RU2761496C2 - Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени - Google Patents
Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2761496C2 RU2761496C2 RU2019129560A RU2019129560A RU2761496C2 RU 2761496 C2 RU2761496 C2 RU 2761496C2 RU 2019129560 A RU2019129560 A RU 2019129560A RU 2019129560 A RU2019129560 A RU 2019129560A RU 2761496 C2 RU2761496 C2 RU 2761496C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- virus
- real
- blood
- pigs
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в организме свиней различных пород и возрастов. Способ заключается в предварительном отборе крови и получении сыворотки крови, выделении вирусной РНК из сыворотки крови и осуществлении обратной транскрипции с проведением ПЦР в реальном времени. Для амплификации используются праймеры: прямой №1 (SEQ ID NO: 1): TGGCTGCTGAAGATGA, прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA, обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA и TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1. Логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM свидетельствует о наличии вируса РРСС в крови свиней. Технический результат заключается в высокочувствительном, общедоступном и безопасном способе идентификации вируса РРСС, а также в сокращении времени проведения диагностической работы с целью выявления вируса. 1 табл., 2 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к ветеринарии и касается способов измерения, использующих вирусы, а именно нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в ветеринарии при идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в организме свиней различных пород и возрастов.
Вирус РРСС (род Porartevirus, семейство Arteriviridae) - это вирус, вызывающий заболевание свиней, которое называется репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Это экономически значимое панзоотическое заболевание вызывает нарушение репродуктивной функции у племенного скота и заболевание дыхательных путей у молодых свиней (Mengeling W.L., Lager K.М. and Vorwald А.С. Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome. J. Vet. Diagn. Invest. 1995, vol. 7, pp. 3-16). При этом вирус РРСС имеет иммуносупрессивные свойства, что создает условия для инфицирования вторичными вирусными или бактериальными инфекциями (Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. М.:ВНИТИБП, 1998. С. 552-558). К возбудителю РРСС восприимчивы свиньи всех возрастных категорий и пород. Источником возбудителя инфекции являются переболевшие и больные свиньи, которые выделяют вирус с носовой слизью, фекалиями, мочой и спермой. Массовые вспышки РРСС наносят существенный экономический ущерб свиноводству (Pileri Ε. and Mateu Ε. Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination. Veterinary Research. 2016, vol. 47(1), p. 108). Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус, который относится к роду Arterivirus из семейства Arteriviridae (Kappes М.А. and Faaberg K.S. PRRSV structure, replication and recombination: Origin of phenotype and genotype diversity. Virology. 2015, vol. 479-480, pp. 475-486). Большие трудности при идентификации вируса представляет наличие большого количества (несколько сотен) штаммов РРСС, которые различаются между собой по последовательности РНК, в серологических реакциях, а также по некоторым биологическим свойствам (Takikawa N. et al. Detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine sera by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med. Sci. 1996, vol. 58, pp. 355-357).
На данный момент идентификацию болезни проводят путем комплексного исследования, которое учитывает эпизоотическую обстановку, клинические признаки болезни, а также патоморфологические изменения с последующим лабораторным исследованием (окончательный диагноз). Для лабораторной идентификации используют пробы крови и легких, экссудат из брюшной и грудной полостей, средостенные лимфатические узлы от абортированных плодов или убитых нежизнеспособных поросят. Чаще всего при лабораторных исследованиях выявляют антитела к вирусу.
Зачастую необходимо быстро выявить присутствие вируса РРСС у свиней ввиду их быстрого распространения между контактирующими животными, чтобы предотвратить массовую вспышку заболевания, обеспечить иммунизацию животных и провести карантинные мероприятия. Наиболее подходящим для этого является использование молекулярно-биологических методик на основе ПНР в реальном времени ввиду их высокой чувствительности, специфичности, универсальности и низкой трудоемкости. Большой проблемой является выявление консервативных последовательностей РНК вируса для разработки метода генетической идентификации ввиду его высокой вариабельности. В ходе обширного биоинформатического анализа нами были идентифицированы участки РНК вируса, которые консервативны между разными штаммами вируса РРСС, что позволило разработать праймеры и TaqMan зонд для специфичной идентификации вируса РРСС.
Известен способ дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (заявка на изобретение RU 97103225, МПК G01N 33/53, A61K 39/12, опубл. 10.11.1998), взятый за прототип, включающий использование культуры клеток, инфицированной вирусом РРСС, фиксацию данной культуры, инкубирование ее последовательно с исследуемыми сыворотками и антисвиными ПХ-иммуноглобулинами, обработку субстратом, при этом используют стандартную перевиваемую культуру клеток MARC-145, инфицированную вирусом РРСС.
Недостатком данного способа является высокая трудоемкость, продолжительность анализа и потребность в наличии живых культур клеток, инфицированных вирусом РРСС, что требует дополнительных финансовых и временных затрат как на приобретение клеток, так и на их культивирование и поддержание жизнеспособности.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации вируса РРСС в организме свиней.
Технический результат заключается в высокочувствительном, общедоступном и безопасном способе идентификации вируса РРСС, а также в сокращении времени проведения диагностической работы с целью выявления вируса.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени, согласно изобретению, из предварительно отобранной крови свиней получают сыворотку крови, из неё выделяют вирусную РНК и осуществляют обратную транскрипцию для получения кДНК вируса с последующим проведением ПЦР в реальном времени, при этом для амплификации используют праймеры: прямой №1 (SEQ ID NO: 1): TGGCTGCTGAAGATGA, прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA и обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA, а также TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1, причем логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора в реальном времени свидетельствует о наличии вируса РРСС в крови свиней.
Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ORF7 вирусной РНК. Установлены консервативные участки нуклеиновой кислоты вируса, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации вируса на основе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда, который представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с кДНК TaqMan зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие её экзонуклеазной активности) и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.
На фиг. 1 приведены кривые флуоресценции трёх проб РНК (кДНК), выделенной из крови животных больных вирусом, полученные в ходе проведения ПЦР в реальном времени, на фиг. 2 - кривые флуоресценции двух проб РНК (кДНК), выделенной из сыворотки крови свиней, предположительно больных РРСС.
Способ идентификации вируса РРСС с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда в представленном способе реализуется следующим образом:
1. Производится отбор крови у свиней. Для анализа достаточно 1 мл биологического материала.
2. Из крови любым доступным способом получают сыворотку крови.
3. Производится выделение вирусной РНК из сыворотки крови. Выделение РНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.
4. С выделенной вирусной РНК проводят обратную транскрипцию (любым доступным способом) для получения кДНК.
5. Проводят ПЦР в реальном времени. Используют следующие температурные циклы: 94°С 3 мин, 40 циклов: 94°С 20 сек, 54°С 30 сек, 72°С 40 сек.
Используются следующие праймеры и TaqMan зонд:
Прямой №1 (SEQ ID NO: 1): TGGCTGCTGAAGATGA
Прямой №2 (SEQ ID NO: 2): ACAGCTCCRATGGGGA
TaqMan зонд (SEQ ID NO: 4): FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1
Обратный (SEQ ID NO: 3): GAAGTCACGCGAATYA
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР, который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для вируса РРСС, с которыми взаимодействует TaqMan зонд.
6. В случае, если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, это означает, что в крови животного содержится вирус РРСС.
Способ поясняется примером.
Из двух образцов сыворотки крови свиней (Проба №1 и Проба №2) с помощью набора Viral RNA Kits (Zymo Research, США) была изолирована вирусная РНК. С изолированной вирусной РНК была проведена обратная транскрипция с помощью набора MMLV RT (Евроген, Россия). Далее была проведена ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США) с праймерами TGGCTGCTGAAGATGA (SEQ ID NO: 1), ACAGCTCCRATGGGGA (SEQ ID NO: 2) и GAAGTCACGCGAATYA (SEQ ID NO: 3), также TaqMan зондом FAM-TGCAATCGATCCAGAC-BHQ1 (SEQ ID NO: 4). Наблюдалось логарифмическое повышение флюоресценции в канале FAM для двух анализируемых образцов (фиг. 2). Таким образом, в образцах сыворотки крови свиней Проба №1 и Проба №2 содержится вирус РРСС.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу, сопутствующие реактивы и расходные материалы.
Claims (1)
- Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени, отличающийся тем, что из предварительно отобранной крови свиней получают сыворотку крови, из нее выделяют вирусную РНК и осуществляют обратную транскрипцию для получения кДНК вируса с последующим проведением ПЦР в реальном времени, при этом для амплификации используют праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, а также TaqMan зонд - SEQ ID NO: 4, причем логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора в реальном времени свидетельствует о наличии вируса РРСС в крови свиней.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129560A RU2761496C2 (ru) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129560A RU2761496C2 (ru) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019129560A RU2019129560A (ru) | 2021-03-18 |
| RU2019129560A3 RU2019129560A3 (ru) | 2021-06-01 |
| RU2761496C2 true RU2761496C2 (ru) | 2021-12-08 |
Family
ID=74874022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129560A RU2761496C2 (ru) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2761496C2 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761496C2 (ru) * | 2019-09-18 | 2021-12-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии" (ФГБНУ "ВНИВИПФиТ") | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
| CN117511936B (zh) * | 2024-01-05 | 2024-04-09 | 广州奕昕生物科技有限公司 | 一种基于mb-rt-pcr检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒及检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2019129560A (ru) * | 2019-09-18 | 2021-03-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармокологии и терапии" (ФГБНУ "ВНИВИПФиТ") | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
-
2019
- 2019-09-18 RU RU2019129560A patent/RU2761496C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2019129560A (ru) * | 2019-09-18 | 2021-03-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармокологии и терапии" (ФГБНУ "ВНИВИПФиТ") | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PILERI Ε., et al. Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination. Veterinary Research. 2016, vol. 47(1), p. 108. * |
| TAKIKAWA N. et al. Detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine sera by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med. Sci. 1996, vol. 58, pp. 355-357. * |
| TAKIKAWA N. et al. Detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine sera by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Vet. Med. Sci. 1996, vol. 58, pp. 355-357. PILERI Ε., et al. Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination. Veterinary Research. 2016, vol. 47(1), p. 108. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019129560A (ru) | 2021-03-18 |
| RU2019129560A3 (ru) | 2021-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108384899B (zh) | 一种检测新型鹅星状病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN111455107A (zh) | 用于检测猫呼吸道病原体的引物组、产品、方法及应用 | |
| WO2020034317A1 (zh) | 塞内卡病毒和口蹄疫病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂及试剂盒 | |
| RU2761496C2 (ru) | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени | |
| CN111518877B (zh) | 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒 | |
| CN104450970A (zh) | 用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法 | |
| CN110564880A (zh) | 检测布鲁氏菌减毒活疫苗株和野毒株的方法及应用 | |
| CN109593883B (zh) | 猪圆环病毒多重实时荧光pcr检测引物对、探针、及制备的试剂盒 | |
| CN105886663A (zh) | 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量pcr的检测试剂盒 | |
| CN101812539B (zh) | 猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法 | |
| CN106435032B (zh) | 一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重rt-pcr引物、试剂盒和方法 | |
| US7700326B2 (en) | RT-PCR detection for differential diagnosis of field isolates or lapinized vaccine strain of classical swine fever virus (CSFV) in samples | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
| CN104232789A (zh) | 可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的rt-pcr技术 | |
| CN104164515B (zh) | 一种洪湖碘泡虫特异性pcr检测引物及其检测方法 | |
| Shen et al. | A Novel, Cleaved Probe-Based Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Specific and Sensitive Detection of Porcine Deltacoronavirus | |
| CN114574628B (zh) | 一种检测试剂盒及其应用 | |
| RU2607025C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота | |
| CN114395643A (zh) | 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法 | |
| RU2586527C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, флюоресцентный зонд и способ для выявления генома вируса эпизоотической диареи свиней методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции | |
| CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
| CN113755614A (zh) | 布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 | |
| CN114457191A (zh) | 基于Cas13a无扩增检测H7亚型禽流感病毒方法 | |
| CN111363849A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法 |