CN109182364A - 一种特异性识别蛋白a的多克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种特异性识别蛋白a的多克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Abstract

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域，更具体地，涉及一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用。该方法首先通过对蛋白A的抗原表位分析，把可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备中采用大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备特异性识别蛋白A的多克隆抗体。本发明制备的特异性识别蛋白A的多克隆抗体可应用于定量检测试验样品中Protein A的残留水平，同时也便于Protein A纯化介质制造商监测特定条件下Protein A的脱落特征。

Description

一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域，更具体地，涉及一种特异性识 别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白A是葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)的简称，是一种 从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁中分离的蛋白质。蛋白A主要 有5个结合抗体的功能域，每个结构域大约由58个氨基酸残基组成(1、Karen L.A，Julia D.B，EmilyS.S.aureus IgG-bindingproteins SpA and Sbi：Host specificity andmechanisms ofimmune complex formation，MolecularImmunology，2008，45： 1600-1611；2、逢少蕉，梁浩，宋淑亮，葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用， 生命的化学，2008，28卷第6期，748-751)。
在单克隆抗体药物的纯化过程中，以蛋白A为基础的亲合层析是广泛应用 的纯化方法之一，该方法中Protein A是通过共价偶联方式结合于纯化介质之上， 单克隆抗体可以有效的在此步骤中得到纯化。然而，在蛋白A亲合层析柱使用 过程中会有微量的蛋白A从层析柱上脱落下来。研究表明蛋白A可能对人体有 潜在的危害，它的生物学作用包括刺激人体多种细胞素(IFNγ，TNFα，IL-1 α，IL-1β，IL-2，IL-4)的释放。此外如果抗体产品污染有Protein A也可能影 响免疫检测的结果。因此用精确灵敏的方法来确证单克隆抗体药物中蛋白A的 残留处于一个较低的和稳定的水平是单克隆抗体药物的质量标准之一。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种特异性识别蛋白A的 多克隆抗体及其制备方法和应用，通过对蛋白A的抗原表位分析获得可产生较 强免疫原性位点的基因片段，并进行PCR扩增、构建表达载体、免疫动物得到 特异性针对该位点的抗体。该抗体可应用于定量检测试验样品中Protein A的残 留水平。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的在于提出一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备 方法，包括如下步骤：
(1)蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白A 的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体构建含有 如SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大 肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白A抗原；
(3)将所述重组蛋白A抗原免疫动物，经血清分离纯化获得特异性识别蛋 白A的多克隆抗体。
进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SE Q ID No.3所示。
进一步地，所述步骤(2)中的表达载体为PET28a。
进一步地，所述大肠杆菌感受态为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
进一步地，所述步骤(2)得到的重组蛋白A抗原的氨基酸序列如序列表中 SEQ IDNO.4所示。
进一步地，所述步骤(3)中重组蛋白A抗原免疫的动物为母鸡。
更进一步地，所述免疫母鸡的具体方法为：取纯化后的重组蛋白A抗原免 疫待产母鸡，连续免疫四次，间隔15-30天免疫一次，首免剂量500-600μg/只， 以后每次免疫300-400μg/只，免疫四次之后第8天开始收集鸡蛋，即为含重组 特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋。
更进一步地，含特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋进行分离纯化的具 体步骤为：取鸡蛋放入75％酒精中浸泡5分钟，将其蛋壳敲碎取出蛋黄放在滤 纸上吸附掉残留蛋清，破除蛋黄上的细胞膜，然后按1：9用去离子水稀释混匀， 然后加入1％辛酸，在搅拌机上搅拌30min，调节pH至5.1，置4℃冰箱6h；取 出8000g离心5min，上清用滤纸过滤；加入固体硫酸铵至终浓度为50％，4℃静 置1h，5 000g离心20min,弃上清；再用和卵黄加水之后相同体积的PBS 溶解后，采用截留50KD分子量的膜包进行超滤，获高纯度的重组特异性识别 蛋白A的多克隆抗体。
本发明的第二个目的在于提出一种上述述特异性识别蛋白A的多克隆抗体 的制备方法在试验样品中蛋白A的定量检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，通过对蛋 白A的抗原表位分析，把可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物 进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物 得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备的中采用大肠杆菌表达系统， 能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备特异性识别 蛋白A的多克隆抗体。
(2)本发明制备的特异性识别蛋白A的多克隆抗体可应用于定量检测试验 样品中Protein A的残留水平，同时也便于Protein A纯化介质制造商监测特定 条件下Protein A的脱落特征。
(3)本发明的特异性识别蛋白A的多克隆抗体是免疫母鸡得到的，母鸡易 于饲养，无需采血，只需收集免疫母鸡产下的蛋即可获得抗体，对鸡无损伤， 符合现代动物伦理制度。由于种系发育遗传距离差距大，禽类卵黄抗体与哺乳 动物免疫球蛋白之间不会发生血清学交叉反应，避免在免疫检测过程中产生假 阴性和假阳性结果。
附图说明
图1为本发明实施例1中蛋白A目的片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检 测谱图；
图2为本发明实施例2采用ELISA方法定量检测试验样品中蛋白A含量的 方法流程图；
图3为本发明实施例2采用ELISA方法定量检测试验样品中蛋白A含量的 标准曲线。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明 的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所 有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备
一、抗原表位分析
采用DNAStar软件进行抗原表位分析，分析结论显示SEQ ID No.1所示序 列的抗原性良好，抗原决定簇主要集中在N端19个氨基酸和C端45个氨基酸， 根据抗原决定簇分析结果，考虑将SEQID No.1进行原核表达，并根据序列设计 特异性引物。
二、表达载体的构建
1、蛋白A目的片段获取
在北京天一辉远生物技术公司通过全基因合成的方法，合成用于原核表达 载体构建的DNA序列，即合成SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2、PCR扩增
以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为模板，按表1体系将溶液依次从多至 少加入PCR管中(模板cDNA最后加入)进行PCR扩增。扩增引物如下所示：
上游引物：SEQ ID No.2：5’-gatcagcttggaagtaacccgatggtcagtgtg-3’
下游引物：SEQ ID No.3：5’-ctgacacgcgtgacatcagaattcgagtgacacg-3’
表1PCR反应体系
模板DNA(SEQ ID No.1) 5μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
5×Buffer(TrispH8.0，KCl) 20μL
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 2μL
2.5mM dNTP Mixture(10mM) 15μL
dH2O 154μL
PCR程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环。PCR 产物经凝胶电泳分析，获得约为250bp的DNA条带(图1所示)，产物回收纯 化待用。
3、构建表达载体
PCR目的片段和PET28a空载体分别用BamHI和Sail双酶切，37℃水浴酶 切20min；酶切片段切胶，凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体，目的片段和载体 酶切产物做连接反应，反应体系如下表2，用枪轻轻吹吸混匀后，22℃连接2小 时以上。
表2
试剂 目的片段 载体 5×Buffer(TrispH8.0，KCl) T4连接酶
加样量(μL) 15 3 3 3
4、转化和阳性克隆筛选
从-80℃冰箱中取出感受态细胞至冰上融化，加入连接产物(10μL)，轻轻吹 吸使DNA与大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞充分混匀，冰上30min，42℃热击 90s，冰上1min；加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中158转/min震 荡45min；然后6000r离心4min；在超净台里面吸掉800μL上清，剩余菌液混 匀，涂至含有相应抗生素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～ 16小时后可出现菌落；经氨苄青霉素筛选后，挑取单克隆菌落进行菌体PCR检 测，选取PCR检测阳性菌落。
5、重组蛋白表达及纯化
将含有阳性菌落的大肠杆菌菌液，接种至LB培养液中，使用恒温摇床， 37℃，180rpm培养，待菌体OD值达到0.6，加入终浓度1mM的IPTG，并将 温度调至30℃，180rpm继续培养6h。取50ml大肠杆菌菌液，放置在离心机， 10000rpm，1min，弃上清收集菌体，加入10mlPBS，重新悬浮菌体。将重新悬 浮的菌体放置在冰浴中，使用超声破碎仪，进行菌体破碎。将破碎处理后的菌 液，放置在离心机中，12000rpm，10min，分别收集上清和沉淀，沉淀使用10ml PBS重新悬浮，分别取两种溶液10μl，加入10μl 2×SDS缓冲液，沸水煮沸 10min，离心后，取上清进行SDS-PAGE检测，检测结果显示：上清中含有一条 目的蛋白大小的条带。将上清溶液，经Ni柱纯化后，进行SDS-PAGE检测，结 果显示：能够纯化出目标蛋白条带，与预测目的蛋白大小一致，且蛋白A表达 量很大，足够满足制备抗体的需要，其氨基酸序列为SEQID No：4所示。
6、免疫
取纯化后的重组蛋白A抗原免疫待产母鸡，连续免疫四次，间隔15-30天 免疫一次，首免剂量500-600μg/只，以后每次免疫300-400μg/只，免疫四次之 后第8天开始收集鸡蛋，即为含重组特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋。
7、纯化
取鸡蛋放入75％酒精中浸泡5分钟，将其蛋壳敲碎取出蛋黄放在滤纸上吸 附掉残留蛋清，破除蛋黄上的细胞膜，然后按1：9用去离子水稀释混匀，然后 加入1％辛酸，在搅拌机上搅拌30min，调节pH至5.1，置4℃冰箱6h；取出8000g 离心5min，上清用滤纸过滤；加入固体硫酸铵至终浓度为50％，4℃静置1h，5 000g离心20min,弃上清；再用和卵黄加水之后相同体积的PBS溶解后，采 用截留50KD分子量的膜包进行超滤，获高纯度的重组特异性识别蛋白A的多 克隆抗体。
实施例2：采用ELISA方法定量检测出试验样品中蛋白A的含量
Protein A亲和层析广泛应用于抗体的纯化，该方法中Protein A是通过共价 偶联方式结合于纯化介质之上，纯化时Protein A的脱落是药物研究中的一大问 题。将本发明的特异性识别蛋白A的多克隆抗体应用于定量检测试验样品中 Protein A的残留水平，同时也便于Protein A纯化介质制造商监测特定条件下 Protein A的脱落特征。
本实施例应用双抗体夹心酶联免疫检测(夹心ELISA)原理检测Protein A的 残留，用特异性识别蛋白A的单克隆抗体包被微孔板，形成固相抗体，向固相 抗体微孔板中加入Protein A标准品和待测样品，然后加入生物素(Biotin)标 记的实施例1的方法制备的特异性识别蛋白A的多克隆抗体，最后加入辣根过 氧化物酶标记的链霉亲和素(SA‐HRP)，形成抗体+抗原+抗体‐Biotin+SA ‐HRP复合物，经过洗涤后加入TMB底物显色；TMB在HRP酶的催化下转 化成蓝色并在酸的作用下最终转换成黄色，颜色的深浅与样品中Protein A的量 呈正相关。检测流程图如图2所示。
其中特异性识别蛋白A的单克隆抗体的制备方法如下：
(1)取实施例1中纯化后的重组蛋白A抗原免疫5-8周龄Balb/C小鼠5只，免 疫剂量为100ug抗原/只，第一次主注射使用弗氏完全佐剂，以后注射使用弗氏不 完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。免疫间隔时间为2－3周，免疫3－ 4次；背部多点注射。从小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清，间接ELISA方法检 测抗血清效价。
(2)细胞融合及亚克隆：融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期； 选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞 并计数。按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合 操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞， 第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛 选检测。融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂 交瘤细胞，证明融合操作成功。吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测。根 据ELISA结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二 次复检，进一步确认阳性孔。对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次 亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为 第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。
(3)将上述阳性细胞扩大培养并注射至Balb/C小鼠(经弗氏不完全佐剂至 敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹 水产生时及时抽取腹水。将上述细胞的腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于 90％。纯化方法如下：辛酸硫酸铵+DEAE离子柱法纯化(gG1、IgG2a、IgG2b、IgG3亚型抗体)，腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积，用4倍体积的60mM醋 酸缓冲液(pH4.0)1:3稀释，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，室 温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。10000r/min，4℃，20min，收集上清，加入1/10体积的10*PBS(0.1MpH7.4)。根据每ml上述混合液加 0.277g固体硫酸铵(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，继续静置至少 60min以上。10000r/min，4℃，20min，弃上清，将沉淀溶解于少量PBS中。对 PBS透析，4℃透析过夜。检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。
1.样品准备
样品中的抗体结合Protein A可导致检测值偏低，所以从样品中完全解离并 除去抗体非常重要。加热处理可以有效的分离Protein A和抗体，抗体经加热变 性，再经离心除去，Protein A则留于上清液中。较高的抗体浓度可能会干扰检 测的准确度，需要稀释至10mg/ml以下；样品pH值要调整到6.0‐7.5的范围， 以免影响检测结果的准确度。
2.试剂的准备
(1)1×洗液
用去离子水或双蒸水按1:20稀释20×洗液。例如：取40ml的20×洗液加入760 ml的去离子水中配成800ml洗液，经0.22μm滤膜过滤，2-8℃条件下保存。
注：如果在20×洗液中出现结晶，在50℃的水浴锅中温浴，直至结晶完全消 失。
(2)1×样品稀释液
用去离子水或双蒸水按1:5稀释5×样品稀释液，经0.22μm滤膜过滤，2-8℃条 件下保存。
注：如果在5×样品稀释液中出现结晶，在50℃的水浴锅中温浴，直至结晶 完全消失。
(3)检测抗体工作液
检测重组蛋白：根据检测所需的量用抗体稀释液按1:150稀释Protein A检测 抗体。
(3)Protein A标准品溶液
制备Protein A标准曲线，用样品稀释液稀释步骤配制出标准曲线2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0.156ng/ml、和0ng/ml。
3.标准品/待测样品孵育
(1)将配制好的Protein A标准曲线或待测样品各100μl加入对应板孔中 (空白孔除外)。
(2)用盖板膜封板，37℃孵育30分钟。
(3)洗板：移去盖板膜，弃去板孔中液体，每孔加入1×洗液260μl，浸泡 30秒，弃去洗液，重复洗涤4次。
(4)在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
(5)快速混匀后，每孔加入生物素标记的特异性识别蛋白A的多克隆抗体 100μl(空白孔除外)。
(6)用盖板膜封板，37℃孵育30分钟。
(7)洗板，同第3步。
(8)在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
(9)每孔加入HRP标记链霉亲和素100μl(空白孔除外)。
(10)用盖板膜封板，37℃孵育10分钟。
(11)洗板，同第3步。
(12)在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
(13)每孔加入显色液100μl(包括空白孔).
(14)用盖板膜封板，室温(20-25℃)避光反应10-15分钟(从加入显色 液至第一孔时开始计时)。
注：显色反应时间受温度影响，理想反应温度为20-25℃，当温度低时，反 应时间要适当延长.
(15)移去盖板膜，每孔加入终止液50μl(包括空白孔).
(16)终止后立即用酶标仪在450nm处测量吸光值。
(17)以OD值为纵坐标，Protein A标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲 线，根据标准曲线计算出样品中Protein A的含量。
4.结果分析
(1)以Protein A的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，标准曲线如图3所示。 将待测样品中的OD值代入到标准曲线中计算样品中Protein A的含量。
(2)本发明中的特异性识别蛋白A的多克隆抗体可特异性检测天然Protein A和重组Protein A。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。
序列表
<110> 武汉百意欣生物技术有限公司
<120> 一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaagcaccg aaagctgata acaaattcaa caaagaacaa caaaatttca tccaaagctt 60
aaaagatgac ccaagccaaa gcgctaacct t 91
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcagcttg gaagtaaccc gatggtcagt gtg 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgacacgcg tgacatcaga attcgagtga cacg 34
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn
1 5 10 15
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala
20 25 30

Claims (9)

1.一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白A的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体构建含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白A抗原；
(3)将所述重组蛋白A抗原免疫动物，经血清分离纯化获得特异性识别蛋白A的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的表达载体为PET28a。
4.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)得到的重组蛋白A抗原的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中重组蛋白A抗原免疫的动物为母鸡。
7.根据权利要求6所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫母鸡的具体方法为：取纯化后的重组蛋白A抗原免疫待产母鸡，连续免疫四次，间隔15-30天免疫一次，首免剂量500-600μg/只，以后每次免疫300-400μg/只，免疫四次之后第8天开始收集鸡蛋，即为含重组特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋。
8.根据权利要求7所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，含特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋进行分离纯化的具体步骤为：取鸡蛋放入75％酒精中浸泡5分钟，将其蛋壳敲碎取出蛋黄放在滤纸上吸附掉残留蛋清，破除蛋黄上的细胞膜，然后按1：9用去离子水稀释混匀，然后加入1％辛酸，在搅拌机上搅拌30min，调节pH至5.1，置4℃冰箱6h；取出8000g离心5min，上清用滤纸过滤；加入固体硫酸铵至终浓度为50％，4℃静置1h，5 000g离心20min,弃上清；再用和卵黄加水之后相同体积的PBS溶解后，采用截留50KD分子量的膜包进行超滤，获高纯度的重组特异性识别蛋白A的多克隆抗体。
9.一种权利要求1-8任一项所述特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法在试验样品中蛋白A的定量检测中的应用。
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