CN105671205A - 检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的rt-lamp引物组及试剂盒 - Google Patents

检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的rt-lamp引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，所述引物组包含4条引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1-4所示，本发明还建立了针对CSBV的RT-LAMP试剂盒，通过对RT-LAMP条件优化，寻找到了合适的中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-LAMP检测条件，该试剂盒具有仪器要求简单、操作简便、高敏感度、高特异性、成本低廉、直接观察结果等特点，尤其适合基层技术人员检测使用，对CSBV真正做到早检测，早预防，确保我国中华蜜蜂蜂群的健康发展，保证区域内野生植物和农作物正常授粉，维持生态平衡。

Description

检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。
背景技术
蜜蜂囊状幼虫病是一种严重危害幼虫的病毒性疾病，由蜜蜂囊状幼虫病毒(SacbroodVirus，SBV)引起。蜜蜂囊状幼虫病毒属于小RNA病毒，目前至少可以感染蜜蜂科的两大蜂种即西方蜜蜂和东方蜜蜂，能感染中华蜜蜂的病毒被称为中华蜜蜂囊状幼虫病毒(ChineseSacbroodVirus，CSBV)。此病毒对蜂群危害极其严重，尤其对我国本土蜂种中华蜜蜂危害极其严重；中华蜜蜂为东方蜜蜂一个亚种，对此病毒抵抗力非常弱，极易暴发流行。自从1972年中华蜜蜂囊状幼虫病首次在中国广东爆发至今，此病毒对中华蜜蜂蜂群发展及生产能力造成了严重的影响，导致我国中华蜜蜂的种群数量急剧减少。流行病学调查结果显示，此病目前已成为危害中华蜜蜂种群发展最严重的常发疾病之一。在一些地区，中华蜜蜂囊状幼虫病的发病率高达100％，甚至有些蜂场直接导致蜂群崩溃，当地众多野生植物和农作物的传粉受到了严重的影响，生态环境平衡以及作物收成面临严峻的考验。
中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的传播大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。开发有效的病毒早期检测技术，做到早发现、早预防、早控制就显得尤为重要。目前生产实践中主要通过观察症状和聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)方法等检测CSBV，但是当蜂群出现明显症状时通常就错过了最佳防控时期，具有明显滞后性；一般PCR检测条件要求苛刻，且价格昂贵，不利于基层使用和推广。病毒的早期检测技术对于病害的防控意义重大，因此建立快速、准确、简便、经济的CSBV检测方法迫在眉睫。
环介导等温平衡扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年日本学者Notomi等开发的一种全新的等温核酸扩增方法，其特征为针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。相对于普通的PCR扩增技术而言具有高特异性、高灵敏性、操作简便、结果判定直观等优点，具体如下：反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下一步即可完成，可在短时间内实现109～1010倍的扩增，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。目前针对CSBV的LAMP检测方法仅限于马鸣潇等于2011年证实LAMP可以用于CSBV的检测，实验检测的灵敏度低，效果较差。目前，能够快速、准确、特异、便捷以及经济的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的RT-LAMP引物组和试剂盒尚未见有报道及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速、灵敏、特异的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的发明人通过研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒的编码基因序列设计了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，包含以下四条引物：
F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；
B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；
FIP：5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3’；
BIP：5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3’。
本分发明的另一个方面还提供了一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，所述方法包括使用本发明所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增反应。
可选的，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。优选的，为了提高检测反应的特异性和灵敏度，检测反应条件为：63℃下反应60min，80℃作用10min结束反应。
可选的，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
为了获得更高的灵敏度和特异性检测结果，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
本发明所提供的检测方法可以应用于非诊断和治疗目的的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测。例如应用于中华蜜蜂囊状幼虫病毒研究和应用于与该病毒相关生物制剂的生产领域等。
本发明的另一个方面提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的RT-LAMP引物组。
可选的，在所述试剂盒中还包括RT-LAMP反应所需试剂。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述RT-LAMP反应所需试剂包括链置换DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、甜菜碱、AMV逆转录酶、TritonX-100；上述试剂可以共同组成RT-LAMP反应液，所述RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体系。
在应用所述试剂盒时，RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体系，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
在本发明的一种优选的实施方式中，在应用所述试剂盒时，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
可选的，利用所述试剂盒进行检测反应时，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。
所述的RT-LAMP引物组或所述的试剂盒在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途也属于本发明的保护范围。
在本发明的一种实施方式中可以通过以下所列举的方法进行结果检测，
(1)直观检测：
显色法：反应结束后加入1μL钙黄绿素，阳性反应结果显示黄绿色，阴性反应保持原黄色不变，在紫外光激发下，阳性样品显示明亮荧光；
目视浊度法：将反应结束后获得的反应物离心，阳性反应结果可观察到沉淀，阴性反应无沉淀；
荧光实时监测法：反应结束后加入SYBRGreen显色剂，然后置于荧光定量仪实时观察；
(2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。
本发明还提供了所述RT-LAMP引物组在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途。
与现有的中华囊状幼虫病毒(CSBV)早期检测方法相比，本发明所提供的RT-LAMP试剂盒有显著的优点，具体如下：一、反应迅速，利用AMV逆转录酶实现一步RT-LAMP完成反应，省去了RNA反转录过程，同时相比一般的RT-PCR节约2-3hr。二、特异性好，灵敏度高，对蜜蜂其他病毒如蜜蜂残翅病毒(DWV)等呈阴性反应，最低可检测到8个拷贝的RNA模板，即使几个病毒粒子，也能被快速准确的检测到。三、反应结果易于观察，RT-LAMP反应在DNA扩增过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，反应结束时无需进行琼脂糖凝胶电泳，可直接观察沉淀或者加入荧光染料，阳性反应管在紫外下呈现强烈的绿色荧光。四、成本低廉，利用BstDNApolymerase可实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪。
本发明所述的RT-LAMP试剂盒可快速、灵敏的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒，操作简单、成本低廉、反应结果易于观察、特异性好，非常适合于中华蜜蜂囊状幼虫病的现场检测，保证蜂群的健康及作物的正常授粉，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为RT-LMAP体系不同MgSO4浓度的优化结果。1-7泳道MgSO4浓度分别为阴性对照、实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E和实验组F，M为DL2kmarker。
图2为RT-LAMP体系不同dNTP浓度的优化结果。1-7泳道dNTP浓度分别为实验组J、实验组K、实验组L、实验组M、实验组C和实验组N，M为DL2kmarker。
图3为RT-LAMP体系中内、外引物不同比例的优化结果。1-5泳道内外引物浓度比分别为实验组G、实验组H、实验组I、实验组C，M为DL2kmarker。
图4为RT-LAMP体系中，不同反应温度的优化结果。1-3泳道反应温度分别为实验组O、实验组C和实验组P。
图5为RT-LAMP特异性检测实验；其中M为DL2kmarker；1：以中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)cDNA为模板的RT-LAMP；2：以SBVcDNA为模板的RT-LAMP；3：以DWVcDNA为模板的RT-LAMP。
图6为RT-LAMP的灵敏度检测；其中M为DL2kmarker；1-7：以10倍稀释的中华囊状幼虫病毒(CSBV)RNA(9.2×10-12ng/μL～9.2×10-6ng/μL)为模板的RT-LAMP。
图7为RT-LAMP的可视化结果；其中，1为阴性对照；2、3为CSBVRNA为模板的RT-LAMP扩增产物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1)引物设计
以CSBV基因序列(GeneBank:HM237361)，在NCBI基因数据库中通过Blast比对分析得到CSBV同源性95％以上的保守基因序列，以其为模板，设计RT-LAMP引物：外引物为CSBV-F3(F3)和CSBV-B3(B3)，内引物为CSBV-FIP(FIP)和CSBV-BIP(BIP)(如表1所示)。
表1
F3： 5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；
B3： 5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；
FIP： 5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3’；
BIP： 5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3’。
2)样本RNA的抽提
将患病蜜蜂进行液氮冷冻处理，用研磨棒进行研磨，为了充分研磨，可以在研磨的过程中加入500mlTrizol，研磨充分后再加600mL的Trizol，上下翻转摇匀，室温静置5min。4℃10000×g离心10min，吸取上清加入0.2mL的氯仿混匀，室温孵育3min。4℃10000×g离心10min，吸取上清600mL(避免吸取沉淀残渣)，加入0.5mL异丙醇，轻柔的颠倒混匀，-20℃孵育10min。10000×g4℃离心10min，弃上清，在管底或侧壁可见白色沉淀，加1mL冷藏的75％乙醇吹打洗涤，4℃7500×g离心5min，弃上清后室温晾晒10min，用30-50μL无RNase水溶解TotalRNA，-80℃冰箱储存备用。
3)CSBV环介导等温扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification)的建立：反应体系为25μL。
设置A-P共16个实验组，分别利用如表2所示的反应条件进行RT-LAMP扩增反应，其他反应条件相同，反应体系中试剂的用量分别均为：8UBstDNApolymerase，10UAMV逆转录酶，1μLRNA，0.5M甜菜碱(Betaine)，10×ThermopolBuffer1μL，补DEPC水至25μL，TritonX-100浓度为0.1％，反应混合物置于水浴锅中反应1hr，80℃10min终止反应，产物通过琼脂糖凝胶电泳获得典型梯状条带的亮度。结果见图1、图2、图3和图4。当MgSO4浓度为2-6mM时，条带清晰；当dNTP浓度为0.6-1mM时，条带清晰；当内外引物浓度为8:1时，条带最为清晰。
表2
4)检测体系特异性和灵敏性检测
利用与实验组C相同的方法和条件使用蜜蜂SBV、DWV为模板检测体系的特异性，RT-LAMP检测体系的特异性测试良好，可特异性检测到中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)，见图5。同时利用与实验组C相同的方法和条件对CSBV模板进行不同倍数的稀释检测，证实RT-LAMP可以检测到RNA的水平为10-10数量级，见图6。
5)检测体系可视化结果鉴定
利用与实验组C相同的方法和条件对CSBV模板进行RT-LAMP检测，在CSBV的RT-LAMP扩增产物中加入螯合的1μL钙黄绿素染料，结果证实扩增产物在紫外灯下肉眼观察呈现绿色，反应为阳性结果，对照呈现无色状态，见图7。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，包含以下四条引物：
F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；
B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；
FIP：5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3’；
BIP：5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3’。
2.一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增反应。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：
6.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RT-LAMP引物组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中还包括RT-LAMP反应所需试剂。
8.权利要求1所述的RT-LAMP引物组或权利要求6-7中任意一项所述的试剂盒在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途。
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