CN115838417A - 一种抗新冠突变型n蛋白的抗体、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗新冠突变型N蛋白的抗体及其制备方法和用途。本发明制备的抗体对新冠突变型N蛋白具有高特异性、高亲和性、高反应活性，为突变型新冠病毒的检测提供了重要的原料来源。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域。更具体地，涉及一种抗新冠突变型N蛋白的抗体、其制备方法和用途。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科，为不分节段的单股正链RNA病毒。它编码4种结构蛋白(S、E、M和N蛋白)，其中，N蛋白是病毒粒子的核心成分，其蛋白全长419个氨基酸，大小为43-50kDa。N蛋白有三个相对保守的结构域，其中一域可与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。N蛋白是一个磷酸化蛋白，磷酸化能够调节N蛋白的构象，增强与病毒蛋白的构象，增强与病毒RNA的亲和力。在核衣壳包装过程中，N蛋白可与M蛋白相互作用，促进核衣壳包装成病毒粒子。
N蛋白检测呈阳性可作为新冠早期感染的直接证据。然而，新冠病毒N蛋白上出现的各种突变意味着抗原逃逸检测抗体对的几率上升，导致试剂盒面临无法检出突变株病毒的风险。因此，开发一种能够特异性结合突变型N蛋白的单克隆抗体具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在提供一种特异性强、亲和力高、活性高、可稳定保存的抗新冠突变型N蛋白的抗体以解决现有技术中的新冠抗体无法特异性检测出突变型新冠病毒的技术问题。
本发明的目的是提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段含有以下CDRs：
一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含以下CDRs：
重链CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；和
重链CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。
本发明的另一目的是提供所述抗体或抗原结合片段相关的核酸、载体或细胞。
本发明还提供了制备所述抗体或抗原结合片段的方法。
本发明还提供了一种抗体对，以及包含上述抗体或抗原结合片段或所述抗体对在制备突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明涉及一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含以下CDRs：
重链CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；和
重链CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由VH和VL构成)，scFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)或单域抗体(仅由VH组成)。此类片段可通过重组核酸技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在一些实施方式中，所述抗体还包含重链可变区的框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，和轻链可变区的框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其中，所述HFR1-4分别包含SEQ IDNO:7-10所示，LFR1-4分别包含SEQ ID NO:11-14所示，或与各自具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列。
但本领域技术人员可以想到的包括上述CDR区、框架区或可变区的任何氨基酸的替换、插入或缺失也在本发明保护范围内。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；所述轻链可变区由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区；所述重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种的重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链或λ链。
在一些实施方式中，所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中，所述抗体的重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:17组成；所述抗体的轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:18组成。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')2，scFv，Fv，Fd，单链抗体，双价抗体或结构域抗体。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合新冠病毒D377位突变的N蛋白。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合新冠病毒D377Y突变的N蛋白。
本发明还涉及核酸，所述核酸编码所述抗体或抗原结合片段。
核酸通常是RNA或DNA，核酸分子可以是单链或双链的。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时采用DNA核酸。
本发明还涉及载体，所述载体含有所述核酸。
本发明还涉及细胞，所述细胞含有所述核酸或所述载体。
本发明还涉及一种抗体对，所述抗体组合包括抗体1和抗体2，所述抗体1为上述的抗体或抗原结合片段，所述抗体2为结合新冠病毒N蛋白第85-95位氨基酸片段的抗体。
本发明还涉及上述抗体或抗原结合片段或抗体对在制备突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒中的用途。本发明还涉及一种突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含上述的抗体或抗原结合片段或抗体对。
在一些具体的实施方式中，所述突变型新冠病毒检测试剂为免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括硝酸纤维素膜和结合垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述检测线上直接或间接包被抗体1，所述结合垫上标记有抗体2；所述间接包被的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接包被。
在一些具体的实施方式中，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有质控线、检测线，所述样品垫上包被有生物素化的抗体1，所述结合垫上标记有抗体2，所述检测线1上包被亲和素。
在一些具体的实施方式中，所述免疫层析试纸为胶体金免疫层析试纸。
本发明还涉及一种突变型新冠病毒的鉴别方法，所述方法包括使用上述的抗体或抗原结合片段、抗体对或检测试剂或试剂盒。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
以下实施例中，限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
实施例1 Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体的筛选
1、免疫动物
取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的2019-nCoV N蛋白突变抗原(SEQ ID NO:19，以下命名为Dx-nCoVN)与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的Dx-nCoVN与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)，滴度在1∶2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2、饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3、免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4、细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2～5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5、杂交瘤细胞的选择培养
免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经PEG处理后，形成多种细胞成分的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞；骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体，以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的异核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此，在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体，并选择出真正的杂交细胞。因此，在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养。
6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含特异性识别Dx-nCoVN的抗体的培养孔。采用间接ELISA法鉴定细胞培养上清的交叉反应性，用Dx-nCoVN包被96孔板，封闭，加入杂交瘤细胞培养液上清孵育，加羊抗鼠IgG-HRP，测405nm反应值，挑选反应值(0.5以上)比较高的细胞株制备抗体进行下一轮筛选实验。筛选得到Anti-Dx-nCoVN8D2抗体。
实施例2 8D2抗体的检测特异性
将2019-nCoV野生型N蛋白重组抗原以及携带以下位点的突变型N蛋白全长抗原分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释8D2抗体浓度到1ug/ml，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。具体数据如下：
表1
| 抗体编号 | OD值 |
| 野生型N抗原 | 0.0335 |
| D377Y(即Dx-nCoVN抗原) | 2.2832 |
| D63G+R203M+D377Y | 2.2648 |
| R203M+D377Y | 2.4172 |
| P67S+R203M+D377Y | 2.3342 |
| R203K+D377Y | 2.4003 |
| D63G+R203M+G215C+D377Y | 2.0524 |
以上结果表明8D2抗体对野生型抗原反应性较弱，但是对N蛋白携带D377Y位点突变的突变型抗原反应性较强，说明此抗体特异性识别携带该位点突变的突变型抗原。
实施例3 8D2抗体结合片段的鉴定
采用不同片段的Dx-nCoVN抗原分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释8D2抗体浓度到1ug/ml，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。具体数据如下：
表2
| 抗原片段 | 1-43aa | 44-180aa | 181-247aa | 248-364aa | 365-419aa |
| OD值 | 0.0083 | 0.0092 | 0.0101 | 0.0102 | 2.3014 |
以上结果表明，8D2抗体识别仅结合365-419aa，不结合Dx-nCoVN抗原的其他片段。
实施例4 Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体的重组表达
1、表达质粒构建
(1)Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体基因制备
从分泌Anti-Dx-nCoVN 8D2单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链(Heavy Chain)及轻链(Light Chain)基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为366bp；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为339bp，属于VH1基因家族。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出Light Chain基因片段和Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2、稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
将步骤1-(3)步骤制备得到的质粒用超纯水稀释至40μg/100μL，调节CHO细胞1.43×107cells/mL于离心管中，100μL上述质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液(主要成分NaHCO3)稀释Dx-nCoVN抗原(含D337Y突变的N抗原，SEQ ID NO:19所示)进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的羊抗鼠IgG抗体，每孔100uL，37℃，30min；加入显色液A液(50uL/孔，主要成份柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50uL/孔，主要成份柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(EDTA·2Na+浓H2SO4)，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对Dx-nCoVN抗原有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μL、步骤1-(3)步骤制备得到的质粒100μg/管、PvuⅠ酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
步骤2-(2)步骤制备得到的质粒用超纯水稀释至40μg/100μL，调节CHO细胞1.43×107cells/mL于离心管中，100μL上述质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/mL，2.2mL进行批培养，细胞密度0.3×106cells/mL，2mL进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3、重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125mL规格的摇瓶中培养，接种体积为30mL，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/mL接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/mL左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用ProteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取8.6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE。
经上述步骤获得的Anti-Dx-nCoVN 8D2抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。重链可变区、轻链可变区、重链及轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15-18所示。
实施例5突变型新冠病毒的检测
以下实施例中涉及的结合新冠病毒N蛋白的85-95aa的7R1抗体购自菲鹏生物，货号为：8COV19-50。该抗体也可以通过以新冠病毒N蛋白为免疫原免疫筛选得到。
1、7R1抗体标记：取5ml浓度为万分之四的胶体金，加入30-40ul 0.2M K2CO3，搅拌5min，加入7R1标记抗体(所加抗体体积＝50μg/抗体浓度)，搅拌5min，再加入50ul 10％BSA封闭终止标记；离心10000rpm，7min，去上清，沉淀用金子复溶液复溶，最后用金子复溶液定容到0.5ml(即1/10胶体金溶液体积)。
2、配制金子工作液：用金子复溶液将7R1抗体浓缩金以20％的稀释比例配制成金子工作液，铺于玻璃纤维上。
3、制备干燥好的金子：将铺好的金子放入冻干机冻干(1-2h)或者放37℃干燥房干燥过夜。
4、8D2抗体包被：将硝酸纤维素膜与PVC底板组装好备用；将8D2抗体稀释至1.0-1.5mg/ml，用喷金画膜仪在NC膜上均匀地划检测线；
5、制备金标条：用切条机将金标条按需要的宽度切条，组装后加样进行检测。
6、检测：
(1)待测样品：携带以下位点的突变型N蛋白全长抗原，使用PBS稀释到不同浓度进行试验；
(2)检测方法：根据色卡比对，肉眼判读显色读值。
7、结果：
表3-1突变抗原为携带D63G+R203M+D377Y的抗原
表3-2突变抗原为携带P67S+R203M+D377Y的抗原
表3-3突变抗原为携带D377Y的抗原(即Dx-nCoVN抗原)
表3-4突变抗原为携带R203M+D377Y的抗原
表3-5突变抗原为携带的R203K+D377Y抗原
表3-6突变抗原为携带D63G+R203M+G215C+D377Y的抗原
表3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6中，字母C后的数字代表显色，数字越大，显色越弱(活性越低)。
当待测样品中含N蛋白携带D377Y位点突变的突变型抗原时，检测线显色；以下试验当待测样品中不含该类型突变抗原时的情况。
表4-1突变抗原为携带D63G的抗原
表4-2突变抗原为携带R203K+G204R+G212V的抗原
表4-3突变抗原为野生型抗原
表4-1、4-2、4-3中，字母B代表不显色(未检出)，字母C后的数字代表显色，数字越大，显色越弱(活性越低)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 一种抗新冠突变型N蛋白的抗体、其制备方法和用途
<130> 110
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 6
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
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Thr
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
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Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys
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Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
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Leu Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn His Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys
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<220>
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Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
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Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
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Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Arg Ser Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp
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115 120 125
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130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210 215 220
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
260 265 270
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275 280 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
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305 310 315 320
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325 330 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
355 360 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
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Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
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420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 220
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<220>
<223> 人工序列
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
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Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
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165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
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195 200 205
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<220>
<223> 人工序列
<400> 19
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Lys Arg Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
Claims (12)
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含以下CDRs：
重链CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
重链CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包含重链可变区的框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，和轻链可变区的框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述HFR1-4分别包含SEQ ID NO:7-10所示的氨基酸序列，所述LFR1-4分别包含SEQ ID NO:11-14所示的氨基酸序列，或与各自具有90％以上一致性的氨基酸序列。
3.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，抗体或抗原结合片段包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.根据权利要求1至3任一所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区：所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种的重链恒定区；所述轻链恒定区为κ链或λ链；
可选地，所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
5.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，抗体或抗原结合片段包括重链和/或轻链，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.根据权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合新冠病毒D377位突变的N蛋白。
7.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求7所述的核酸。
9.一种制备权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求8所述的细胞。
10.一种抗体对，其特征在于，所述抗体对包括抗体1和抗体2，所述抗体1为权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体2为结合新冠病毒N蛋白第85-95位氨基酸片段的抗体。
11.权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段或权利要求10所述的抗体对在制备突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒中的用途。
12.一种突变型新冠病毒检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1至5任一所述的抗体或抗原结合片段或权利要求10所述的抗体对；
优选地，所述检测试剂为免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括硝酸纤维素膜和结合垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述检测线上直接或间接包被抗体1，所述结合垫上标记有抗体2；
优选地，所述间接包被的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接包被；
优选地，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有质控线、检测线，所述样品垫上包被有生物素化的抗体1，所述结合垫上标记有抗体2，所述检测线1上包被亲和素；
优选地，所述免疫层析试纸为胶体金免疫层析试纸。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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