CN101956020A - 蜜蜂囊状幼虫病pcr及荧光pcr快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物、蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物。本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提供技术保障。

Description

蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法

技术领域：

本发明属于生物领域。

背景技术：

囊状幼虫病(sacbrood disease)简称囊幼病，又叫尖头病、囊雏病，是由囊状幼虫病毒(sacbrood bee virus，SBV)引起的蜜蜂幼虫肠道传染病，也是中蜂的主要病害之一。在养蜂生产上时有发生，发病轻时，出现近百只幼虫死亡，工蜂采集活动正常；发病严重时，蜂群只见幼虫增多却不见成蜂增加，造成大批幼虫死亡，工蜂表现不安，采集力明显下降，甚至整群飞逃，给蜂农造成严重损失。

蜜蜂囊幼病最早在1913年发现，但直到1964年才证实其病原体为囊状幼虫病毒^[9]，1971年，囊幼病在广东省佛冈、从化、增城等地发生。第二年开始流行，并迅速蔓延至全国乃至东南亚，尤其在东南亚一带几乎形成毁灭性的灾害。囊幼病多流行于夏秋高温季节，其危害大，传染快，蜂群患病后轻者影响蜂群的繁殖和采集，重者会造成全场蜂群覆灭^[10]。SBV主要感染幼虫使其致病死亡。一般在1～2日龄小幼虫阶段侵入，在5～6日龄大幼虫阶段出现明显的症状，也可在成蜂体内繁殖，但不表现出症状。SBV一般在1～2日龄小幼虫阶段侵入，在中肠细胞、脂肪细胞、王浆腺细胞和气管等组织中大量增殖，被害幼虫无法化蛹，一般都在幼虫封盖前后表现症状，感染幼虫失去光泽，然后软塌下陷，贴于巢房下半部，头部离开巢房壁翘起，形成钩状幼虫，虫体由苍白色逐渐变为淡褐色，由于虫体后部皮下渗出液增多，用镊子夹出呈现典型的囊状^[11]。幼虫通常在5～6日龄时死亡，发病高峰期患病幼虫约有1/3死于封盖前，2/3死于封盖后^[12]。发病初期出现“花子”，接着即可在脾面上出现“尖头”，幼虫头部离开巢房壁翘起，形成钩状幼虫，体色由珍珠白变黄，继而变褐、黑褐色。抽出后虫体呈现典型的囊状袋。封盖的病虫房盖下陷，工蜂将房盖咬一小孔或启开拖出巢房，未被拖出的死幼虫，体色由淡褐色变为深褐色或黑色，后期呈一干片，似龙船状。病死虫体干后不翘，无臭，无粘性，易清除。

SBV是类小核糖核酸病毒(picornavirus)，属于正链RNA病毒，病毒粒子直径28nm，无囊膜，圆形。基因组RNA碱基组成G+C含量37％到39％，对酸敏感。包含3种结构蛋白，25、28和31.5kDa，此外还有一个小的VP4样蛋白尚未见详细报道，SBV是蜜蜂病毒中第一个完成全基因组测序的病毒，基因组RNA全长8832核苷酸，稍长于典型的哺乳动物微小RNA病毒(大约7500核苷酸)，包含一个单独的开放阅读框(179到8752核苷酸)编码2858氨基酸的蛋白。5′末端有结构基因，3′末端有非结构基因。SBV对外界不良环境的抵抗力不强，在59℃热水中只能生存10分钟，室温干燥情况下可以存活3星期，在病虫尸体可以存活1个月，如果病虫尸体腐败只能存活7～10天。据资料报道，在蜂粮中可存活100～120天，残留在巢房壁上的病毒夏季能存活80～90天，冬天则可存活90～100天。阳光直射4～7小时可以杀死。

蜜蜂囊幼病的防治重在如何及早发现病毒的感染。在蜂群内有明显的感染症状时，已经对蜂群产生了很大的危害，随后的防治措施也难以避免业已造成的巨大损失。在病毒的检测方面，传统的病毒离子的分离和形态观测需要繁琐的步骤和较高的试验条件。随着分子生物学的发展，使得利用生物技术进行囊状病毒的检测成为可能。到目前为止，对囊状幼虫病病毒的实验室诊断还主要基于电子显微镜的观察，以及传统的检测方法如琼脂扩散试验、放射性免疫测定、ELISA等免疫学方法，这些方法的敏感性和特异性较低，无法避免假阳性反应。

发明内容：

本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。

本发明步骤是：

a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；

b、引物设计与合成：

蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物：

SBV1  5’-ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3’

SBV2  5’-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3’

蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物：

SBV311F  5’-AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3’

SBV380R  5’-AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3’

SBV331T  5’-FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’

c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；

(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；

(3)4℃ 12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；

(4)4℃ 12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；

(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；

d、将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃5min，4℃5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。

本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提供技术保障。

附图说明：

图1是本发明SBV PCR扩增结果；

图2是本发明SBV PCR特异性检测结果；

图3是本发明PCR敏感性检测结果；

图4是本发明特异性试验结果；

图5是本发明荧光PCR敏感性试验。

具体实施方式：

本发明的步骤是：

a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；

b、引物设计与合成：

蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物：

SBV₁  5’-ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3’

SBV₂  5’-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3’

蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物：

SBV311F  5’-AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3’

SBV380R  5’AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3’

SBV331T  5’-FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’

c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；

(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；

(3)4℃ 12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；

(4)4℃ 12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；

(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；

d、将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃5min，4℃5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。

材料

1.病料

蜜蜂病料来自2005年以来对吉林省不同地区40个蜂场的蜜蜂及蜂产品检疫样品；中国农业科学院蜜蜂研究所病料37份；福建农林大学蜂学院蜜蜂病料20份；包括的蜂种有意大利蜜蜂，高加索蜜蜂，浙江浆蜂，中华蜜蜂。

蜜蜂囊状幼虫病病料、蜜蜂急性麻痹病病料、蜜蜂慢性麻痹病病料、残翼病病料、黑蜂王台病病料、美洲幼虫腐臭病病料、欧洲幼虫腐臭病病料、患白垩病蜜蜂幼虫病料由中国农科院蜂病研究所和福建农林大学蜂学院提供。

2.试剂

TaqHS DNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10×buffer缓冲液、6×Loading buffer，100bp DNA Ladder Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

TRIzol试剂盒：GIBCOBRL公司产品；One Step RNA PCR(AMV)试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)等购自大连宝生物工程有限公司；

DEPC水配制与器皿处理：配制0.1％的DEPC水溶液，37℃磁力搅拌24h。取出适量高压，用高压后DEPC水配制成75％的酒精，剩余分装以备RT-PCR和提取RNA使用。用未高压DEPC水处理离心管和枪头，将离心管和枪头在未高压处理的DEPC水中浸泡过夜，晾干后高压除去DEPC。

3.实验仪器

高速冷冻离心机(SIGMA 3K30，德国西格马公司)，核酸蛋白分析仪(Gene Spec V，Hitachi NaKa instruments Co.，Ltd.日本)，PCR扩增仪(Biometra Tgradient-96，德国Biometra公司)，荧光定量PCR扩增仪(ABI Sequence Detection system 7000)，电泳仪(SAVANT PS500A美国)，凝胶成像系统(Kodak EDAS290，美国柯达公司)，生化恒温培养箱，微量移液器(0.1～1000μl BIOHIT芬兰)、恒温水浴锅等。

方法

1.病料的采集和处理

病料的采集和保存按如下步骤进行：

①成蜂标本的采集和保存：对患成年蜂病的蜂群可取蜂群内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂及在蜂箱前面爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只。装入密封袋内，作好记录和标记，注意不要用酒精浸泡，尽快转移到液氮中保存。

②幼虫标本的采集和保存：第一，割取一小块有病虫或死虫的巢脾，装入密封袋内。第二，挑取单个幼虫若干只装入已消毒的冻存管内，尽快转移到液氮中保存。注意，凡是供作微生物检验的标本，均不能加任何防腐剂，也不能用化学剂处理。

2.引物设计与合成

2.1蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物的设计与合成

根据Genebank网站公布的蜜蜂囊状幼虫病病毒全基因组核苷酸序列(GeneBankAF092924)，设计引物SBV₁和SBV₂由大连TaKaRa宝生物工程有限公司合成，理论扩增片段大小为487bp，其引物序列见表1-1。

表1-1蜜蜂囊状幼虫病病毒PCR引物

Tab 1-1 The primers ofPCR for SBV

2.2蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物的设计与合成

根据Genebank网站公布的蜜蜂囊状幼虫病病毒病毒核苷酸序列(GeneBank AF092924)，应用DNAman软件设计出一对引物SBV311F、SBV380R及探针SBV331T。核酸探针SBV331T两端用荧光染料修饰，5’端报告荧光为-FAM(6-Carboxyfluoresciein)，在518nm处有最大的吸光值；3’端淬灭荧光为-TAMRA(6-Carboxytetramethylrhodamine)，在582nm处有最大吸光值，由TakaRa宝生物工程(大连)有限公司合成，引物及探针序列见表1-2。

表1-2蜜蜂囊状幼虫病病毒实时定量荧光PCR引物及探针

3.总RNA的提取

取疑似囊状幼虫病患病蜜蜂，按如下步骤提取总RNA：

(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；

(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；

(3)4℃ 12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；

(4)4℃12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；

(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解。

4.RT反应

将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构。各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃ 5min，4℃ 5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。RT反应体系如下表1-3：

表1-3密蜂囊状幼虫病病毒RT反应体系

5.PCR反应

反应体系如下：

表1-4蜜蜂囊状幼虫病病毒PCR反应体系

应用德国Biometra公司的Biometra Tgradient-96梯度PCR扩增仪进行扩增反应，其反应步骤包括预变性、变性、退火、延伸，具体参数如表1-5所示：

表1-5蜜蜂囊状幼虫病病毒PCR反应参数

5.1PCR检测特异性试验

以蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒cDNA为特异性试验对照，以之前一检测过的蜜蜂囊状幼虫病毒cDNA作为阳性样品，并设ddH₂O作为阴性对照，在已建立的最佳反应条件和反应体系下进行PCR反应，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后分析结果并拍照。

5.2PCR检测敏感性试验

蜜蜂囊状幼虫病毒cDNA应用核酸蛋白分析仪测定浓度后，定量到1mg/ml，用DEPC水作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍稀释，在最佳反应条件和反应体系下进行PCR检测并观察结果。

6.实时荧光PCR检测

PCR反应液须在冰盒中进行配制，配液顺序为：去离子水(ddH₂O)、10×buffer、dNTP、引物、荧光探针、Taq酶、样品DNA。以提取的囊状幼虫病毒cDNA为模板，每次反应均设阴性对照。

初步反应体系如表1-6。

表1-6蜜蜂囊状幼虫病病毒实时定量荧光PCR反应体系

本试验建立的实时定量荧光PCR初步反应参数包括预变性、变性、退火、延伸四步。实时定量荧光PCR初步反应参数见表1-7。

表1-7蜜蜂囊状幼虫病病毒FQ-PCR反应参数

ABI7000荧光定量PCR仪完全封闭操作，仪器直接读数，实时定量荧光PCR荧光信号在每一循环延伸步骤完成后收集，并立即表现出结果，可实时观察每一循环所收集荧光信号的强度。

6.1实时荧光PCR检测特异性试验

在已优化好的荧光PCR反应体系和反应条件下，以蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒cDNA作为特异性试验对照，进行荧光PCR，以检测建立的荧光实时定量PCR方法的特异性，并记录试验结果。

6.2实时荧光PCR检测敏感性试验

将所提取的标准蜜囊状幼虫病毒cDNA应用核酸蛋白分析仪测定浓度后，定量到1mg/ml，然后用DEPC水作进行10¹、10²、10³、10⁴倍稀释，在之前已优化好的荧光PCR体系、条件下，共同进行荧光定量PCR反应，测定最低模板检测量，并记录试验结果。

结果与分析

1.蜜蜂囊状幼虫病PCR方法的建立与标准化

1.1PCR扩增电泳检测结果

本试验所设计的一对引物能扩增蜜蜂囊状幼虫病毒核苷酸序列(GeneBank AF092924)上一段487bp长的片段。下面电泳图中所显示的扩增片段在500bp与400bp之间，约为487bp，大小符合所设计的两引物之间DNA片段的长度，且阴性对照未见特异性条带。如图1所示。

1.2PCR检测的特异性试验结果

在优化好的PCR反应体系和反应条件下，以蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒cDNA为特异性试验对照进行PCR检测。电泳结果显示，仅有囊状幼虫病毒被扩增出条带，而其它对照以及阴性对照均未扩增出条带。结果如图2所示。

1.3PCR检测敏感性试验结果

在优化好的PCR反应体系和反应条件下，进行敏感性试验。从图1-3可以看出5号(10^-4模板稀释度)隐约扩出电泳条带，6号(10^-5模板稀释度)则无电泳条带，且7号(阴性对照)未扩增出条带。因此，所建立的PCR方法检测的灵敏性可达10^-4的模板稀释度。PCR敏感性检测结果如图3所示。

2.蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR方法的建立与标准化

2.1荧光PCR反应优化结果

用优化的MgCl₂、Taq酶反应体系进行引物、探针比例的矩阵优化，阴性对照CT值为37，曲线为平直的直线，阴性对照成立，结果可见，当20μM引物用量1.5μL、20μM探针用量1μL时反应体系的CT值最小，由此设定20μM Forward primer用量为0.75μL，20μMReverse primer用量为0.75μL，20μM TaqMan探针用量为1μL。扩增结果CT值见表1-8：

表1-8引物、探针用量配比优化

由以上优化结果得出本试验的最佳反应体系组成参数如表1-9：

表1-9反应体系参数

反应参数如表1-10：

表1-10循环参数

2.2荧光PCR检测特异性试验结果

将提取的各病原(蜜蜂囊状幼虫病毒、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌)的DNA用优化的反应体系和反应条件进行荧光实时定量PCR检测，由图1-4可以看出本发明建立的方法可以很好的扩增囊状幼虫病毒，而其他病原对照菌的曲线是平的，略有弯曲，可判为阴性。由此可以判定本试验所建立的荧光定量PCR方法具有较好的特异性。扩增结果曲线如图4。

2.3荧光PCR检测敏感性试验结果

将不同稀释度的cDNA(其终浓度分别为1μg、100ng、10ng、1ng)用优化好的反应体系和反应条件进行试验，如图所示四条曲线由上至下分别是10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍稀释阳性样本的扩增结果，可见其中第四条曲线不明显，其荧光强度增加值接近200，不影响结果的判定，所以本发明建立的荧光PCR诊断方法可以检测到1ng的阳性cDNA。扩增曲线如图5。

一、关于实时定量荧光PCR

荧光实时定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如，利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前，实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

目前根据临床证状或用ELISA方法检测蜜蜂囊状幼虫病与PCR方法相比较费时费力且敏感性与特异性低，尤其对一些多重混合感染难以区别。其中ELISA方法存在血清学的交叉反应；而如果应用单抗提高其特异性，则检测成本明显增加^[15]，不利于推广应用。而本试验建立的荧光PCR方法可以快速、准确、稳定的检测出囊状幼虫病原且不易受其他蜜蜂病的干扰。常规PCR应用通用引物检测蜜蜂囊状幼虫病毒，进一步提高了诊断的特异性，然而其并没有足够的敏感性来取代以前的检测方法，而且在进行大量样品检测时容易污染。另外，常规PCR的产物需要电泳检测，存在费时、费力、环境污染等问题。最近有许多应用TaqMan探针PCR，检测人、动物、植物真菌的报道。大量研究资料表明，病原感染发病以及病情的严重程度与病原的数量有关。因此，病原定量不仅可以用于疾病诊断，还可以用于指导疾病的防制以及监测新型药物的作用效果^[16]。目前，国内外已经开放研制出多种畜禽及人类传染病的荧光PCR诊断试验盒^[17]。

本发明所应用的引物和探针是根据蜜蜂囊状幼虫病毒保守序列设计的，因此，能够满足国内主要蜜蜂囊状幼虫病毒亚型的检测。经过试验证明，本试验应用的引物、探针可扩增1ng的蜜囊状幼虫病毒cDNA样品，检测蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒呈阴性，说明本发明建立的荧光实时定量PCR高度敏感、特异性；本试验所用的仪器为ABI 7000，可同时检测96份样品，并实时监测反应系统内荧光强度的改变情况，又因不用电泳，大大减少PCR产物污染，因此本试验建立的方法即具有高通量性，可用于大量样品的长期检测而不产生PCR产物污染，提高了方法的特异性，还具有快速检测的特点，一般在4小时内作出检测结果。如果发生假阳性，可很快用备份样品实行快速检测进行纠正，作出比常规PCR更客观的试验结果，更客观判定阳性、阴性和可疑。重复性试验证明本试验建立的方法稳定，出具的结果有一定的可信度，可应用于实践囊状幼虫病检测。当然荧光PCR也存在不足，如成本高、TaqMan探针对序列变化敏感等。

2.关于荧光PCR的引物、探针

实时荧光PCR检测中引物和探针的设计是荧光PCR扩增获得成功的关键之一，其探针、引物的要求高于常规PCR。在设计引物和探针时应尽量遵循以下原则，引物要在探针确定以后再选择，并尽可能地与探针接近，但不要重叠。保持GC含量在30％～80％之间，但要避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个；在引物中3’末端的5个碱基中G和(或)C的总数不能超过2个，在探针中5’末端的第一个碱基不能是G；无论引物还是探针Tm一般应当在58～60℃之间较为合适。

本试验探针设计在两条引物之间，3’端或两端予以封闭，以防止以探针作为引物进行扩增，加之对模板区域敏感，所以只有在引物没有错配、模板合适的情况下，TaqMan探针才能被Taq酶水解，荧光PCR仪才能收集到荧光，因此可明显提高特异性，降低假阳性的机率。为了能有效检测样品，通过文献研究，设计采用了引物与探针的最佳组合，使荧光PCR反应效率高、灵敏度高、重现性好。

3.关于囊状幼虫病毒与中蜂囊状幼虫病病毒

中蜂囊状幼虫病是中蜂生产中一种严重的病毒病。它分布广，发病率高，对幼虫危害很大，对成蜂的健康和行为也有直接影响，1976年首次在广东发生，迅速蔓延至全国乃至东南亚，特别是在东南亚已形成近乎毁灭性的灾害。杨冠煌、袁耀东和董炳义等人研究表明，该病是由病毒引起，命名为中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood beevirus，CSBV)，属细小病毒科，其基因组为一条正链，衣壳有种结构蛋白，与意蜂囊状幼虫病病毒(sacbrood bee virus，SBV)在生理、生化性质上都很相似，但具有不同的抗原性，也没有交叉感染性。研究表明，CSBV与SBV是很相似而又不同的病毒。其衣壳按T＝1(p＝3)的对称二十面体结构排列，表面光滑，有个五邻体和个孔洞。研究还发现，病毒内部的核酸是按一一对称的二十面体结构排列，这种排列方式在细小病毒中尚未见报道。

根据昆虫细小RNA病毒及其特性的对比和分析，CSBV和SBV是亲缘关系十分密切，两种病毒可能是由同一祖先病毒演化而来的不同细小RNA病毒，本发明在所分离到的病料中未发现中蜂囊状幼虫病，所建立的PCR及荧光PCR方法能否对CSBV和SBV进行鉴别还有待于进一步验证。

4.蜜蜂的囊状幼虫病快速检测方法的应用

该病是一种对蜜蜂危害巨大的病毒病，症状主要见于幼虫，染病幼虫体内病毒大量复制，很快就会死亡，只剩下外皮层没有被消化，用镊子提起时，幼虫内液体形成囊状，因此而得名。该病主要发生于春季和秋季的气候多变季节，此时正值蜜蜂的春季繁育季节或冬季的越冬蜜蜂繁育季节，蜂群处于繁殖的旺季，群内幼虫较多，为该病毒的繁殖提供了很好的繁育条件^[20]。蜂群一旦得此疾病，由于蜜蜂的交互哺育行为，病毒在群内个体之间传播很快，会波及群内所有的幼虫，导致幼虫大量死亡，虽巢内成年蜜蜂不断地哺育幼虫，但只有很少幼虫发育成成虫，轻则延缓蜂群的增长，极大的影响蜂群的生产能力，重者则可导致整群蜜蜂的死亡。感染该病毒的成年蜜蜂虽然不至于很快死亡，但也会影响成年蜜蜂的抗病能力，极易感染其他疾病，影响蜜蜂的采集能力^[21]，对蜂群的影响巨大。在我国，该疾病是蜂业生产者最常遇到的一种蜜蜂疾病之一，中华蜜蜂种群内比较严重，而在意大利蜜蜂群内则比较少见。

蜜蜂囊状幼虫病的防治重在如何及早发现病毒的感染。在蜂群内有明显的感染症状时，已经对蜂群产生了很大的危害，随后的防治措施也难以避免业已造成的巨大损失。在病毒的检测方面，传统的病毒离子的分离和形态观测需要繁琐的步骤和较高的试验条件。随着分了生物学的发展，使得利用生物技术进行囊状病毒的检测成为可能。

小结

1根据Genebank网站公布的蜜囊状幼虫病毒保守序列设计引物，成功扩增出451bp特异性片段，与蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒无交叉反应，特异性较好可以作为PCR诊断标记。

2根据Genebank网站公布的蜜囊状幼虫病毒保守序列应用DNAman软件设计出一对特异性引物SBV311F、SBV380R及探针SBV331T。

3优化出的囊状幼虫病实时定量荧光PCR方法反应体系为：25mM Mg²⁺：5μL、5U/μL Taq酶：1μL、20μM引物与20μM探针最佳配比为：0.75μL、1μL，最佳退火延伸温度：55℃。

4本发明建立的荧光PCR方法，4h内即可报告检测结果，可以检测到1ng的阳性cDNA，与蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、黑蜂王台病病毒无交叉反应，特异性较好。

蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR快速检测试剂盒使用

【原理】

根据Genebank网站公布的蜜蜂囊状幼虫病病毒病毒全基因组序列(GeneBank AF092924)，应用DNAman软件设计出一对引物SBV311F、SBV380R及探针SBV331T，序列见附表1。核酸探针SBV331T两端用荧光染料修饰，5’端报告荧光为-FAM(6-Carboxyfluoresciein)，在518nm处有最大的吸光值；3’端淬灭荧光为-TAMRA(6-Carboxytetramethylrhodamine)，在582nm处有最大吸光值。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

【规格】

50次。

【试剂盒组成】

-20℃以下保存，保存期6个月，可进行50次检测。

【适用仪器】

适用于基于Taqman技术原理设计的自动荧光PCR仪及相关软件。

【样品采集】

1.样品的采集和前处理：采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。

2.采样工具：棉拭子；剪刀、镊子；Eppendorf管；研钵。以上取样工具必须经121℃士2℃，15min高压灭菌并烘干。

3.保存与运送：采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，长期保存须在-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。

【样品提取】

1.在250μL病毒浓缩液中加入750μL A液，振摇15s，室温放置5min；

2.加入200μL氯仿，振摇15s。室温放置10min；

3.4℃，10000rpm离心15min，取上层水相于另一离心管中加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；

4.4℃，12000rpm离心12min，沉淀RNA；小心弃去尽上清，用冰冷的75％乙醇1mL洗涤沉淀，混悬后12000rpm离心20min，小心弃净上清，超净台内风干RNA沉淀；

5.用DEPC处理的灭菌双蒸水20μL溶解沉淀，加入1.5μL RNA酶抑制剂，5μL/管分装，立即加B液反转录成cDNA，-20℃冻存或直接进行PCR。

【试剂准各、加样和PCR扩增】

1.试剂：0.01mol/L(PH7.2)的PBS：121℃士2℃，15min高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/mL加入青霉素和链霉素；三氯甲烷；异丙醇；75％乙醇；新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)进行分装。

2.加样：从试剂盒中取出相应的反应液，待反应液室温融化后，2000r/min离心5s。设所需PCR反应数为n，其中n为待检样品数、阳性对照及阴性对照之和。每个测试反应体系需使用25μL C液，4μL D反应液，计算各试剂的使用量，加入一反应管中，再向每个反应管中各分装29μL，加入反转录后的cDNA5～10μL，用DEPC处理水补足至50μL，盖紧管盖后，1000r/min离心30s。

3.PCR扩增：设定好反应参数：95℃10s；95℃5s，60℃30s，72℃10s；40循环；72℃2min。在每一循环60℃退火步骤读取荧光信号。将反应管装入定量PCR仪中启动反应。

【结果判断】

1.阳性对照的CT值应小于28，阴性对照CT值应大于35；

2.CT值小于等于30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在SBV，判为阳性；

3.CT值在30～35之间视为可疑，应重复试验，若仍在此范围内判为阴性。

【保存条件及有效期】

-20℃避光保存，有一效期为8个月。

【注意事项】

1.由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。

2.反应液分装时应避免产生气泡，上机前检杳各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

3.试剂盒中各溶液使用前应充分融化，混匀冰低速离心。

4.融化后的反应液置于冰上，并尽量避免反复冻融。

5.退火温度可根据所用仪器选择使用最低限量时间。

序列表

<110>中华人民共和国吉林出入境检验检疫局

<120>蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法

<160>5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Sacbrood bee virus

<400>1

ACCAACCGATTCCTCAGTAG

 

<160>5

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Sacbrood bee virus

<400>1

CCTTGGAACTCTGCTGTGTA

 

<160>5

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Sacbrood bee virus

<400>1

CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA

 

<160>5

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Sacbrood bee virus

<400>1

AAGTTGGAGGCGCGTAATTG

<160>5

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>Sacbrood bee virus

<400>1

AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG

Claims (1)

1.一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，其特征在于：

a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；

b、引物设计与合成：

蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物：

SBV₁5’-ACC AAC CGATTC CTC AGTAG-3’

SBV₂5’-CCT TGGAAC TCT GCT GTG TA-3’

蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物：

SBV311F    5’-AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3’

SBV380R    5’-AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3’

SBV331T    5’-FAM-

CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’；

c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；

(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；

(3)4℃12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；

(4)4℃12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；

(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；

d、将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃5min，4℃5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。

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