CN116425870A - 一种抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体31a8及其产品和应用 - Google Patents
一种抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体31a8及其产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体31A8及其产品和应用，属于细胞生物技术、免疫学领域。抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体31A8的轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链可变区的3个互补决定区(LCDR1‑3)的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示，所述重链可变区的HCDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.10～13所示，同时公开了轻链可变区的四个框架区(LFR1‑4)和重链可变区的四个框架区(HFR1‑4)的氨基酸序列。经实验证明，本发明中所提供的单克隆抗体31A8与新型冠状病毒具有较好的结合活性，且特异性强，能够用于临床检测新型冠状病毒SARS‑COV‑2。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，具体涉及一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体(命名为31A8)及其产品和应用。
背景技术
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-COV-2)，属于冠状病毒乙型冠状病毒属、严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种的一个分型，其在复制过程中因不断适应导致了突变的不断发生，进而产生了多种变异株，致使其传播力、致病性和免疫原性均有一定的变化。因此，对新冠病毒的有效快速检测仍然是保护大众健康的有效手段之一。
大众广为熟知的新冠病毒检测方法主要有两种，一种是核酸检测，但因其耗时、耗力，且对操作人员、检测设备、检测环境等均有较高的要求，因此在病毒常规快速检测方面应用受限。另一种是抗原检测，其具有检测速度快、成本低、操作相对简单且可居家自行检测等优点。但是，目前市售抗原检测试剂盒的灵敏度较核酸检测还是略微差了一些。同时，由于新冠病毒不断的突变，因此亟需亲和力更好且广谱性的抗体用于抗原检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体31A8及其产品和应用，以解决现有的抗新型冠状病毒的单克隆抗体存在的N蛋白结合活性较低，亲和力差的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明的第一方面提供了一种抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体31A8，所述单克隆抗体31A8包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1；其中，所述单克隆抗体31A8轻链可变区的3个互补决定区(LCDR1～3)的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示，所述重链可变区的HCDR1～3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.10～12所示。
进一步，所述单克隆抗体31A8轻链可变区框架区LFR1～4具有与SEQ IDNo.4-7所示氨基酸序列至少90％序列一致性，所述重链可变区框架区HFR1～4具有与SEQ ID No.13-16所示氨基酸序列至少90％序列一致性。
进一步，所述单克隆抗体31A8轻链可变区具有与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VL，所述重链可变区具有与SEQ ID No.17所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VH。
进一步，所述单克隆抗体31A8轻链可变区具有与SEQ ID No.9所示的核苷酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VL，所述重链可变区具有与SEQ ID No.18所示的核苷酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的VH。
本发明的第二方面提供了一种新型冠状病毒感染的产品，包括第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段，或编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段的核酸分子、重组表达载体、宿主细胞；其中：
a)核酸分子：所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或者其功能片段；
b)重组表达载体：所述重组表达载体包含a)中所述的核酸分子；
c)宿主细胞：所述宿主细胞包含b)中所述的重组表达载体；
d)药物偶联物，包含本发明第一方面所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或者基于其的功能片段。
进一步，所述重组表达载体具有与抗体可操作地连接的信号肽；
进一步，所述重组表达载体进一步包含转录调控原件。
进一步，所述产品还包括拥有执行抗原-抗体反应的试剂或者拥有检测反应的试剂；
进一步，用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐、稀释液等；
进一步，所述药物偶联物还包含选自下列组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或者酶。
本发明第三方面提供了如下任一项所述的方法：
1)一种制备本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括：培养本发明第二方面所述的宿主细胞，任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长于的培养基中分离所述单克隆抗体；
2)一种检测样品中N蛋白的方法，所述方法包括本发明第一方面所述的单克隆抗体接触待测样本，确定所述待测样本中N蛋白的存在或者水平。
3)进一步，1)中所述方法还包括对所述单克隆抗体进行纯化；
4)进一步，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞；
5)进一步，所述细胞选自293T细胞或者CHO细胞或者Expi293FTM细胞。
本发明的第四方面提供了如下任一项所述的应用：
1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在检测N蛋白中的应用；
2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在制备检测新型冠状病毒感染的产品中的应用；
3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在制备诊断新型冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用；
4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在或者本发明第三方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
进一步，所述产品包括试剂盒。
进一步，所述试剂盒包括：胶体金免疫检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、放射免疫检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒、微流控芯片。
进一步，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
进一步，所述新型冠状病毒感染相关疾病为COVID。
进一步，所述新型冠状病毒感染相关疾病为COVID-19。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，命名为31A8，并明确的给出了其轻链和重链的可变区互补决定区氨基酸序列，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链可变区的3个互补决定区(LCDR1-3)的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示，所述重链可变区的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.10～13所示，同时公开了轻链可变区的四个框架区(LFR1-4)和重链可变区的四个框架区(HFR1-4)的氨基酸序列。经实验证明，本发明中所提供的单克隆抗体31A8与新型冠状病毒具有较好的结合活性，且特异性强，能够用于临床检测新型冠状病毒SARS-COV-2。
附图说明
图1是N蛋白免疫小鼠抗体效价测定结果；
图2是单克隆抗体31A8亚型鉴定结果；
图3是ELISA验证单克隆抗体31A8特异性结果；
图4是ELISA检测单克隆抗体31A8的结合活性图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明中使用的术语“抗体(Antibody)”，又称免疫球蛋白(Immunoglobulins,Ig)，是机体免疫细胞被抗原激活后，B细胞分化成熟为浆细胞后所合成、分泌的一类能够与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，包括能够与靶蛋白的抗原部分结合的全抗体分子及其功能片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、单链抗体或其任何组合。抗体的基本结构是由两条相同的相对分子质量较小的肽链(成为轻链，Light chain，L链)和两条相同的相对分子质量较大的肽链(成为重链，Heavy chain，H链)组成的，L链和H链近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(Variable region，V)，C端氨基酸序列较保守的区域成为恒定区(Constant region，C)。VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，且为抗原结合部位，因此被称为高变区(Hypervariable region，HVR)或互补决定区(Complementarity determining region，CDR)，VL和VH各包括3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR3可变程度更高。V区中非CDR部位的氨基酸组成和排列相对较为保守，称为骨架区(Framework region，FR)，VL和VH各有四个骨架区FR1、FR2、FR3和FR4。
本发明中使用的术语“单特异性抗体”是指对特定靶标(例如表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”，其在本发明中是指单分子组成的抗体或其片段的制备。抗体可以是完整的免疫球蛋白，如IgA、IgG、IgM或其他亚型，也可以是具有全抗体分子的功能片段(如具有生物或者化学功能的化合物)。本发明所使用的抗N蛋白的抗体命名为31A8，31A8可以与具有N蛋白或者新型冠状病毒抗原任何变异株特异性结合。
本发明中使用的术语“抗体片段”、“抗体或其抗原结合片段”、“抗体的抗原活性片段”以及“多个抗体片段”在本发明中可以互换，是指包括抗原结合位点或可变区域的完整抗体的部分。该部分包括完整抗体的Fc区域的恒定区重链结构域(如CH2、CH3或CH4，主要取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双价抗体、单链Fv(ScFv)分子、仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽、包含轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅保留一个重链可变区的单链多肽、以及包含重链可变区的三个CDR的单链多肽。
本发明中使用的术语“新型冠状病毒(Novel coronavirus)”是指单股正链RNA病毒，术语巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科。本发明所述的新型冠状病毒是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-Cov)中的SARS-Cov-2。
本发明中使用的术语“同一性”指与本发明所用氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。应用计算机软件时，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。本发明所提供的如SEQ IDNo.1-8和SEQ ID No.10-17所示的氨基酸序列的功能等价变体，所述变体与SEQ ID No.1-8和SEQ ID No.10-17所示氨基酸序列具有n(n＝1-10)个氨基酸的置换、缺失或添加，或与SEQ ID No.1-8和SEQ ID No.10-17所示氨基酸序列具有至少90％以上序列同一性，均在本发明的保护范围内。
本发明中使用的术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母治理、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或其他载体，如质粒pcDNA、质粒pTT3、质粒pEF、质粒pFUSE等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译调控原件。在本发明的具体实施方式中，使用了pFUSE系列载体。
本发明提供了一种分离的核酸分子，本发明中，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰或者未经修饰的RNA或DAN，各自为单链和/或双联形式的线性或环状，或它们的混合物。因此，本发明的核酸包括DNA(如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA。术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分(如病毒、核酸或蛋白质)。术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物，其已与至少月50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其他材料分离。在一些实施方式中，分离的核酸分子大体上不含任何其他污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其他分子。
本发明提供了一种包含表达载体的宿主细胞，在本发明中，“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”“细胞培养物”和其他表示微生物或作为单细胞实体培养的更高级别真核细胞系可以互换使用，其能够用作或者已经用作重组载体或其他转染的DNA的接受者，并且包括已经转染的原始细胞的原始子代。所述表达载体用于表达本发明所述的针对N蛋白的抗体或本发明所描述的抗体或者其功能片段。本发明中有用的宿主细胞包括但不限于真核宿主细胞。优选的真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞和原生动物宿主细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、Expi293FTM细胞或NIH3T3细胞。优选的真菌宿主细胞包括曲霉菌属、酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。本发明的实施方式中，宿主细胞是Expi293FTM细胞。
本发明中使用的术语“药学上可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用载体的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在用提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的载体可以是具有惰性的填充剂，也可以是为所述的抗N蛋白的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞等任一种组合物提供某种功能(如稳定组合物的整体pH值或者阻止组合物中活性成分的降解)的功效。药学上可接受的载体的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、增强剂、吸附剂、螯合剂、缓冲剂、甜味剂等。
本发明中使用的术语“转化”、“转染”指将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染的方法包括任何将核酸导入宿主细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙沉淀法、聚乙二醇法和阳离子脂质体法。
本发明中使用的术语“治疗”是指在新型冠状病毒感染导致相关疾病之后，是受试者接触(如给药)本发明的抗N蛋白抗体货值抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物等，从而与不接触时相比是该疾病的症状减轻。在其中一个具体实施例中，新型冠状病毒感染相关疾病为COVID-19。
本发明中使用的术语“生物受试者”、“受试者”、“个体”在本发明中可以互换使用，指动物受试者，特别是脊椎动物受试者，优选哺乳动物受试者。在本发明范围内的合适的脊椎动物受试者包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长目动物(如人、猿、猴、黑猩猩)、啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(如家兔、野兔)、绵羊类动物(如绵羊)。优选的受试者是灵长目动物(如人、猿、猴、黑猩猩)和啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)。
以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的受试者样本的N蛋白，以降低测定的复杂性和成本。可实验本发明所述的能够检测样本新型冠状病毒N蛋白的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中抗体至一定的程度，如浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒包括胶体金免疫检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、放射免疫检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒、微流控芯片。需要致敏的是本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者的样品进行检测，也包括对环境中的环境样本包括但不限于水样品、食物样品、空气样品、动物细胞样品、土壤样品和工业样品等多种样品的非诊断目的的检测。
本发明中使用的术语“样本”以其最广泛的意义使用。在某种情况下，样本包括细胞、有机体，以及生物和环境样品。其中，生物样品可从动物(包括人)获得并且旨在其中发现的生物材料或组合物，包括但不限于骨髓、尿液、脑脊液、核酸、血液、血清、组织以及其纯化或过滤形式；环境样品包括但不限于水样品、食物样品、空气样品、动物细胞样品、土壤样品和工业样品。
下面结合附图和实施例对本发明的做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1、新型冠状病毒N蛋白制备
合成SARS-COV-2病毒N蛋白的基因序列至PUC载体上，再将目的基因克隆至pET-32a载体中。提取质粒，双酶切鉴定，同时测序比对结果。将构建好的原核表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆接种于LB培养基中，37℃摇菌至OD值为0.5～1，加入IPTG后16℃过夜诱导表达。收集菌体，超声破碎离心后收集上清。用Ni柱亲和层析纯化后的蛋白经透析、浓缩，得到高浓度的SARS-COV-2N蛋白。
2、杂交瘤细胞的获得
步骤一、N蛋白免疫小鼠
5-8周龄雌性Balb/c小鼠共3只；适应饲养一周后，进行第一次免疫，将50μg N蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合，完全乳化后皮下4点注射；三周后进行第二次免疫，将50μg N蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合，完全乳化后皮下4点注射；三周后进行第三次免疫，取50μg N蛋白与适量生理盐水混合后腹腔注射。
步骤二、ELISA检测免疫小鼠抗体产生情况
第三次免疫后三周，采集鼠尾血，离心收集血清，ELISA检测免疫小鼠抗体产生情况。具体步骤为：N蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入稀释液按一定比例梯度稀释后的血清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，室温(RT)孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。结果见图1，相对于没有免疫的正常小鼠，3只免疫小鼠抗体效价均达到1:102.4万以上，该结果说明3只免疫小鼠均可用于后续实验。
步骤三、细胞融合
骨髓瘤细胞SP2/0复苏后，用20％胎牛血清适应饲养一周。取2号免疫鼠，融合3天前取50μg N蛋白与适量生理盐水混合后腹腔注射，完成加强免疫。融合当天，处死小鼠后无菌取脾，研磨后用无血清培养基洗涤2次后，与SP2/0细胞按10:1比例混合，1200rpm离心10min,弃上清，轻弹离心管底部，使细胞沉淀松动。30s内缓慢加入预温至37℃的45％ PEG溶液1mL。室温静置90s后缓慢加入预热至37℃的不完全培养基，其中，第1分钟滴入1mL，第2分钟加入2mL，第3分钟滴入3mL，第4分钟加入4mL，直至加完25mL，之后混匀后，800rpm离心6min，弃上清。加入预热至37℃的完全培养基40mL，混匀后加入已经接种了腹腔巨噬细胞的96孔细胞培养板中，并于37℃、5％ CO2培养箱中培养。融合后第2-7天隔天补加HAT和HT进行融合细胞的筛选。
步骤四、ELISA检测阳性杂交瘤细胞及杂交瘤细胞的克隆化
融合后7-10天，观察杂交瘤细胞生长情况，待孔内细胞超过1/3孔底时，可进行杂交瘤抗体分泌情况的检测。检测步骤为：N蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％ BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入杂交瘤细胞上清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，RT孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。选取OD值高的克隆进行亚克隆并在7-10后再次进行ELISA筛选。克隆化3次后，最终筛选出1个阳性克隆细胞，命名为31A8。
3、单克隆抗体亚型鉴定
N蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％ BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入杂交瘤细胞上清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入HRP标记的兔抗鼠二抗(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、kappa)，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，RT孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。实验结果如图2所示，31A8IgG1和kappa OD值远高于阴性对照。因此，31A8单克隆抗体重链为IgG型，轻链为kappa型。
4、单克隆抗体31A8序列测定
提取杂交瘤细胞总RNA，反转录得到cDNA；用5'RACE法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；将扩增出的片段亚克隆到pEASY-Blunt载体，提取质粒后测序；后的抗体轻重链序列结果(SEQ ID No.8-9和17-18)，并使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列的CDR区。
31A8抗体轻链可变区(VL)基因序列(SEQ ID No.9)：
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTTCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGCTACACATTTTCTTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA
31A8抗体轻链可变区(VL)氨基酸序列(SEQ ID No.8)：
MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQATHFLQTFGGGTKVEIK
31A8抗体重链可变区(VH)基因序列(SEQ ID No.18)：
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACCAAATACACCATGCACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTAATAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAAGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACGCCGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
31A8抗体重链可变区(VH)氨基酸序列(SEQ ID No.17)：
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFT KYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGNSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAY MELRSLTSEDSAVYYCATPDYWGQGTTLTVSS。
5、ELISA验证单克隆抗体31A8的特异性
构建MERS-N蛋白表达载体并转化BL-21(DE3)感受态细胞，摇菌，IPTG诱导表达；收集菌体，超声破碎后离心，收集上清，通过Ni柱亲和层析；对层析得到的蛋白进行透析、浓缩，测定蛋白浓度。
N蛋白、MERS-N蛋白和BSA分别包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％ BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入杂交瘤细胞31A8上清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，RT孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。
实验结果如下表1和图3所示：
表1ELISA验证单克隆抗体31A8的特异性
可以看出，单克隆抗体31A8可以特异性的识别SARS-COV-2病毒N蛋白。
6、重组31A8单克隆抗体及其作用效果
步骤一、抗体表达载体构建
将测序确定的抗体重链、轻链可变区分别克隆至抗体表达载体pFUSE-CHIg-mG1、pFUSE2-CLIg-mk上，分别标记为31A8mG1、31A8mk。酶切鉴定后送测序。大量提取测序正确的质粒，用于细胞转染制备重组抗体。
步骤二、ELISA验证重组31A8的作用效果
将构建好的重组抗体表达质粒31A8mG1、31A8mk、31A8mG1+31A8mk、mG1+mk(空载体对照)分别转染培养至转染密度的Expi293FTM细胞中培养72h。N蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％ BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入上述转染的细胞上清，100μL/孔，杂交瘤细胞上清作为阳性对照，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，RT孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。实验结果(表2)表明：单独转染31A8抗体重链31A8mG1或者轻链31A8mk，不能识别N蛋白；共同转染重链、轻链重组表达质粒31A8mG1和31A8mk，可以检测到显著的信号。这充分说明31A8单克隆抗体在Expi293FTM细胞成功重组表达，并且分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别N蛋白，具有生物学活性。
表2ELISA验证重组31A8单克隆抗体作用效果
步骤三、ELISA检测重组单克隆抗体31A8结合活性
将构建好的重组抗体表达质粒31A8mG1+31A8mk转染Expi293FTM细胞中培养72h后，收集上清，利用protein A亲和层析方法，纯化获得重组单克隆抗体31A8，并测定浓度。N蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；3％ BSA满孔37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入梯度稀释后的重组31A8，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育40min；PBST洗涤3次，每次2min，拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，RT孵育10min后，终止液终止，于酶标仪上测定吸光值，其中，测定波长为450nm，参比波长为630nm。实验结果(图4)表明：重组单克隆抗体31A8能够很好的结合N蛋白，且呈现浓度依赖性，EC50为0.007μg/mL。
综上，本发明中所提供的单克隆抗体31A8与新型冠状病毒具有较好的结合活性，且特异性强，能够用于临床检测新型冠状病毒SARS-COV-2。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1；其中：
轻链可变区的3个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示；
重链可变区的3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示；
该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15及SEQ ID No.16所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区具有与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性；该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区具有与SEQ ID No.17所示的氨基酸序列至少90％序列一致性。
4.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区具有与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列95％的序列一致性；该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区具有与SEQ ID No.17所示的氨基酸序列95％的序列一致性。
5.根据权利要求1或2所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，编码该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的核酸具有与SEQ ID No.9所示的核苷酸序列至少90％序列一致性；编码该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区的核酸具有与SEQ ID No.18所示的核苷酸序列至少90％序列一致性。
6.根据权利要求5所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，编码该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的核酸具有与SEQ ID No.9所示的核苷酸序列95％序列一致性；编码该抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区的核酸具有与SEQID No.18所示的核苷酸序列95％序列一致性。
7.一种检测新型冠状病毒感染的产品，其特征在于，包括：
a)核酸分子，该核酸分子编码权利要求1～6中任意一项所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或者基于其的功能片段；
b)重组表达载体，该重组表达载体包含a)所述的核酸分子；
c)宿主细胞，该宿主细胞包含b)所述的重组表达载体；
d)药物偶联物，包含权利要求1～6中任意一项所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或者基于其的功能片段；
e)组合物，包括上述a)、b)、c)、d)中至少两种。
8.权利要求1～6中任意一项所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备检测新型冠状病毒感染的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂、试剂盒或检测试纸。
9.权利要求1～6中任意一项所述的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体及权利要求7所述的检测新型冠状病毒感染的产品在制备诊断与新型冠状病毒感染相关的疾病的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括诊断试剂、试剂盒或诊断试纸。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：胶体金免疫检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、放射免疫检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒和微流控芯片。
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