KR102191896B1 - 구제역 바이러스 혈청형 o 진천주의 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구제역바이러스 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능을 보유하고 있는 단일클론항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 O 항체 탐지용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구제역바이러스 혈청형 O에 대한 항체측정을 통하여 구제역 백신접종 후 항체역가 측정을 통해 백신 접종여부를 확인하여, 구제역 예방 및 확산을 최소화 하기 위한 방역 조치에 일조할 수 있을 것으로 사료된다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 O (진천주)에 대한 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 O에 대한 항체 탐지 방법 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 O 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV)는 Picornaviridae, aphthovirus에 속하는 RNA 바이러스로써 7종의 혈청형(O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3)과 70여종의 아형 바이러스가 분포하고 있다. FMDV에 감염된 개체(예를 들어, 우제류 등)는 혀, 점막, 발굽 사이에 수포 및 가피를 형성하며 이병율이 높아 OIE에서 List A질병으로 분류하고 있고, 국내에서도 제 1종 법정 전염병으로 분류하고 있다.
국내에서는 2000년 이후 9차에 걸쳐 구제역이 발생하여 막대한 경제적 피해(예를 들어, 2010년 안동에서 발생된 경우 직접적 피해규모 약 3조원 추정)가 초래되었으며, 가장 최근에는 2014년 12월부터 2015년 4월까지 7개 시도에서 약 185건, 2016년도 전북과 충남에서 1월 내지 3월 사이 21건의 구제역이 발생된 바 있다.
2010년도에 구제역 백신 정책이 실시된 이후로 구제역 백신에 사용되는 백신주는 국내 상황에 적합하도록 다양하게 선발되고 있으며, 2016년 하반기에 O-Campos 주 (아르헨티나)와 O-Primorsky주 (러시아)가 도입되었다.
백신 접종국의 경우, 백신기반 구제역 콘트롤 프로그램에 있어서 감수성 동물(소, 돼지)에 대한 백신항체 수준 평가가 매우 중요한 항목 중 하나이다.
OIE 매뉴얼에 따르면, 구제역 구조단백질(백신항체)항체 진단법으로 바이러스 중화시험법(VNT, Virus Neutralization Test, 표준진단법)와 액상차단효소면역법(LPBE) 등이 등재되어 있으나 중화시험법은 구제역바이러스 배양을 위한 BL-3등급 시설에서만 실험진행이 가능하며, 액상차단효소면역법은 불활화된 구제역 바이러스와 다클론항체를 이용한 방법으로써 실험실간 표준화가 어렵고 제한적이기 때문에 일반 실험실에서의 항체가 측정이 어렵다.
현재 국내에서는 구제역 백신주의 다변화(O campos, O primoskyi)에 따른 백신별 항체수준을 검사할 수 있는 항체진단키트로써 O1 manisa 주 기반의 다국적 기업 제품(Prionics사, FMDV O SP Ab ELISA) 1종류만 사용하고 있다. 따라서 다변화된 구제역 백신바이러스에 따른 지역형(topotype)별 항체가를 측정하는데는 한계가 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 현재 국내에서 백신평가 시 중화시험에 사용하는 국내분리주 (진천주)를 중화시킬 수 있는 단클론항체를 개발하였으며, 이를 이용한 효소면역측정법(ELISA,Enymne Linked Immunosorbent Assay) 등 구제역바이러스에 대한 항체 진단키트에 적용하여, 다변화된 국내 백신 상황에 적합한 항체 역가 측정이 가능해 질 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 중화능 보유 항체 또는 그의 항원 결합단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 O 에 대한 항체를 탐지할 수 있는 면역진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 O 에 대한 목적동물에서의 항체를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 그 용도에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
구제역 바이러스는 피코르나바이러스과 아프터바이러스(Aphthovirus)속에 속하며, 여과성 병원체로서 처음 발견된 동물바이러스로서 소 등 우제류 동물에 감염된다. 바이러스의 입자는 직경이 22 내지 28nm이고, 외피(envelope)가 없이 4종류의 구성 단백질 60분자로 구성된 캡시드(Capsid)단백질이 5′말단에 VPg 단백질이 공유 결합된 외가닥의 (+)RNA를 둘러싸고 있다.
구제역바이러스는 7종의 혈청형인 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 구성되며, 혈청형 간 상호 방어 면역이 형성되지 않는다. 다시 말해서, 감수성 동물에 구제역바이러스 혈청형 O에 대한 백신을 접종하여 적정한 방어 면역이 형성되었더라도 다른 구제역바이러스 혈청형 Asia1 바이러스가 침입하게 되면 방어되지 못하고 구제역이 발생하게 된다.
또한, 혈청형이 달라서 발생하는 상기 상황뿐만 아니라 같은 혈청형 내에서도 지역형(topotype)에 따라 백신에 의한 방어면역이 충분히 형성되지 않아 지역형에 의한 감염이 유발 될 수 있다. 일예로 국내에서는 구제역 바이러스 혈청형 O 중 O1 manisa 주기반의 백신을 접종하였으나, O1 manisa주와 혈청형은 동일하나 진천에서 구제역이 발생된 경우를 들 수 있다. 이는 혈청형이 동일 하더라고 지역형에 따라 충분한 백신 방어가 형성되지 못할 수 있는 것으로써 백신주 다양화의 중요한 이유가 된다.
실제로 국내에서는 구제역 혈청형 O를 방어하기 위한 백신으로써, O1 manisa주만 사용하지 않고 O1 manisa주와 3039 주가 혼합된 혼합백신을 사용하고 있으며, 최근에는 Primorsky주와 Campos주 기반의 구제역 혈청형 O에 대한 백신을 사용하고 있다.
따라서 다양한 구제역 백신주의 상용화에 따라 해당 백신의 항체 역가를 잘 표현해줄 수 있는 항체진단법의 개발 및 상용화가 필요한 실정이다.
특히 Primorsky주 기반의 백신이 접종 된 동물의 경우 중화항체역가 상 양성으로 표현되었으나 현재 상용화되어있는 다국적기업 제품(ELISA)에서는 음성으로 표현되는 위음성의 결과가 초래되고 있다.
본 발명에서는 Primorsky 주 기반의 백신 접종 후 항체역가를 정확하게 측정할 수 있는 진단키트 개발 및 국내 야외 발생주인 진천주의 감염에 의한 항체역가를 정확하게 측정할 수 있는 진단키트 개발을 위해서, Primorsky주와 항원적 동등성이 유사한 진천주(백신접종 후 항혈청의 바이러스 중화시험 시 이용되는 FMDV 혈청형 O형 이며 국내 야외 발생주임)를 중화시킬 수 있는 단클론항체를 개발하여 액상차단 효소면역측정법(LPBE, Liquid Phase Blocking ELISA)에 적용하였다.
본 발명의 일 예는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O 진천주에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나눠지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(u), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "단일클론항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18683P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 불활화된 FMDV 혈청형 O(진천주, 면역원)을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 구제역 바이러스 혈청형 O 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다.
상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2 내지 5주마다 2 내지 6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3 내지 5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다.
상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B세포와 골수종세포를 1:1 내지 10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000 내지 6,000의 PEG를 10 내지 80%의 농도로 첨가하여, 30 내지 37℃에서 1 내지 10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 FMDV 혈청형 O (진천주) 에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다.
최종적으로, FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
한편, 상기 단일클론항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 타입일 수 있으며, 예를 들어, IgG2b 타입일 수 있다.
또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "항체(antibody)"는 특정 항원의 특이 아미노산 서열을 특이적으로 인지하는 당단백질로써, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항체는 단일클론항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)일 수 있다. 비-인간, 예를 들어, 마우스의 인간화 항체는 마우스의 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린의 쇄 또는 그의 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 서브서열일 수 있다.
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 필수적으로 설치류 동물의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체에 상응하는 서열 대신 치환시켜 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메릭 항체이며, 실질적으로 온전한 인간 항체의 가변 영역보다 적은 영역이 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(framework, FR) 잔기가 설치류 동물의 항체에 있는 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간화 항체일 수 있다.
상기 인간 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변영역의 서열이 인간으로부터 유래한 항체를 의미하며, 인간 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업자에게 널리 알려진 다양한 기술, 예를 들어, 유전적 재조합 기술과 세포공학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
용어 "키메릭"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2 개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, FMDV 혈청형 O (진천주)를 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 FMDV 혈청형 O, A, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 에 모두 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 통해, 인터넷 상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 양태로서 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 양태로서 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 FMDV 혈청형 O 형 진천주에 중화능 보유 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다.
상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한, 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산서열로 이루어진 경쇄 가변영역인 것일 수 있으며, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역인 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transfomation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
즉, 상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.
상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
상기 하이프리도마 세포는 수탁번호 KCTC 18683P인 것인 하이브리도마 세포일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 한국생명공학연구원 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2018년 05월 02일자로 수탁번호 KCTC 18683P 로 기탁하였다.
한편 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다. 즉, 기탁물들은 기탁 시료 관리를 위한 가장 최근의 요청 이후 적어도 5년의 기간 동안, 어떤 경우에는 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안 또는 그 기탁물의 개시를 공표하는 어느 특허의 강제 가능한 시기 동안, 그 기탁물의 생존을 유지하고 오염되지 않도록 모든 주의를 다하여 보관한다.
기탁자에게는 기탁물의 상태 때문에 요청 시 수탁기관이 시료를 분양할 수 없을 경우에는 그 기탁물을 대체해야 하는 의무가 있다. 대상이 되는 기탁물에 대한 일반인의 입수 가능성을 제한하는 모든 제약들은 그 기탁물을 개시하고 있는 특허가 허여되면 완전히 없어지게 된다.
상기 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는 96웰 플레이트와 효소결합제(conjugate)를 포함하는 FMDV 혈청형 O에 대한 항체를 탐지할 수 있는 효소면역측정법에 관한 것이다.
상기 96well plate는 FMDV 혈청형 O에 특이적으로 결합하거나 FMDV 혈청형에 상관없이 모두 결합하는 단일클론항체가 고정되어있고 그 항체 위에 구제역바이러스 혈청형 O (진천주)에서 유래된 유전자로부터 발현된 재조합단백질(예를 들어, 베큘로바이러스 발현시스템을 통해 발현된 P1-3C)이 비공유결합으로 결합된 것일 수 있다.
상기 효소결합제(conjugate)는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체와 효소가 공유결합 된 것일 수 있다.
상기 단일클론항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18683P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체인 것일 수 있다.
본 발명에서 구제역 바이러스 항체 진단에 사용하고 있는 효소면역측정법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 특이항체 위에 항원이 코팅되어있는 96웰 플레이트와 효소가 결합되어있는 특이항체(conjugate)를 이용하여 다수의 검체로 부터 검사하고자 하는 항체를 감지할 수 있는 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 키트는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단클론 항체를 이용하여 구제역바이러스에 감염된 동물 개체에서 유래한 다양한 시료에서 FMDV 혈청형 O (진천주) 및 그 유사주에 대한 항체를 더욱 정확하게 진단할 수 있게 한다.
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 바이러스에 대한 항체 탐지용 조성물 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 항체 탐지용 키트에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리도마 배양액 스크리닝을 위한 효소면역측정법의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 O (진천주)의 P1, 3C 유전자 증폭결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 FMDV 혈청형 O (진천주)의 P13C 재조합단백질의 발현확인 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법 원리를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법의 반응 최적화 시험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법과 타사 (다국적기업, A 사) 제품의 성능 (민감도, 특이도)비교 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 O (진천주)의 P1, 3C 유전자 증폭결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 FMDV 혈청형 O (진천주)의 P13C 재조합단백질의 발현확인 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법 원리를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법의 반응 최적화 시험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법과 타사 (다국적기업, A 사) 제품의 성능 (민감도, 특이도)비교 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 하이브리도마의 제작 및 단일클론항체 중화능 평가
1-1. 면역원 준비
FMDV 혈청형 O (진천주)(농림축산검역본부, 대한민국)를 BHK21 세포(ATCC, CCL-10)에 접종 후 37℃에서 24시간 배양을 통해 증폭된 FMDV 혈청형 O (진천주)를 수거하였다. 그 다음, 바이너리 에칠렌이민(Binary Ethylenimine; BEI)을 0.003 N 농도로 처리하고 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 불활화시켰다. 그 다음, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 0.002 N을 첨가하여 중화시켰다. 불활화 배양 상층액에 PEG 6000(Poly Ethylene Glycol; PEG)과 염화나트륨(sodium chloride; NaCl)을 각각 7.5%, 2.3% 첨가하고 24시간 동안 4℃에서 교반 배양(stirring incubation)하였다. PEG 6000 처리 상층액은 11,000 RPM에서 20분간 원심 분리한 후 펠릿을 TN 버퍼(pH 7.6)로 다시 풀어주었다. 11,000 RPM에서 20분간 다시 원심 분리하여 상층액을 설탕 밀도 기울기 원심 분리법(sucrose density gradient centrifugation)으로 초원심 분리(30,000 rpm, 4시간)하여 순도 높은 FMDV 혈청형 O (진천주) 분획을 수득하였다.
1-2. 면역화
1-1에서 수득한 불활화된 FMDV O형 진천주를 이용하여 실험동물(balb/c mouse)에 면역(immunization)을 실시하였다. 구체적으로, 항원으로서 불활화 FMDV O (진천주)를 0.25 mg/ml 농도로 200 ul 준비하고 Freund's Adjuvant(FA) 200 ul와 혼합하여 마우스(㈜오리엔트바이오) 복강에 2주 간격으로 1 내지 3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 불활화 FMDV O (진천주) 100ul를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하였다.
1-3. 세포융합 및 하이브리도마 제조
면역화된 마우스 몸통 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 부유시켰다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지 DMEM과 혼합하여 비장세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 상기 현탁액을 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 비장세포와 골수세포주(SP2/0 Ag14 (ATCC, USA))를 1:5의 세포 수 비율로 혼합한 후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 침전시킨 후 상층액은 제거하였다. 원심 분리된 세포를 천천히 분산시킨 후, 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG1500, Roche) 1.0 ml을 처리하고, 37℃에서 1분 동안 유지시킨 후 DMEM 1ml을 첨가하였다. 그 다음, DMEM 10 ml을 1분 동안 서서히 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 반응시킨 후 50.0 ml로 맞추고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 세포침전물을 분리배지(HAT배지)에 1 X 105 내지 2 X 105 cells/ml 농도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 0.1 ml씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포를 제조하였다.
1- 4. 하이브리도마 세포의 선별
상기 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 FMDV 혈청형 O (진천주)에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 도 1과 같이 ELISA 분석 방법을 사용하였다.
구체적으로, 목적하는 불활화 FMDV 혈청형 O (진천주)를 96웰 마이크로플레이트의 한 웰당 각각 100 ul(0.5 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 그 다음, 0.1% casein-PBS 블록킹 용액을 웰 당 100ul씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응 후 인산 완충용액-트윈20(0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하, PBS-T)로 3회 세척하였다.
그 다음, 하이브리도마 세포의 배양액을 각 웰에 100 ul씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제(Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 목적으로 하는 FMDV 혈청형 O (진천주)에 반응성이 높은 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주를 제한 희석하여 클로닝을 진행하여 단일클론화 하였고, 이후 위와 같은 방법으로 목적 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 위와 같은 방법으로 불활화 FMDV 혈청형 O (진천주)에 특이적으로 반응하는 7종의 단일클론항체가 선발되었으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| No | Clone name | Isotype |
| 1 | 5H40 | IgG2a |
| 2 | 6H32 | IgG2a |
| 3 | 8B87 | IgG2b |
| 4 | 9G72 | IgG2b |
| 5 | 10E44 | IgG2a |
| 6 | 11D14 | IgG2a |
| 7 | 11H89 | IgG2b |
1-5. 복수제작 및 정제
FMDV 혈청형 O (진천주)에 반응하는 7종 하이브리도마를 이용하여 생산된 복수(ascitic fluids)를 0.45um 여과 후 프로테인 G 컬럼 (GE, Sweden)에 바인딩시켰으며, 용출 버퍼(100mM glycin HClr, pH 2.8)를 이용하여 단일클론항체 만 용출한 후 투석(MWCO 12,000~14,000)를 통해 PBS(pH 7.0)로 버퍼 교환하였다. 정제된 단일클론항체는 -70℃ 에 보관하였다.
1-6. FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단클론항체 선별
FMDV 혈청형 O (진천주)에 대한 중화능 보유 단클론항체를 선별하기 위하여 FMDV 혈청형 O (진천주)를 이용한 바이러스중화시험(VNT, Virus Neutralization Test)을 수행하였다.
중화시험방법은 OIE매뉴얼의 방법을 사용하였다. 검사혈청은 56℃, 30분간 불활화하였다. 그 다음, 가검혈청을 연속적으로 2진 희석을 실시하였다. 그 다음, 구제역 바이러스를 100TCID50 농도로 분주하였다. 그 다음, 37℃ CO2 incybator(습상으로)에서 1시간 반응시켰다. BHK-21세포를 10% FBS가 첨가된 배양액에 부유하여 웰 당 50 ul씩 분주하였다. 37℃ CO2 배양기(습상)에서 48시간에서 72시간 배양한 다음, CPE를 관찰 한 후 기록하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 형태적으로 음성 대조군과 비교하여 세포변성이 나타나지 않는 웰의 최고 혈청 희석배수의 역수를 중화항체가로 표시하였다.
| No. | Clone Name | ELISA screening plate (O.D 450nm) |
VNT titer |
| 1 | 5H40 | 2.39 | <8 |
| 2 | 6H32 | 1.57 | <8 |
| 3 | 8B87 | 2.23 | 64 |
| 4 | 9G72 | 1.82 | <8 |
| 5 | 10E44 | 1.78 | 32 |
| 6 | 11D14 | 1.55 | <8 |
| 7 | 11H89 | 0.32 | 22 |
실시예 2. FMDV 혈청형 O (진천주) 유전자 기반 재조합 구조단백질 제작
FMDV 혈청형 O (진천주) P1 과 3C 유전자를 베큘로바이러스 발현시스템(baculovirus expression system) 통해서 발현시켰다.
2-1. FMDV 혈청형 O (진천주) P13C 재조합 단백질 제작
FMDV O형 진천주를 BHK21 세포에 접종 후 37도에서 24시간 배양을 통해 증폭된 FMDV O형 진천주를 수거하여 상용화된 RNA Preparation 키트 (RN EASY Mini kit(Quigen cat. no. 74104))의 용법에 따라 viral RNA를 분리하였다. FMDV O형 진천주 구조단백질(SP, Structural Protein) P1과 비구조단백질 프로테아제의 일종인 3C의 cDNA 확보 및 증폭을 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭을 위한 PCR 반응은 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix (바이오니아, cat. no. K-2631-CFG)를 사용하여 50ul 반응액에서 이루어졌다.
P1유전자 증폭을 위한 PCR은, 한 사이클을 변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1분) 및 익스텐션 (72℃, 2분)으로 구성하여 총 35 사이클을 실행하였으며, 마지막 단계에서 72℃ 에서 10분 동안 유지하였다. 3C 유전자 증폭을 위한 PCR은 한 사이클을 변성 (94℃, 30초), 어닐링 (55℃, 30초) 및 익스텐션 (72℃, 1분)으로 구성하여 총 35 사이클을 실행하였으며, 마지막 단계에서 72℃ 에서 10분 동안 유지하였다. FMDV O형 진천주 P1, 3C 유전자 증폭 결과는 도 2에 나타내었다.
PCR을 이용하여 증폭된 각 DNA 단편은 제한효소처리 후 p10 프로모터와 폴리헤드린(polyhedron) 프로모터를 가지고 있는 배큘로바이러스 발현 벡터인 pFastBac dual로 삽입하여 재조합 플라스미드를 획득하였다.
획득된 P13C 플라스미드로부터 Bacmid DNA를 제작하기 위해 DH10bac(Invitrogen) 이라는 E. coli를 이용하여 형질전환(Transformation)을 실시하였다. 제작한 pFastBacDual 벡터에서 Tn7R 부분부터 Tn7L 부분까지 전위(transposition)에 의해 bacmid에 유전자가 전달되게 된다. 이렇게 재조합된 P13C bacmid DNA를 추출한 후, PCR을 통해 유전자 삽입을 확인하여, 표 3에 나타내었다.
2-2. 곤충세포(sf9 세포)에서의 단백질 발현 확인
PCR 결과가 확인된 재조합 P13C BacmidDNA를 곤충 세포(insect cell)인 Sf9 세포에 Cellfectin II 시약을 이용하여 감염 시킨 후 27℃에서 CPE(Cytopathic effect)를 관찰하여 배양한다. 재조합 P13C 배큘로바이러스가 만들어지면 계대배양을 통해 시드를 확보 하였고 BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(Takara, cat. no. 631404)를 이용하여 플라크를 관찰하여 Baculovirus 역가를 측정하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 재조합 P13C의 발현확인은 SDS-PAGE와 FMDV O VP1 특이 단클론항체를 이용한 웨스턴블랏(Western blot)으로 진행하였다.
| 서열 번호 |
명명 | 서열 | 비고 |
| 17 | P1 | GGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCTACCGGATCACAGAACCAGTCAGGCAACACCGGGAGTATCATCAACAATTACTACATGCAGCAGTATCAGAACTCCATGGACACCCAACTTGGTGACAATGCTATCAGCGGAGGCTCCAACGAGGGATCCACAGACACAACTTCCACCCACACAACCAACACCCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGCTCTGCCTTCAGCGGTCTTTTCGGCGCCCTCCTCGCCGATAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAAGATCGCATCCTCACCACCCGAAACGGACACACCACCTCGACAACCCAGTCGAGTGTTGGCATAACGCACGGGTACGCAACGGCTGAGGATTTTGTGAGCGGGCCGAACACCTCTGGTCTTGAGACCAGAGTCATCCAAGCGGAGCGGTTCTTCAAAACCCACCTGTTCGACTGGGTCACCAGTGATCCGTTTGGACGGTGTTACTTGTTGGAGCTCCCGACTGATCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACCGACTCATACGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTTACCGCTGTGGGGAATCAGTTCAACGGAGGCTGCCTACTAGTGGCCATGGTGCCTGAACTTTGTTCCATCGGGCAGAGAGAGCTGTTCCAGCTTACACTCTTCCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACAGCCCACATCAAGGTGCCCTTTGTTGGCGTCAACCGTTACGATCAGTACAAGGTACACAAGCCGTGGACCCTCGTGGTTATGGTCGTGGCCCCACTGACTGTCAACACCGAAGGCGCTCCGCAGATCAAGGTGTACGCCAACATCGCACCCACCAACGTGCACGTCGCGGGTGAGTTCCCTTCCAAAGAGGGGATTTTCCCTGTGGCCTGTAGCGACGGCTATGGCGGCTTGGTGACAACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGTTTACGGCAAAGTTTTCAACCCCCCCCGCAACATGTTGCCAGGGCGGTTCACCAACCTCCTGGACGTGGCTGAGGCTTGTCCCACGTTTCTGCACTTCGATGGCGGCGTGCCGTACGTGACCACGAAGACGGACTCGGACAGGGTGCTCACACAATTTGACTTGTCTTTGGCGGCAAAACACATGTCAAACACCTTCCTTGCAGGTCTTGCCCAGTACTACACGCAGTACAGCGGCACCATCAACCTGCACTTCATGTTCACAGGCCCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATGATTGCGTATGCCCCTCCGGGCATGGAACCGCCCAAAACACCTGAGGCTGCTGCTCATTGCATTCACGCAGAGTGGGACACGGGTCTGAACTCAAAGTTTACCTTTTCCATCCCTTACCTCTCGGCGGCTGATTATGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCTGAGACCACAAATGTTCAGGGGTGGGTCTGCTTGTTTCAAATAACGCACGGGAAAGCTGAAGGCGACGCTCTTGTCGTGCTGGCCAGTGCTGGCAAGGACTTTGAGCTGCGCCTGCCTGTGGACGCTCGGCAACAGACCACTTCGACAGGCGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACCGTTGAGAACTACGGTGGCGAGACACAGATCCAGAGGCGCCACCACACAGACGTCTCGTTCATACTGGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACTCAACAAATGTACTGGACCTGATGCAGACCCCCCCCCACACTCTAGTAGGGGCGCTCCTCCGCGCTGCCACTTACTATTTCGCTGACCTAGAGGTGGCAGTGAAACACGAGGGGGACCTTACCTGGGTGCCAAACGGAGCACCTGAAGCAGCCTTGGACAACACCACCAACCCAACGGCGTACCATAAGGCGCCGCTTACCCGGCTTGCATTGCCCTACACGGCACCACACCGTGTTTTGGCCACCGTTTACAACGGGAACTGCAAATACACCGGGGGCTCACTGCCCAACGTGAGAGGCGATCTCCAAGTGCTGGCACCGAAAGCGGCGAGGCCATTGCCCACTTCTTTCAACTACGGTGCTATCAAAGCCACTCGGGTAACAGAACTGCTGTACCGCATGAAGAGGGCCGAGACGTACTGCCCTCGGCCCCTCTTGGCTGTCCACCCGAGTGCGGCTAGACACAAACAGAAAATAGTGGCACCTGTAAAGCAG | |
| 18 | 3C | AGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACGGTGGCCATCTGTTGCGCCACCGGAGTGTTTGGTACTGCTTACCTTGTCCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAAGGACAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTCATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAAGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGCGTGGTCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATTGTAGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGGGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAATGGGGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCACACATCGATCCCGAACCACACCACGAG |
실시예 3. 단클론항체 8B87을 이용한 구제역바이러스 항체진단용 효소면역측정법 반응 최적화
2-1. 96 웰 플레이트 에 구제역 재조합 항원 부동화(immobilization)
11C41 단클론항체를 96웰 마이크로플레이트의 한 웰 당 각각 100 ul씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 단클론항체는 인산 완충용액-트윈20(0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)으로 세척하여 제거하였다. 3% BSA-PBS blocking 용액을 웰 당 200ul씩 분주한 후 상온에서 2 시간 동안 반응 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 구제역 재조합 항원(원액~10배 희석항원)을 웰 당 100ul씩 분주한 후 37도에서 1시간동안 반응 후, 반응하지 않은 항원은 PBS-T로 세척하였다.
2-2. 효소-단일클론항체 8B87 conjugate 제조
상용화 HRP 컨쥬게이션 키트 (Roche, cat. no. 11 829 696 001)를 이용하여 사용자 메뉴엘에 따라 HRP 커플링을 수행하였다.
2-3. 검체 희석버퍼 (specimen dilution buffer)
혈청을 희석하기 위한 검체 희석버퍼는 PBS-T를 사용하였다.
2-4. 효소면역측정법 반응 최적화 시험
구제역 재조합 항원이 원액~10배희석농도로 코팅되어있는 96웰 마이크로플레이트에 구제역 바이러스 백신접종된 돼지 항혈청(Cal-1 ~ Cal-6) 20 uL와 검체 희석버퍼 80 uL를 섞어 각 웰에 100 ul씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 항혈청을 제거하였다. 여기에 효소-단일클론항체 8B87 컨쥬게이트를 다양한 농도(0.1ug/ml ~ 1ug/ml)로 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후, 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 측정하여, 그 결과를 도 5 및 표 4에 나타내었다.
| Anti-FMDV mAb (11C41) coating plate | ||||||||||||||||||
| 8B8-HRP | 1 ug/ml | 0.5 ug/ml | 0.1 ug/ml | |||||||||||||||
| P13C 발현용액 | 원액 | 2배 희석 |
10배 희석 | 원액 | 2배 희석 |
10배 희석 | 원액 | 2배 희석 |
10배 희석 | |||||||||
| OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | OD | S/N | |
| Cal-1 | 0.56 | 0.31 | 0.49 | 0.32 | 0.15 | 0.42 | 0.39 | 0.25 | 0.40 | 0.31 | 0.11 | 0.35 | 0.19 | 0.14 | 0.20 | 0.19 | 0.08 | 0.31 |
| Cal-2 | 0.78 | 0.43 | 0.62 | 0.40 | 0.15 | 0.44 | 0.54 | 0.35 | 0.52 | 0.40 | 0.12 | 0.38 | 0.28 | 0.21 | 0.28 | 0.26 | 0.09 | 0.35 |
| Cal-3 | 1.09 | 0.60 | 0.84 | 0.55 | 0.19 | 0.53 | 0.73 | 0.47 | 0.69 | 0.53 | 0.17 | 0.50 | 0.43 | 0.33 | 0.43 | 0.40 | 0.12 | 0.46 |
| Cal-4 | 1.29 | 0.71 | 1.15 | 0.75 | 0.24 | 0.69 | 1.04 | 0.67 | 1.04 | 0.81 | 0.22 | 0.66 | 0.60 | 0.46 | 0.60 | 0.56 | 0.15 | 0.60 |
| Cal-5 | 1.55 | 0.85 | 1.35 | 0.88 | 0.30 | 0.85 | 1.29 | 0.84 | 1.16 | 0.91 | 0.24 | 0.74 | 0.76 | 0.58 | 0.75 | 0.70 | 0.18 | 0.70 |
| Cal-6 | 1.77 | 0.97 | 1.33 | 0.87 | 0.29 | 0.84 | 1.43 | 0.92 | 1.18 | 0.92 | 0.26 | 0.79 | 0.93 | 0.71 | 0.92 | 0.86 | 0.21 | 0.81 |
| Cal-7 | 1.50 | 0.82 | 1.32 | 0.86 | 0.29 | 0.84 | 1.26 | 0.81 | 1.18 | 0.92 | 0.20 | 0.60 | 0.85 | 0.65 | 0.87 | 0.82 | 0.20 | 0.81 |
| Cal-8 | 0.57 | 0.31 | 0.58 | 0.38 | 0.11 | 0.32 | 0.46 | 0.30 | 0.48 | 0.37 | 0.08 | 0.25 | 0.61 | 0.47 | 0.79 | 0.74 | 0.14 | 0.56 |
| Negative Control | 0.73 | 0.40 | 0.65 | 0.42 | 0.27 | 0.78 | 0.47 | 0.30 | 0.42 | 0.33 | 0.17 | 0.52 | 0.21 | 0.16 | 0.19 | 0.18 | 0.09 | 0.36 |
* S/N = Sample O.D / Negative control O.D
도 5 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 항원의 코팅 농도는 원액, 효소-단일클론항체 8B87 컨쥬게이트의 농도는 0.1ug/ml로 결정하였다.
실시예 3. 민감도 및 특이도 평가
3-1. 효소면역측정법 민감도 및 특이도 평가 시험
구제역 재조합 항원이 원액으로 코팅되어있는 96웰 마이크로플레이트에 구제역 백신(동방 사; Type O Primorsky strain) 접종된 돼지 항혈청과 구제역 비발생지역의 돼지 항혈청 (특이성 검증용 시료; N1 내지 N24) 각 20 ul과 검체 희석버퍼 80 ul를 섞어 각 웰에 100 ul을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 다음, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 검체를 제거하였다. 여기에 효소-단일클론항체 8B87 컨쥬게이트를 0.1ug/ml 농도로 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후, 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 측정하여, 그 결과를 도 6 및 표 5에 나타내었다.
| 검체 | VNT titer | 8B87 Kit | 다국적회사 kit | |||
| S/N | 판정 | S/N | 판정 | |||
| Primorsky strain 기반 백신 접종 돼지혈청 (항체양성) |
Primorsky 1 | >256 | 0.27 | 양성 | 0.37 | 양성 |
| Primorsky 2 | 181 | 0.51 | 양성 | 0.56 | 음성 | |
| Primorsky 3 | 181 | 0.21 | 양성 | 0.36 | 양성 | |
| Primorsky 4 | >256 | 0.35 | 양성 | 0.50 | 양성 | |
| Primorsky 5 | >256 | 0.08 | 양성 | 0.15 | 양성 | |
| Primorsky 6 | 90 | 0.53 | 양성 | 0.69 | 음성 | |
| Primorsky 7 | >256 | 0.11 | 양성 | 0.25 | 양성 | |
| Primorsky 8 | 90 | 0.44 | 양성 | 0.63 | 음성 | |
| Primorsky 9 | >256 | 0.27 | 양성 | 0.51 | 음성 | |
| Primorsky 10 | >256 | 0.10 | 양성 | 0.14 | 양성 | |
| Primorsky 11 | 90 | 0.39 | 양성 | 0.50 | 양성 | |
| Primorsky 12 | 90 | 0.32 | 양성 | 0.71 | 음성 | |
| Primorsky 13 | >256 | 0.18 | 양성 | 0.37 | 양성 | |
| Primorsky 14 | 90 | 0.21 | 양성 | 0.40 | 양성 | |
| Primorsky 15 | 90 | 0.37 | 양성 | 0.57 | 음성 | |
| 구제역 비발생국 및 백신 미접종 돼지혈청 (항체음성) |
N1 | - | 0.88 | 음성 | 0.83 | 음성 |
| N2 | - | 0.93 | 음성 | 0.83 | 음성 | |
| N3 | - | 0.84 | 음성 | 0.85 | 음성 | |
| N4 | - | 0.80 | 음성 | 0.90 | 음성 | |
| N5 | - | 0.85 | 음성 | 0.89 | 음성 | |
| N6 | - | 0.86 | 음성 | 0.93 | 음성 | |
| N7 | - | 0.77 | 음성 | 0.90 | 음성 | |
| N8 | - | 0.97 | 음성 | 0.91 | 음성 | |
| N9 | - | 0.86 | 음성 | 0.88 | 음성 | |
| N10 | - | 0.85 | 음성 | 0.84 | 음성 | |
| N11 | - | 0.93 | 음성 | 0.89 | 음성 | |
| N12 | - | 0.83 | 음성 | 0.94 | 음성 | |
| N13 | - | 0.71 | 음성 | 0.85 | 음성 | |
| N14 | - | 0.89 | 음성 | 0.88 | 음성 | |
| N15 | - | 0.87 | 음성 | 0.87 | 음성 | |
| N16 | - | 1.03 | 음성 | 0.89 | 음성 | |
| N17 | - | 0.91 | 음성 | 0.74 | 음성 | |
| N18 | - | 1.01 | 음성 | 0.88 | 음성 | |
| N19 | - | 0.83 | 음성 | 0.90 | 음성 | |
| N20 | - | 0.81 | 음성 | 0.83 | 음성 | |
| N21 | - | 0.83 | 음성 | 0.72 | 음성 | |
| N22 | - | 0.82 | 음성 | 0.90 | 음성 | |
| N23 | - | 0.90 | 음성 | 0.87 | 음성 | |
| N24 | - | 0.98 | 음성 | 0.84 | 음성 | |
S/N = Sample O.D / Negative Control O.D8B87 kit: S/N ≤0.6 양성, S/N >0.6 음성
다국적회사 kit: S/N ≤0.5 양성, S/N >0.5 음성
도 6 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 8B87을 이용한 항체 효소면역측정법은 모든 구제역 백신(동방 사; Type O Primorsky strain)을 맞은 돼지 항혈청에서 타사키트보다 반응성이 높으며, 구제역 비발생지역의 돼지 항혈청과는 반응하지 않는 것으로 확인 되었다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc.
REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Monoclonal Antibodies for detecting the structural protein
antibodies against Foot and Mouth Disease Virus serotype O and
using the same
<130> PN190031
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 1_8B87
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 2_8B87
<400> 2
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Lys Pro
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 3_8B87
<400> 3
Val Ile Tyr His Asp Tyr Leu Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8B87 Heavy chain V-region
<400> 4
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Ser Trp Val Lys Gln Val Pro Gly Lys
20 25 30
Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Lys Pro Ala
35 40 45
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Tyr Leu Asp Thr Ser
50 55 60
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Glu
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Phe Cys Val Ile Tyr His Asp Tyr Leu Trp Phe Ala Tyr
85 90 95
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala
100 105
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 1_8B87
<400> 5
Asn Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 2_8B87
<400> 6
Leu Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 3_8B87
<400> 7
Gln Gln Asn Tyr Ala Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8B87 Light chain V-region
<400> 8
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Asn Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Val Pro Gly
50 55 60
Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Ala Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 1_8B87
<400> 9
gggtacacct tcacaaacta tgga 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 2_8B87
<400> 10
ataaacacca acactggaaa gcct 24
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 3_8B87
<400> 11
gtaatctacc atgattacct ctggtttgct tac 33
<210> 12
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8B87 Heavy chain V-region
<400> 12
aagaagcctg gagagacagt caagatctcc tgcaaggctt ctgggtacac cttcacaaac 60
tatggagtga gctgggtgaa gcaggtccca ggaaagggct taaagtggat gggctggata 120
aacaccaaca ctggaaagcc tgcatatgct gatgacttca agggacggtt tgccttctat 180
ttggacacct ctgccagtac tgcctatttg cagatcagca acctcaaaaa tgaagacgag 240
gctacatatt tctgtgtaat ctaccatgat tacctctggt ttgcttactg gggccagggg 300
acgctgataa ctgtctctgc ag 322
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 1_8B87
<400> 13
aacagtgttg atacttatgg caatagtttt 30
<210> 14
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 2_8B87
<400> 14
cttgcatcc 9
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 3_8B87
<400> 15
cagcaaaatt atgcggatcc gtggacg 27
<210> 16
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8B87 Light chain V-region
<400> 16
aacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtaa cagtgttgat acttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctttc ttgcatccga cctagaatct 180
ggggtccctg gcaggttcag aggcagtggg tccaggacag acttcaccct caccattgat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaattatgc ggatccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334
<210> 17
<211> 2202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P1
<400> 17
ggagccgggc aatccagtcc ggctaccgga tcacagaacc agtcaggcaa caccgggagt 60
atcatcaaca attactacat gcagcagtat cagaactcca tggacaccca acttggtgac 120
aatgctatca gcggaggctc caacgaggga tccacagaca caacttccac ccacacaacc 180
aacacccaga acaatgactg gttttcaaag ctggccagct ctgccttcag cggtcttttc 240
ggcgccctcc tcgccgataa gaaaaccgag gagaccactc ttctcgaaga tcgcatcctc 300
accacccgaa acggacacac cacctcgaca acccagtcga gtgttggcat aacgcacggg 360
tacgcaacgg ctgaggattt tgtgagcggg ccgaacacct ctggtcttga gaccagagtc 420
atccaagcgg agcggttctt caaaacccac ctgttcgact gggtcaccag tgatccgttt 480
ggacggtgtt acttgttgga gctcccgact gatcacaaag gtgtctacgg cagcctgacc 540
gactcatacg cttacatgag aaacggttgg gatgttgagg ttaccgctgt ggggaatcag 600
ttcaacggag gctgcctact agtggccatg gtgcctgaac tttgttccat cgggcagaga 660
gagctgttcc agcttacact cttcccccac cagttcatca acccccggac gaacatgaca 720
gcccacatca aggtgccctt tgttggcgtc aaccgttacg atcagtacaa ggtacacaag 780
ccgtggaccc tcgtggttat ggtcgtggcc ccactgactg tcaacaccga aggcgctccg 840
cagatcaagg tgtacgccaa catcgcaccc accaacgtgc acgtcgcggg tgagttccct 900
tccaaagagg ggattttccc tgtggcctgt agcgacggct atggcggctt ggtgacaact 960
gacccaaaga cggctgaccc cgtttacggc aaagttttca accccccccg caacatgttg 1020
ccagggcggt tcaccaacct cctggacgtg gctgaggctt gtcccacgtt tctgcacttc 1080
gatggcggcg tgccgtacgt gaccacgaag acggactcgg acagggtgct cacacaattt 1140
gacttgtctt tggcggcaaa acacatgtca aacaccttcc ttgcaggtct tgcccagtac 1200
tacacgcagt acagcggcac catcaacctg cacttcatgt tcacaggccc cactgacgcg 1260
aaagcgcgtt acatgattgc gtatgcccct ccgggcatgg aaccgcccaa aacacctgag 1320
gctgctgctc attgcattca cgcagagtgg gacacgggtc tgaactcaaa gtttaccttt 1380
tccatccctt acctctcggc ggctgattat gcgtacaccg cgtctgacgc tgctgagacc 1440
acaaatgttc aggggtgggt ctgcttgttt caaataacgc acgggaaagc tgaaggcgac 1500
gctcttgtcg tgctggccag tgctggcaag gactttgagc tgcgcctgcc tgtggacgct 1560
cggcaacaga ccacttcgac aggcgagtcg gctgaccccg tgactgccac cgttgagaac 1620
tacggtggcg agacacagat ccagaggcgc caccacacag acgtctcgtt catactggac 1680
agatttgtga aagtcacacc aaaagactca acaaatgtac tggacctgat gcagaccccc 1740
ccccacactc tagtaggggc gctcctccgc gctgccactt actatttcgc tgacctagag 1800
gtggcagtga aacacgaggg ggaccttacc tgggtgccaa acggagcacc tgaagcagcc 1860
ttggacaaca ccaccaaccc aacggcgtac cataaggcgc cgcttacccg gcttgcattg 1920
ccctacacgg caccacaccg tgttttggcc accgtttaca acgggaactg caaatacacc 1980
gggggctcac tgcccaacgt gagaggcgat ctccaagtgc tggcaccgaa agcggcgagg 2040
ccattgccca cttctttcaa ctacggtgct atcaaagcca ctcgggtaac agaactgctg 2100
taccgcatga agagggccga gacgtactgc cctcggcccc tcttggctgt ccacccgagt 2160
gcggctagac acaaacagaa aatagtggca cctgtaaagc ag 2202
<210> 18
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3C
<400> 18
agtggtgctc ccccgactga cttgcaaaag atggtcatgg gtaacaccaa gcctgttgag 60
ctcatcctcg acgggaagac ggtggccatc tgttgcgcca ccggagtgtt tggtactgct 120
taccttgtcc ctcgtcatct tttcgcagag aagtatgaca agatcatgtt ggacggcaga 180
gccatgacag acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtgaa aggacaggac 240
atgctctcag acgccgcgct catggtgctt caccgtggga atcgcgtgcg ggacatcacg 300
aagcacttcc gtgatgtggc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgtcgg cgtggtcaac 360
aacgctgatg ttgggagact gatcttctct ggtgaggccc ttacctacaa ggacattgta 420
gtgtgcatgg acggagacac catgcccggt ctcttcgcct acaaagccgc caccaaggcg 480
ggttactgtg ggggagccgt tcttgcaaag gacggagccg agactttcat cgtcggcact 540
cactccgcag gcggcaatgg ggttggatac tgctcatgcg tttccaggtc tatgctgctt 600
aaaatgaagg cacacatcga tcccgaacca caccacgag 639
Claims (13)
- 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O 진천주를 중화시킬 수 있는 수탁번호 KCTC18683P 하이브리도마 세포에서 생산되는 것인 단일클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG2b 타입인 것인, 단일클론항체.
- 삭제
- 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
을 포함하는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 항체 탐지용 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제4항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제6항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 재조합 벡터.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
- 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 중화능 보유 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC18683P 인 하이브리도마 세포.
- 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) O형 진천주에 대한 중화능 보유 수탁번호 KCTC18683P 인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 포함하는 FMDV 혈청형 O형 진천주 항체 탐지용 면역진단키트.
- 제10항에 있어서, 상기 단일클론항체는,
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인, FMDV 혈청형(serotype) O형 진천주 항체 탐지용 면역진단키트. - 제10항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, FMDV 혈청형 O형 진천주 항체 탐지용 면역진단키트.
- 삭제
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| KR1020190029503A KR102191896B1 (ko) | 2019-03-14 | 2019-03-14 | 구제역 바이러스 혈청형 o 진천주의 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
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2019
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