CN104789697A - 一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的四色荧光定量PCR方法及其试剂盒；该检测方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的存在，并能对每种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型四色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，最低检测浓度为1×102拷贝/μl。

Description

一种同时检测CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的四色荧光定量PCR方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）引起的一种高度接触性热性传染病，该病传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主。感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业带来了重大的经济损失。病猪是本病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染和隐形感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰爆发的猪瘟也表明，猪瘟的流行形式在发生改变，这给全世界的养猪业带来了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒（Bivine viral disease virus，BVDV）和羊边界病毒（border disease virus，BDV）同属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（pestivirus），在进行抗原检测的时候，能发生交叉免疫反应，而针对基因设计特异的引物、探针，则可以有效地避免交叉检出。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3KB，含一个大的开放阅读框（ORF），病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。
猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是：眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。我国的PRRSV分离毒株大多属于基因2型，即北美型。而高致病性猪蓝耳病病毒，是指非结构蛋白2（Nsp2）编码区连续缺失12个氨基酸的毒株，并对猪呈现致死性。
伪狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名。本病毒是疱疹病毒中抵抗力较强的一种，在不同的液体中和物体表面至少存活7d。本病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感；在pH 4～9之间稳定；对热抵抗力较强。真空冷冻干燥的病毒培养物可保存多年。蛋白质序列表明，PRV与牛疱疹病毒（BHV-1）、马疱疹病毒（EHV-1）以及水痘病毒的同源性很高。目前, 在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒( Bartha-K 61)，在其基因组BamH I-7片段中缺失了约4kb的序列, 此序列包括整个gE ( g 1)和大部分g I( gp63)序列。而本专利以gC基因作为靶序列，设计出用于检测出伪狂犬病毒野毒株以及疫苗株的引物和探针。
猪圆环2型病毒已经遍及世界各养猪国家，成为全球性疫病之一。已有的研究表明，PCV-2与猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪的流产和繁殖障碍、猪增生性坏死性肺炎（PNP）和猪先天性脑震颤（CT）等的发生密切相关。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1为非致病性的病毒。PCV-2为致病性的病毒, 为单链DNA病毒。猪对PCV-2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。虽然PCV-2可分为多种基因型（PCV-2a，PCV-2b，PCV-2c，PCV-2d），但各基因型之间核苷酸的同源性大于96%，而与PCV-1型的同源性小于80%，所以适合用荧光定量PCR的方式来区分PCV-2型和PCV-1型。
常规的猪瘟、猪蓝耳病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对 CSFV Alfort株和 Brescia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白 E1是 CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株（shimen）的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV 可以从各种临床样品中分离到,包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、睾丸、附睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA) 以及免疫组化试验(IHC) 可以检测组织中的PRRSV 抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速,这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA 结果影响非常大,要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行了PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，不仅可以检出病毒，还可以进行病毒的分型，以便结合症状进行更加有效的诊断。
概括来说猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存在特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。
荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了“猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒以及猪圆环病毒感染的联合检测方法还未完善。
多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、核酸提取液、反转录酶系、Taq酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的特异性引物及探针，序列分别为：
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-FAM-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’（SEQ ID NO.3）；
高致病性猪蓝耳病病毒
上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.5），
荧光探针：PRRSV-MP：5’-VIC- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC–BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）；
伪狂犬病毒
上游引物：PRV-F：5’-CCATGTGTGCCACTAGCATT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRV-R：5’-CCCCATCGCGGTTTTAA-3’（SEQ ID NO.8）；
荧光探针：PRV-P：5’-CY5-TTCCTGATTCACGCCCACG- BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）；
猪圆环病毒2型
上游引物：PCV2-MF：5’- ATAATCAAAAAGGGAGATTGGAAGCT-3’（SEQ ID NO.10）；
下游引物：PCV2-MR：5’-GGTGGGTGTTCACGCTGAA-3’（SEQ ID NO.11）；
荧光探针：PCV2-MP：5’-ROX- CCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGG-BHQ3-3’（SEQ ID NO.12）。
进一步的，上述多色荧光定量PCR MIX还含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPS。
进一步的，上述多色荧光定量PCR MIX具体成分及含量为：
10×多色荧光定量PCR buffer                    2.5μl
CSFV-F（10μM）                                       1μl
CSFV-R（10μM）                                      1μl
PRRSV-MF（10μM）                                1μl
PRRSV-MR（10μM）                                1μl
PRV-F（10μM）                                 1μl
PRV-R（10μM）                                     1μl
PCV2-MF（10μM）                                 1μl
PCV2-MR（10μM）                             1μl
CSFV-P（10μM）                                  0.5μl
PRRSV-MP（10μM）                                0.5μl
PRV-P（10μM）                                       0.5μl
PCV2-MP（10μM）                                 0.5μl
dNTPS (10mM)                                            1μl
ddH2O                                                   6.5μl 
Total                                                              20.0μl。
进一步的，上述10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。
进一步的，上述核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，10mM EDTA，3M的异硫氰酸胍和1mM的DTT。
一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测的方法，利用上述所述的检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
1）提取待测样品中的病毒核酸；
2）以得到的核酸为模板进行四色荧光定量PCR检测，其中猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的的荧光探针报告基团均不相同；
上述荧光定量PCR反应体系为每25μl中含有多色荧光定量PCR MIX 20μl、反转录酶系0.5μl、Taq酶系0.5μl以及提取的核酸模板或者阳性质控品或者阴性质控品4μl；
荧光定量PCR反应的条件为：93～95℃ 2分钟，然后93～95℃ 5～10 秒，58℃ 45秒，采集荧光信号，40个循环；
3）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型阳性；
上述检测方法用于非病的诊断和冶疗。
本发明的有益效果是：
本发明方法和试剂盒能够同时检测出待测标本中猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型这4种感染猪的病毒，应用极为方便。优化的引物探针以及多色荧光定量PCR MIX，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级农产品检验检疫机构大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。
本发明试剂盒，可方便地同时检测出猪体内的多种常见病毒，准确率高，具有广泛的应用前景；且操作简便，特异性强，对临床样品的快速诊断及流行病学调查具有很强的实用价值。
附图说明
图1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图2 为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图3 为多色荧光PCR体系中PRV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图4 为多色荧光PCR体系中PCV-2检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图5为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，CSFV组织样本为阳性，PRRSV-CH1R株疫苗、PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图6为多色荧光PCR方法中PRRSV-M的特异性实验，PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗为阳性，PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图7为多色方法PCR体系中PRV的特异性实验图，PRV组织样本、PRV疫苗为阳性，PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图8为多色荧光PCR方法中PCV-2的特异性实验， PCV-2组织样本为阳性，图中起峰值的为PCV-2的2个复孔，PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗及阴性质控品均为阴性。
具体实施方式
实施例1
1、特异性引物及探针的设计
用于检测猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的引物和探针序列如下：
猪瘟病毒（CSFV）的
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-FAM-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’（SEQ ID NO.3）
和
高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）的
上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.5），
荧光探针：PRRSV-MP：5’-VIC- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC–BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）
和
伪狂犬病毒（PRV）的
上游引物：PRV-F：5’-CCATGTGTGCCACTAGCATT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRV-R：5’-CCCCATCGCGGTTTTAA-3’（SEQ ID NO.8）；
荧光探针：PRV-P：5’-CY5-TTCCTGATTCACGCCCACG- BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）
和
猪圆环病毒2型（PCV-2）的
上游引物：PCV2-MF：5’- ATAATCAAAAAGGGAGATTGGAAGCT-3’（SEQ ID NO.10）；
下游引物：PCV2-MR：5’-GGTGGGTGTTCACGCTGAA-3’（SEQ ID NO.11），
荧光探针：PCV2-MP：5’-ROX- CCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGG-BHQ3-3’（SEQ ID NO.12）
用于检测猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；伪狂犬病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；猪圆环病毒2型的荧光探针报告基团为ROX，淬灭基团为BHQ3。
2、标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型包括猪的组织、血清、分泌排泄物等。组织标本：无菌条件下取组织约100～200mg左右，置入1.5ml洁净EP管中，保存待检。血清：用一次性无菌注射器抽取受检猪静脉血3-5ml，留取血清，保存待检。分泌排泄物：无菌条件下采集，保存待检。采集的标本应该尽快送检，或者保存于-20℃。
3、阳性质控品的制备
分别以猪瘟病毒（CSFV）、高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒2型(PCV-2)标准品为模板，进行PCR扩增，步骤如下：
反转录体系：
Oligo dT Primer (50 μM)1 μl、dNTP Mixture (10 mM ) 1 μl以及总核酸2μg，65℃ 5min，激冷，然后加入5×PrimeScript Buffer 4μl（TAKARA公司）、RNase Inhibitor (40 U/μl)0.5μl、PrimeScript RTase (200 U/μl)1μl和RNase free H2O 4.5μl。
反转录条件：
30℃ 10min，然后42℃，30min，进行逆转录，合成cDNA。
PCR体系：
10×PCR Buffer 5μl、TaKaRa Taq（5 U/μl）1μl 、dNTP Mixture（各2.5 mM）4μl、上述CSFV、PRRSV-M、PRV和PCV-2的上下游引物（10μM）各0.5μl、上述cDNA0.5μl和RNase free H2O39.25μl。
PCR条件：
按照94℃ 3分钟预变性，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，共35个循环，72℃延伸10分钟。
反应后取5μl PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与pMD-18T载体连接，重组质粒pMD-18T-CSFV、pMD-18T-PRRSV-M、pMD-18T-PRV和pMD-18T-PCV-2涂布于培养皿上，转化感受态DH5α细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，取品5μl稀释测其A260nm和A280nm吸光度值，计算其浓度并换算成绝对拷贝数，稀释成1.0×107拷贝/μl，作为多色荧光定量PCR的阳性质控品。
4、病毒核酸的提取
1）固体组织：取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的EP管中，10000rpm离心2min，取上清100μl于1.5ml的EP管中，加入200μl 核酸提取液充分震荡，静置3min；
所述核酸提取液含有50mM 的Tris-HCl，0.7M 的NaCl，10mM EDTA，3M的异硫氰酸胍和1mM的DTT；
2）血清或病毒液：取100μl血清加入200μl 核酸提取液充分震荡，静置3min，用力震荡15s，4℃ 13,000rpm离心5min；
3）弃上清，加入1ml 75%乙醇，充分混匀，13,000rpm离心5min，小心吸去大部分残留液体；
4）将提取管敞口在室温空气中干燥10min，使液体挥发干净，用20μl  DEPC水溶解沉淀即为待检测的病毒核酸。
5、多色荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系配制如下，多色荧光定量PCR MIX 20μl、反转录酶系0.5μl、Taq酶系0.5μl，瞬时离心，然后加入待检测的核酸4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl进行扩增。
其中，所述多色荧光定量PCR MIX含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPS、及猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的特异性引物和探针，具体组成如下：
10×多色荧光定量PCR buffer                   2.5μl
CSFV-F（10μM）                                      1μl
CSFV-R（10μM）                                     1μl
PRRSV-MF（10μM）                               1μl
PRRSV-MR（10μM）                               1μl
PRV-F（10μM）                                       1μl
PRV-R（10μM）                                    1μl
PCV2-MF（10μM）                             1μl
PCV2-MR（10μM）                                   1μl
CSFV-P（10μM）                                 0.5μl
PRRSV-MP（10μM）                               0.5μl
PRV-P（10μM）                                      0.5μl
PCV2-MP（10μM）                                   0.5μl
dNTPS (10mM)                                           1μl
ddH2O                                                  6.5μl
Total                                                             20.0μl。
上述10×多色荧光定量PCR buffer含有500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类（检测CSFV的报告基团选择FAM，淬灭基团选择BHQ1；检测PRRSV-M的报告基团选择VIC，淬灭基团选择BHQ1；检测PRV的报告基团选择CY5，淬灭基团选择BHQ2；检测PCV-2的报告基团选择ROX，淬灭基团选择BHQ3，设定循环条件：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器循环条件为95℃ 2分钟；然后95℃10秒，58℃45秒，采集荧光信号，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93℃→2分钟，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。
6、结果分析和判定
反应结束后，调整阈值使阴性质控品无Ct 值或Ct值为40，FAM荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为CSFV阳性，VIC荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV-M阳性，CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRV阳性，ROX荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PCV-2阳性。多个通道荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，则为对应通道的检测项目呈共阳型。
当荧光Ct值在35~40之间或没有呈S型扩增曲线时，需复检。
7、灵敏度实验
上述阳性质控品（107拷贝/μl），依次稀释为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μl，进行灵敏度实验。
多色荧光定量PCR体系中CSFV检测的敏感性实验见图1，多色荧光定量PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性见图2，多色荧光定量PCR体系中PRV检测的敏感性见图3，多色荧光定量PCR体系中PCV-2检测的敏感性见图4。图1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。图2 为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。图3 为多色荧光PCR体系中PRV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。图4 为多色荧光PCR体系中PCV-2检测的敏感性实验，从左到右依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×102拷贝/μl，该多色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍，精确性优于普通PCR方法。
8、特异性实验
根据上述的多色荧光定量PCR检测方法，用猪瘟病毒（CSFV）组织样本为阳性，猪蓝耳病毒PRRSV-CH1R株疫苗、PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、口蹄疫FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、猪乙脑病毒（JEV）组织样本、伪狂犬病毒（PRV）组织样本、伪狂犬病毒（PRV）疫苗、猪圆环病毒2型（PCV-2）组织样本阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性或假阳性，吻合度为100%，实验结果见图5、图6、图7、图8。
图5为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，其中只有CSFV组织样本为阳性，PRRSV-CH1R株疫苗、PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图6为多色荧光PCR方法中PRRSV-M的特异性实验，其中PRRSV-JXA1株疫苗和PRRSV-HuN4株疫苗为阳性，PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图7为多色方法PCR体系中PRV的特异性实验图，其中PRV组织样本和PRV疫苗为阳性，PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
图8为多色荧光PCR方法中PCV-2的特异性实验， 其中只有PCV-2组织样本为阳性，PRRSV-JXA1株疫苗、PRRSV-HuN4株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-A1型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗及阴性质控品均为阴性。
9、重复性试验
将8次独立重复提取含阳性质控品质粒分别进行多色荧光定量PCR扩增，均出现一致的曲线，表明本发明的双色荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110>  广东省农业科学院动物卫生研究所
 
<120>  一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒
       2型的四色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒
 
<130> 
 
<160>  12   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cagtagttcg acgtgagcag aag                                               23
 
 
<210>  2
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
cgctagggtt aaggtgtgtc ttg                                               23
 
 
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
acctcgagat gctacgtgga cga                                               23
 
 
<210>  4
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
agctgatgac acctttgagt gagt                                              24
 
 
<210>  5
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gacaaatcca gaggctcatc ct                                                22
 
 
<210>  6
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
agaactgtga caacaacgct gacgcac                                           27
 
 
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
ccatgtgtgc cactagcatt                                                   20
 
 
<210>  8
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
ccccatcgcg gttttaa                                                      17
 
 
<210>  9
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
ttcctgattc acgcccacg                                                    19
 
 
<210>  10
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  10
ataatcaaaa agggagattg gaagct                                            26
 
 
<210>  11
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  11
ggtgggtgtt cacgctgaa                                                    19
 
 
<210>  12
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  12
ccgtattttc ttgcgctcgt cttcgg                                            26

Claims (6)

1.一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、核酸提取液、反转录酶系、Taq酶系、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的特异性引物及探针，序列分别为：
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-FAM-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’（SEQ ID NO.3）；
高致病性猪蓝耳病病毒
上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.5），
荧光探针：PRRSV-MP：5’-VIC- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC–BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）； 
伪狂犬病毒
上游引物：PRV-F：5’-CCATGTGTGCCACTAGCATT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRV-R：5’-CCCCATCGCGGTTTTAA-3’（SEQ ID NO.8）；
荧光探针：PRV-P：5’-CY5-TTCCTGATTCACGCCCACG- BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）；
猪圆环病毒2型
上游引物：PCV2-MF：5’- ATAATCAAAAAGGGAGATTGGAAGCT-3’（SEQ ID NO.10）；
下游引物：PCV2-MR：5’-GGTGGGTGTTCACGCTGAA-3’（SEQ ID NO.11）；
荧光探针：PCV2-MP：5’-ROX- CCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGG-BHQ3-3’（SEQ ID NO.12）。
2.根据权利要求1 所述的检测试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX还含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPS。
3.根据权利要求1 或2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX具体成分及含量为：
10×多色荧光定量PCR buffer         2.5μl
CSFV-F（10μM）                     1μl
CSFV-R（10μM）                     1μl
PRRSV-MF（10μM）                1μl
PRRSV-MR（10μM）                1μl
PRV-F（10μM）                   1μl
PRV-R（10μM）                   1μl
PCV2-MF（10μM）                    1μl
PCV2-MR（10μM）                 1μl
CSFV-P（10μM）                      0.5μl
PRRSV-MP（10μM）                0.5μl
PRV-P（10μM）                   0.5μl
PCV2-MP（10μM）                     0.5μl
dNTPS (10mM)                       1μl
ddH2O                               6.5μl
Total                              20.0μl。
4.根据权利要求2 所述的检测试剂盒，其特征在于：10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。
5.根据权利要求1 所述的检测试剂盒，其特征在于：所述核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，10mM EDTA，3M的异硫氰酸胍和1mM的DTT。
6.一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测的方法，其特征在于：利用权利要求1～5任一所述的检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
1）提取待测样品中的病毒核酸；
2）以得到的核酸为模板进行四色荧光定量PCR检测，其中猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的的荧光探针报告基团均不相同；
上述荧光定量PCR反应体系为每25μl中含有多色荧光定量PCR MIX 20μl、反转录酶系0.5μl、Taq酶系0.5μl以及提取的核酸模板或者阳性质控品或者阴性质控品4μl；
荧光定量PCR反应的条件为：93～95℃ 2分钟，然后93～95℃ 5～10 秒，58℃ 45秒，采集荧光信号，40个循环；
3）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型阳性；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
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