CN106841607B

CN106841607B - 急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN106841607B
Application number: CN201710256361.6A
Authority: CN
Inventors: 祁振强
Original assignee: Shenzhen Bao Shun Thai Science And Technology Industry Ltd By Share Ltd
Current assignee: Shenzhen Brostiger Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: CN106841607A

Abstract

本发明涉及急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。本发明的试剂盒所包被抗体采用抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体作为包被抗体，将所述卵黄抗体用来检测哺乳动物病原具有灵敏度高、价格便宜、具有动物福利保护的特点，试剂盒精度高，检测简单，便于推广应用。

Description

急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种试剂盒及其制备方法，尤其涉及急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

自2009年以来，早期死亡综合症(EMS)，又称急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)给亚洲，特别是东南亚和中国的对虾养殖产业造成了前所未有的冲击。除了大规模减产外，该疾病还带来了诸多负面问题，例如：对虾养殖就业问题、社会福利问题、对虾供求问题和全球对虾总体价格问题等等。

2013年5月，美国亚利桑那大学水产病理实验室(μAZ-APL)定义急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)病原为副溶血弧菌的特异菌株，该菌株能够产生毒素并诱导健康对虾致病。2014年，在世界范围内普遍证实目前APHND的病因与副溶血弧菌所携带的毒素质粒所表达的PirA和PirB两种毒素相关。

目前针对该疾病的诊断集中在对毒素质粒的基因检测。现阶段已出现了一种商业化的基因检测试剂盒和三种通过基础研究得出的不同引物设计得到的诊断方法。

CN 103667498A公开了副溶血性弧菌的检测方法。所述方法用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因。检测方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外围引物的验证；交叉引物恒温扩增反应体系的建立；交叉引物恒温扩增程序；扩增产物的检测。CN104360065A公开了检测副溶血性弧菌的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体3G9F7D5C9，CGMCC No.9010，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体3G9E9G3H7，CGMCC No.8003。

现阶段的诊断方法存在的不足之处：(1)基因诊断需要PCR仪器以及复杂的操作过程，且时间一般在4个小时以上，不利于基层以及现场对疫情的快速诊断。而且目前该诊断方法在国内还没有商品化的产品，全球范围内的三种基因检测方法均由国外提供，其中一种已得到商品化；(2)基因诊断只能检测是否存在毒素表达基因，并不能诊断出毒素是否得以表达。而急性肝胰腺坏死综合症得根本原因是表达的毒素蛋白对机体的损伤，因此只有检测毒素蛋白才能更准确地判断疫病的爆发，减少假阳性；(3)目前的基因诊断技术只有95％的准确性，还有待进一步提高；(4)试剂盒的检测效率不高。

发明内容

本发明的目的在于提供急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒通过特异性卵黄多克隆抗体提高检测灵敏度，同时降低检测的操作难度。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；

其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。

作为试剂盒，酶标板和酶标检测抗体是其核心成分，只要有这两种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分，比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照，可以与上述三种成分配套组装在一个试剂盒中，也可以单独提供，因此本发明中试剂盒可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本发明优选包括这些辅助成分，以方便使用。

优选地，所述特异性卵黄抗体为用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体。

本发明中，所述的pirA和pirB作为一种毒素蛋白，通过基因工程手段从副溶血弧菌中获得，作为一种特异性可产生特异性抗体的蛋白，其产生的抗体具有抗急性肝胰腺坏死综合症，相比于直接用副溶血弧菌直接免疫产生抗体，以pirA和pirB蛋白免疫产生的抗体，专一性更强，效果更好；除此之外，通过pirA和pirB免疫产蛋禽类产生的卵黄抗体，相较于别的抗体，抗性更强，效率更高。

本发明中制备多克隆抗体的方法，是目前比较成熟的技术，具体地，可以用纯化的病毒或者重组表达的病毒蛋白免疫动物，分离血清或卵黄，并通过沉淀离心、层析等方法从血清或卵黄中提取抗体。本发明中的特异性卵黄抗体是将重组表达的病毒pir蛋白免疫蛋鸡后通过硫酸铵沉淀法和亲和层析方法得到。

优选地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示片段，所述序列如下：

MSNNIKHETD YSHDWTVEPN GGVTEVDSKH TPIIPEVGRS VDIENTGRGE LTIQYQWGAPFMAGGWKVAK SHVVQRDETY HLQRPDNAFY HQRIVVINNG ASRGFCTIYY H。

优选地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示片段，所述序列如下：

MTNEYVVTMS SLTEFNPNNA RKSYLFDNYE VDPNYAFKAM VSFGLSNIPY AGGFLSTLWNIFWPNTPNEP DIENIWEQLR DRIQDLVDES IIDAINGILD SKIKETRDKI QDINETIENF GYAAAKDDYIGLVTHYLIGL EENFKRELDG DEWLGYAILP LLATTVSLQI TYMACGLDYK DEFGFTDSDV HKLTRNIDKLYDDVSSYITE LAAWADNDSY NNANQDNVYD EVMGARSWCT VHGFEHMLIW QKIKELKKVD VFVHSNLISYSPAVGFPSGN FNYIATGTED EIPQPLKPNM FGERRNRIVK IESWNSIEIH YYNRVGRLKL TYENGEVVELGKAHKYDEHY QSIELNGAYI KYVDVIANGP EAIDRIVFHF SDDRTFVVGE NSGKPSVRLQ LEGHFICGMLADQEGSDKVA AFSVAYELFH PDEFGTEK。

本发明中，所述pirA和pirB蛋白的氨基酸序列是特异性的产生特异性的抗体针对急性肝胰腺坏死综合症，灵敏度高，效果显著。

优选地，所述酶标检测抗体为酶标记的鼠源抗PirA和PirB毒素蛋白的多克隆抗体。

优选地，所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体，优选为辣根过氧化物酶标记的检测抗体。

优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液和洗涤液。

优选地，所述样品稀释液为pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液；优选为pH 7.2的磷酸盐缓冲液。

优选地，所述洗涤液为pH 9-10的碳酸盐缓冲液；优选为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括封闭液和终止液。

优选地，所述封闭液为含1％牛血清蛋白的洗涤液。

优选地，所述终止液为硫酸溶液。

优选地，所述试剂盒还包括酶底物溶液。

优选地，所述酶底物溶液包含邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，优选3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

优选地，所述阳性对照为包含纯化后pir毒素蛋白的溶液。

优选地，所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。

另一方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；

(2)用所述特异性卵黄抗体包被空白酶标板，得到包被的酶标板；

(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒；

任选地，还包括将样品稀释液、洗涤液、封闭液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到试剂盒中。

优选地，所述步骤(1)具体包括：

(1a)制备pirA和pirB毒素蛋白；

(1b)用所述毒素蛋白pirA和pirB免疫蛋鸡；

(1c)分离蛋黄，然后通过硫酸铵沉淀法粗提抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；

(1d)通过重组得到的pir病毒蛋白偶联的亲和层析柱亲和层析纯化得到抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体。

优选地，所述步骤(1a)具体包括：

(a)通过PCR扩增技术获得所述pirA和pirB的基因序列，并将pirA和pirB的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；

(b)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；

(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述pirA和pirB蛋白表达；

(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白。

本发明的pirA和pirB蛋白可以通过在适当的宿主中表达得到，也可以通过常规肽合成技术化学合成得到，优选的是在适当的宿主中表达得到。

优选地，步骤(1b)所述免疫产蛋鸡的方法为将纯化后的pirA和pirB的重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，进行四点肌肉注射免疫产蛋禽类。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，具体步骤如下：

(1a)制备pirA和pirB毒素蛋白，具体步骤如下：

(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白；

(1b)用所述毒素蛋白pirA和pirB免疫蛋鸡；

(1d)通过重组得到的pirA和pirB毒素蛋白偶联的亲和层析柱亲和层析纯化得到抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；

(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒；

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明试剂盒包被抗体采用抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体作为包被抗体，卵黄抗体用来检测哺乳动物病原具有灵敏度高、价格便宜、具有动物福利保护的特点；本发明采用抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体包被酶标板，通过亲和层析分离得到的特异性卵黄抗体作为包被抗体有利于避免pir毒素蛋白以外蛋白在酶标板结合，从而避免了酶标检测抗体与一些杂蛋白的结合，减少假阳性发生率，提高最终检测结果的特异性；酶标检测抗体通过HRP标记的鼠源抗来进一步增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：制备pirA和pirB蛋白

(1)副溶血性弧菌pirA和pirB基因的克隆，表达载体的构建及鉴定

(a)根据副溶血性弧菌pirA和pirB基因的序列设计引物：

pirA基因序列的PCR扩增引物为：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’，其中下划线部分为BamH I酶切位点；

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC TTAGTGGTAATAGATTGTACAGAAA-3’，其中下划线部分为Not I酶切位点。

pirB基因序列的PCR扩增引物为：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGACTAACGAATACGTTGTAACAA-3’，其中下划线部分为BamH I酶切位点；

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC CTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3’，其中下划线部分为Not I酶切位点。

采用常规小量细菌DNA提取方法即碱裂解法提取副溶血性弧菌的质粒。

PCR扩增：以提取的质粒为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

设置一组以水为样本的阴性对照。

反应条件如下：

所获得PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒(QIAqμickGel Extraction)纯化。采用TAKARA pMD18-T kit参照说明书体系进行连接。

(b)验证，将得到的pirA和pirB基因序列进行转化并克隆验证；具体地，所述转化为取10μL连接产物加至100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s，立即冰上冷却2min。加入890μL LB培养基。37℃培养1h。

采用蓝白斑初步筛选克隆，取40μL X-Gal和8μL IPTG混合均匀后涂布于氨苄抗性培养基上，室温静置干燥，于其上涂布100μL转化培养菌夜，37℃过夜培养。

具体地，所述PCR验证M13引物，对经过夜培养后的透明无色单菌落进行PCR，具体如下：

标记平板上的预选的单菌落，用枪头依次挑取单菌落重悬于10μL灭菌去离子水中，沸水10min处理。12000g离心1min，取上清为模板，PCR体系如下：

设置一组以水为样本的阴性对照。

反应条件如下：

所述酶切采用将过夜培养的菌夜采用试剂盒的提取的方法纯化质粒，电泳检测无误后进行双酶切，酶切体系如下：

同时酶切Pet28a质粒，作为阴性对照，酶切温度为37℃，时间1h。所获得酶切产物进行1.2％的琼脂糖凝胶回收目的条带。

(b)通过同源重组法，将连接产物重组到表达载体体pET-28a(+)(购自TAKARA公司)中，构建重组载体；将所述重组载体转化到克隆菌DH5α大肠杆菌中，筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；具筛选可以通过X-Gal等方法筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；

具体地，将上述中回收到的目的片段和载体进行连接。采用TAKARAT4连接酶体系如下：

按上述方法将连接产物转化到DH5α感受态，并在LB(Kan+)平板进行培养，37℃过夜，挑取单菌落进行PCR鉴定。

(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，PCR验证并酶切验证，验证基因片段的大小，证明PCR得到的序列正确。将所述测序证明正确的重组载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的阳性表达菌；

具体地，挑取6个单菌落37℃过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5mLAmp+LB培养基中，37℃220rpm培养2h。取出1mL菌液作为未诱导对照，其余按照体积加入IPTG至终浓度为0.4mM，37℃180rp培养4h。取1mL菌液12000g离心10min，弃上清，用100μL去离子水重悬沉淀，加入等体积的2×SDS loadingbμffer，沸水浴10min，取上清用12％SDS-PAGE电泳检测。

将经检测诱导成功的菌株扩大培养和诱导，将过夜培养的菌液1:100稀释至200mL新鲜LB培养基中，按照上述诱导条件对其进行诱导。

经诱导后的菌液12000g离心10min，收集菌体。以1/10体积的裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎，控制功率200W，工作条件为超声4s暂停10s 90次，以冰浴降温，重复3次以彻底破碎细菌。将经超声破碎处理的菌液12000g离心10min后，分别取上清和沉淀经12％SDS-PAGE验证蛋白表达方式。

(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白，具体地，可以通过Ni-NTA柱亲和层析纯化等方式分离纯化所述pirA和pirB蛋白。

具体地，可以采用GE公司的Ni-NTA亲和层析预装柱(NiSepharose HighPerformance)按照产品说明书纯化目的蛋白pirA和pirB。实验中，以50-100cm/h的线性流速用蒸馏水洗5个柱体积，以150cm/h的线性流速用6个柱体积的结合缓冲液平衡柱子，然后加入预处理过的样品，用缓冲液洗涤，直到吸收达到基线。采用逐步洗脱法用洗脱缓冲液洗脱，收集各阶段样品，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。

实施例2：免疫蛋鸡后提取抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体

免疫，将pirA和pirB蛋白作为抗原与等体积的费氏佐剂混合，采用皮下多点注射免疫蛋鸡；

具体地，测定纯化后毒素蛋白的浓度，用PBS将纯化后的重组蛋白的浓度调整至0.01～0.1mg/mL，将调整后的重组蛋白与佐剂按照1:1比例相混合后按照公司特有的五次两途径免疫的方式免疫蛋鸡。第一次免疫为1mL重组蛋白与1mL弗氏完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射，两周后用0.5mL重组蛋白与0.5mL弗氏不完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射免疫。两周后再次重复以上操作，但免疫总剂量改为1.5mL。第四次免疫为一个月以后，采用0.75mL重组蛋白与0.5mL弗氏不完全佐剂充分混合后进行翅静脉注射免疫。40天后重复以上操作。至此一共五次免疫完成。；第三次免疫结束7天后开始收集鸡蛋提取纯化IgY。

(1)卵黄抗体的初步分离：将卵黄液与醋酸-醋酸钠的酸化水缓冲液按1：10混合，4度静置过夜，10000g离心20min，留上清。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35％，4度静置至明显分层。将混合液10000g离心20min，去上清，沉淀用30mL PBS溶解。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35％，4度静置至明显分层。10000g离心20min，去上清，沉淀用PBS溶解；

(2)抗PEDV特异性卵黄抗体的免疫亲和层析：将重组得到的pir毒素蛋白与HiTrap进行偶联，制备得到亲和层析柱。将步骤(1)得到的粗提卵黄抗体经pir毒素蛋白亲和层析柱以1mL/min的速度过柱，最后用洗脱液洗下挂在柱上的抗pir毒素蛋白的特异性卵黄抗体，经离心后用PBS重悬抗体沉淀得到抗pir毒素蛋白特异性卵黄抗体液。

实施例3：试剂盒的组装

(1)包被酶标板：将纯化得到的抗pir毒素蛋白的特异性卵黄抗体稀释至浓度为5μg/mL，取100μL稀释的特异性卵黄抗体液包被96孔酶标板，4℃包被过夜。次日取出后以PBST洗板3次，每次3min。以PBST溶液配制的1％BSA作为封闭液，每孔加入封闭液100μL，37℃封闭1h。封闭结束后用PBST洗板3次，每次3min。装入96孔酶标板专用包装袋，用封口机封口后4℃保存。

(2)酶标检测抗体：抗pir毒素蛋白的酶标多克隆抗体可通过技术服务外包获得或商购，也可通过本领域常规方法制备，制备已知抗原的酶标多克隆抗体的方法是本领域公知的。

试剂盒其他溶液配制：

(3)样品稀释液：pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)；

(4)洗涤液：pH9.6的碳酸盐缓冲液

(5)封闭液(1％BSA)：1.0g牛血清白蛋白溶于100mL洗涤液；

(6)终止液：取54.3mL浓度为95％浓硫酸加蒸馏水至1000mL即可；

(7)TMB底物：商品化购买成品；

(8)阳性对照：用PBS将纯化后的pir毒素蛋白调整至浓度为40ng/mL，每毫升加入1000IU青霉素和链霉素，除菌过滤后粉状，作为阳性对照；

(9)阴性对照：称取适量BSA于PBS溶液中配置成浓度为2μg/mL，每毫升加入1000IU青霉素和链霉素，除菌过滤后粉状，作为阴性对照。

组建的试剂盒包括以下几个方面：96孔酶标板、检测抗体、样品稀释液、洗涤液、封闭液、终止液、TMB底物、阳性对照、阴性对照及产品说明书。

实施例4：用试剂盒检测样本

用所述试剂盒检测副溶血弧菌的方法：

取出包被的酶标板，每孔加入100μL的待测样品，加入封闭液，37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μL的酶标检测抗体辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG(1:10000)，37℃孵育1h，用洗涤液洗5次；然后每孔加入100μL TMB显色液显色10min，立即加入终止液终止反应。用酶标仪测定酶标孔450nm的吸光值，当待测样品与阳性对照的OD₄₅₀比大于0.8，待测样品和阴性对照的OD₄₅₀比大于2.1判断为阳性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司

<120> 急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法

<130> 2015

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asn Asn Ile Lys His Glu Thr Asp Tyr Ser His Asp Trp Thr

1 5 10 15

Val Glu Pro Asn Gly Gly Val Thr Glu Val Asp Ser Lys His Thr Pro

20 25 30

Ile Ile Pro Glu Val Gly Arg Ser Val Asp Ile Glu Asn Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Glu Leu Thr Ile Gln Tyr Gln Trp Gly Ala Pro Phe Met Ala Gly

50 55 60

Gly Trp Lys Val Ala Lys Ser His Val Val Gln Arg Asp Glu Thr Tyr

65 70 75 80

His Leu Gln Arg Pro Asp Asn Ala Phe Tyr His Gln Arg Ile Val Val

85 90 95

Ile Asn Asn Gly Ala Ser Arg Gly Phe Cys Thr Ile Tyr Tyr His

100 105 110

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Asn Glu Tyr Val Val Thr Met Ser Ser Leu Thr Glu Phe Asn

1 5 10 15

Pro Asn Asn Ala Arg Lys Ser Tyr Leu Phe Asp Asn Tyr Glu Val Asp

20 25 30

Pro Asn Tyr Ala Phe Lys Ala Met Val Ser Phe Gly Leu Ser Asn Ile

35 40 45

Pro Tyr Ala Gly Gly Phe Leu Ser Thr Leu Trp Asn Ile Phe Trp Pro

50 55 60

Asn Thr Pro Asn Glu Pro Asp Ile Glu Asn Ile Trp Glu Gln Leu Arg

65 70 75 80

Asp Arg Ile Gln Asp Leu Val Asp Glu Ser Ile Ile Asp Ala Ile Asn

85 90 95

Gly Ile Leu Asp Ser Lys Ile Lys Glu Thr Arg Asp Lys Ile Gln Asp

100 105 110

Ile Asn Glu Thr Ile Glu Asn Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Asp Asp

115 120 125

Tyr Ile Gly Leu Val Thr His Tyr Leu Ile Gly Leu Glu Glu Asn Phe

130 135 140

Lys Arg Glu Leu Asp Gly Asp Glu Trp Leu Gly Tyr Ala Ile Leu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Ala Thr Thr Val Ser Leu Gln Ile Thr Tyr Met Ala Cys Gly

165 170 175

Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Val His Lys

180 185 190

Leu Thr Arg Asn Ile Asp Lys Leu Tyr Asp Asp Val Ser Ser Tyr Ile

195 200 205

Thr Glu Leu Ala Ala Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn

210 215 220

Gln Asp Asn Val Tyr Asp Glu Val Met Gly Ala Arg Ser Trp Cys Thr

225 230 235 240

Val His Gly Phe Glu His Met Leu Ile Trp Gln Lys Ile Lys Glu Leu

245 250 255

Lys Lys Val Asp Val Phe Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro

260 265 270

Ala Val Gly Phe Pro Ser Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr

275 280 285

Glu Asp Glu Ile Pro Gln Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg

290 295 300

Arg Asn Arg Ile Val Lys Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His

305 310 315 320

Tyr Tyr Asn Arg Val Gly Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu

325 330 335

Val Val Glu Leu Gly Lys Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser

340 345 350

Ile Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn

355 360 365

Gly Pro Glu Ala Ile Asp Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg

370 375 380

Thr Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln

385 390 395 400

Leu Glu Gly His Phe Ile Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Asp Lys Val Ala Ala Phe Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp

420 425 430

Glu Phe Gly Thr Glu Lys

435

Claims

1.一种检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；

其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体；

所述特异性卵黄抗体为用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；

所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段；

所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示的片段。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标检测抗体为酶标记的鼠源抗PirA和PirB毒素蛋白的多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的检测抗体。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液和洗涤液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为pH 9-10的碳酸盐缓冲液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液和终止液。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含1％牛血清蛋白的洗涤液。

12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。

13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶底物溶液。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液包含邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。

16.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包含纯化后pirA和pirB毒素蛋白的溶液。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。

19.一种如权利要求1-18任一项所述的检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒；

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1a)制备pirA和pirB毒素蛋白；

(1b)用所述毒素蛋白pirA和pirB免疫蛋鸡；

(1d)通过重组得到的pirA和pirB毒素蛋白偶联的亲和层析柱亲和层析纯化得到抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体。

21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1a)具体包括：

(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白。

22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1a)制备pirA和pirB毒素蛋白，具体步骤如下：

(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白；

(1b)用所述毒素蛋白pirA和pirB免疫蛋鸡；

(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒；