CN116813774B - 一种抗人cd47蛋白的抗体、核酸分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用，涉及CD47抗体制备技术领域。提供的抗人CD47蛋白的抗体具有与天然抗原(CD47)蛋白较高的亲和力，为鼠源性单克隆抗体，能特异性识别人类细胞系MD‑MB‑231(乳腺癌细胞)及Jurkat等细胞中表达的CD47蛋白。因此，可以用于开发以人CD47蛋白为诊断标志物的检测或诊断试剂、试剂盒。抗CD47的抗体一定浓度下不引起人红细胞凝集。可以用于进一步的人源化改造，从而靶向给药。此外，本发明提供的抗CD47的抗体能够有效抑制白血病细胞、乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖，具有良好的肿瘤抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及CD47抗体制备技术领域，具体而言，涉及一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用。
背景技术
肿瘤是全球第二大导致人类死亡的病因。无论在发达国家还是在发展中国家，肿瘤导致的癌症都是死亡率最高的疾病，并且其死亡率和发病率仍不断增高。全球癌症疾病报告显示：过去十年里，全球癌症发病率升高了33％。仅2015年，就有1520万人被诊断为癌症，并有880万人因此死亡；发展中国家的癌症死亡率高于发达国家，患病人数占到全球的57％，死亡人数高达全球的65％，因此抗肿瘤药物市场的潜力十分巨大。
几乎所有肿瘤细胞都具有通过提高自身CD47蛋白表达，不但使其周围多种免疫细胞正常免疫杀伤功能受到抑制，而且表现出促进肿瘤组织扩增和转移的特性，这种特性能够导致患者病情进一步恶化。相关研究表明，阻断肿瘤细胞CD47相关的信号通路，能够解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，从而激活肿瘤微环境中免疫细胞，尤其是巨噬细胞的杀伤功能，杀伤肿瘤细胞；活化的巨噬细胞通过吞噬靶细胞，发挥其抗原提呈的功能，特异性的活化T细胞，通过活化的T细胞发挥的细胞毒作用，进一步杀伤肿瘤细胞。
利用抗体结合细胞表面蛋白靶点治疗多种肿瘤和类风湿等免疫疾病已取得显著的效果；截至目前，经FDA批准上市的相关药物已超过60种。相关研究已经证明，利用抗CD47单克隆抗体，在体内特异性结合肿瘤细胞表面高表达的CD47蛋白，能够有效解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的抗人CD47的抗体，为肿瘤治疗提供更多的抗体选择。该抗体能特异性识别人类分化抗原47(CD47)，能够作为免疫活化物刺激机体的免疫反应，能够抑制肿瘤细胞的增殖，有可能产生抗肿瘤等疾病的效果。通过进行人源化表达抗体，可以用于靶向治疗。在低浓度时，红细胞完全不凝集。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区：
重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1-3所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
轻链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4-6所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
本发明提供的抗人CD47蛋白的抗体具有与天然抗原(CD47)蛋白较高的亲和力，为鼠源性单克隆抗体，能特异性识别人类细胞系MD-MB-231(乳腺癌细胞)及Jurkat等细胞中表达的CD47蛋白。因此，可以用于开发以人CD47蛋白为诊断标志物的检测或诊断试剂、试剂盒。抗CD47的抗体一定浓度下不引起人红细胞凝集。可以用于进一步的人源化改造，从而靶向给药。此外，本发明提供的抗CD47的抗体对于Jurkat细胞(急性T细胞白血病细胞系)具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。因此，本发明提供的抗体能够有效抑制白血病细胞、乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖，具有良好的肿瘤抑制活性。且抗体来源明确，成分确定，可重复性高，具有良好的应用前景。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；重链可变区的结构为：FR1-H-CDR-H1-FR2-H-CDR-H2-FR3-H2-CDR-H3-FR4-H4。
在一种可选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。轻链可变区的结构为：FR1-L-CDR-L1-FR2-L-CDR-L2-FR3-L2-CDR-L3-FR4-L4。
人源化后的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；人源化后的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.11：
VQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVRQAPG QGLEWIGRIVPGSGSTSYNEMFKRRVTMTVDTSTSTAYMELNSLR SEDTAVYYCARGELRREFAYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO.12：
DIELTQSPASLSASPGERATITCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQ APKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSVEPEDFATYYC QQYSGNHYTFGGGTKVEIK。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗原结合片段选自抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种；
在一种可选的实施方式中，抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；
在一种可选的实施方式中，抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
将获得单克隆细胞株测序，获得抗人CD47单克隆抗体的可变区基因序列，利用可变区序列，通过改造进行人源化表达，利用毕赤酵母的得到人源化CD47-zh3抗体。经检测，本发明提供的抗体来源明确，成分确定，可重复性高，能够进行靶向用药。
第二方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤检测或诊断试剂或试剂盒中的应用，肿瘤的诊断标志物为人CD47蛋白。
本发明提供的抗体与CD47蛋白具有较高的亲和力，能够特异性结合人CD47蛋白，因此可以用于制备肿瘤检测或诊断试剂或试剂盒中的应用。
第三方面，本发明还提供了抗体或其抗原结合片段在制备治疗由人CD47蛋白介导的相关疾病的药物或在制备CAR-T细胞中的应用。
本发明提供的抗体对于Jurkat细胞(急性T细胞白血病细胞系)以及乳腺癌细胞具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。因此，本发明提供的抗体能够有效抑制白血病细胞、乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖，具有良好的肿瘤抑制活性。可以用于治疗多种人CD47蛋白介导的相关疾病。
在一种可选的实施方式中，由人CD47蛋白介导的相关疾病选自肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，肿瘤选自上皮性肿瘤和血液系统肿瘤中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、乳腺癌、腺瘤和鳞癌中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，血液系统肿瘤选自白血病、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，CAR-T细胞用于治疗肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病中的至少一种疾病。CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠直肠癌和肛门癌。
在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。
在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。
在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺导管癌、乳腺上皮癌或乳腺小叶癌。乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。
卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。
子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。
膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。
肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。
鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌(例如食管鳞癌)、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。
口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)又称口腔鳞癌。口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。
在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。
第四方面，本发明还提供了含有上述的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
免疫偶联缀合物例如选自抗体-药物缀合物，将抗体与具有特定接头的药物进行反应制得相应的抗体-药物缀合物。本领域的技术人员可以根据工程化抗体使得抗体上的某个位点作为药物缀合位点，这均在本发明的保护范围内。
在一种可选的实施方式中，免疫缀合物还包括治疗剂；
在一种可选的实施方式中，治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
免疫检查点相关制剂包括不限于：抑制性第二信号分子的抗体、PD-L1抑制剂、PD-1/PD-L1单抗药物。抑制性第二信号分子可以是PD-1；CTLA-4；PD-1和CTLA-4。
免疫检查点抑制剂治疗的相关生物标志物包括PD-L1、MSI/bMSI、TMB/bTMB、TNB及EGFR突变、ALK融合、TP53突变、KRAS突变。
在其他实施方式中，还可以是上述免疫偶联缀合物的药用盐。
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物，达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用(例如，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤效果)。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收，增强稳定性或靶向性，延长半衰期，进而更好的发挥本发明的生物功效。
在一种可选的实施方式中，药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
本发明的优选技术方案中，上述载体为药学上可接受的载体。
双特异性分子例如选自双特异性抗体。
嵌和抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
第五方面，本发明还提供了一种检测试剂或试剂盒，试剂盒含有上述的抗体或其抗原结合片段。
在一种可选的实施方式中，抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
第六方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的抗体或其抗原结合片段。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
第七方面，本发明还提供了一种重组细胞，其含有重组载体，重组载体含有上述的核酸分子。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
在一种可选的实施方式中，宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
在一种可选的实施方式中，真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。假丝酵母例如选自白色假丝酵母或光滑假丝酵母。
第八方面，本发明还提供了一种制备上述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养上述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到抗体或其抗原结合片段。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的抗人CD47蛋白的抗体具有与天然抗原(CD47)蛋白较高的亲和力，为鼠源性单克隆抗体，能特异性识别人类细胞系MD-MB-231(乳腺癌细胞)及Jurkat等细胞中表达的CD47蛋白。因此，可以用于开发以人CD47蛋白为诊断标志物的检测或诊断试剂、试剂盒。抗CD47的抗体一定浓度下不引起人红细胞凝集。可以用于进一步的人源化改造，从而靶向给药。此外，本发明提供的抗CD47的抗体对于Jurkat细胞(急性T细胞白血病细胞系)具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。因此，本发明提供的抗体能够有效抑制白血病细胞、乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖，具有良好的肿瘤抑制活性。且抗体来源明确，成分确定，可重复性高，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为天然蛋白的结合鉴定实验结果图；
图2为红细胞凝集实验结果图；
图3为CD47抑制Jurkat细胞增殖实验结果图；
图4为分泌表达目标蛋白小试的SDS-PAGE图、WB图和浓缩后的SDS-PAGE图；
图5为人源化CD47-zh3抗体与天然蛋白的结合鉴定实验结果图；
图6为人源化抗体CD47-zh3抑制Jurkat细胞增殖的实验结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
抗体的获得：通过融合杂交瘤技术获得特异性抗CD47的小鼠单克隆抗体。
1.1动物免疫：
根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为本公司表达的重组人CD47带his标签的蛋白。同时以它作为血清效价和杂交瘤筛选用的检测抗原。取适量重组蛋白经PBS稀释后与福氏佐剂等体积混合，电动搅拌器充分乳化后使抗原形成稳定油包水的溶液，而后取6-8周龄balb/c小鼠，背部皮下多点注射免疫。加强免疫后7-10天进行小鼠效价检测，选择效价高的免疫小鼠进行腹腔注射冲击免疫，冲击免三天后进行细胞融合。
1.2杂交瘤融合和筛选：
细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,扩增至一定数量，调整细胞至对数生长期。处死免疫小鼠，无菌环境取脾，根据文献中的方法使用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞。融合后的细胞铺96孔细胞培养板，根据细胞生长情况，7～10天对融合板进行全量换液，全量换液后1～2天，取各孔上清，用ELISA方法进行检测。方法如下：抗原用CBS稀释至1ug/ml，加入ELISA板条，100ul/孔，4℃过夜。弃去包被液，加入3％的脱脂奶粉-PBS，200ul/孔，置37℃2小时。融合板克隆上清依次加入包被好的ELISA板中，然后置37℃中孵育1.5小时。弃去板孔中溶液，ELISA洗液洗涤三次。加入1:7500稀释的羊抗鼠IgG-HRP，100ul/孔，37℃中孵育1小时。弃去板孔中溶液，ELISA洗液洗涤三次。加入ELISA显色液，100ul/孔，37℃中孵育10min。加入ELISA终止液，50ul/孔，酶标仪读取OD值。
ELISA阳性的克隆，继续取上清进行流式检测。方法如下：取培养好的MDA-MB-231细胞，消化离心后调整细胞浓度至1×106个/ml，100ul/孔加入96孔板中。设置阴性对照，阳性对照，然后依次加入阳性克隆上清，100ul/孔，室温反应1小时。1200rpm离心5分钟，去上清，用3％FBS-PBS洗2次。加入1:500羊抗鼠IgG-CY3,100ul/孔,室温避光反应1小时。1200rpm离心5分钟，去上清，用3％FBS-PBS洗2次，最后一次加200ul 3％FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。流式检测阳性的克隆，采用有限稀释法进行克隆化，筛选出单克隆。再经过连续两次流式检测阳性的单克隆即可建株并扩培保种。通过这种方法发明人得到了1株流式阳性的单克隆细胞株8A4。
实施例2
本实施例提供了抗体的亲和力检测以及与天然蛋白的结合鉴定实验。
(1)亲和力检测
将CD47抗原按照3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L包板；调整抗体浓度至10- 7mol/L水平，然后倍比稀释1:2～1:256，加至不同抗原包被量的孔中；加入二抗，TMB显色，检测450nm吸光值。根据抗原抗体结合S曲线，求出不同抗原浓度下，半数吸光值的抗体浓度。半数吸光值的抗体浓度可通过IGOR软件计算获得。这样就有四个抗体浓度(mol/L)，AB1，AB2，AB3，AB4。代入公式K＝(N-1)/(N*AB’-AB)计算亲和力常数。AB’代表抗原浓度为AG’时，产生半数吸光值的抗体浓度。N＝AG/AG’(AG>AG’)。当N＝2时，可以得到3个K值；当N＝4时，可以得到2个K值；当N＝8时，可以得到1个K值。求出次6个K值的平均值即为最终结果。
根据ELISA检测结果计算出各抗原包被浓度下的半数吸光浓度的抗体浓度，结果如下：
| 抗原包被浓度 | CD47-8A4抗体半数吸光浓度(*109mol/L) |
| 3ug/ml | 1.7158 |
| 1.5ug/ml | 2.7297 |
| 0.75ug/ml | 2.3269 |
| 0.3725ug/ml | 2.0057 |
绘制抗体浓度的对数与OD450曲线图(X轴表示抗体浓度的对数，Y轴表示OD450)，根据下表的数据可知抗体亲和力常数为K＝4.85×108L/mol。
(2)天然蛋白的结合鉴定实验
通过流式细胞术测定CD47抗体与表达CD47的细胞系MDA-MB-231。实验方法：将收集上述细胞离心去上清，稀释至1×106个/ml,100ul/孔加入96孔板中，即1×105个细胞/孔。抗CD47抗体稀释至10ug/ml,按100ul/孔加入到上述细胞中，室温孵育60min。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次。加入1:500稀释的羊抗鼠IgG-CY3，100ul/孔，室温孵育1小时。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次，最后一次加200ul10％FBS-PBS重悬细胞。空白对照用10％FBS-PBS代替。使用流式细胞仪上机检测。
结果参照图1所示，H12对应阴性对照，C6对应8A4细胞株。结果显示：与MDA-MB-231结合时，空白对照平均荧光强度(MFI)281，检测抗体平均荧光强度(MFI)178029。表明本发明提供的抗体能够与细胞系MDA-MB-231表达的CD47特异性结合，信号高，能够用于开发相应的检测试剂盒，用于CD47蛋白的检出。
实施例3红细胞凝集实验
将实施例1中的待检抗体按100ug/ml浓度，倍比稀释，加入96孔U型板中，100ul/孔。新鲜人全血用生理盐水稀释5倍，混匀后加入上述U型96孔板中，20ul/孔。室温反应1小时后观察结果。结果判定：
++++:100％红细胞凝集,凝集颗粒均匀地分布在整个孔底，呈薄状。
+++:75％红细胞凝集,孔底红细胞呈滴状，凝集边缘不整齐。
++:50％红细胞凝集,孔底形成环状,周围有凝集颗粒,但不成膜状。
+:25％红细胞凝集,孔底形成-一个小团，但小团边缘不整齐,周围有少量凝集。
-:红细胞完全不凝集,红细胞在孔底形成小团，小团边缘整齐,周围无凝集颗粒。
结果如图2所示，从左到右的抗体浓度分别为0.05ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.39ug/ml、0.78ug/ml、1.56ug/ml、3.123ug/ml、6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。结果判定：
| 抗体浓度 | 100ug/ml | 50ug/ml | 25ug/ml | 12.5ug/ml | 6.25ug/ml | 3.123ug/ml |
| 结果判定 | + | + | + | + | + | + |
| 抗体浓度 | 1.56ug/ml | 0.78ug/ml | 0.39ug/ml | 0.2ug/ml | 0.1ug/ml | 0.05ug/ml |
| 结果判定 | + | + | + | - | - | - |
结果显示，抗CD47-8A4在浓度在100ug/ml时仍为一个“+”，低于0.2ug/ml时红细胞完全不凝集。
实施例4
CD47抑制Jurkat细胞增殖实验。
实验方法：Jurkat细胞以8×103个/孔的密度种植于96孔板，每孔加入100μl含10％FBS的1640培养基。37℃5％CO2培养过夜，分别用终浓度为25、50、100μg/ml的CD47-8A4抗体处理细胞，抗体用10％FBS的1640培养基稀释，每孔加入100μl。空白对照(Control)仅加入等量培养基。分别于加入抗体后第24、48加入20μl/孔的CCK8工作液，培养箱中孵育3h后检测450nm处吸光值。
结果参照图3所示，*：P<0.05**:P<0.01***:P<0.001。结果显示：CD47-8A4抗体处理对Jurkat细胞具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。抗体处理24小时后，浓度在25ug/ml有抑制作用；抗体处理48小时后，浓度在100ug/ml有显著性抑制作用。
实施例5
通过DNA克隆和测序，获得抗人CD47单克隆抗体的可变区基因序列。
使用Trizol试剂提取杂交瘤细胞株中的总RNA。收集在9cm皿中培养的细胞到15ml离心管中，离心去上清。加入1ml的Trizol试剂并将细胞吹打均匀使细胞裂解，将裂解后样品转至1.5ml离心管室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm4℃离心10min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000rpm4℃离心10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm4℃离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50ulRNase-freeddH2O。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
选用AMV第一链cDNA合成试剂盒把总RNA逆转录为cDNA。实验体系配制如下，6ul的总RNA+1ul Oligo dT+4ul RNase-free水(共11ul)。轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5min预变性后，冰浴30s，然后离心3-5s，接着冰浴2min。在冰浴状态下加入4ul的5◇缓冲液+1ul的dNTP混合物+1ul的RNase抑制剂+1ul逆转录酶(总共20ul体系)，轻轻混匀后离心3-5s，在PCR仪上42℃50分钟，85℃5min，完成cDNA合成。随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5`端区域。
轻链与重链的PCR扩增。对于扩增抗体轻链可变区序列，配置PCR反应体系：2×Taq酶缓冲液25ul+FP-VL 1ul+RP-VL 1ul+cDNA 2ul+ddH2O 21ul。对于扩增抗体重链可变区序列，配置PCR反应体系：2×Taq酶缓冲液25ul+FP-VH 1ul+RP-VH 1ul+cDNA 2ul+ddH2O21ul。重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复35个循环)：
步骤1-预变性94℃，4min；
步骤2-变性94℃，30sec；
步骤3-退火55℃，45sec；
步骤4-延伸72℃，60sec；
步骤5-72℃，10min；
步骤6-保存4℃。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约为375bp，VL的约为325bp)，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA提取。简述如下：从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；加入胶块重量3-6倍的buffer B2,50℃水浴5-10分钟溶胶；将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒；倒掉收集管中的液体；柱中加入500ulwash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体；再重复加wash solution一次，倒掉液体；孔吸附柱于9000g离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40ul Elution Buffer,室温静置1分钟后，离心1分钟。获得制备的DNA溶液，纯化PCR产物经过测序获得抗体的可变区序列。测序结果见下表(单克隆细胞株8A4分泌的鼠抗人CD47单克隆抗体的VH和VL的氨基酸序列)：
实施例6
本实施例进行人源化抗体CD47-zh3的获得。获得抗人CD47单克隆抗体的可变区基因序列，人源化后重构到毕赤酵母表达载体pPIC9k内，通过电转仪导入酵母菌GS115内，经过甲醇诱导表达3天，得到重组CD47-zh3抗体。
设计人源化CD47抗体表达，轻重链通过linker序列(GGGGSGGGGSGGGGS)链接，N端有flag和his标签。
人源化抗体序列：
DIELTQSPASLSASPGERATITCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSVEPEDFATYYCQQYSGNHYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWIGRIVPGSGSTSYNEMFKRRVTMTVDTSTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARGELRREFAYWGQGTLVTVSS DYKDDDDKHHHHHH。
(1)质粒构建
扩增并抽提含有目的基因的载体质粒；亚克隆到真核表达载体pPIC9k中；
测序验证构建质粒的准确性；通过质粒提取试剂盒获得含有目的基因的重组质粒。
(2)电转化与PCR验证
线性化：pPIC9k质粒经过Sal1酶过夜酶切后回收，电泳检测线性化和未线性化质粒；电转化：制备GS115酵母感受态细胞，将线性化质粒经1500V电压刺激后电转化至感受态细胞中，涂布在含有0.5、1.0和1.5mg/mL的G418抗生素的MD固体平板上，培养2-3d；菌液PCR：挑选若干个单菌落于YPD液体培养基中过夜培养，取菌液用酵母的通用引物AOX-1进行PCR验证，其中以线性化的重组质粒为阳性对照。
(3)分泌表达小试
接菌：根据PCR胶图选择需要表达小试的菌株，将上步YPD培养基中的菌株接种于BMGY培养基中。诱导：离心上步中的BMGY培养物，弃上清，更换成BMMY培养基，每12h加入0.5％的甲醇进行诱导表达，72h后收菌；检测：摇瓶发酵结束后取样进行SDS-PAGE、WB验证。
(4)分泌表达大摇
活化菌种：接种表达活性良好的阳性菌株200μL于50mL YPD液体培养基进行过夜培养；扩大培养：接种上步活化的菌液20mL于1L BMGY培养基中，待菌液OD600为2-3后5000rpm、30min离心，弃上清；诱导表达：更换1L BMMY培养基，每12h加入0.5％的甲醇进行诱导表达，72h后收菌，5000rpm、30min离心，保留上清；透析交换：将上步中的上清液转移至14K的透析袋中，用pH为7.4的Tris-Hcl在4℃中透析过夜；柱料结合：取1/4柱体积的新填料，用2个柱体积的1*PBS平衡柱子，平衡好的柱料与透析过后的蛋白上清液混合均匀，14℃、150rpm孵育2h。蛋白洗脱：将上步中的混合液逐渐加入到结合住中，待上清完全流出后加入1个柱体积的1*PBS平衡柱子，依次用含有20mM、50mM和500mM咪唑的1*Tris-HCl各50mL洗脱目的蛋白，浓缩跑SDS-PAGE胶检测。
结果参照图4所示，图4中的Marker所指示的条带对应的蛋白分子量从下至上依次为：10,15,25,35,45,60,75,100,140,180kDa。1-6：单克隆菌株进行小试表达SDS图片，“对照”为跑胶对照实验；阳性：WB阳性对照。
由图可知，浓缩获得了目标大小的目的蛋白。
实施例7
人源化CD47-zh3抗体与天然蛋白的结合鉴定。
将实施例6获得的人源化CD47-zh3抗体与天然抗原结合，通过流式细胞术测定人源化CD47-zh3抗体与表达CD47的细胞系Jurkat的结合。实验方法：将收集上述细胞离心去上清，稀释至1×106个/ml,100ul/孔加入96孔板中，即1×105个细胞/孔。抗CD47抗体稀释至3ug/ml,按100ul/孔加入到上述细胞中，室温孵育60min。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次。加入1:500稀释的羊抗鼠IgG-CY3，100ul/孔，室温孵育1小时。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次，最后一次加200ul10％FBS-PBS重悬细胞。空白对照用10％FBS-PBS代替。使用流式细胞仪上机检测。
结果参照图5，结果显示：与Jurkat结合时，空白对照平均荧光强度(MFI)411，人源化CD47-zh3抗体荧光强度(MFI)11244；Q其中1为空白对照，6为人源化CD47-zh3抗体3ug/ml。
实施例8
人源化抗体CD47-zh3抑制Jurkat细胞增殖。
实验方法：Jurkat细胞以5×103个/孔的密度种植于96孔板，每孔加入100μl含10％FBS的1640培养基。37℃5％CO2培养过夜，分别用终浓度为5、10、50、100ug/ul的人源化抗体CD47-ZH3抗体处理细胞，抗体用10％FBS的1640培养基稀释，每孔加入100μl。空白对照(Control)仅加入等量培养基。分别于加入抗体后24h和48h加入20μl/孔的CCK8工作液，培养箱中孵育3h后检测450nm处吸光值。
结果参照图6所示，ns:无显著性差异；*：P<0.05***:P<0.001。结果显示：人源化抗体CD47-ZH3抗体处理对Jurkat细胞具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。抗体处理24小时后，抗体浓度在100ug/ml时对于Jurkat细胞有抑制作用；抗体处理48小时后，抗体浓度在50ug/ml时对于Jurkat细胞有显著性抑制作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (19)
1.一种抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区：
所述重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1-3所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述轻链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4-6所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求2所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
6.根据权利要求5所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
7. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。
9.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
11.如权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤检测或诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述肿瘤的诊断标志物为人CD47蛋白。
12.如权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗由人CD47蛋白介导的相关疾病的药物或在制备CAR-T细胞中的应用；其特征在于，所述由人CD47蛋白介导的相关疾病选自上皮性肿瘤和血液系统肿瘤中的一种或多种；所述上皮性肿瘤选自乳头状瘤、腺癌、腺瘤和鳞癌中的至少一种；所述血液系统肿瘤选自白血病、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤中的至少一种；所述CAR-T细胞用于治疗上皮性肿瘤和血液系统肿瘤中的至少一种疾病。
13.如权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗由人CD47蛋白介导的相关上皮性肿瘤的药物或在制备CAR-T细胞中的应用；其特征在于，所述上皮性肿瘤选自胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌和乳腺癌中的至少一种；
所述CAR-T细胞用于治疗所述上皮性肿瘤。
14.含有权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
15.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的检测试剂或试剂盒，其特征在于，抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
17.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
18.一种重组细胞，其特征在于，其含有重组载体，所述重组载体含有权利要求17所述的核酸分子。
19.一种制备如权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求18所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其抗原结合片段。
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