CN110272488A - 猫杯状病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

猫杯状病毒单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有特异性结合猫杯状病毒的鼠单克隆抗体的可变区序列、特异性结合猫杯状病毒的抗体以及分泌抗体的杂交瘤细胞，该可变区序列能特异性结合猫杯状病毒，且对多种猫杯状病毒均能结合。该抗体制备的双抗夹心检测试剂盒能对临床上的多种FCV毒株均能检测，克服了现有技术检测FCV毒株广谱性差、灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，特别地检测无症状的动物多种类型的靶标准确率更高，具有快速、简便、准确的优势。

Description

猫杯状病毒单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及两种猫杯状病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体对的双抗夹心检测试剂盒和应用，属于生物技术领域。
背景技术
猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)属于杯状病毒科，可引发猫科(以猫为主)的上呼吸道感染、口腔水泡性疾病及慢性肠胃炎，还可引发猫肺炎、跛性综合征等疾病。FCV所引发的疾病发病率极高，呈世界性分布，极易感染一岁内的幼猫，导致幼猫死亡。FCV传播途径广泛，主要传染源为病猫和带毒猫，病猫在急性期可随分泌物和排泄物排出大量病毒，直接传染易感猫；带毒猫经治疗，症状可消失，临床康复后作为无症状的病原携带者仍可长期排毒，也是危险的传染源。
FCV与猫疱疹病毒1型引发疾病的临床症状相似并经常混合感染，还可与其它病毒、寄生虫混合感染。而仅根据病史、临床症状和流行特点进行诊断常常误诊，从而延误时机并导致病毒的进一步扩散和传播。
FCV常用的检测方法包括电镜观察技术、病毒分离、中和试验、免疫荧光试验、RT-PCR等，操作繁琐、检测耗时，需要专业技术人员和专门仪器方可完成。特别是FCV具有丰富的抗原多样性，遗传变异性也很强，这成为FCV感染准确诊断和有效防制的一大难题。近年来，由于FCV高度变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性、全身性疾病，对猫群及其它猫科动物的健康构成严重威胁。而现有产品无法准确检测FCV强毒株，为面对这种严峻局势，急需建立一种快速、准确、简单、广谱的诊断FCV方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了两株猫杯状病毒单克隆抗体，其能特异性、广谱性地结合猫杯状病毒。
本发明涉及一种特异性结合猫杯状病毒的单克隆抗体5D9的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明的单克隆抗体5D9的可变区序列能特异性结合猫杯状病毒，对早期毒株、现在流行株均能特异性结合，其针对的抗原表位位于Cap蛋白上；且其能针对现在流行毒株广谱性地结合。
本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段具有特异性、广谱性地结合猫杯状病毒的能力。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5D9株，所述杂交瘤细胞5D9株分泌所述单克隆抗体5D9。
本发明还涉及一种特异性结合猫杯状病毒的鼠单克隆抗体5F5的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明的单克隆抗体5F5的可变区序列能特异性结合猫杯状病毒，对早期毒株、现在流行株均能特异性结合，其针对的抗原表位位于Cap蛋白上；且其能针对现在流行毒株广谱性地结合。
本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段仍具有特异性、广谱性地结合猫杯状病毒的能力。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5F5株，所述杂交瘤细胞5F5株分泌所述单克隆抗体5F5。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体5D9、有效量的金标记所述单克隆抗体5F5，以及对猫杯状病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得猫杯状病毒抗原与所述单克隆抗体5F5的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5F5，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5D9，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述有效量的所述单克隆抗体5D9为0.8-2.0mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体5F5胶体金标记时为10-30μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1.0-3.0mg/ml。
本发明还涉及所述试剂盒的检测方法，其中，所述检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中，10分钟后判定结果。
本发明还涉及所述抗体或抗体片段用于猫杯状病毒抗原表位鉴定研究以及反应性评价；所述抗体或抗体片段为单克隆抗体5D9或5F5。
本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猫杯状病毒检测中的应用。其中，所述非诊断目的的猫杯状病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测。
本发明制备的单克隆抗体均能与多个FCV毒株反应且反应活性良好。本发明的含有所述单克隆抗体对的试剂盒，检测多个FCV毒株均为阳性且灵敏度高，克服了现有技术检测FCV毒株广谱性差、灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，特别地检测无症状的动物多种类型的靶标准确率更高，具有快速、简便、准确的优势。
附图说明
图1为小鼠阳性血清的Western Blot鉴定图，其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为阳性对照(小鼠阳性血清)。
图2为单克隆抗体5D9的Western Blot鉴定图，其中，泳道M为蛋白Marker，泳道2蛋白条带为单克隆抗体5D9。
图3为单克隆抗体5F5的Western Blot鉴定图；其中，泳道M为蛋白Marker，泳道3蛋白条带为单克隆抗体5F5。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种特异性结合猫杯状病毒的单克隆抗体5D9的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
术语“猫杯状病毒”(Feline calicivirus，FCV)也称猫嵌杯状病毒，属于杯状病毒科，仅1个血清型，可引发猫科动物的口腔和上呼吸道疾病(也成为猫传染性结膜炎)，引发的临床症状包括鼻炎、结膜炎和口腔溃疡，严重的出现支气管炎和肺炎，也可引起关节和肌肉疼痛及慢性口腔溃疡，发病率极高，呈世界性分布，极易感染一岁内的幼猫，导致幼猫死亡。
术语“猫杯状病毒结构蛋白”又称FCV结构蛋白、衣壳蛋白、Cap蛋白或VP1蛋白，由开放阅读框ORF2编码，成熟后自我组装成62kD左右的空衣壳即病毒样粒子或病毒样颗粒VLPs。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猫杯状病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明的单克隆抗体5D9的可变区序列能特异性结合猫杯状病毒，对早期毒株、现在流行株均能特异性结合，其针对的抗原表位位于Cap蛋白上；且其能针对现在流行毒株广谱性地结合。
本发明涉及一种特异性结合猫杯状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猫杯状病毒的能力。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体5D9，所述单克隆抗体5D9重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列。
所述单克隆抗体5D9为猫杯状病毒单克隆抗体，进一步为猫杯状病毒Cap蛋白的单克隆抗体；重链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列；对多个FCV毒株的IFA效价均≥1:1600，与FCV多个毒株均具有良好的反应性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5D9，所述杂交瘤细胞分泌所述单克隆抗体5D9。
本发明的上述抗体或抗体片段能特异性、广谱地结合猫杯状病毒。
本发明涉及一种特异性结合猫杯状病毒的单克隆抗体5F5的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明的单克隆抗体5F5的可变区序列能特异性结合猫杯状病毒，对早期毒株、现在流行株均能特异性结合，其针对的抗原表位位于Cap蛋白上；且其能针对现在流行毒株广谱性地结合。
本发明涉及一种特异性结合猫杯状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、犬源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猫杯状病毒的能力。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体5F5，所述单克隆抗体5F5重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ.IDNo.4编码的氨基酸序列。
所述单克隆抗体5F5为猫杯状病毒单克隆抗体，进一步为猫杯状病毒Cap蛋白的单克隆抗体；重链可变区的氨基酸为SEQ.ID No.3，和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQ.IDNo.4；对FCV多个毒株的IFA效价均≥1:1600，对FCV多个毒株均具有良好的反应活性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5F5，所述杂交瘤细胞分泌所述单克隆抗体5F5。
本发明的上述抗体或抗体片段能特异性、广谱地结合猫杯状病毒。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体5D9、有效量的所述单克隆抗体5F5，以及对猫杯状病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得猫杯状病毒抗原与所述单克隆抗体5F5的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5F5，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5D9，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；所述有效量的所述单克隆抗体5D9为0.8-2.0mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体5F5胶体金标记时为10-30μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1.0-3.0mg/ml。
本发明的双抗夹心法检测试剂盒能有效地检测猫杯状病毒，对无症状的动物多种类型的靶标组织均能准确检测。
作为本发明的一种实施方式，所述有效量的所述单克隆抗体5D9为1.5mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体5F5胶体金标记时为20μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒的检测样品为猫眼鼻拭子或咽拭子、血清、或唾液样品。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件相互接触，而不相邻的部件之间不接触。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含1％V/V Triton X-100的PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)。
本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤1)用胶体金标记所述单克隆抗体5F5为金标抗体，制成金标垫；
步骤2)固定所述单克隆抗体5D9、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线；
步骤3)配制样品处理液，分装；
步骤4)将步骤1)所制备的金标垫、步骤2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述单克隆抗体5F5标记时为10-30μg/ml，所述步骤2)中所述单克隆抗体5D9为0.8-2.0mg/ml、所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1.0-3.0mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)中所述单克隆抗体5F5标记时为20μg/ml，所述步骤2)中所述单克隆抗体5D9为1.5mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为含1％V/V TritonX-100的PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)。
本发明还涉及所述试剂盒的检测方法，其中，所述检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心，10分钟后判定结果。
本发明还涉及所述抗体或抗体片段用于猫杯状病毒抗原表位鉴定研究以及反应性评价；所述抗体或抗体片段为单克隆抗体5D9或5F5。
本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猫杯状病毒检测中的应用。其中，所述非诊断目的的猫杯状病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测。
本发明还涉及一种单链抗体，所述单链抗体的重链可变区为SEQ.ID NO.1所示序列编码或为SEQ.ID NO.3所示序列编码，所述单链抗体的轻链可变区为SEQ.ID NO.2所示序列编码或为SEQ.ID NO.4所示序列编码。
含本发明所述单克隆抗体或所述试剂盒可用于非诊断目的的猫杯状病毒检测中的应用，可应用于流行病学分析、对离体组织进行检测、健康体检及排查、表位鉴定研究、猫杯状病毒抗原反应性的检测等非诊断目的方面。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实例中所用的样品处理液为含1％V/V Triton X-100的PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)，其1L体积PBS缓冲液配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.24g，但不限于此配方；若无特殊说明，均用PBS缓冲液稀释，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猫杯状病毒的分离及鉴定
收集具有口腔溃疡、鼻炎、结膜炎、慢性肠胃炎、急性关节炎、厌食、嗜睡等临床症状甚至因这些临床症状引起死亡的猫(源自河南、山东、广东、湖北、四川等多个省份宠物医院)的眼鼻或鼻咽拭子累计50份，用猫杯状病毒RT-PCR检测试剂盒分别进行检测，除10份阴性外，其余40份均为阳性，其中30份与猫疱疹病毒1型混合感染、或与猫泛白细胞减少症病毒混合感染、或三种病毒混合感染，仅10份为FCV单一病毒感染，将相应的病料接种FK81细胞，盲传3代获得相应的病毒，收获病毒培养液并对其结构蛋白进行测序，结果：10株FCV病毒的结构蛋白基因序列均不一致，且与已公布的FCV结构蛋白基因序列的同源性至少为75％。故将分离到的10株FCV毒株分别命名为FC001株、FC002株、FC003株、FC004株、FC005株、FC006株、FC007株、FC008株、FC009株、FC010株，以上各株均为现在的流行株。
实施例2猫杯状病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
2.1猫杯状病毒单克隆抗体的制备和纯化
将实施例1制备的10株FCV毒株(105.0TCID50/ml)经PEG20000浓缩分别作为免疫原，与弗氏完全佐剂乳化后一免，与弗氏不完全佐剂乳化后二免、三免，按0.4ml/只免疫各6～8周龄雌性Balb/C小鼠，共10组。先用10株FCV毒株分别制备的IFA抗原板检测各自毒株作为免疫原三免后的小鼠血清IFA效价，将IFA效价最高的小鼠血清(见表1中小鼠1-10)再用这10株FCV毒株进行IFA评价，结果见表1。
间接免疫荧光IFA：将10株FCV毒株分别接种培养至单层的FK81细胞，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO2条件下培养24～48小时后，弃上清；用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min后PBS洗涤；在病毒接种孔中分别加入100μl以稀释度1︰25起始的2倍倍比稀释的小鼠血清或杂交瘤细胞的细胞上清原液，同时设置阴性对照，37℃作用40～60分钟；用PBS洗涤；加入1︰500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用40～60分钟；用PBS洗涤；加入50μlPBS后于荧光显微镜下观察。IFA效价判定：对照成立的情况下，以可观察到黄绿色荧光的接毒细胞孔对应的最大稀释度作为抗体的IFA效价。
表1 不同FCV毒株免疫小鼠后血清IFA效价检测
挑选IFA效价最高且与其它9个临床毒株以及从ATCC购买的F9株、2280株(早期毒株)、100869株(现在流行株)均反应的小鼠(编号：8)用相应的免疫原进行四免(0.2ml/只)，免后3天取小鼠脾脏与SP2/0细胞进行细胞融合，按常规方法进行杂交瘤细胞培养，通过多次IFA筛选(FC008株制备的IFA抗原板)和克隆化后，得到5株稳定的单克隆细胞株，分别命名为1E1、1B12、3F9、5D9、5F5。
将5株杂交瘤细胞即1E1、1B12、3F9、5D9、5F5分别于母鼠体内制备腹水，腹水制备过程中发现1株单克隆抗体1E1所对应的母鼠产生腹水较少，1株单克隆抗体1B12产生腹水较快且较少，3株单克隆抗体即3F9、5D9、5F5所产腹水量相当，经多个毒株制备的IFA抗原板进行IFA评价，结果见表2：仅2株单克隆抗体5D9、5F5与FCV多个毒株反应且IFA效价≥1∶1600，表明5D9、5F5与FCV多个毒株(包括早期毒株、现在流行株)均具有良好的反应性。
表2 5株单抗腹水针对不同毒株的IFA效价
故用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体5D9、5F5的腹水，之后用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：单克隆抗体5D9、5F5的纯度均不低于85％；用BCA蛋白定量试剂盒按照说明书分别进行定量分析，结果：单克隆抗体5D9、5F5的浓度分别为4.2、3.8mg/ml。
2.2猫杯状病毒单克隆抗体特性的鉴定
亚型：用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体5D9、5F5的重链亚型分别为IgG2a、IgG2b，轻链亚型均为kappa。
特异性：用IFA评价单克隆抗体5D9、5F5特异性，按照实施例2.1IFA方法，将猫疱疹病毒1型FHV-1、猫泛白细胞减少症病毒FPV病毒液分别培养以制备IFA抗原板，之后进行IFA检测，结果：对照均成立，但FHV-1、FPV反应孔均未观察到黄绿色荧光即均为阴性，表明单克隆抗体5D9、5F5特异性好。
WB试验即Western-Blot试验，按https://www.biomart.cn/experiment/430/465/475/66192.htm所述方法，将FCV FC008株作为抗原、2株单克隆抗体5D9、5F5的1∶100倍稀释液分别作为一抗进行反应，同时设阳性对照，进行WB试验，结果见附图1-图3，2株单克隆抗体与FCV病毒液反应后在约62kD出现条带，初步推断2株单克隆抗体均为针对FCV结构蛋白即Cap蛋白的特异性单克隆抗体，且同样条件下5D9反应条带较粗、5F5反应条带较细。
2.3单克隆抗体5D9、5F5可变区序列的测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-ACTAGTCGACATGAAATGCTCGTGGRTYATSAACTT-3’
P2：5’-ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYAT-3’
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-ACTAGTCGACATGGTYGTYATVTCCTTGCT-3’
P4：5’-ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKW-3’
收集2株杂交瘤细胞，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果：单克隆抗体5D9的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2所示；单克隆抗体5F5的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.4所示。
实施例3试纸条的制备
3.1单克隆抗体的配对
根据实施例2的WB试验结果，进一步用FCV FC008株(106.0TCID50/ml)、FCV 2280株(106.0TCID50/ml)、100869株(106.0TCID50/ml)病毒液、样品稀释液、PCR检测为阴性的眼鼻拭子对单克隆抗体配对试验进行调试，结果见表3：
表3 单克隆抗体搭配结果汇总
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
结果：标记单克隆抗体5D9、固定单克隆抗体5F5后检测FCV 2280株、100869株病毒液为阴性而检测阴性眼鼻拭子为阳性，表明此搭配模式导致存在假阳性、假阴性结果；而标记单克隆抗体5F5和固定单克隆抗体5D9检测FCV不同毒株的病毒液均为阳性，检测样品稀释液、阴性眼鼻拭子均为阴性，因此选择这一搭配模式进行后续研究。
3.2胶体金检测试纸条的制备及检测
3.2.1试纸条的制备及检测
将HAuC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.0ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，继续加热煮沸15min，待颜色逐渐稳定成红色，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积100ml，置于2～8℃保存，用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH至7.4，匀速搅拌30min，将单克隆抗体5F5溶液(终浓度为10-30μg/ml)加于胶体金溶液中，匀速搅拌30min，逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30min后4℃12000r/min离心30min，重悬沉淀即为金标单克隆抗体5F5，重悬后其浓度为60-240μg/ml；用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体5F5包被做成金标垫；将单克隆抗体5D9(包被浓度为0.8-2.0mg/ml)和羊抗鼠二抗(包被浓度为1-3mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线(T)和质控线(C)。将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上，即为猫杯状病毒胶体金检测试纸条。样品处理管内含样品处理液。
检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-4滴混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
3.2.2试纸条中单克隆抗体工作浓度的优化
将金标单克隆抗体5F5按表4的终浓度分别进行标记，将固定单克隆抗体5D9按1.0mg/ml、羊抗鼠二抗按1.0mg/ml进行包被，制备试纸条1A～1G，用FCV FC008株病毒液、阴性眼鼻拭子及阴性血清(均经RT-PCR鉴定)进行评价，结果见表4：金标单克隆抗体5F5的终浓度为5μg/ml或35μg/ml标记时检测FCV病毒液灵敏度为107.0TCID50/ml或106.36TCID50/ml，检测临床样本存在假阳性；而当金标单克隆抗体5F5的终浓度为10～30μg/ml标记时检测FCV病毒液灵敏度为105.76～106.36TCID50/ml，检测临床样本正确。
表4 试剂条中不同金标单克隆抗体浓度优化
将固定单克隆抗体5D9按表5的终浓度分别进行标记，将金标单克隆抗体5F5按20μg/ml标记、羊抗鼠二抗按1.0mg/ml进行包被，制备试纸条2A～2F，用FCV FC008株病毒液、阴性眼鼻拭子及阴性血清(均经RT-PCR鉴定)进行评价，结果见表5：固定单克隆抗体5D9的浓度为0.5mg/ml或2.5mg/ml包被时检测FCV病毒液灵敏度为107.0TCID50/ml或106.36TCID50/ml，检测临床样本存在假阳性；而当固定单克隆抗体5D9的终浓度为0.8～2.0mg/ml包被时检测FCV病毒液灵敏度为105.46～106.36TCID50/ml，检测临床样本正确。
表5 试剂条中不同固定单克隆抗体浓度优化
将羊抗鼠二抗按1.0、2.0、3.0mg/ml进行包被，将金标单克隆抗体5F5按20μg/ml标记、固定单克隆抗体5D9按1.5mg/ml包被，制备试纸条3A～3C，用FCV FC008株病毒液、阴性眼鼻拭子及阴性血清(均经RT-PCR鉴定)进行评价，结果(见表6)：羊抗鼠二抗浓度为1.0、2.0、3.0mg/ml时，质控线显色强度差异不大。
另从成本角度以及检测效果考虑用金标单克隆抗体5F5按20μg/ml标记、固定单克隆抗体5D9按1.5mg/ml包被、羊抗鼠二抗按1.0mg/ml包被用于后续评价。
实施例4试纸条的应用
4.1灵敏度及广谱性
分别用多个FCV毒株的病毒液评价实施例3制备的胶体金检测试纸条的灵敏度，并与商品化上海快灵以及Venture生物公司的猫杯状病毒胶体金检测试纸条按各自说明书检测以进行比较，结果见表6：商品化试纸条检测多个FCV临床毒株均存在漏检现象，而本试纸条检测均为阳性且灵敏度明显较高。
表6 试纸条检测不同FCV毒株的灵敏度
4.2特异性
将实施例3制备的胶体金检测试纸条分别检测FHV-1、FPV病毒液以及猫源其它如猫传染性腹膜炎病毒、猫肠道冠状病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒的阳性病料，结果均为阴性，表明特异性良好。
4.3保存期
分别将试纸条于常温放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，检测结果符合率均为100％，表明试纸条可在常温保存24个月甚至27个月。
4.5临床应用
将收集到的具有临床症状的50份猫眼鼻拭子或咽拭子、20份猫血清、30份唾液，以及无临床症状的50份猫眼鼻拭子或咽拭子、20份猫血清、30份唾液，均用FCV RT-PCR试剂盒进行鉴定，并用本发明试纸条以及商品化上海快灵的、Venture生物公司的猫杯状病毒胶体金检测试纸条按各自说明书进行检测，结果见表7：所有试纸条检测RT-PCR阴性样品均为阴性，特异性良好；但商品化试纸条检测RT-PCR阳性样品阳性符合率为73％、73％，远低于本发明试纸条的结果90％，存在严重的漏检、假阴性现象，从而误导医者或养殖者放松警惕，造成损失。另外，与商品化试纸条相比，本发明试纸条检测无临床症状的猫眼鼻拭子或咽拭子、血清、唾液样品准确率更高，更有利于流行病学调查、健康体检及排查等研究。
表7 临床检测结果比较
注：“+”表示检测结果为阳性所对应的份数，“－”表示检测结果为阴性所对应的份数；阳性符合率、阴性符合率表示与PCR检测结果一致的比率。
综上所述，本发明所制备的试纸条克服了现有技术检测猫杯状病毒灵敏度低、广谱性差等问题，在相当程度上避免了漏检、假阴性现象的发生；解决了现有技术检测多种病料准确率低的技术问题，为该动物健康提供了技术支持，减少了无临床症状的猫作为传染源传播的危险；具有快速、简便、准确、广谱的优势，便于非诊断目的的猫杯状病毒检测中的临床应用，特别是流行病学调查、健康体检及排查等研究。
实施例5基因工程抗体的制备及应用
按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体5D9、5F5的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体5D9的重链可变区和单克隆抗体5F5的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体5F5的重链可变区和单克隆抗体5D9的轻链可变区制备单链抗体4。
按照实施例2所述IFA方法对单链抗体1-4分别进行IFA效价检测，结果见表8：单链抗体1-4对不同FCV毒株的IFA效价均≥1:800，表明单链抗体1-4与不同FCV毒株均具有良好的反应特性。
表8 基因工程抗体的IFA效价检测结果
以上结果显示SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4可用于猫杯状病毒基因工程抗体的制备，可用于不同FCV毒株的反应性评价。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
<120> 猫杯状病毒单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞(hybridoma)
<400> 1
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgcactg tctctggatt ttcattagac ttctatggtg tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatgggctg gtggaatcac agattatcat 180
tcggctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aggatccctc 300
tatcctatgg actcctgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞(hybridoma)
<400> 2
gacatccaga tgattcagtc tccatcgtca atgtttgcct ctctgggaga cagagtcagt 60
ctctcttgtc gggctagtca ggacattaga ggtgatttag actggtatca gcagaaacca 120
ggtggaacta ttaaactcct gatcttctcc acatccaatt taaattctgg tgtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagat tattctctca ccatcgtcag cctagattct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacag cgtaatgcgt atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaggc tggaaattaa acgg 324
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞(hybridoma)
<400> 3
caggtccacc tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcatg attcatcctt ccgatagtga aactaggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcttgg 300
gggctacggt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞(hybridoma)
<400> 4
gacattgtga tgacccagtc tcccaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa cattataaca ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgg 324

Claims (10)

1.一种特异性结合猫杯状病毒的单克隆抗体5D9的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
2.一种特异性结合猫杯状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；其中，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；其中，所述抗体为单克隆抗体5D9。
3.一种杂交瘤细胞5D9株，所述杂交瘤细胞5D9株分泌权利要求2所述单克隆抗体5D9。
4.一种特异性结合猫杯状病毒的单克隆抗体5F5的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
5.一种特异性结合猫杯状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区氨基酸序列为SEQ.ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；其中，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、犬源单克隆抗体或所述抗体的片段；其中，所述抗体为单克隆抗体5F5。
6.一种杂交瘤细胞5F5株，所述杂交瘤细胞5F5株分泌权利要求5所述单克隆抗体5F5。
7.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述单克隆抗体5D9、有效量的金标记权利要求5所述单克隆抗体5F5，以及对猫杯状病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得猫杯状病毒抗原与所述单克隆抗体5F5的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5F5，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5D9，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；
其中，所述有效量的所述单克隆抗体5D9为0.8-2.0mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体5F5胶体金标记时为10-30μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1.0-3.0mg/ml；
优选地，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件相互接触，而不相邻的部件之间不接触；优选地，所述有效量的所述单克隆抗体5D9为1.5mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体5F5胶体金标记时为20μg/ml。
优选地，所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含1％V/V Triton X-100的PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒的检测样品为猫眼鼻拭子或咽拭子、血清、或唾液样品。
9.一种单链抗体，所述单链抗体的重链可变区为SEQ.ID NO.1所示序列编码或为SEQ.ID NO.3所示序列编码，所述单链抗体的轻链可变区为SEQ.ID NO.2所示序列编码或为SEQ.ID NO.4所示序列编码。
10.一种权利要求7或8所述试剂盒在用于非诊断目的的猫杯状病毒检测中的应用，其中，所述非诊断目的的猫杯状病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、健康体检及排查、表位鉴定研究、猫杯状病毒抗原反应性的检测。
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