CN104313177B - 一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法 - Google Patents

一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检测方法，以基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立起来的一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高和成本低廉的分子检测技术。该检测方法通过在灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的β微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株。LAMP扩增产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，有产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y菌株；LAMP扩增产物显示为紫色，电泳图谱无条带，无产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非抗性基因型F200Y菌株。本发明简便、快速、成本低，对作物灰霉病的抗性风险评估及合理用药具有重要的理论指导意义。

Description

一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检测方法
技术领域
本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)对灰葡萄孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y菌株的快速分子鉴定方法，属于生物学领域中分子生物学的检测方法。
背景技术
灰霉病是一类由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的植物真菌病害，可危害200多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。多年来，灰霉病主要采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行防治。但是随着使用年限的增长的使用剂量的增加，田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效显著下降。经过多年的研究，南京农业大学杀菌剂生物学实验室发现灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由灰葡萄孢菌β-微管蛋白基因(BC1G_00122)突变造成，该基因编码第198位或200位氨基酸密码子的突变可引起灰葡萄孢菌对多菌灵抗药性的产生，其中198位氨基酸的突变可引起灰葡萄孢菌对多菌灵表现高水平抗性，200位氨基酸的突变可导致灰葡萄孢菌对多菌灵表现中等水平抗性。200位氨基酸突变基因型为TTC→TAC，即苯丙氨酸(Phe，F)→络氨酸(Tyr，Y)，简写为F200Y。
传统的鉴定方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用进行鉴别，该方法鉴定周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着病原抗性基因型的鉴定，PCR技术得到了广泛的应用，该技术需要昂贵的试验仪器和繁琐的电泳过程，在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患，并且鉴定时长达数小时。为了克服这些缺点，一种基于环介导恒温扩增技术(LAMP)在灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型的鉴定上受到一定的关注。
环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原突变基因型的快速鉴定。
本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术能快速、准确鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y。该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的抗药性治理及抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鉴定的相关报道。
发明内容
本发明的目的是对已有的灰葡萄孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种简便、快速、省时省力、灵敏度高、检测成本低的鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的分子检测方法。
本发明所述的快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子生物学方法，步骤是：
(1)在灰葡萄孢菌的β微管蛋白基因(BC1G_00122)上包括200位氨基酸的序列设计LAMP引物，分别以敏感菌株及抗性基因型F200Y菌株的基因组DNA为模板，利用所述的LAMP引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，其中：所述的LAMP引物分别是：
LAMP反应所用的外引物对：
F3：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA
B3：AGGTGGTAACACCGGACAT
LAMP反应所用的内引物对(含错配碱基)：
FIP：TGGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA
BIP：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG
(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为多菌灵抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱应为梯状条带，判定为抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增，判定为非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
其中：
步骤(1)所述的LAMP总体积优选为10μL：
步骤(1)所述的LAMP反应参数优选为：60℃45min，80℃10min。
本发明采用LAMP技术，快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y菌株，丰富灰葡萄孢菌对多菌灵抗性检测的技术体系；为灰葡萄孢菌的抗性监测及抗性风险评估提供理论基础和技术支撑，对我国灰霉病的发生流行和抗性治理具有重要的理论指导意义。
本发明提供的快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程；
2、检测效率高：该检测方法所用检测时间不足1小时，大大提高了检测效率，而传统的室内生物测定法需要几天时间，PCR检测需要繁琐的电泳过程，也要数小时；
3、灵敏度高：将构建的质粒载体稀释成不同的浓度，作为模板，进行灵敏度检测，最低检测下限为普通PCR检测下限的100倍；
4、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
5、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织及病残体提取DNA进行快速检测，大大提高检测准确度；
6、本发明是国内外首次利用LAMP技术鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。
附图说明
图1：LAMP检测的特异性检测
具体实施方式
实施例1LAMP反应体系优化
为了节省鉴定成本，保证该鉴定方法的稳定性和可靠性，对反应体系中BstDNA聚合酶(8U/μL)(0.8-4.0U)、Mg2+(25mM)浓度(0.6-2.0μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3(10μM)浓度(0.1-0.5μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.4-2.0μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.4-1.2μL)进行了优化，确定了最佳反应体系为：BstDNA聚合酶(8U/μL)0.25μL，10×ThermoPol1μL，MgCl2(25mM)1.6μL，dNTP(10mM)0.8μL，FIP(40μM)0.4μL，BIP(40μM)0.4μL，F3(10μM)0.4μL，B3(10μM)0.4μL，甜菜碱(8M)1.0μL，HNB(2.5mM)0.8μL，基因组DNA0.4μL，无菌ddH2O2.55μL。
实施例2LAMP反应参数优化
为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度及时间进行了优化，得出最佳反应温度和时间分别为60℃和45min。
实施例3LAMP反应灵敏度试验
为了确定LAMP反应的检测下限，将灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的含有200位突变位点的DNA片段克隆至载体pEASY-T3，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒后，以10倍梯度稀释作为模板，分别进行LAMP及PCR扩增。最终得出，LAMP的最低检测下限为普通PCR检测下限的100倍。
实施例4LAMP反应特异性试验
以灰葡萄孢菌对多菌灵不同抗性基因型菌株(E198A，E198K，E198V，F200Y)和野生型菌株的基因组DNA为模板分别进行LAMP扩增。当模板为基因型F200Y菌株时，反应产物颜色为天蓝色，电泳图谱成梯状条带；当模板为野生型菌株和其它抗性基因型菌株时，反应产物颜色为紫色，电泳无条带，上述结果表明该鉴定方法结果可靠，特异性强(图1)。
实施例5LAMP反应重复性试验
对采集不同地理位置的8个灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的基因组DNA为模板进行LAMP检测，以野生型为对照，结果显示8个实验样品的反应颜色均为天蓝色，电泳图谱均呈梯状条带。并经过突变基因的测序结果表明，8个样品均在β微管蛋白序列的200位发生点突变。上述结果表明该鉴定方法结果可靠，重复性好。
本发明所建立的LAMP方法能准确、快速鉴定出灰葡萄孢对多菌灵抗性基因型F200Y菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的鉴定技术，也为灰霉病对多菌灵抗性群体的动态监测，抗药性病害的流行预警及合理用药提供了理论基础和技术指导。

Claims (1)

1.一种基于LAMP技术快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检测方法，步骤是：
(1)运用两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两对特异性引物的碱基序列分别是：
LAMP反应所用的外引物对：
F3：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA
B3：AGGTGGTAACACCGGACAT
LAMP反应所用的内引物对：
FIP：TGGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA
BIP：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG
LAMP的反应总体积为10μL，反应体系是：
LAMP反应参数为60℃45min，80℃10min；
(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为多菌灵抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱应为梯状条带，判定为抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增，判定为非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
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灰葡萄孢菌抗多菌灵β-微管蛋白基因在禾谷镰孢菌种的表达研究;刘圣明;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20120715;D046-13 *

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