CN105316422A - 一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用，属于生物技术技术领域。所述试剂盒由LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照组成。所述试剂盒还可以包含显色剂。所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。检测试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用步骤包括：弧菌菌株的纯化分离、弧菌DNA的制备、恒温基因扩增反应以及通过浊度仪或ESE-Quant？Tube？Scanner进行结果判断。本发明的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、操作简单和结果可靠等优点，适合对虾养殖现场快速检测使用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及海水养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)研制的用于对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原的快速检测试剂盒及其应用。
背景技术
对虾养殖业是我国海水养殖的支柱产业，对虾生产和贸易已为我国农村经济发展、增加农民收入、创造就业机会做出了重要贡献，同时也为全球消费者提供更多优质蛋白食品做出了积极贡献。然而对虾养殖业的健康可持续发展一直面临着病害频发、种质退化和养殖环境恶化等诸多因素的挑战，其中对虾病害威胁最为严重，因为种质退化、抗病力下降和养殖环境恶化也间接导致了病害的频发。
自2009年在我国华南沿海南美白对虾养殖中突发一种被称为“偷死病”的疾病，该病一般在投苗20至30天后发生，病虾体色呈白浊并微红，昏睡、厌食、生长缓慢，疾病能扩散迅速，造成仔虾和幼虾阶段大量死亡，死亡对虾的肝胰腺呈现不同程度的缩小、褪色和坏死等病变特征(Lightneretal.,2012)，因此在学术上该疾病被称为对虾急性肝胰腺坏死病(Acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND)或早期致死综合症(Earlymortalsyndrome，EMS)。随后在越南(2010)、马来西亚(2011)和泰国(2012)等亚太地区相继报道了此疾病(Panakorn,2012；Flegel,2012；Mooney,2012)，目前已蔓延至拉丁美洲等多个对虾养殖国家和地区，无论是大型水产养殖公司，还是小型私人养殖户都遭受到了不同程度的经济损失，给全球的对虾养殖产业造成了新一轮的巨大冲击。
对虾AHPND的病原目前已被证实为一种特殊的副溶血弧菌，该弧菌携带一个约70kb的质粒pVA1，编码致死性毒素蛋白PirA和PirB，从而变成有毒菌株(Leeetal.,2015,PNAS)。为了降低对虾AHPND的爆发给对虾养殖业带来损失，建立可靠、快速的针对这株特异性副溶血性弧菌的检测方法至关重要。为此，泰国T.W.Flegel教授以及台湾罗竹芳教授为首的研究人员已经建立了基于普通PCR技术的检测方法。由于检测靶位点是针对70kb质粒pVA1的其它基因，而非PirA和PirB毒力蛋白，该PCR方法会造成假阳性检测结果；因为一些副溶血弧菌菌株携带pVA1质粒，但自然缺少PirA和PirB毒力蛋白。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由日本学者Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原微生物的现场化检测。
本研究以对虾AHPND病原的毒力蛋白PirB为靶位点设计LAMP引物，以ESE-Quanttubescanner为恒温反应及检测平台，开发AHPND病原的LMAP试剂盒和检测方法。该检测方法能特异、快速检测pirB基因的存在，从而准确确定检测样品中是否存在AHPND病原。同时该方法使用ESE-Quanttubescanner仪器，通过吸收荧光来实时判断反应的进行，实现LAMP检测结果自动化和数据化，比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠；且该仪器便携、易操作，相比定量PCR仪，节约了大量成本；综述所述，本研究建立的方法能特异、快速检测AHPND病原，且适合养殖对虾现场使用。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于公开了上述快速检测试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述试剂盒由如下(a)或(b)组成：
(a)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照；或
(b)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和显色剂SYTO-9。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物共3对引物组成；其中：
一对外引物由pirB-F3序列和pirB-B3序列组成，其中：外引物pirB-F3序列如SEQIDNO:1所示，外引物pirB-B3序列如SEQIDNO:2所示；
一对内引物由pirB-FIP序列和pirB-BIP序列组成，其中：内引物pirB-FIP序列如SEQIDNO:3所示，内引物pirB-BIP序列如SEQIDNO:4所示；
一对环引物由为pirB-LF序列和pirB-LB序列组成，其中：环引物pirB-LF序列如SEQIDNO:5所示，环引物pirB-LB序列如SEQIDNO:6所示。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述外引物、内引物与环引物之间摩尔比为1:8:4。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述LAMP反应液的组成为：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mMMgSO4水溶液，三者的体积比为8:5:2。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，阳性对照为将pirB片段序列连接到T载体中得到的质粒，pirB片段序列如SEQIDNO:7所示；阴性对照为超纯水。
上述技术方案所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，
当试剂盒由(a)组成时，在25μl由试剂盒制成的反应体系中pirB-F3终浓度为0.2μM，pirB-B3终浓度为0.2μM，pirB-FIP终浓度为1.6μM，pirB-BIP终浓度为1.6μM，pirB-LF终浓度为0.8μM，pirB-LB终浓度为0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；
当试剂盒由(b)组成时，在25μl由试剂盒制成的反应体系中pirB-F3终浓度为0.2μM，pirB-B3终浓度为0.2μM，pirB-FIP终浓度为1.6μM，pirB-BIP终浓度为1.6μM，pirB-LF终浓度为0.8μM，pirB-LB终浓度为0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照。
上述技术方案中任一技术方案所述的快速检测试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用。
上述技术方案所述的应用，其中，包括如下步骤：
(1)、弧菌菌株的纯化分离：从待检对虾组织中使用无菌接种环取样划线于TCBS平板上进行过夜培养，纯化分离弧菌菌株；
(2)、弧菌DNA的制备：在离心管中加入50μL无菌TE溶液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)，挑取弧菌单菌落至上述TE溶液中，将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水煮10min，冷却至室温，再充分震荡10s后12000r/min离心2min，上清液即为弧菌DNA，置于-20℃备用；
(3)、恒温基因扩增反应：所述恒温基因扩增反应按照下述(ⅰ)或(ⅱ)两种反应体系进行：
(ⅰ)、25μl反应体系含有：终浓度为0.2μM的pirB-F3，终浓度为0.2μM的pirB-B3，终浓度为1.6μM的pirB-FIP，终浓度为1.6μM的pirB-BIP，终浓度为0.8μM的pirB-LF，终浓度为0.8μM的pirB-LB，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；或
(ⅱ)、25μl反应体系含有：pirB-F30.2μM，pirB-B30.2μM，pirB-FIP1.6μM，pirB-BIP1.6μM，pirB-LF0.8μM，pirB-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于ESE-QuantTubeScanne上65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
(4)、结果判断：当步骤(3)中按照(ⅰ)反应体系进行时，通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果，浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性；当步骤(3)中按照(ⅱ)反应体系进行时，将反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
本发明具有以下有益效果：
本发明具有特异性好、灵敏度高、操作简单和结果可靠等有益效果，适合对虾养殖现场使用。
(1)、特异性好：对副溶血弧菌E379，副溶血弧菌E027，溶藻弧菌ZJO，哈氏弧菌E385、创伤弧菌A061,霍乱弧菌O1的DNA不发生扩增。
(2)、灵敏度高：最低检测极限可达到10fg/反应。
(3)、操作简单：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，检测结果可通过是否存在焦磷酸镁沉淀，或者加入SYTO-9，根据ESE-QuantTubeScanner实时读取的荧光信号来判断扩增结果，因此对操作者技术要求不高，适合对虾养殖现场使用。
(4)、结果可靠：检测靶位点是pirB基因，而副溶血弧菌只有携带此基因方能致病，因此检测结果能准确判断待检样品是否是对虾AHPND病原。
附图说明：
1、图1为实施例4中LAMP检测AHPND病原的特异性结果图。
2、图2为实施例5中LAMP检测AHPND病原的灵敏度结果图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种用于快速检测对虾急性肝胰腺坏死病病原的试剂盒及其检测方法作进一步的说明。
实施例1：用于检测对虾AHPND病原的试剂盒建立：
用于检测对虾AHPND病原的试剂盒是基于LAMP技术建立的，包括LAMP引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。
(1)、LAMP引物设计：以对虾AHPND病原携带毒力蛋白pirB基因(GenBank登录号为KP324996)为靶位点，利用在线设计软件PrimerExplorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。引物序列见表1。
表1引物序列表
(2)、LAMP反应液：含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。
(3)、阳性对照为含有对虾AHPND病原毒素基因pirB片段的质粒DNA，其制备方法为：以人工合成的pirB基因DNA为模板，利用表1中的外引物(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)对进行扩增，所得基因片段长度为386bp，序列如SEQIDNO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。
(4)、阴性对照为超纯水。
实施例2：使用浊度仪建立对虾AHPND病原检测方法：
利用实施例1的试剂盒检测对虾AHPND病原的方法，包括如下步骤：
(1)、弧菌菌株的纯化分离：从待检对虾组织中使用无菌接种环取样划线于TCBS平板上进行过夜培养，纯化分离弧菌菌株；
(2)、弧菌DNA的制备：在离心管中加入50μL无菌TE溶液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)，挑取弧菌单菌落至上述TE溶液中，将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水煮10min，冷却至室温，再充分震荡10s后12000r/min离心2min，上清液即为弧菌DNA置于-20℃备用；
(3)、恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：pirB-F30.2μM，pirB-B30.2μM，pirB-FIP1.6μM，pirB-BIP1.6μM，pirB-LF0.8μM，pirB-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，BstDNA聚合酶10U，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
(4)、结果判断：通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。
实施例3：使用ESE-Quanttubescanner建立对虾AHPND病原检测方法：
用上述试剂盒按以下方法对待测对虾AHPND病原进行检测，试剂盒中除增加实施例1中没有的显色剂(SYTO-9)外，其余同实施例1。
(1)、弧菌菌株的纯化分离：从待检对虾组织中使用无菌接种环取样划线于TCBS平板上进行过夜培养，纯化分离弧菌菌株；
(2)、弧菌DNA的制备：在离心管中加入50μL无菌TE溶液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)，挑取弧菌单菌落至上述TE溶液中，将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水煮10min，冷却至室温，再充分震荡10s后12000r/min离心2min，上清液即为弧菌DNA置于-20℃备用；
(3)、恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：pirB-F30.2μM，pirB-B30.2μM，pirB-FIP1.6μM，pirB-BIP1.6μM，pirB-LF0.8μM，pirB-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，于65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
(4)、结果判断：将反应管放置在ESE-Quanttubescanner中进行反应，观察ESE-Quanttubescanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
实施例4：检测特异性实验：
用实施例3的方法分别对pirB阳性DNA，副溶血弧菌E379，副溶血弧菌E027，溶藻弧菌ZJO，哈氏弧菌E385、创伤弧菌A061,霍乱弧菌O1的DNA进行检测。
鉴定结果如图1所示：以对虾AHPND病原LAMP引物组进行扩增反应，pirB阳性DNA正常扩增，阴性水对照及副溶血弧菌E379，副溶血弧菌E027，溶藻弧菌ZJO，哈氏弧菌E385、创伤弧菌A061,霍乱弧菌O1没有扩增，显示出良好的特异性。
实施例5：检测灵敏度实验：
将含有AHPND病原毒素基因pirB片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/ul,10ag/μl,1ag/μl。用实施例3的操作方法分别对稀释后的阳性克隆进行检测。鉴定结果如图2所示：对阳性质粒的检测限达到10fg/μl。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下(a)或(b)组成：
(a)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照；或
(b)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和显色剂SYTO-9。
2.根据权利要求1所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物共3对引物组成；其中：
一对外引物由pirB-F3序列和pirB-B3序列组成，其中：外引物pirB-F3序列如SEQIDNO:1所示，外引物pirB-B3序列如SEQIDNO:2所示；
一对内引物由pirB-FIP序列和pirB-BIP序列组成，其中：内引物pirB-FIP序列如SEQIDNO:3所示，内引物pirB-BIP序列如SEQIDNO:4所示；
一对环引物由为pirB-LF序列和pirB-LB序列组成，其中：环引物pirB-LF序列如SEQIDNO:5所示，环引物pirB-LB序列如SEQIDNO:6所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：所述外引物、内引物与环引物之间摩尔比为1:8:4。
4.根据权利要求1所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液的组成为：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mMMgSO4水溶液，三者的体积比为8:5:2。
6.根据权利要求1所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为将pirB片段序列连接到T载体中得到的质粒，pirB片段序列如SEQIDNO:7所示。阴性对照为超纯水。
7.根据权利要求1～6所述的用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其特征在于：
当试剂盒由(a)组成时，在25μl由试剂盒制成的反应体系中pirB-F3终浓度为0.2μM，pirB-B3终浓度为0.2μM，pirB-FIP终浓度为1.6μM，pirB-BIP终浓度为1.6μM，pirB-LF终浓度为0.8μM，pirB-LB终浓度为0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；
当试剂盒由(b)组成时，在25μl由试剂盒制成的反应体系中pirB-F3终浓度为0.2μM，pirB-B3终浓度为0.2μM，pirB-FIP终浓度为1.6μM，pirB-BIP终浓度为1.6μM，pirB-LF终浓度为0.8μM，pirB-LB终浓度为0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照。
8.权利要求1～7任一权利要求所述的快速检测试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、弧菌菌株的纯化分离：从待检对虾组织中使用无菌接种环取样划线于TCBS平板上进行过夜培养，纯化分离弧菌菌株；
(2)、弧菌DNA的制备：在离心管中加入50μL无菌TE溶液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)，挑取弧菌单菌落至上述TE溶液中，将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水煮10min，冷却至室温，再充分震荡10s后12000r/min离心2min，上清液即为弧菌DNA，置于-20℃备用；
(3)、恒温基因扩增反应：所述恒温基因扩增反应按照下述(ⅰ)或(ⅱ)两种反应体系进行：
(ⅰ)、25μl反应体系含有：终浓度为0.2μM的pirB-F3，终浓度为0.2μM的pirB-B3，终浓度为1.6μM的pirB-FIP，终浓度为1.6μM的pirB-BIP，终浓度为0.8μM的pirB-LF，终浓度为0.8μM的pirB-LB，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；或
(ⅱ)、25μl反应体系含有：pirB-F30.2μM，pirB-B30.2μM，pirB-FIP1.6μM，pirB-BIP1.6μM，pirB-LF0.8μM，pirB-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于ESE-QuantTubeScanner上65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
(4)、结果判断：当步骤(3)中按照(ⅰ)反应体系进行时，通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果，浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性；当步骤(3)中按照(ⅱ)反应体系进行时，将反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
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| CN (1) | CN105316422A (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106350603A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-25 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其应用 |
| CN106520966A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-03-22 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种急性肝胰腺坏死综合症中priB基因的LAMP试剂盒及其应用 |
| CN106841607A (zh) * | 2017-04-19 | 2017-06-13 | 深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司 | 急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法 |
| CN107326074A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-11-07 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种南美白对虾肝肠胞虫lamp检测的方法及其专用试剂盒 |
| CN107523627A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-29 | 广州双螺旋基因技术有限公司 | 一种检测急性肝胰腺坏死病病原的lamp试剂盒 |
| CN107723372A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-02-23 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种南美白对虾肝胰腺坏死症lamp检测试剂盒 |
| CN107988326A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-05-04 | 杭州众测生物科技有限公司 | 对虾急性肝胰腺坏死病（ahpnd）的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
| CN111110718A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种对虾肝肠胞虫专杀药物及其制备方法与应用 |
| CN111850153A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-30 | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） | 检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒 |
| CN113337626A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 江苏省海洋水产研究所 | 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 |
| CN115948582A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-04-11 | 中国海洋大学三亚海洋研究院 | 一种基于era技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101643793A (zh) * | 2009-08-27 | 2010-02-10 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法 |
| CN101845519A (zh) * | 2010-01-29 | 2010-09-29 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种用于快速检测对虾桃拉病毒的lamp试剂盒及其检测方法 |
| CN103484571A (zh) * | 2013-10-12 | 2014-01-01 | 中国科学院南海海洋研究所 | 传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 |
-
2015
- 2015-12-02 CN CN201510874945.0A patent/CN105316422A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101643793A (zh) * | 2009-08-27 | 2010-02-10 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法 |
| CN101845519A (zh) * | 2010-01-29 | 2010-09-29 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种用于快速检测对虾桃拉病毒的lamp试剂盒及其检测方法 |
| CN103484571A (zh) * | 2013-10-12 | 2014-01-01 | 中国科学院南海海洋研究所 | 传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHUNG-TE LEE等: "The opportunistic marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin", 《PNAS》 * |
| JETNAPHANG KONGRUENG等: "LAMP assay to detect Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp", 《AQUACULTURE INTERNATIONAL》 * |
| TOMOYA KONO等: "Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| WANSADAJ JAROENRAM等: "Rapid and sensitive detection of white spot syndrome virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 * |
| 徐芊等: "副溶血弧菌LAMP检测方法的建立", 《中国生物工程杂志》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520966A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-03-22 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种急性肝胰腺坏死综合症中priB基因的LAMP试剂盒及其应用 |
| CN106350603A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-25 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种急性肝胰腺坏死综合症中priA基因的LAMP试剂盒及其应用 |
| CN106841607A (zh) * | 2017-04-19 | 2017-06-13 | 深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司 | 急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法 |
| CN106841607B (zh) * | 2017-04-19 | 2019-02-12 | 深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司 | 急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法 |
| CN107326074A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-11-07 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种南美白对虾肝肠胞虫lamp检测的方法及其专用试剂盒 |
| CN107523627B (zh) * | 2017-09-21 | 2020-12-11 | 广州双螺旋基因技术有限公司 | 一种检测急性肝胰腺坏死病病原的lamp试剂盒 |
| CN107523627A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-29 | 广州双螺旋基因技术有限公司 | 一种检测急性肝胰腺坏死病病原的lamp试剂盒 |
| CN107723372A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-02-23 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种南美白对虾肝胰腺坏死症lamp检测试剂盒 |
| CN107988326A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-05-04 | 杭州众测生物科技有限公司 | 对虾急性肝胰腺坏死病（ahpnd）的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
| CN111110718A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种对虾肝肠胞虫专杀药物及其制备方法与应用 |
| CN111850153A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-30 | 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） | 检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒 |
| CN113337626A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 江苏省海洋水产研究所 | 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 |
| CN113337626B (zh) * | 2021-06-02 | 2024-03-12 | 江苏省海洋水产研究所 | 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 |
| CN115948582A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-04-11 | 中国海洋大学三亚海洋研究院 | 一种基于era技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用 |
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