagcat aatcgagccg gtctcaccgc caccgcgtcc 300
tcaaccagct gcgcctacgc actccaatgt tagcgagaaa aaggccacga ctccacctcg 360
agtaatagcc actgagatta ttggaccacc gcccaaacag agaaatgaaa aaagtgtaaa 420
taccaaacag gggcaagcac aacttgtcac cgaaataacc cctgagaata ctaaaaagac 480
aacaacaata actacaacaa ctaccaccat aattaccgaa ccaccgaaaa acacaattgg 540
tgatttagta ggacgaattg aagaaccagc agagaaaaac aatgcggaga agttgctttc 600
cgtgttattt ggaaatgagg aatggaaaaa agttaacttg agaattctta gacaaatcat 660
tgaaggagtt gaattacaat atcatccaaa ttttgagcgg ttcaaagcgg tttttacaca 720
cccgagaatt gaatttatct ccttttcacc tcagctcggc tatgtattgg gttttgaaaa 780
ttctcaacat gtaagaaata atgaaatagc caaatacgga agtgatctcc gtggtggatt 840
cgcaagtttc gctgtgtacg caaaaggcct aaccgagaat atgattgttg gaaattcatt 900
gagctcgctc cttcgtgttg tc 922
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> HsSF序列
<400> 2
ggaccctgac gaccagaata 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> HsSR序列
<400> 3
gacaacacga aggagcgagc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> D2A序列
<400> 4
acaagtaccg tgagggaaag ttg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> D3B序列
<400> 5
tcggaaggaa ccagctacta 20

Claims (7)

1.甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求1所述的甜菜孢囊线虫特异性SCAR标记设计的一组特异性引物，分别为：
HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，
HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。
3.甜菜孢囊线虫快速SCAR-PCR分子检测方法，其特征在于：其PCR的反应体系中包含一组特异性引物为HsSF和HsSR，其核苷酸序列为：
HsSF:5’-GGACCCTGACGACCAGAATA-3’，
HsSR:5’-GACAACACGAAGGAGCGAGC-3’。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述PCR的反应体系为含Mg2+的10×Buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，ddH2O 32.6μl，浓度为20μmol/L引物HsSF和HsSR各1.5μl，5U/μl exTaq酶0.4μl，模板DNA 1μl，总计50μl。
5.根据权利要求4所述的检测方法，PCR反应扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的检测方法，所述SCAR-PCR分子检测为一步双重PCR检测，所述PCR的反应体系中还含有通用引物。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述通用引物序列为：
D2A:5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，
D3B:5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。
CN201710554037.2A 2017-07-09 2017-07-09 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法 Active CN107287316B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710554037.2A CN107287316B (zh) 2017-07-09 2017-07-09 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710554037.2A CN107287316B (zh) 2017-07-09 2017-07-09 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107287316A CN107287316A (zh) 2017-10-24
CN107287316B true CN107287316B (zh) 2020-08-11

Family

ID=60101068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710554037.2A Active CN107287316B (zh) 2017-07-09 2017-07-09 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107287316B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143817B (zh) * 2020-09-25 2021-12-24 中国农业科学院植物保护研究所 南美番茄潜叶蛾scar引物及其应用
CN112626239B (zh) * 2021-02-08 2022-06-21 河南农业大学 玉米孢囊线虫特异性scar标记、检测引物及其pcr快速检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1614396A (zh) * 2004-12-14 2005-05-11 中国科学院微生物研究所 一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针
CN102329793A (zh) * 2011-10-31 2012-01-25 中国农业科学院植物保护研究所 菲利普孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090293142A1 (en) * 2006-03-07 2009-11-26 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Methods for increasing shoot-to-root ratio, seed production and resistance to diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1614396A (zh) * 2004-12-14 2005-05-11 中国科学院微生物研究所 一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针
CN102329793A (zh) * 2011-10-31 2012-01-25 中国农业科学院植物保护研究所 菲利普孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5 的克隆与分析;彭焕等;《中国农业科学》;20121231;第45卷(第5期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107287316A (zh) 2017-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wonni et al. Analysis of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola population in Mali and Burkina Faso reveals a high level of genetic and pathogenic diversity
Chaitieng et al. Development of a black gram [Vigna mungo (L.) Hepper] linkage map and its comparison with an azuki bean [Vigna angularis (Willd.) Ohwi and Ohashi] linkage map
Gajardo et al. Phytoplasmas associated with grapevine yellows disease in Chile
Abd-Elmagid et al. Discriminatory simplex and multiplex PCR for four species of the genus Sclerotinia
Pagan et al. Mitochondrial haplotype-based identification of ethanol-preserved root-knot nematodes from Africa
Williams et al. The application of species-specific assays based on the polymerase chain reaction to analyse Fusarium crown rot of durum wheat
Dianese et al. Development of a locus-specific, co-dominant SCAR marker for assisted-selection of the Sw-5 (Tospovirus resistance) gene cluster in a wide range of tomato accessions
CN104263813B (zh) 用于鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其方法
CN102329793B (zh) 菲利普孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法
CN107287316B (zh) 甜菜孢囊线虫的特异性scar标记以及快速scar-pcr分子检测方法
Guan et al. A TaqMan-based real time PCR assay for specific detection and quantification of Xylella fastidiosa strains causing bacterial leaf scorch in oleander
Çağlar et al. Detection and molecular characterization of Bermuda grass (Cynodon dactylon) white leaf phytoplasma from Turkey
Jeyaprakash et al. Differentiation of Meloidogyne floridensis from M. arenaria using high-fidelity PCR amplified mitochondrial AT-RICH sequences.
KR101010446B1 (ko) 고추 탄저병 균주(Colletotrichum capsici)에 대한 저항성주동유전자 연관 분자표지 개발 및 이의 이용
Zhang et al. Molecular variation of Sporisorium scitamineum in Mainland China revealed by internal transcribed spacers
Papayiannis et al. A real-time PCR assay to differentiate the B and Q biotypes of the Bemisia tabaci complex in Cyprus
CN101560515B (zh) 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法
KR101681645B1 (ko) 무에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출 방법
Cho et al. Development of AFLP and CAPS markers linked to the scab resistance gene, Rvn2, in an inter-specific hybrid pear (Pyrus spp.)
KR102116428B1 (ko) 뿌리혹병 저항성 배추 품종의 판별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
CN102796825A (zh) 特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法
Bhat et al. Detection and characterization of the phytoplasma associated with a phyllody disease of black pepper (Piper nigrum L.) in India
CN114410802B (zh) 一种检测禾谷孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用
Hasan et al. Identification of Meloidogyne spp. According to Morphological characteristics, PCR-SCAR Marker and 18S rDNA region in Iraq
KR101719719B1 (ko) Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Peng Huan

Inventor after: Wu Wei

Inventor after: Zhang Yu

Inventor after: Gao Haifeng

Inventor after: Zhang Yingdong

Inventor after: Peng Deliang

Inventor after: Li Xin

Inventor after: Huang Wenkun

Inventor after: Kong Lingan

Inventor after: Feng Xiaodong

Inventor after: Zhao Shouqi

Inventor after: Liu Hui

Inventor before: Peng Huan

Inventor before: Wu Wei

Inventor before: Zhang Yi

Inventor before: Gao Haifeng

Inventor before: Zhang Yingdong

Inventor before: Peng Deliang

Inventor before: Li Xin

Inventor before: Huang Wenkun

Inventor before: Kong Lingan

Inventor before: Feng Xiaodong

Inventor before: Zhao Shouqi

Inventor before: Liu Hui