CN113264999B - 中和肺炎链球菌溶血素蛋白的抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。所述抗原结合蛋白能够特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白。本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白的制备方法及其用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种能够靶向肺炎链球菌溶血素蛋白(PLY)的抗原结合蛋白。
背景技术
肺炎链球菌又称肺炎球菌，广泛定植在人类鼻咽部，在机体抵抗力低下时可引起肺部或者中枢神经系统感染，严重时形成菌血症或者脓毒症。
溶血素(PLY)是肺炎链球菌重要的毒力因子，在肺炎链球菌形成感染过程中发挥重要作用。PLY可以破坏肺组织上皮、内皮及免疫细胞，增加血管通透性及肺炎链球菌定植、传播和侵袭，并影响患者肺功能，形成急性肺损伤，甚至急性呼吸窘迫综合征。因此，亟需开发有效的对抗肺炎链球菌感染的药物。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：1)能够特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白及其变体；2)对肺炎链球菌溶血素蛋白具有高亲和力及中和活性；3)能有效阻断肺炎链球菌形成的感染；4)能够有效预防和/或治疗肺炎链球菌引起的疾病和/或病症。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VL，且所述VL包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体或其抗原结合片段，其中抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体；所述其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：能够特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白和能够预防和/或治疗肺炎链球菌引起的疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含所述核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含所述核酸分子或所述载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体和/或所述细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请还提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗由肺炎链球菌引起或介导的疾病和/或病症。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与肺炎链球菌溶血素蛋白的亲和力测试。
图2显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白的体外中和肺炎链球菌溶血素蛋白溶血活性的测定。
图3显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对PLY毒素模型小鼠的保护作用。
图4显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对肺炎链球菌感染模型小鼠的保护作用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“肺炎链球菌溶血素”可以与“Pneumolysin”、“PLY”和“肺炎链球菌溶血素蛋白”互换使用，通常指肺炎链球菌含有的一种多功能毒力因子。在本申请中，该术语可涵盖野生型肺炎链球菌溶血素蛋白及其变体、类似物、同源物和功能活性片段。例如，所述肺炎链球菌溶血素蛋白的变体可以包含与野生型溶血素相比，发生第146位氨基酸缺失的突变。例如，所述功能活性片段可以是能够在宿主中引起体液和/或细胞免疫应答的部分。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白)的其它抗体片段。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，肺炎链球菌溶血素)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。在本申请中，术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有。在本申请中，术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。在本申请中，术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。术语“dAb”通常包括sdAb。术语“sdAb”通常指单域抗体。单域抗体通常指仅由抗体重链可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL)组成的抗体片段。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体的CDR区以外的部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如羊驼，小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“多肽分子”和“多肽”、“肽”可以互换使用，通常指氨基酸残基的聚合物。术语“融合蛋白”通常指具有至少两个共价连接在一起的部分的多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头连接。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。该术语也适用于，如抗原结合蛋白对与多个抗原交叉反应的特定表位是有特异性的，其中，特异性的抗体能结合携带交叉反应表位的多种抗原。这种抗原结合蛋白的结合位点和/或具有特异性结合交叉反应表位的抗原结合蛋白，分别也被称为多特异性或交叉特异性结合位点的抗原结合蛋白。例如，抗原结合蛋白可具有与多个不同抗原交叉反应的表位特异性结合的多特异性结合位点。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
1.分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案3-4中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
6.根据实施方案5所述分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案3-6中任一项所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案7所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案2-8中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-13中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含选自下述任一组的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4：
1)所述H-FR1包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列；以及
2)所述H-FR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案15所述的分离的抗原结合蛋白的VH包含SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区。
18.根据实施方案17所述的分离的抗原结合蛋白，其重链恒定区源自人IgG恒定区。
19.根据实施方案17-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
20.根据实施方案1-19中任一项所述分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案23-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
26.根据实施方案25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案22-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案22-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案29所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案21-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含选自下述任一组的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4：
1)所述L-FR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列；以及
2)所述L-FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述L-FR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述L-FR3包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述L-FR4包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案1-34中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案35所述分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案1-36中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链恒定区。
38.根据实施方案1-37中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区源自人Igκ恒定区。
39.根据实施方案1-38中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包含选自下述任一组的VH和VL：
1)所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；以及
2)所述VH包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。
41.根据实施方案40所述的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
42.根据实施方案40-41中任一项所述的分离的抗原结合的蛋白，其中所述抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白。
44.根据实施方案43所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述肺炎链球菌溶血素包含野生型肺炎链球菌溶血素蛋白及其变体。
45.根据实施方案43-44中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白包含与野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，第146位氨基酸缺失的肺炎链球菌溶血素蛋白变体。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够预防和/或治疗肺炎链球菌引起的疾病和/或病症。
47.根据实施方案46所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述疾病和/或病症包括肺炎链球菌引起的疾病和/或病症的并发症。
48.多肽分子，其包含实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
49.根据实施方案48所述的多肽分子，其包含融合蛋白。
50.免疫缀合物，其包含实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
51.核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽分子。
52.载体，其包含实施方案51所述核酸分子。
53.细胞，其包含实施方案51所述的核酸分子或实施方案52所述的载体。
54.药物组合物，其包含实施方案1-47中任一项所述分离的抗原结合蛋白、实施方案48-49中任一项所述的多肽分子、实施方案50所述免疫缀合物、实施方案51所述的核酸分子、实施方案52所述的载体和/或实施方案53所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
55.制备所述分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-47中任一项所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养实施方案53所述的细胞。
56.根据实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案48-49中任一项所述的多肽分子、实施方案50所述的免疫缀合物、实施方案51所述的核酸分子、实施方案52所述的载体、实施方案53所述的细胞和/或实施方案54所述药物组合物单独使用或与其它药物联合使用。
57.实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案48-49中任一项所述的多肽分子、实施方案50所述的免疫缀合物、实施方案51所述的核酸分子、实施方案52所述的载体、实施方案53所述的细胞和/或实施方案54所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
58.根据实施方案57所述的用途，其中所述疾病和/或病症及其并发症由肺炎链球菌引起或介导。
59.根据实施方案57-58中任一项所述的疾病和/或病症包括肺炎链球菌引起或介导的疾病和/或病症的并发症。
60.检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案48-49中任一项所述的多肽分子、实施方案50所述的免疫缀合物、实施方案51所述的核酸分子、实施方案52所述的载体、实施方案53所述的细胞和/或实施方案54所述药物组合物。
61.实施方案1-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案48-49中任一项所述的多肽分子、实施方案50所述的免疫缀合物、实施方案51所述的核酸分子、实施方案52所述的载体、实施方案53所述的细胞和/或实施方案54所述药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的存在和/或含量。
分离的抗原结合蛋白
抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过IMGT定义。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
例如，通过表1的方法划分SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，本申请中分离的抗原结合蛋白可以包含如下表所示的CDR。
表1不同方法划分SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列得到的HCDR序列
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，所述HCDR3可以包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR2，所述HCDR2可以包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，所述HCDR1可以包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以源自任一种免疫球蛋白的重链恒定区，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。例如，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在本申请中，所述免疫球蛋白的重链恒定区可以包含其突变体。在本申请中，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1-4中任一种的重链恒定区。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以源自人IgG1重链恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
例如，通过表2的方法划分SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，本申请中分离的抗原结合蛋白可以包含如下表所示的CDR。
表2.不同方式划分SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列得到的CDR序列
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，所述LCDR3可以包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR2，所述LCDR2可以包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQID NO:13所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人Igκ恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所示HCDR3可以包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VH和VL。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，所述抗体可以包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。例如，所述人源化抗原结合蛋白的VH可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗原结合蛋白的VL可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
此外，需要说明的是，本申请所述分离的抗原结合蛋白可以包含与其存在一个或多个保守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。
在本申请中，可以通过使用肺炎链球菌溶血素突变体对小鼠进行免疫，获取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合筛选具有肺炎链球菌溶血素蛋白抗原亲和力的抗原结合蛋白。在本申请中，还可以对筛选得到的抗原结合蛋白翻译后修饰位点进行优化，获得人源化序列。
可以通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的肺炎链球菌溶血素抗原结合蛋白。
例如，可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白的抗原结合活性。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合肺炎链球菌溶血素。在本申请中，所述肺炎链球菌溶血素可以包含野生型肺炎链球菌溶血素以及其变体。在本申请中，所述肺炎链球菌溶血素的变体可以包含与野生型肺炎链球菌溶血素相比，第146位氨基酸缺失。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白与肺炎链球菌溶血素的结合可以通过ELISA方法进行检测。例如，本申请所述的抗原结合蛋白可以以小于或等于约0.018μg/ml，小于或等于约0.016μg/ml，小于或等于约0.014μg/ml，小于或等于约0.012μg/ml，小于或等于约0.010μg/ml的EC50值与肺炎链球菌溶血素蛋白结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够中和肺炎链球菌溶血素蛋白的生物学活性。例如，可以将重组肺炎链球菌溶血素与本申请所述分离的抗原结合蛋白混合，加入兔红细胞，检测所述抗原结合蛋白的抗溶血活性。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够预防和/或治疗疾病和或/病症。在本申请中，所述疾病和/或病症可以由肺炎链球菌引起或介导。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包含由肺炎链球菌引起或介导的疾病和/或病症的并发症。例如，所述疾病和/或病症可以包含脓毒症和/或菌血症。
多肽分子、核酸分子、载体、细胞、免疫缀合物和药物组合物
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述多肽分子可以包含融合蛋白。在本申请中，所述多肽分子可以为融合蛋白。在本申请中，所述融合蛋白可以包括多特异性抗体。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，可以将本申请所述的分离的抗原结合蛋白或其片段与另一试剂，如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成免疫缀合物。此外，可以以融合蛋白质的形式提供免疫缀合物，其可以由编码免疫缀合物的多核苷酸表达。所述免疫缀合物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。在ADC中，抗体和治疗剂可以通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如，可以用肺炎链球菌溶血素减毒株或其片段免疫动物。例如，所述肺炎链球菌减毒株可以包含与野生型相比的第146位缺失突变。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的肺炎链球菌溶血素都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对肺炎链球菌溶血素特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。例如，激发免疫原可以是全长的肺炎链球菌溶血素，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。
方法和用途
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法可以包括向有需要的受试者施用本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在本申请中，所述施用可以通过不同方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
另一方面，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物，其可以用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以由肺炎链球菌引起或介导。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以是肺炎链球菌引起或介导的疾病和/或病症的并发症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括细菌感染。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括菌血症和/或脓毒症。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物可以单独使用，也可以与其他药物联合使用预防和/或治疗疾病和/或病症。在某些实施方式中，所述其他药物可以是目前已知的任何具有抗菌作用的药物。所述疾病和/或病症可以是由于肺炎链球菌感染引起的，也可以是由其他感染引起的相关疾病。
另一方面，本申请还提供了检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的方法，所述方法包括施用所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在本申请中，所述检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的方法可以是体外方法。例如，使本申请所述的分离的抗原结合蛋白和离体的样品接触，检测样品中肺炎链球菌溶血素的存在和/或含量。在某些情形中，所述检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的方法为非治疗目的。在某些情形中，所述检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的方法不是诊断方法。
另一方面，本申请还提供了检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的试剂或试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中肺炎链球菌溶血素的存在和/或含量。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1重组蛋白的表达
重组构建肺炎链球菌溶血素(UniProtKB-Q04IN8，C端引入His标签)，并根据溶血素全长氨基酸序列缺失第146位的丙氨酸作为减毒的PLYmut的氨基酸，以氨基酸序列为模板，限定酶切位点为NdeI/XhoI，委托北京擎科生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成，获得PLY、PLYmut蛋白的质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞后，利用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，将菌液超声裂解后的上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化得到PLY、PLYmut重组蛋白。
实施例2PLYmut抗原免疫Balb/C小鼠
采用制备的PLYmut蛋白，皮下多点免疫方法对5只Balb/C小鼠进行免疫，皮下多点免疫。
免疫流程图如下所示。
实施例3免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合及筛选具有PLYmut抗原结合活性的抗体
采用PEG法将骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653与免疫PLYmut抗原的小鼠脾脏细胞进行融合。将融合后的杂交瘤细胞接种于96孔板中培养。后续使用HAT培养基和HT的培养基进行杂交瘤细胞培养。培养至96孔板细胞上清液微黄时，取100μl细胞培养上清液，通过ELISA实验筛选与PLYmut抗原有较高结合活性的杂交瘤克隆细胞。将结合活性较强的杂交瘤母克隆细胞扩增培养后，通过有限稀释法进行亚克隆，并选取单克隆细胞。将单克隆上清液通过ELISA实验筛选得到能够分泌与PLYmut蛋白具有较强结合活性的抗体的单克隆细胞。
实施例4具有结合活性鼠源抗体序列的获得
利用RNAfast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)提取1×106分泌抗PLYmut抗体的单克隆细胞总RNA。并利用反转录试剂盒(Takara)，将总RNA反转成cDNA。利用引物扩增cDNA片段(Anke Krebber.1997)，利用DNA产物纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)将PCR产物纯化，利用连接试剂盒(北京擎科生物科技有限公司)连接到T载体上，并转化到感受态细胞中，委托上海擎科生物进行序列测定，最终获得鼠源抗体11B9的重链可变区序列和轻链可变区序列。
m11B9VH
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSYYWNWIRKFPGNKLEYMGYINYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARRGAMITLDYWGQGTTLTVSS
m11B9VL
DIVLTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGIYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYTYPLTFGAGTKLELK
其中下划线部分表示使用IMGT编号方案划分得到的CDR序列。
实施例5抗PLY鼠源抗体的人源化
通过NCBI数据库比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，选取与鼠源抗体11B9(m11B9)最接近的germline序列为模板，对m11B9进行人源化，并对抗原结合蛋白翻译后修饰位点进行优化，获得人源化序列如下。
hu11B9VH2
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSYYWNWIRQHPGKGLEWIGYINYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCARRGAMITLDYWGQGTTLTVSS
hu11B9VL2
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCKASENVGIYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSATDFTLTISSVQPEDFAVYYCGQSYTYPLTFGAGTKLELK
其中下划线部分表示使用IMGT编号方案划分得到的CDR序列。
实施例6抗PLY抗体的表达与亲和力检测
使用Expi293F表达系统进行11B9HL(其中VH为m11B9VH，VL为m11B9VL)人鼠嵌合抗体和11B9H2L2(其中VH为hu11B9VH2，VL为hu11B9VL2)人源化抗体进行重组表达，将表达后的细胞上清液使用Protein A磁珠进行纯化，得到的纯化产物采用ELISA方法进行亲和力鉴定。96孔酶标板(Thermo)中包被PLY蛋白0.1μg/孔，4℃孵育过夜，使用PBST缓冲液洗板后，每孔加入200μl的5％ BSA放置于37℃孵育1小时；封闭结束使用PBST缓冲液进行洗板，并在酶标板中加入首孔为0.1μg倍比稀释后的11B9HL和11B9H2L2(使用人IgG做为对照)，4℃孵育过夜；一抗过夜后进行洗板，在酶标板中加入1：10000稀释的HRP标记山羊抗人IgG二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时后进行洗板；每孔加入100μl TMB 37℃孵育进行显色，10min后采用终止液终止显色，酶标仪(Multiskcin FC，Thermo)读取结果数值并使用Graphpad软件作图。
结果如图1所示，11B9HL的EC50值为0.01602μg/ml，11B9H2L2的EC50值为0.01626μg/ml，人源化抗体和嵌合抗体均与肺炎链球菌溶血素PLY蛋白具有强亲和力。
实施例7体外中和肺炎链球菌溶血素PLY溶血活性测定
配置一定浓度的单克隆抗体稀释液加入96孔板(thermo)中，并加入6.25ng重组肺炎链球菌溶血素PLY蛋白混合均匀，37℃孵育10min，随后加入5％兔红细胞，37℃孵育1h。将样品3000rpm离心5min获得上清液，利用酶标仪(Multiskcin FC，Thermo)405nm波长处检测吸光度，测得其抗溶血活性。
结果如图2所示，结果显示本申请所述单克隆抗体11B9HL和11B9H2L2均具有抗肺炎链球菌毒素使兔红细胞溶血的活性。
实施例8人源化单克隆抗体对PLY毒素模型小鼠的保护作用
预先向C57BL/6小鼠注射1.25mg/kg的人源化单克隆抗体11B9H2L2或人IgG(作为对照)，1h后尾静脉注射0.75μg肺炎链球菌溶血素PLY蛋白，观察小鼠生存时间。
结果如图3所示，对照组小鼠全部死亡，而注射11B9H2L2组小鼠则基本达到了完全保护效应。
实施例9人源化单克隆抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用
取种子库肺炎链球菌，解冻后，取200μl菌液用涂布器均匀涂布在哥伦比亚血平板，培养10～12h，从哥伦比亚血平板上取出一块血琼脂(3cm×3cm)，置于15ml灭菌后的THY培养基中，37℃恒温培养箱中静置培养至OD600为0.4～0.6，约需2～3h。离心收集菌体，并用PBS重悬备用。根据体重对C57BL/6J小鼠进行随机分组，分为模型组、单克隆抗体药物治疗组。提前12h经尾静脉给予嵌合抗体11B9HL、人源化单克隆抗体11B9H2L2或人IgG 45mg/kg，12h后经尾静脉注射2×108CFU的肺炎链球菌，观察记录各组小鼠的生存情况。
结果如图4所示，11B9HL和11B9H2L2均对肺炎链球菌(SP)感染小鼠具有保护作用，其中人源化抗体11B9H2L2对肺炎链球菌(SP)感染小鼠具有很强的保护效应。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
序列表
<110> 星济生物（苏州）有限公司、昕曜生物（上海）有限公司
<120> 中和肺炎链球菌溶血素蛋白的抗原结合蛋白及其用途
<130> 0193-PA-004
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
<400> 1
Ala Arg Arg Gly Ala Met Ile Thr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2
<400> 2
Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1
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Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
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Gly Gln Ser Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Gly Ala
1
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 H-FR2
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Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly
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Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 L-FR1
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
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Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 L-FR2
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Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 L-FR3
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Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Ala Asp Tyr His Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9、hu11B9 L-FR4
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 H-FR1
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 H-FR2
<400> 16
Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 H-FR3
<400> 17
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 L-FR1
<400> 18
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 L-FR2
<400> 19
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 L-FR3
<400> 20
Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Ala Met Ile Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9VL
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
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Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9VH2
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Ala Met Ile Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9VL2
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3(Chothia, AbM, Kabat, 组合)
<400> 25
Arg Gly Ala Met Ile Thr Leu Asp Tyr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2(Chothia)
<400> 26
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2(AbM)
<400> 27
Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2(Kabat, 组合)
<400> 28
Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1(Chothia)
<400> 29
Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1(AbM, 组合)
<400> 30
Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1(Kabat)
<400> 31
Ser Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2(Chothia, AbM, Kabat, 组合)
<400> 32
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1(Chothia, AbM, Kabat, 组合)
<400> 33
Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 H-FR1; hu11B9 H-FR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<400> 34
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Xaa Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Xaa Val Xaa
20 25
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 H-FR2; hu11B9 H-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Phe或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Gly或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ile或Met
<400> 35
Trp Asn Trp Ile Arg Xaa Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 36
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 H-FR3; hu11B9 H-FR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa = Thr或Val
<400> 36
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Xaa Xaa Ile Xaa Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Tyr Xaa Leu Xaa Leu Xaa Ser Val Thr Xaa Xaa Asp
20 25 30
Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys
35
<210> 37
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 L-FR1; m11B9 L-FR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Lys或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Pro或Val
<400> 37
Xaa Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9 L-FR2; hu11B9 L-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Glu或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 38
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Gln Xaa Pro Xaa Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 39
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu11B9 L-FR3; m11B9 L-FR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Ala或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa = Asp或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> Xaa = His或Tyr
<400> 39
Ser Xaa Arg Xaa Thr Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Xaa Glu Asp Xaa
20 25 30
Ala Xaa Tyr Xaa Cys
35
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9VH; hu11B9VH2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Phe或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Gly或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> Xaa = Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(67)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> Xaa = Thr或Val
<400> 40
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Xaa Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Xaa Val Xaa Gly Asp Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Xaa Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Xaa Xaa
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Xaa Xaa Ile Xaa Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Xaa Leu
65 70 75 80
Xaa Leu Xaa Ser Val Thr Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Ala Met Ile Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m11B9VL; hu11B9VL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Lys或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa = Glu或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa = Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> Xaa = Ala或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(58)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Asp或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = His或Tyr
<400> 41
Xaa Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ile Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Gln Xaa Pro Xaa Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Xaa Arg Xaa Thr Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Xaa
65 70 75 80
Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Xaa Cys Gly Gln Ser Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
Claims (28)
1.分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合肺炎链球菌溶血素蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CDR的命名系统为IMGT。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-
FR4，所述H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4的氨基酸序列选自下述任一组：
1)所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQID NO:10所示；或
2)所述H-FR1的氨基酸序列SEQ ID NO:15所示，所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。
3.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示。
4.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区。
5.根据权利要求4所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区源自人IgG恒定区。
6.根据权利要求4所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
7.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-
FR4，所述L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4的氨基酸序列选自下述任一组：
1)所述L-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述L-FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示，所述L-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，且所述L-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或
2)所述L-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述L-FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:19所示，所述L-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，且所述L-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
8.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL，且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示。
9.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链恒定区。
10.根据权利要求9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区源自人Igκ恒定区。
11.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，所述VH和VL的氨基酸序列选自下述任一组：
1)所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或
2)所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
12.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段和/或F(ab’)2。
14.根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括F(ab)2，scFv，和/或di-scFv。
15.根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为单克隆抗体。
16.根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组中的一种或多种：嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白为野生型肺炎链球菌溶血素蛋白。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白为与野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，第146位氨基酸缺失的肺炎链球菌溶血素蛋白变体。
19.融合蛋白，其包含权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
20.免疫缀合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
21.核酸分子，其编码权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
22.载体，其包含权利要求21所述的核酸分子。
23.细胞，其包含权利要求21所述的核酸分子或权利要求22所述的载体。
24.药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求19所述的融合蛋白、权利要求20所述的免疫缀合物、权利要求21所述的核酸分子、权利要求22所述的载体和/或权利要求23所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
25.权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求19所述的融合蛋白、权利要求20所述的免疫缀合物、权利要求21所述的核酸分子、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的细胞和/或权利要求24所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物能够中和肺炎链球菌溶血素的溶血活性。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物对肺炎链球菌感染具有保护作用。
27.检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求19所述的融合蛋白、权利要求20所述的免疫缀合物、权利要求21所述的核酸分子、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的细胞和/或权利要求24所述药物组合物。
28.权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求19所述的融合蛋白、权利要求20所述的免疫缀合物、权利要求21所述的核酸分子、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的细胞和/或权利要求24所述药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中肺炎链球菌溶血素蛋白的存在和/或含量。
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Also Published As
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| CN113264999A (zh) | 2021-08-17 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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